Summary
Questo protocollo dimostra un'analisi flusso-stretching di singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione per lo studio della diffusione di (1D) unidimensionale di molecole lungo il DNA.
Abstract
Descriviamo un'analisi flusso-stretching di singola molecola semplice, robusta e alta velocità di trasmissione per lo studio della diffusione di 1D delle molecole lungo il DNA. In questo saggio, lamelle di vetro sono funzionalizzate in una reazione di uno stadio con Silano-PEG-biotina. Le cellule di flusso sono costruite da interposizione di un nastro adesivo con canali pre-tagliati tra un coprioggetto funzionalizzato e una lastra PDMS contenente fori di entrata e di uscita. Canali multipli sono integrati nella cella di un flusso e il flusso di reagenti in ogni canale possa essere completamente automatizzato, che significativamente aumenta la velocità di analisi e riduce il tempo di preparazione manuale per test. All'interno di ogni canale, biotina-λ-DNAs sono immobilizzati sulla superficie e un flusso laminare viene applicato per flusso-tratto delle autorità nazionali designate. Le molecole di DNA sono tese a > 80% della loro lunghezza contorno e servire come spazialmente estesi modelli per studiare l'attività di associazione e trasporto di molecole fluorescente contrassegnati. Le traiettorie di singole molecole vengono rilevate da formazione immagine di fluorescenza di riflessione interna totale (TIRF) time-lapse. Immagini RAW sono analizzate utilizzando snella personalizzata singola particella software di monitoraggio per identificare traiettorie di singole molecole diffondendo lungo DNA e stimare le loro costanti di diffusione 1D automaticamente.
Introduction
Un problema di lunga data nella biologia è proteine come endogene che agiscono a specifici siti nel genoma possono individuare il loro target di DNA abbastanza rapidamente per l'organismo sopravvivere e rispondere efficacemente al suo ambiente. Studi negli ultimi quarant'anni proposto e in gran parte supporto l'ipotesi che la cinetica di DNA target cerca da una proteina può essere accelerato dalla diffusione in cui la proteina si alterna tra diffusione 3D nel bulk e diffusione 1D (tra cui facilitata scorrevole e saltellando processi) lungo il DNA1. È ormai noto che molte proteine coinvolte nella regolazione genica, metabolismo dell'acido nucleico e altri processi sono in grado di scivolare sulla DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Inoltre, recenti studi ha riferito che anche piccoli peptidi possono associare a e far scorrere il DNA, con la capacità di trasportare un carico; ad esempio, una molecola proteica o PCR primer, lungo DNA10,11,12,13,14.
Negli ultimi 15 anni, l'analisi di flusso-stretching di singola molecola è stato ampiamente utilizzato per studiare l'associazione e la diffusione delle molecole lungo DNA2,15,16. In questo tipo di analisi, molecole di DNA double-stranded biotinilati sono immobilizzati sulla superficie e un flusso laminare viene applicato al flusso allungare il DNA. La > 80% allungato DNAs servire come modelli spazialmente estesi per studiare l'attività di associazione e trasporto di molecole etichettati con fluorofori dove le traiettorie di singole molecole lungo DNA vengono rilevate da formazione immagine di fluorescenza time-lapse. Nella nostra implementazione, ottimizzato per la riproducibilità e facilità d'uso, questo test è costituito da cinque fasi principali: preparazione di biotina-λ-DNA, vetrino coprioggetti funzionalizzazione, costruzione di cella di flusso, fluorescenza e analisi dei dati. In precedenti protocolli17, lamelle di vetro sono state funzionalizzate da primo trietossisilano reagendo con (3-amminopropil) (APTES) e poi con ammina-reattivo polietilenglicole (PEG) reagenti (ad es., NHS-PEG-biotina) per formare uno strato di PEG che resiste l'adsorbimento non specifico di componenti di analisi sulla superficie del vetrino coprioggetti. La qualità dei vetrini coprioggetti funzionalizzati dipendeva in gran parte la qualità dei reagenti di PEG e condizioni di reazione ad ogni passo. Il nostro protocollo descrive un protocollo semplificato funzionalizzazione e costruzione di cella di flusso multiplex che richiede nessun adesivo liquido o tempo di polimerizzazione sulle cellule di flusso del giorno vengono assemblati. Inoltre descriviamo una snella e robusta dati analisi procedura11 che elimina le fasi di regressione computazionalmente intensivi applicando un metodo di simmetria radiale per centroide localizzazione18 e una diffusione basato su covarianza stimatore costante19.
