Summary
Detta protokoll visar en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flöde-stretching-analys för att studera endimensionell (1D) diffusionshastighet för molekyler längs DNA.
Abstract
Vi beskriver en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flöde-stretching-analys för att studera 1D diffusionshastighet för molekyler längs DNA. I denna analys, glas coverslips är functionalized i en one-step reaktion med silan-PEG-biotin. Flödesceller är uppbyggda av sandwiching en tejp med färdigskurna kanaler mellan ett functionalized täckglas och en PDMS platta innehållande inlopp och utlopp hål. Flera kanaler är integrerade i ett flöde cell och flödet av reagenser till varje kanal kan vara helt automatiserad, vilket avsevärt ökar assay genomströmning och minskar hands-on tid per analys. Inuti varje kanal, biotin-λ-DNAs är orörlig på ytan och ett laminärt flöde används för att flödet-stretch de utsedda nationella myndigheterna. DNA-molekylerna sträcks till > 80% av sin kontur längd och servera som rumsligt extended mallar för att studera aktiviteten bindande och transport av fluorescently märkta molekyler. Trajectoriesen av enstaka molekyler spåras av time-lapse totala inre reflektion fluorescens (Frida) imaging. RAW-bilder analyseras med strömlinjeformad anpassade enda partikel spårning programvara automatiskt identifiera banor av enstaka molekyler sprida längs DNA och uppskatta sin 1D diffusion konstanter.
Introduction
Långvariga problem i biologi är hur endogena proteiner som agerar på specifika platser i genomet kan lokalisera deras DNA mål tillräckligt snabbt för organismen att överleva och effektivt bemöta sin omgivning. Studier under de senaste fyrtio åren föreslagit och i hög grad stöd för hypotesen att kinetiken för DNA rikta Sök genom ett protein kan påskyndas genom gjord lättare diffusion där proteinet växlar mellan 3D diffusion i bulk och 1D diffusion (inklusive glidande och hoppande processer) längs DNA1. Det är nu känt att många proteiner involverade i genreglering, nukleinsyra metabolism och andra processer klarar av glidande på DNA2,3,4,5,6,7 ,8,9. Dessutom rapporterade nyare studier att även små peptider kan binda till och skjut på DNA, med förmåga att transportera en Last. exempelvis en proteinmolekyl eller PCR primer, längs DNA10,11,12,13,14.
De senaste 15 åren, har enda molekyl flöde-stretching analysen använts allmänt att studera bindande och diffusionshastighet för molekyler längs DNA2,15,16. I denna typ av analys, immobilizeds biotinylerade dubbelsträngat DNA-molekyler på ytan och en laminär tillämpas flöde sträcka DNA. Den > 80% sträckt DNAs serve som rumsligt utökade mallar för att studera bindande och transport aktivitet av molekyler märkta med fluorophores där trajectoriesen av enstaka molekyler längs DNA spåras av time-lapse fluorescens imaging. I vårt genomförande, optimerad för reproducerbarhet och användarvänlighet, denna analys består av fem viktiga steg: beredning av biotin-λ-DNA, täckglas funktionalisering, flöde cell konstruktion, fluorescens imaging och dataanalys. I föregående protokoll17, glas coverslips var functionalized av första reagera med (3-Aminopropyl) triethoxysilane (APTES) och sedan med amine-reaktivt polyetylenglykol (PEG) reagens (t.ex. NHS-PEG-biotin) att bilda en PEG-lager som motstår ospecifik adsorption av assay komponenter till täckglas ytan. Kvaliteten på functionalized coverslips berodde till stor del på kvaliteten på PEG reagenser och reaktion villkor vid varje steg. Våra protokollet beskriver en förenklad funktionalisering protokoll och multiplex flöde cell konstruktion som kräver inget flytande lim eller härdningstid i dag flöde celler är monterade. Vi beskriver också en strömlinjeformad och robust data analys förfarandet11 som eliminerar processorkrävande regression steg genom att tillämpa en radiell symmetri metod för centroiden lokalisering18 och en kovarians-baserade diffusion konstant estimator19.