Qui, segnaliamo un semplice, robusto e singola molecola throughput elevato flusso d'allungamento implementazione di analisi con significativi miglioramenti apportati nella funzionalizzazione vetrino coprioggetti, flusso cella costruzione e analisi dei dati. In particolare, abbiamo sviluppato un protocollo di funzionalizzazione coprioggetto One-Step, in cui coprioggetti pulito e asciutti reagiscono direttamente con Silano-PEG-biotina. Questo protocollo semplifica la preparazione del vetrino coprioggetto e migliora l'affidabilità della qualità delle superfici funzionalizzate rispetto al protocollo di reazione standard in due fasi. Descriviamo l'uso di vetrini coprioggetti così funzionalizzati con celle di flusso PDMS multicanale che permettono il collegamento di tubi robusti da effettuarsi senza colla. Ulteriormente queste cellule di flusso sono più insenature computerizzato per ogni camera di flusso che consentono il flusso di reagente automatizzati per ridurre hands-on tempo durante l'installazione e throughput di dosaggio aumentato.
Protocol
1. preparazione di biotina-λ-DNA
Nota: molecole di biotina-λ-DNA sono preparati legando un oligonucleotide di biotina, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotina - 3 ' per Λ-DNA molecole 20.
- Biotina 0,1 mM Prepare etichettato oligo nel buffer TE.
- Stock di λ-DNA di 0,5 mg/mL calore a 65 ° C per 60 s e tuffo nel ghiaccio bagnato subito.
Nota: Tempra veloce raffreddamento riduce λ-DNA concatemerization. - Pipetta 100 µ l della soluzione λ-DNA in un tubo del microcentrifuge.
- Aggiungere 1 µ l dell'oligo di 0,1 mM in 9 µ l di tampone TE.
- Add 2 µ l della soluzione oligo al tubo del microcentrifuge contenente il λ-DNA. Mescolare accuratamente.
Nota: Oligo è presente in circa un 12 volte eccesso molare sopra l'estremità di λ-DNA complementare. - Riscaldare la miscela di oligo/λ-DNA a 65 ° C per 60 s.
- Raffreddare lentamente la miscela a temperatura ambiente.
Nota: Questo passaggio consente l'oligo tempri la fine di λ-DNA complementare. - Mettere il composto sul ghiaccio. 11 µ l di tampone di reazione di T4 DNA ligasi (concentrazione di buffer finale 1 x). Mescolare delicatamente. Quindi aggiungere 2 µ l (800 unità) dell'enzima ligasi del DNA T4. Mescolare delicatamente.
- Incubare la miscela per 2 h a 16 ° C o una notte a 4 ° C.
- Purificare il prodotto utilizzando tubi filtro centrifugo con un limite di peso molecolare nominale di 100 kDa. In particolare, trasferire la miscela di passaggio 1,9 in un filtro centrifugo provetta e centrifugare a 14.000 x g per 5 min, lavare due volte con 400 µ l di tampone di TE e raccogliere il prodotto purificato.
Nota: Il come-purificato biotina-λ-DNAs nel buffer di TE sono stabili a-20 ° C fino ad un anno.
2. Vetrino coprioggetti funzionalizzazione
Nota: lamelle di vetro sono funzionalizzate reagendo con Silano-PEG-biotina. Questo protocollo di reazione di uno stadio è più semplice e più affidabile nella nostra esperienza che il protocollo di reazione standard in due fasi 20. Vetrino coprioggetti funzionalizzazione con Silano-PEG-biotina crea siti di legame per streptavidina e minimizza il DNA non specifico e adsorbimento di proteine sulla superficie del vetrino coprioggetti.
- Sonicate cinque lamelle di n ° 1 in etanolo al 95% all'interno di una colorazione jar per 10 minuti e poi sciacquare con acqua ultrapura per tre volte.
Nota: Il coprioggetto quinto fornisce un ricambio in caso di rottura. - Riempire la vaschetta di colorazione con 1m KOH, trattare con ultrasuoni per 10 minuti e poi sciacquare con acqua ultrapura tre volte.
- Ripetere due volte il ciclo di 2.1-2.2.