Här redovisar vi en enkel, robust och hög genomströmning enda molekyl flow stretching analysens genomförande med signifikanta förbättringar gjorts i täckglas funktionalisering, flöde cell konstruktion och analys av data. Särskilt utvecklade vi ett one-step täckglas funktionalisering protokoll, där rena torra coverslips reagerar direkt med silan-PEG-biotin. Detta protokoll förenklar täckglas beredning och förbättrar tillförlitligheten i kvaliteten på functionalized ytor jämfört med standard two-step reaktion protokollet. Vi beskriver användningen av så-functionalized coverslips med flerkanaligt PDMS flödesceller som aktiverar robust slang anslutningar göras utan lim. Dessa flödesceller ytterligare inkluderar flera datorstyrda vikar för varje flöde kammare som möjliggör automatiserad reagens flödet att minska hands-on tid under installationen och ökad assay genomströmning.
Protocol
1. beredning av biotin-λ-DNA
Obs: Biotin-λ-DNA molekyler förbereds av ligating en biotin-märkta oligonukleotiden, 5 '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotin - 3 ' till Λ-DNA molekyler 20.
- Förbered 0,1 mM biotin märkt oligo i TE buffert.
- Värme 0,5 mg/mL λ-DNA lager vid 65 ° C för 60 s, och steget in i våt is rätt bort.
Obs: Snabb kylning kylning minskar λ-DNA concatemerization. - Pipettera 100 µL av λ-DNA lösningen i en mikrocentrifug rör.
- Add 1 µL av den 0,1 mM oligo in 9 µL av TE buffert.
- Add 2 µL av oligo lösningen till mikrocentrifug röret som innehåller λ-DNA. Blanda omsorgsfullt.
Obs: Oligo är närvarande i ungefärligt en 12-fold molar överskott över kompletterande λ-DNA slutet. - Värm λ-DNA/oligo blandningen vid 65 ° C för 60 s.
- Långsamt svalna blandningen rumstemperatur.
Obs: Detta steg kan oligo att glödga till kompletterande λ-DNA slutet. - Placera blandningen på isen. Tillsätt 11 µL av T4 DNA-ligase reaktion buffert (slutligt buffertvärde koncentration 1 x). Blanda försiktigt. Tillsätt sedan 2 µL (800 enheter) av T4 DNA-ligase enzymet. Blanda försiktigt.
- Inkubera blandningen för 2 h vid 16 ° C eller över natten vid 4 ° C.
- Rena produkten med centrifugal filter tubes med en nominell molekylvikt på högst 100 kDa. Specifikt, överför steg 1,9 blandningen till en centrifugal filterröret och centrifugera vid 14 000 x g under 5 minuter, tvätta med 400 µL TE buffert två gånger och samla renade produkten.
Obs: De som-renat biotin-λ-utsedda nationella myndigheterna i TE buffert är stabila vid-20 ° C i upp till ett år.
2. Täckglas funktionalisering
Obs: glas coverslips är functionalized genom att reagera med silan-PEG-biotin. Detta one-step reaktion protokoll är enklare och mer tillförlitlig vår erfarenhet än standard two-step reaktion protokoll 20. Täckglas funktionalisering med silan-PEG-biotin skapar bindningsställen för streptividin och minimerar ospecifik DNA och protein adsorption till täckglas ytan.
- Sonicate fem nr 1 coverslips i 95% etanol inuti en färgning jar i 10 min och skölj sedan med ultrarent vatten för tre gånger.
Obs: Det femte täckglaset ger reserv om går sönder. - Fyll färgning burken med 1 M KOH, Sonikera i 10 min och skölj sedan med ultrarent vatten tre gånger.
- Upprepa 2.1-2.2 cykeln två gånger.
- Torka coverslips under rena torra N 2 gasflödet.
- Ytterligare rengör och torka coverslips genom att tillämpa luftbehandling plasma vid 900 mTorr tryck för 5 min.
- Inkubera coverslips med 25 mg/mL silan-peg-biotin upplöst i 95% etanol i rumstemperatur i 2 h. specifikt, smörgås 50 µL silan-peg-biotin lösning mellan två rena torra coverslips och inkubera i täckglas " smörgåsar " inuti en stängd pipett tip låda med ca 10 mL vatten i botten (inte i kontakt med coverslips) att minimera lösningsmedel avdunstning.
- Tvätta bort överflödig PEG molekyler med ultrarent vatten och torka PEG belagda coverslips under ren torr N 2 gasflödet.
Obs: Den functionalized coverslips kan förvaras upp till tre dagar under omgivningsförhållanden.
3. Flöde cell konstruktion
Obs: flödesceller är uppbyggda av sandwiching en dubbel-tejp med färdigskurna kanaler mellan en PEG functionalized täckglas och en PDMS platta innehållande inlopp och utlopp hål. Flera kanaler är integrerade per flöde cell.
- Utforma flödet kanaler i ett CAD-program och skära kanalerna (bredd, djup och längd på varje kanaler är 1, 0,13 och 12 mm, respektive) på en dubbel-tejp med hjälp av en fräs med tejp (vanligtvis åtta kanaler är integrerade per flöde cell). Ta bort tejp rester för att bilda de flöde kanalerna.
- Att göra PDMS plattor, grundligt blanda 45 g av PDMS med 5 g av crosslinking reagens (nog för att göra tolv 5-mm tjock PMDS plattor som kan lagras på obestämd tid under omgivningsförhållanden) använder en mixer, Häll blandningen i två 10 cm petriskålar, och lämna den rätter i en vakuumkammare tills i huvudsak alla luftbubblor är borta (manuellt ta bort luftbubblor om någon finns kvar när rätterna tas bort från vakuumkammare). Sedan överföra rätterna till 80 ° C ugn tills PDMS stelnar (ca 2 h).
- Klippa ut en PDMS-platta som matchar storleken på den dubbel-tejpen med färdigskurna kanaler. Skal en skyddsfilm av den dubbel-tejpen och följa filmen till ett platt ansikte av PDMS stålämnen. Punch utlopp och inlopp hålen på PDMS plattan med en biopsi-hålslagaren med en 23 Gauge kanyl.
- Skala den andra skydd filmen av dubbel-självhäftande tejpen och följa PDMS-tape församlingen täckglaset functionalized yta (se till att täckglaset är platt. Se en bild av en färdigmonterad flöde cell i figur 1a).
4. Frida Imaging
Obs: Biotin-λ-DNAs är bundna till en flöde kanal yta och laminär tillämpas flöde sträcka DNA-molekylerna ( figur 1b). Den > 80% sträckt DNA molekyler serve som rumsligt utökade mallar för att observera aktiviteten bindande och transport av fluorescently märkta molekyler. Trajectoriesen av enstaka molekyler spåras av time-lapse Frida imaging ( figur 1 c & e).
- Fix cellen flöde på en Mikroskop scenen och belastning före avgasade tomma buffert (10 mM natriumfosfat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM etanol, 5% (v/v) glycerol, 0.01% Tween-20, 1% (v/v) β-merkaptoetanol, pH 7,4), 0,2 mg/mL streptividin lösning, 1 mg / mL bovint serumalbumin (BSA) lösning och 100 pM biotin-λ-DNA lösning till fyra reservoarer att varje har en Tygon slangen ansluten till en magnetventil värde och en annan Tygon slangen ansluten till en PEEK slangar av sleeving Tygon slangen över den mindre PEEK slangar ( förhindrar återflödet av reagenser). Degas små volymer av buffert av övernattning exponering vakuum eller kortare exponering för vakuum med omrörning (tills bubblor syns inte längre).