- Asciugare i vetrini coprioggetti sotto flusso di gas pulito e asciutto N 2.
- Ulteriori pulire ed asciugare i vetrini coprioggetti applicando il trattamento al plasma aria a pressione mTorr 900 per 5 min
- Incubare i vetrini coprioggetti con 25 mg/mL Silano-peg-biotina disciolta in etanolo al 95% a temperatura ambiente per 2 h. specificamente, 50 µ l di soluzione di silano-peg-biotina tra due vetrini coprioggetti pulito e asciutti a sandwich e incubare il vetrino coprioggetto " panini " all'interno di una casella di punta della pipetta chiuso con circa 10 mL di acqua nella parte inferiore (non a contatto con i coprioggetti) per minimizzare l'evaporazione del solvente.
- Lavare via in eccesso PEG molecole con acqua ultrapura e a secco il PEG rivestito coprioggetti sotto pulire a secco flusso di gas di 2 N.
Nota: I coprioggetti funzionalizzati possono essere conservati fino a tre giorni in condizioni ambientali.
3. Costruzione di cella di flusso
Nota: le cellule di flusso sono costruite da interposizione di un nastro biadesivo con canali pre-tagliati tra un piolo funzionalizzati vetrino coprioggetto e una lastra PDMS contenente fori di entrata e di uscita. Canali multipli sono integrati per cella di flusso.
- Canali di flusso in un software CAD di progettazione e tagliare i canali (larghezza, profondità e lunghezza di ogni canali sono 1, 0,13 e 12 mm, rispettivamente) su un nastro biadesivo utilizzando una fresa di nastro (in genere otto canali sono integrati per cella di flusso). Rimuovere residui di nastro per formare i canali di flusso.
- Per produrre lastre PDMS, mescolare bene 45 g di PDMS con 5 ml di reagente di reticolazione (abbastanza per aver reso dodici 5-mm spessore lastre PMD che possono essere immagazzinate a tempo indeterminato in condizioni ambientali) utilizzando un mixer, versare il composto in due capsule di Petri 10cm e lasciare il piatti all'interno di una camera a vuoto fino a quando essenzialmente tutte le bolle d'aria sono andati (manualmente rimuovere le bolle d'aria se permangono quando i piatti vengono rimossi dalla camera a vuoto). Poi trasferire i piatti in un forno a 80 ° C fino a quando solidifica PDMS (circa 2 h).
- Tagliare una lastra PDMS che corrisponde alle dimensioni del nastro biadesivo con canali pre-tagliati. Pellicola protezione one Peel off il nastro biadesivo e aderire la pellicola ad una faccia piana della lastra PDMS. Perforare i fori di ingresso ed uscita sulla lastra PDMS utilizzando una perforatrice di biopsia con un ago di calibro 23.
- Staccare la pellicola di protezione seconda il nastro biadesivo e far aderire l'Assemblea di PDMS-nastro alla superficie funzionalizzata del coprivetrino (assicurarsi che il vetrino coprioggetto è piatto. Vedere una foto di una cella di flusso completamente assemblato in Figura 1a).
4. TIRF Imaging
Nota: biotina-λ-DNAs sono legati ad una superficie del canale di flusso e flusso laminare viene applicato al flusso allungare le molecole di DNA ( Figura 1b). La > 80% allungato servire di molecole di DNA come modelli spazialmente estesi per osservare l'attività di associazione e trasporto di molecole fluorescente contrassegnati. Le traiettorie di singole molecole vengono rilevate da formazione immagine di TIRF time-lapse ( Figura 1C & e).
- Fix la cella di flusso su un microscopio fase e carico pre-degassato vuoto buffer (fosfato di sodio di 10 mM, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 millimetri di etanolo, glicerolo al 5% (v/v), 0,01% di Tween-20, 1% (v/v) β-mercaptoetanolo, pH 7.4), 0,2 mg/mL soluzione di streptavidina, 1 mg / mL di soluzione di albumina di siero bovino (BSA) e soluzione di biotina-λ-DNA pM 100 in quattro bacini che ciascuno hanno una tubazione di Tygon collegato ad un valore di solenoide e un altro di Tygon collegato a una tubazione di SBIRCIATA da manicotto la tubazione di Tygon sopra il tubo (più piccolo PEEK impedisce il riflusso dei reagenti). Degassare piccoli volumi di tampone di esposizione durante la notte a vuoto o più breve esposizione al vuoto di mescolando (finché le bolle non sono più visibili).