- Infoga PEEK slangen av Tom buffert reservoaren i en inloppshål av cellen flöde. Prime kanalen genom att flöda i tomma buffert, och infoga tre andra PEEK slangar i inloppshålen lufttrycket driven flödet av varje reagens styrs av magnetventiler och helt automatiserad via en dator skript. Var noga med att inte framkalla luft bubbla bildas i kanalen.
- Ansluta en Tygon slangar med en kort titt slang från outlet hålet till en avfallsbehållare. Kort titt slangen vid utloppet hjälper undertrycka luft bubbla bildandet under infusion genom att upprätthålla positiva trycket inuti kanalen.
- Tjudra biotin-λ-DNA molekyler till en flöde kanal yta.
- Flöde i 0,2 mg/mL streptividin lösning, inkubera i 5 min och sedan flyta i tomma buffert att tvätta ur den obundna streptividin.
- Flöde i 1 mg/mL BSA lösning, inkubera i 1 min och sedan flyta i tomma buffert att tvätta ur obundna BSA.
Obs: BSA ytterligare dämpar DNA och prov adsorption till ytbehandla. - Flöde i 100 pM biotin-λ-DNA lösning, inkubera i 10 min och sedan flyta i tomma buffert att tvätta ur de obundna DNAs.
Obs: Efter DNA binds till ytan, Undvik snabba flöden för att förhindra skador på uppbundna DNA-molekylerna.
- Att kontrollera kvaliteten på de functionalized täckglaset, flöde i DNA färgning dye såsom Sytox orange enligt villkor som analysen ska användas (Läs 4.6 nedan), och starta fluorescens imaging under 532 nm laserbestrålning.
Obs: Kvaliteten på det functionalized täckglaset är vanligtvis bra och tätheten av flöde sträckt DNA-molekyler kommer att vara hög. Det är viktigt att ha en tillräckligt hög densitet flöde sträckt DNA-molekyler så att DNA-bindning och glidande / 1D diffusion händelser kan observeras. - Fininställa Frida vinkeln att uppnå bästa signal-brus-förhållande av bilder av sträckt DNA-molekyler ( figur 1 d).
- Att registrera banor av enstaka molekyler rör sig längs DNA, upprepa steg 4.2-4.4 släpper en ny kanal (utan DNA färgning färgämne), sedan ingjuta pre avgasade sub-nanomolar fluorophore märkta molekyler med en tillräckligt hög flödeshastighet genom att använda en sprutpumpen och samla in time-lapse fluorescens bilder med en bildfrekvens på 100 Hz.
Obs: Ett flöde motsvarande Weissenberg flera (Wi: dimensionslös produkten av den längsta polymer avkoppling tid - cirka 0,2 s för λ-DNA- och andelen skjuvning - förändringen i flödeshastigheten med avstånd från täckglas ytan) på 500 släpper den kanal rekommenderas för enda molekyl imaging med en bildfrekvens på 100 Hz 21.- Samla 10.000 ramar i en Field-Of-View (FOV) att producera en film och samla liknande filmer från flera (vanligtvis tio) FOVs per prov.
Obs: Tätheten av enstaka partiklar i en FOV bör varken vara för högt - som kommer att komplicera dataanalys genom att göra objektet uppdrag över ramar tvetydiga, inte heller för lågt - vilket kan leda till låg förekomst av enda molekyl händelser på DNA. - Optimera belysning intensitet så att molekyler bundna till täckglas ytan snabbt foto blekt att undertrycka bakgrund medan molekyler sprida på DNA inte är blekt för snabbt så att längre banor kan upptäckas.
Obs: Vi använder vanligtvis 200-800 W/cm 2 driva täthet i FOV.
- Samla 10.000 ramar i en Field-Of-View (FOV) att producera en film och samla liknande filmer från flera (vanligtvis tio) FOVs per prov.
- På slutet av steg 4,6, ingjuta DNA färgning färgämne för att bekräfta att DNA-molekyler kan fortfarande flöde-sträckt.
- Kör både positiva och negativa kontrollprover.
Obs: En bra positiv kontroll är en tetrapeptid, tetrametylrodamin (TMR)-KRRR (TMR är kopplad till den N-terminala aminen) som har en genomsnittlig 1D diffusion konstant 10,5 ± 0,7 (standardfel) M (bp 2/s) vid neutralt pH 11. En bra negativ kontroll är att mäta märkt prover av intresse analysbuffert i en kanal som har ingen DNA uppbundna, där ingen på-DNA diffusion aktivitet bör upptäckas.
5. Dataanalys:
Obs: en anpassad enda partikel spårning programvara används för att identifiera banor av enstaka molekyler sprida längs DNA och uppskatta diffusion konstanter. Denna programvara bestämmer först centroiden positionerna för enstaka partiklar med hög noggrannhet, identifierar partiklar som fastnat på täckglas ytan och sedan länkar partiklar i olika ramar att bilda time-lapse banor. Från dessa banor, 1D diffusion konstanterna uppskattas.
- Att starta dataanalys, öppna en scripting programvara (se tabell av material) och gå till katalogen av enskild partikel spårning programvara. Öppna skriptet " largedataprocess3.m ". En viktig parameter definieras är tröskelvärdet för enskild partikel upptäckt.
- Att bestämma optimal tröskelvärdet, kör den " Determine_threshold_value.m " skript. Detta skript kommer att ange hur tröskelvärdet påverkar enda partikel upptäckt. Efter att fastställa optimala tröskelvärdet, kör den " largedataprocess3.m " script.
- Efter avslutad enda partikel spårning analys, filtrera de råa banor genom att köra den " Trajectory_filtering.m " skript. Ett grafiskt användargränssnitt (GUI) byggs i att visualisera steget filtrering.
- På the GUI panel, inställt 2 pixlar minimala förskjutningen längs DNA, MinXDisp, ange den maximala förskjutningen transverse till DNA, MaxYDisp, att 2 pixlar; ange det minimala antalet ramar, minFrames, till 10; inställt det minimala antalet stater av triplett, minTriplets, 10. ställa in konstanten minimal diffusion längs DNA, D_par, 0; Ange den maximala uppskatta diffusion konstanten tvärgående till DNA, D_trans, att 10 M (bp 2) S -1; ställa in minimal statistik parameter, Chi 2 _stat, till -5; Ange minimal förhållande för förflyttning längs DNA till det transverse till DNA, MinX/Y, 2.
Obs: Alla rå banor som passerar dessa filtrering parametrar listas i tabell 1 och de som inte listas i tabell 3. - Klicka på en bana nummer i tabell 1, banan kommer att förskjutas i grafik 1 & 2. Klicka på den " Play " knappen för att spela raw fluorescens bilderna. Klicka på den " Add_to_Table2 " att identifiera banan som en enda molekyl glidande bana. I slutändan alla banor tillsätts Table2 sparas när du stänger GUI.
- Att beräkna de genomsnittliga diffusion konstanterna, kör skriptet " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Konstanten genomsnittlig diffusion är beräknad från uppsättningen banor som har passerat alla filtrering åtgärder och lagts till i tabell 2.
Representative Results
Figur 2a visar de upptäckta banor av pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B är konjugerat med en cysteinrest) molekyler sprida på DNA i 2 mM NaCl buffert vid pH 6,5. Diffusionen av pVIc är dubbelriktad och drivs av omgivande värmeenergi. Från dessa banor, 1D diffusion konstanter (D1 värden) beräknas för varje bana (se histogram i figur 2b). Medelvärdet D1 värdet av denna pVIc konjugat beräknas vara 22,2 ± 0,9 (standard fel) M (bp2/s) av genomsnitt varje D1 värde över banor viktat efter antalet triplett sammanhängande ståndpunkt samtal som ingår i varje bana.
Figur 1 : Apparater för att spåra rörelse av enstaka molekyler längs DNA.