- Inserire la tubazione di SBIRCIATA del serbatoio vuoto tampone nel foro di un ingresso di cella di flusso. Primo canale di fluire nel buffer vuoto e inserire tre altri tubi di SBIRCIATA nei fori di aspirazione la pressione dell'aria guidato flusso di ciascun reagente è controllata da valvole a solenoide e completamente automatizzata tramite uno script di computer. Fare attenzione a non indurre la formazione di bolle di aria nel canale.
- Collegare la tubazione di Tygon con una tubazione di SBIRCIATA breve dal foro di uscita di un contenitore per rifiuti. La tubazione di SBIRCIATA breve presso l'outlet aiuta a sopprimere la formazione di bolle di aria durante l'infusione di mantenendo una pressione positiva all'interno del canale.
- Molecole di biotina-λ-DNA ad una superficie del canale di flusso di tethering.
- Flusso in soluzione di 0,2 mg/mL streptavidina, incubare per 5 minuti e poi scorrono nel buffer vuoto per lavare fuori la streptavidina unbound.
- Flusso in soluzione 1 mg/mL BSA, incubare per 1 min e quindi il flusso nel buffer vuoto per lavare fuori la BSA non associata.
Nota: BSA ulteriormente sopprime il DNA e l'esempio adsorbimento alla superficie. - Flusso in soluzione di biotina-λ-DNA pM 100, incubare per 10 minuti e poi scorrono nel buffer vuoto per lavare fuori il DNAs unbound.
Nota: Dopo che il DNA è associato alla superficie, evitare flussi rapidi per evitare di danneggiare le molecole di DNA legate.
- Per controllare la qualità del coprivetrino funzionalizzato, flusso nel DNA macchiatura tintura come Sytox arancione sotto le condizioni di analisi da utilizzare (leggi 4.6 qui sotto) e iniziare a fluorescenza imaging illuminazione di laser sotto 532 nm.
Nota: La qualità del coprivetrino funzionalizzato è in genere buona e la densità delle molecole del DNA di flusso allungato sarà elevata. È essenziale avere una densità abbastanza alta di molecole di DNA di flusso teso affinché scorrevole/1D diffusione eventi e grippaggio del DNA possono essere osservati. - Sintonia fine l'angolo TIRF per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore di immagini allungati di molecole di DNA ( Figura 1D).
- Per registrare traiettorie di singole molecole si spostano lungo il DNA, ripetere i punti 4.2-4.4 all'interno di un nuovo canale (senza DNA che macchia di tintura), quindi infondere pre-degassato sub-nanomolari fluoroforo etichettato molecole ad una portata abbastanza alto utilizzando una pompa a siringa e raccogliere immagini di fluorescenza time-lapse con un frame rate di 100 Hz.
Nota: Una portata equivalente ad un numero di Weissenberg (Wi: il prodotto adimensionale del più lungo tempo di rilassamento polimero - circa 0,2 s per λ-DNA - e la velocità di taglio - il cambiamento della velocità di flusso con la distanza dalla superficie del vetrino coprioggetto) di 500 all'interno del canale è consigliato per l'imaging di singola molecola con un frame rate di 100 Hz 21.- Raccogliere 10.000 fotogrammi in un campo di vista (FOV) per produrre un filmato e raccogliere film simili da FOVs multiple (in genere dieci) per esempio.
Nota: La densità delle singole particelle in un FOV dovrebbe essere né troppo alta - che complicare l'analisi dei dati facendo assegnazione dell'oggetto tra frame ambigui, né troppo bassi - che potrebbe condurre a bassa incidenza di eventi di singola molecola DNA. - Ottimizzare l'intensità di illuminazione in modo che molecole associati alla superficie del vetrino coprioggetto sono rapidamente foto-sbiancato per sopprimere sfondo mentre molecole diffondere sul DNA non vengono sbiancati troppo velocemente così che possono essere rilevate più lungo traiettorie.
Nota: In genere utilizziamo il densità di potenza di 200-800 W/cm 2 del FOV.
- Raccogliere 10.000 fotogrammi in un campo di vista (FOV) per produrre un filmato e raccogliere film simili da FOVs multiple (in genere dieci) per esempio.