(a) en åtta-kanal PDMS mikroflödessystem chip följs ett functionalized täckglas som DNA kan vara uppbundna (med USA kvartalet mynt för skala); (b) flöde cell zoom Schematisk visar flöde-sträckt λ-DNA-molekyler; (c) Schematisk bild av Frida mikroskopet och flöde system för stretching DNA; (d) Frida bilden av ett flöde-sträckt λ-DNA; (e) Frida bild av pVIc-Cy3B (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B är konjugerat med en cysteinrest) molekyler bundna till en flow-sträckt λ-DNA. Denna siffra har modifierats med tillstånd2,12. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Endimensionell diffusionen av pVIc (GVQSLKRRRCF) längs DNA.
(a). diffusionen av pVIc längs flödet sträckt λ-DNAs (137 banor) i 2 mM NaCl buffert vid pH 6,5. x(t) och y(t) är förskjutningarna längs och tvärgående λ-DNA, respektive. Streckade horisontella linjer indikerar saknade poäng följd av färgämne blinkar. (b). Histogram av konstanten diffusion, D1 för pVIc sprida längs λ-DNAs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
När du byter från traditionell two-step täckglas funktionalisering reaktion protokollet till en one-step reaktion protokoll, märkte vi att tillförlitligheten för täckglas funktionalisering är betydligt bättre. Eftersom den totala hands-on tid för täckglas förberedelser är mindre än trettio min, rekommenderar vi förbereda färska coverslips varje dag enda molekyl imaging planeras. För att minimera försämringen av silan-PEG-biotin, bör reagens vara aliquoted och lagras under torra N2 gas vid-20 ° C vid mottagandet. Vi använder här inte PEG molekyler som producerar -COO– eller -CH3 terminal grupper som har använts i tidigare20. De negativa laddningarna i -COO– grupper och de hydrofoba -CH3 grupperna utnyttjades för att förhindra ospecifik adsorption av DNA-molekyler och specifikt protein prover till ytan, respektive. Vi observerar mycket låg ytan adsorption av liten peptid prover på fullt biotin-avslutad PEG ytan, medan silan-PEG-COOH eller silan-PEG-CH3 kan vara användbar för analyser av vissa protein prover eller när assay villkor (såsom pH < 7,5) främja DNA-ytan interaktioner.
Övergången från glas bild flödesceller till PDMS flöde celler påskyndar flödet cell byggandet och tillåter enkel integrering av flera kanaler. Ofta skräddarsyr vi åtta kanaler per flöde cell att aktivera åtta oberoende experiment per functionalized täckglas. För att ytterligare öka genomströmning per täckglas, användas ännu större antal mikro-fabricerade kanaler.
Det är tillrådligt att förhindra luft bubbla bildandet inuti kanalen när som helst efter första påfyllning. Vanligtvis, luftbubblor orsakar inte förlust av uppbundna DNAs (även om detta är möjligt), men snarare störa flödet och möjligen orsaka DNAs att hålla sig till täckglaset. Buffert avgasning och tillägg av små tensid kvantiteter är vanligtvis effektivt för att förebygga bubbla bildandet inom slangar och flöde kanal. I fall där luftbubblor introduceras till slangen, försök att spola bubblor ut under ett långsamt flöde och se till att de inte flöda genom regionen där DNAs är uppbundna.