- Alla fine del passaggio 4.6, infondere DNA che macchia di tintura per confermare che le molecole di DNA possono essere ancora flusso-allungato.
- Eseguire entrambi i campioni di controllo positivi e negativi.
Nota: Un buon controllo positivo è un tetrapeptide, tetrametilrodamina (TMR)-KRRR (TMR è accoppiato ad ammina N-terminale) che ha una media costante di diffusione 1D di 10,5 ± 0,7 (errore standard) M (bp 2/s) a pH neutro 11. Un buon controllo negativo è quello di misurare campioni etichettati di interesse nel tampone in un canale che non ha nessun DNA legato, dove dovrebbe essere rilevata alcuna attività di diffusione su DNA.
5. Analisi dei dati:
Nota: una singola particella personalizzata, software di monitoraggio viene utilizzata per identificare traiettorie di singole molecole diffondendo lungo DNA e stimare i costanti di diffusione. Questo software determina innanzitutto le posizioni di baricentro delle singole particelle con elevata precisione, identifica le particelle che sono bloccate sulla superficie del vetrino coprioggetto e quindi collega particelle in fotogrammi diversi per formare traiettorie time-lapse. Da queste traiettorie, si stima che le costanti di diffusione 1D.
- Per avviare l'analisi dei dati, aprire un software script (Vedi tabella dei materiali) e passare alla directory di singola particella software di monitoraggio. Aprire lo script chiamato " largedataprocess3.m ". Un importante parametro da definire è il valore di soglia per il rilevamento di singola particella.
- Per determinare il valore di soglia ottimale, eseguire il " Determine_threshold_value.m " script. Questo script indicherà come il valore di soglia colpisce rilevamento di singola particella. Dopo aver determinato il valore di soglia ottimale, eseguire il " largedataprocess3.m " script.
- Dopo il completamento della singola particella monitoraggio analisi, filtrare le traiettorie crude eseguendo il " Trajectory_filtering.m " script. Un'interfaccia di utente grafica (GUI) è costruito in per visualizzare il passaggio filtrante. Pannello
- su the GUI, impostare lo spostamento minimo lungo DNA, MinXDisp, 2 pixel impostare lo spostamento massimo trasversale al DNA, MaxYDisp, a 2 pixel; impostare il numero minimo di fotogrammi, minFrames, a 10; impostare il numero minimo di Stati di tripletto, minTriplets, 10; impostare la costante minima diffusione lungo il DNA, D_par, 0; impostare la costante di diffusione stimata massima trasversale al DNA, D_trans, 10m (bp 2) S -1; impostare il parametro statistico minimal, Chi stat 2, a -5; impostare il rapporto minimo di spostamento lungo DNA su quello trasversale al DNA, MinX/Y, 2.
Nota: Tutte le traiettorie crude che passano questi parametri di filtraggio sono elencate nella tabella 1, e quelli che non sono elencati nella tabella 3. - Clic su una traiettoria numero nella tabella 1, la traiettoria sarà spostata in grafica 1 & 2. Fare clic sul " gioco " pulsante per riprodurre le immagini raw di fluorescenza. Fare clic sulla " Add_to_Table2 " per identificare la traiettoria come una singola molecola scorrevole traiettoria. Alla fine, tutte le traiettorie aggiungere a Table2 verranno salvate quando si chiude il GUI.
- Per calcolare le costanti di media diffusione, eseguire lo script " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". La costante di diffusione medio è stimato dal set di traiettorie che hanno superato tutti i passaggi filtranti e stato aggiunto alla tabella 2.
Representative Results
La figura 2a Mostra le traiettorie rilevate di pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B è coniugato al residuo di cisteina) molecole diffonde sul DNA in 2 mM NaCl tampone a pH 6,5. La diffusione del pVIc è bi-direzionale e guidato dall'ambiente energia termica. Da queste traiettorie, le costanti di diffusione 1D (D1 valori) sono stimate per ogni traiettoria (Vedi l'istogramma in Figura 2b). Il valore di D1 di questo coniugato pVIc medio è calcolato per essere 22,2 ± 0,9 (errore standard) M (bp2/s) da una media di ogni valore di D1 attraverso traiettorie ponderate per il numero di chiamate consecutive posizione tripletto contenute in ogni traiettoria.
Figura 1 : Apparecchi per il rilevamento di movimento delle singole molecole lungo DNA.
a) un PDMS otto canali chip microfluidico aderito a un coprioggetto funzionalizzato a cui il DNA può essere legato (con moneta del quarto USA per scala); b) flusso schematico di zoom cellulare mostrando le molecole di DNA-λ flusso-allungato; c) schema del sistema di microscopio e flusso TIRF per l'allungamento del DNA; d) immagine TIRF di un flusso-allungato λ-DNA; e) immagine TIRF di pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B è coniugato al residuo di cisteina) molecole legate a un flusso-allungato λ-DNA. Questa figura è stata modificata con autorizzazione2,12. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Diffusione unidimensionale di pVIc (GVQSLKRRRCF) lungo DNA.
a). diffusione di pVIc lungo flusso teso λ-DNAs (137 traiettorie) in 2 mM NaCl di tampone a pH 6,5. x (t) e y (t) sono gli spostamenti lungo e trasversale a λ-DNA, rispettivamente. Linee orizzontali tratteggiate indicano punti mancanti derivanti dalla tintura lampeggiante. b). istogramma della costante diffusione, D1 per pVIc diffusione lungo λ-DNAs. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Quando si passa dal protocollo tradizionale in due fasi coprioggetto funzionalizzazione reazione a un protocollo di reazione di uno stadio, abbiamo notato che l'affidabilità del vetrino coprioggetto funzionalizzazione è migliorato significativamente. Come il tempo totale di hands-on per la preparazione del vetrino coprioggetto è meno di trenta minuti, si consiglia di preparare vetrini coprioggetti freschi imaging di singola molecola ogni giorno è prevista. Per minimizzare il deterioramento di silano-PEG-biotina, il reagente deve essere aliquotati e conservati sotto gas secco di2 N-20 ° c al momento del ricevimento. Qui non usiamo PEG molecole che producono -COO– o -CH3 terminal gruppi che sono stati utilizzati nel passato20. Le cariche negative dei gruppi -COO– e i gruppi di3 -CH idrofobi sono state utilizzate per impedire l'adsorbimento di molecole di DNA e proteine specifici campioni alla superficie, rispettivamente. Osserviamo adsorbimento superficiale molto bassa di campioni di piccolo peptide sulla superficie completamente terminato di biotina PEG, mentre Silano-PEG-COOH e/o Silano-PEG-CH3 potrebbe essere utile per le analisi di alcuni campioni di proteina o quando le condizioni del test (ad esempio pH < 7.5) promuovere interazioni DNA-superficie.
Il passaggio da cellule di flusso scorrevole di vetro al flusso di PDMS cellule accelera la costruzione di cella di flusso e permette una facile integrazione di canali multipli. Progettiamo spesso otto canali per ogni cella di flusso per consentire otto esperimenti indipendenti al vetrino coprioggetti funzionalizzati. Per aumentare ulteriormente la velocità effettiva per vetrino coprioggetti, potrebbe essere utilizzato un numero anche maggiore di canali micro-fabbricato.
Si consiglia di evitare la formazione di bolle di aria all'interno del canale in qualsiasi momento dopo il riempimento iniziale. Solitamente, le bolle d'aria non causano perdita di DNAs tethered (anche se questo è possibile), ma piuttosto interrompere il flusso e possibilmente causare DNAs a bastone per il vetrino coprioggetti. Buffer di degasaggio e l'aggiunta di tensioattivo piccole quantità sono in genere efficace nel prevenire la formazione di bolle all'interno del canale di flusso e tubi. In casi dove le bolle d'aria vengono introdotti ai tubi, provano a scovare le bolle sotto un flusso lento e assicurarsi che essi non passano attraverso la regione dove DNAs sono legati.