En strömlinjeformad och effektiv data analys programvara är avgörande, på grund av den enorma mängden data som genereras. Vi brukar samla in 700 000 högupplösta bilder från mätningar på en flöde cell, som kan bearbetas med hjälp av våra anpassade enda partikel spårning programvara inom en dag på en stationär dator med en quad-core processor och 32 Gb minne. Andelen falskt positiva upptäcka 1 D diffusion banor av programvaran (steg 5,5) är provet beroende och kan vara ganska låg med tanke på att: 1) tätheten av enstaka partiklar i FOV är tillräckligt låg så att det finns lite tvetydighet länka partiklar över () ramar protein prover i allmänhet är mer benägna att ospecifik adsorption till täckglaset än peptid prover, och således bufferten och effekttätheten för varje protein prov behöver optimeras); (2) signalen-brusförhållandet för enstaka partiklar är tillräckligt hög så att sannolikheten för falskt-identifiering av partiklar är låg. Fortfarande, programvaran kan göra enstaka misstag, och vi rekommenderar manuell inspektion av data med hjälp av den medföljande GUI för att utvärdera programvara. I ett program som är särskilt känsliga för falskt positiva bana upptäckt, kan processparametrar inklusive tröskelvärde, minFrames, minTriplets och Chi2_stat ställas in mer strikt på bekostnad av lägre känslighet för sann bindande händelser och potentiellt större statistisk bias i bana identifiering. Vi här delar och beskriva vår enda partikel spårning programvara med hopp om att hjälpa standardisera data analysmetoder och stimulera till diskussion om bästa praxis.
I våra protokoll, som kräver kontinuerligt flöde under imaging för att upprätthålla det sträckt tillståndet av DNA mall molekylerna, kunde vätskeflöden bias transport av vissa proteiner längs DNA mallar om de diffusa av en hoppande mekanismen eller om de hydrodynamiska radie av märkt fluorophore är stora22,23. Medan sådana bias kan mätas och korrigeras i de flesta DataSet, transport av proteiner märkt med en liten fluorophore och sprida av en glidande mekanismen är inte vanligtvis partisk detekterbara utsträckning av flöde2,4, 24. Särskilt, har effekterna av flödeshastigheten för transport av proteiner längs DNA använts för att studera mekanismerna för protein sprida längs DNA23. A nära relaterade alternativ metod som gör mätningar i avsaknad av flöde använder tredjeparts DNA mallar med biotin på både termini som sträcks normalnivå i flödet och uppbundna av båda ändarna till täckglaset sådan att DNA-molekylerna kvar i en utökad konfiguration när flödet är avstängd25,26,27,28. Metoden med dubbel-tether har fördelen av att flödet-fri transport experiment men kräver ändra båda ändarna av DNA mall molekylerna, noggrann flödesreglering under tjudra och karaktärisera avstånden mellan de två platserna som uppbundna. Dessutom bedömas effekterna av heterogena spänningar och DNA konfirmerande dynamics över DNA-molekyler på singel-molekyl analysen.
Alldeles, förutom att studera 1 D diffusionshastighet för molekyler längs DNA, som rapporterade enda molekyl analysen kan gynna många in vitro- biokemiska och biofysiska studier på enda molekyl nivå inklusive DNA rikta sökprocesser av proteiner, enzymatiska aktiviteter på DNA och mer.
Felsökning
Problem 1: Flöde kanaler läckan.
Lösning: Se först till att utformningen av flöde kanaler möjliggör minst 1,5 mm marginal för tätning runt och mellan kanaler; och sedan, under montering av cellen flöde, se till att kontaktytorna mellan täckglaset, den dubbel-tejpen och PDMS plattan är platt, torr och fri från skräp, att trycket för att bilda tätningen är enhetlig, och att försegla driften är utförs vid rumstemperatur.
Problem 2: Tätheten av uppbundna DNAs är för låg.
Lösning: Det här problemet uppstår när PEG funktionalisering effektivitet är låg eller DNA-molekylerna är inte functionalized med biotin. Från vår erfarenhet, tätheten av uppbundna DNA bör vara hög för > 90% av coverslips tillagas av färska eller korrekt lagrad silan-PEG-biotin reagens. I fall när tätheten av uppbundna DNA är låg med ett beprövat parti av biotin-λ-DNA, försöka öka koncentrationerna av silan-PEG-biotin under PEG funktionalisering och koncentrationer av streptividin och biotin-λ-DNA under DNA tjudra. Om detta misslyckas, ersätta de PEG och streptividin reagenserna.