Un software di analisi dati snella ed efficiente è fondamentale, a causa della quantità enorme di dati generati. Solitamente raccogliamo 700.000 immagini ad alta risoluzione da misurazioni su cella di un flusso, che possa essere elaborato utilizzando la nostra singola particella personalizzata software di monitoraggio all'interno di un giorno su un computer desktop con un quad core processore e 32 Gb di memoria. Il tasso di falsi positivi di rilevazione traiettorie diffusione 1D dal software (punto 5.5) è dipendente dal campione e può essere molto basso, dato che: 1) la densità di singole particelle in FOV è sufficientemente bassa affinché ci sia ambiguità piccolo collegamento particelle tra fotogrammi ( campioni della proteina, in generale, sono più inclini all'adsorbimento non specifico per il vetrino coprioggetto di campioni del peptide, e così, il buffer e la densità di potenza per ogni proteina del campione deve essere ottimizzato); 2) il rapporto segnale-rumore di singole particelle è abbastanza alto in modo che la probabilità di falso-identificazione delle particelle è bassa. Ancora, il software può commettere errori occasionali, e si consiglia di ispezione manuale dei dati utilizzando la GUI fornita per valutare le prestazioni del software. In un'applicazione particolarmente sensibile alla rilevazione di falsi positivi traiettoria, parametri di processo, compreso il valore di soglia, minFrames, minTriplets e Chi2stat possono essere impostati più rigorosamente a costo minore sensibilità per l'associazione vera eventi e potenzialmente maggiore bias statistici nella identificazione di traiettoria. Qui condividiamo e descrivere la nostra singola particella software con la speranza di aiutare standardizzare i metodi di analisi di dati e stimolare la discussione sulle procedure consigliate di monitoraggio.
Nel nostro protocollo, che richiede flusso continuo durante imaging per mantenere lo stato allungato il modello di molecole di DNA, il flusso del fluido potrebbe polarizzare il trasporto di alcune proteine lungo modelli di DNA se si diffondono da un meccanismo di salto o se l'idrodinamica raggio il fluoroforo con etichettato è grande22,23. Mentre tale distorsione possa essere misurati e corretti nella maggior parte dei set di dati, il trasporto delle proteine etichettate con un fluoroforo piccolo e diffusione di un meccanismo di scorrimento non è in genere distorte in misura rilevabile di flusso2,4, 24. In particolare, l'impatto della velocità del flusso per il trasporto di proteine lungo del DNA è stato usato per studiare i meccanismi della proteina diffondendo lungo DNA23. A strettamente correlati approccio alternativo che permette di eseguire misure in assenza di flusso utilizza modelli del DNA con biotina a entrambi termini che sono allungati transitoriamente in flusso e vincolato da entrambe le estremità per il coprioggetto tali che le molecole di DNA rimangono in un configurazione estesa quando il flusso è spento25,26,27,28. L'approccio di doppio-tether ha il vantaggio di consentire esperimenti di trasporto privo di flusso ma richiede la modifica di entrambe le estremità delle molecole del DNA modello, controllo di flusso attenti durante il tethering e che caratterizzano le distanze tra i due siti legati. Inoltre, deve essere valutato l'impatto delle tensioni eterogenee e dinamiche conformazionali del DNA attraverso molecole di DNA nel foglio di analisi di singola molecola.
Complessivamente, oltre a studiare la diffusione di 1D delle molecole lungo il DNA, il test come da bilancio singola molecola possa beneficiare molti in vitro biochimiche e studi biofisici a livello di singola molecola, compreso il DNA bersaglio processi di ricerca di proteine, attività enzimatiche sul DNA e altro.
Risoluzione dei problemi
Problema 1: I canali di flusso una perdita.
Soluzione: in primo luogo, assicurarsi che che il design dei canali di flusso consente margine di almeno 1,5 mm per la sigillatura intorno e tra i canali; e poi, durante il montaggio della cella di flusso, assicurarsi che le superfici di contatto tra il vetrino coprioggetto, il nastro biadesivo e la soletta PDMS sono piana, asciutta e priva di detriti, che la pressione è applicata per formare la guarnizione è divisa, e che l'operazione di sigillatura è eseguita a temperatura ambiente.
Problema 2: La densità di DNAs tethered è troppo bassa.
Soluzione: Questo problema si pone quando l'efficienza di funzionalizzazione di PEG è bassa o le molecole del DNA non sono funzionalizzate con biotina. Dalla nostra esperienza, la densità del DNA legato deve essere elevata per > 90% di lamelle preparati freschi o immagazzinato correttamente reagente Silano-PEG-biotina. Nei casi quando la densità del DNA legato è bassa con un batch di comprovata di biotina-λ-DNA, prova d'amplificazione concentrazioni di silano-PEG-biotina durante PEG funzionalizzazione e concentrazioni di streptavidina e biotina-λ-DNA durante la legatura del DNA. Se il problema persiste, sostituire i reagenti PEG e streptavidina.