Problem 3: DNAs hålla sig till täckglaset end kan inte sträckas av flöde.
Lösning: Problemet kan också uppstå när PEG funktionalisering effektivitet är låg, och förvärras av låg assay pH. Försök flyter i mer BSA eller höja pH (t.ex till 8,0) för att hjälpa undertrycka DNA adsorption till ytan (steg 4.3.2). Om DNA adsorption är ett ihållande problem under ett särskilt test tillstånd, prova inklusive upp till 90% silan-PEG-COOH under PEG funktionalisering.
DATA analys anteckningar:
Vi använder anpassade enda partikel spårningsprogram för att identifiera banor av enstaka molekyler sprida längs DNA, från som sin 1D diffusion konstanter, D1 beräknas. För att förbättra dataanalys, genomfört vi de radiell symmetri algoritm18 för lokalisering av partiklar och kovarians-baserade estimator19 för att uppskatta 1 D diffusion konstanter, som dramatiskt påskyndas dataanalys utan att kompromissa med noggrannhet. Vi har tidigare validerat anpassade programvaran genom att analysera simulerade data11. De stora stegen beskrivs nedan.
Partikel-identifiering:
Detta steg är för att upptäcka och segmentera partiklar - diffraktion begränsad ställen - från bakgrunden. Först, rumsligt band-pass filtrera bilderna att förbättra signalen av partiklar i 3-5 pixel intervallet (som motsvarar storleken på funktionen point-spread på vårt system) och sedan tröskelvärdet baserat på intensitet (se skript: spt2_SD_sandbox.m).
Centroiden tilldelning
Segmentera bilden endast lokaliserar molekyler till pixel-nivå rumslig upplösning. För att lokalisera molekyler till mycket högre precision, anställa radiell symmetri super upplösning algoritm18 bilder filtreras som ovan. (Denna metod bygger på en analytisk beräkning och därmed kraftigt minskar computational börda jämfört med andra populära hög noggrannhet metoder såsom 2D Gaussisk montering (se skript: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikel spårning:
För att spåra banan för en partikel genom tiden, måste vi identifiera samma partiklarna igen när de flyttar mellan ramar. Vi anser att de inledande, blinkar och uppsägning stadierna vara delar av en bana. Vi begränsa sammanlänkningen av partiklar i nuvarande ramar som visas i föregående bildrutor genom att den maximala förskjutningen som tillåts per bildruta. I fall där flera kopplingar är möjliga, Jonker-Volgenant algoritm används för att ge globalt optimal koppling uppsättningar (se skript: traceTraj4_kx.3.m).
D1 uppskattning:
För att uppskatta D1 värden från banor, använder vi kovarians-baserade Estimator (CVE)19. Baserat på en analytisk beräkning, denna metod är mer beräkningsmässigt effektiv och statistiskt rigorösa än andra vanligt förekommande metoder såsom regression av genomsnittliga kvadrerade förskjutningar (se skript: runspt5_SD.m).
Banan filtrering:
Vissa banor innehåller artefakter såsom länkning till ytan-bundna molekyler och måste tas bort. Vi har genomfört flera funktioner såsom minsta förskjutning parallellt med DNA, maximala förskjutningen transverse till DNA, minimala längden på banan, minimalt antal triplett i följd upptäckt positioner och lägsta sannolikhet Poäng (se Xiong et al11 för definition) som kan filtreras för att isolera en minimalt partisk uppsättning banor sannolikt att representera molekyler sprida på DNA (se skript: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Den Broad Institute kan välja fil patentansökningar som inkluderar aspekter av arbetet presenteras här.
Acknowledgments
Vi tackar Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick och Evangelos Gatzogiannis för hjälp med inledande instrumentation installation och testning. Vi tackar ytterligare Tony Kulesa för betydande hjälp skriva och utvärdera anpassade enda partikeln spårning programvara. Detta arbete stöds av start finansiering och en karriär Award på vetenskapliga gränssnittet (PCB) från Burroughs Wellcome Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