Problema 3: DNAs stick per il vetrino coprioggetto und non può essere allungato da flusso.
Soluzione: Questo problema può verificarsi anche quando l'efficienza di funzionalizzazione di PEG è bassa ed è aggravato da pH basso dosaggio. Prova che scorre in più BSA o alzando il pH (ad esempio a 8.0) per contribuire a sopprimere l'adsorbimento di DNA alla superficie (punto 4.3.2). Se adsorbimento di DNA è un problema persistente in una condizione di particolare test, prova compreso fino a 90% Silano-PEG-COOH durante PEG funzionalizzazione.
Note di analisi di dati:
Utilizziamo personalizzata singola particella software di monitoraggio per identificare traiettorie di singole molecole di diffusione lungo il DNA, da cui loro costanti di diffusione 1D, D1 sono stimati. Per migliorare l'analisi dei dati, abbiamo implementato l' algoritmo di simmetria radiale18 per la localizzazione di particelle e la covarianza-based estimator19 per stimare le costanti diffusione 1D, velocizzato notevolmente l'analisi dei dati senza compromettere precisione. Abbiamo precedentemente validato il software personalizzato analizzando dati simulati11. I passaggi principali sono descritti di seguito.
Identificazione di particelle:
Questo passaggio è per il rilevamento e segmentazione particelle - macchie di diffrazione limitata - da sfondo. In primo luogo, spazialmente passa-banda filtrare le immagini per migliorare il segnale delle particelle nel 3-5 intervallo di pixel (che corrisponde alla dimensione della funzione punto di diffusione sul nostro sistema) e quindi basato sull'intensità di soglia (vedere script: spt2_SD_sandbox.m).
Assegnazione di centroide
Segmentazione dell'immagine, si localizza solo molecole a livello di pixel risoluzione spaziale. Per localizzare le molecole con una precisione molto maggiore, è possibile impiegare la simmetria radiale super risoluzione algoritmo18 immagini filtrata come sopra. (Questo metodo si basa su un calcolo analitico e così notevolmente riduce il carico computazionale rispetto ad altri metodi popolare ad alta precisione come una giunzione gaussiana 2D (vedere script: spt2_SD_sandbox.m).)
Particella di rilevamento:
Per tenere traccia la traiettoria di una particella attraverso il tempo, dobbiamo ri-individuare le stesse particelle che si muovono tra i fotogrammi. Consideriamo le fasi di iniziazione, lampeggiante e terminazione di essere componenti di una traiettoria. Abbiamo vincolare sollevatore di particelle in frame correnti a quelli visualizzati nei frame precedenti dallo spostamento massimo consentito per ogni frame. In casi dove sono possibili collegamenti multipli, viene utilizzato l'algoritmo di Jonker-Volgenant per produrre set di collegamento ottimale a livello globale (vedere script: traceTraj4_kx.3.m).
Stima di D1:
Per stimare i valori D1 da traiettorie, usiamo la covarianza-Based Estimator (CVE)19. Basato su un calcolo analitico, questo metodo è più computazionalmente efficiente e statisticamente rigorosa rispetto altri metodi come la regressione degli spostamenti quadrati medi comunemente usati (vedere script: runspt5_SD.m).
Traiettoria di filtraggio:
Alcune traiettorie contengono artefatti quali sollevatore a molecole di superficie associato e devono essere rimossi. Abbiamo implementato diverse funzionalità come minimo spostamento parallelo al DNA, massimo spostamento trasversa al DNA, lunghezza minima di traiettoria, numero minimo di posizioni tripletta consecutiva rilevato e il Punteggio di probabilità minima (Vedi Xiong et al11 per definizione) che possono essere filtrati per isolare un set minimamente distorto delle traiettorie probabile rappresentare molecole diffondere sul DNA (vedere script: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Il Broad Institute può decidere di domande di brevetto di file che includono aspetti del lavoro qui presentato.
Acknowledgments
Ringraziamo Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick ed Evangelos Gatzogiannis per assistenza con l'installazione iniziale di strumentazione e test. Ringraziamo ulteriormente Tony Kulesa significativo aiuto scrivendo e valutare la singola particella su misura, software di monitoraggio. Questo lavoro è stato sostenuto dal finanziamento di avvio e un premio alla carriera all'interfaccia scientifica (per PCB) della Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
