Summary
Bu iletişim kuralı tek boyutlu (1 D) Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil göstermektedir.
Abstract
Biz 1 D Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin çalışmak için bir basit, sağlam ve yüksek üretilen iş tek molekül akışı uzanan tahlil tanımlamak. Bu tahlil, cam coverslips bir tek adımlı tepki silane-PEG-biotin ile functionalized. Akış hücreleri bir yapışkan bant functionalized coverslip ve giriş ve çıkış delik içeren bir PDMS levha arasında önceden kesilmiş kanalları ile sandviç tarafından inşa edilir. Birden fazla kanalı bir akış hücre entegre edilmiştir ve reaktifler akışına her kanal tam olarak, hangi önemli ölçüde tahlil işlem hacmi artar ve tahlil başına uygulamalı süresini azaltır otomatikleştirilebilir. Her kanal içinde biotin-λ-DNA'lar yüzeyde immobilize ve laminar akış akış-DNA'lar germek için uygulanır. DNA molekülleri için uzatılır > onların kontur uzunluğu ve hizmet % 80'i kadar dağınık şekilde genişletilmiş fluorescently etiketli moleküllerin bağlama ve taşıma etkinlik eğitim için şablonlar. Tek moleküllerin yörüngeleri izlenir tarafından hızlandırılmış toplam iç yansıma floresan (TIRF) görüntüleme. Ham görüntüleri otomatik olarak tek moleküllerinin DNA Difüzyon yörüngeleri tanımlamak ve onların 1 D Difüzyon sabitler tahmin etmek için standartlaştırılmış özel tek parçacık takip yazılımı kullanarak analiz edilir.
Introduction
Belirli hareket nasıl endojen proteinler Biyoloji uzun zamandır devam eden bir sorun olduğunu sitelerde genomu DNA hedeflerine hayatta ve çevresi için etkili bir şekilde yanıt vermek yeterince hızlı organizma için bulabilir. Çalışmalar son kırk yıl içinde önerilen ve büyük ölçüde DNA Kinetik bir protein tarafından arama hedef hipotez tarafından hızlandırılmış destek kolaylaştırılmış Difüzyon protein toplu 3D Difüzyon ve 1 D Difüzyon (dahil arasında geçiş yapar sürgülü ve süreçleri atlamalı) boyunca DNA1. Çoğu protein gen düzenlemesi, nükleik asit metabolizması ve diğer işlemler dahil DNA2,3,4,5,6,7 kayar yeteneğine artık bilindiği ,8,9. Ayrıca, son yıllarda yapılan çalışmalarda bile küçük peptidler bağlanmak ve DNA'LARINDA bir kargo taşıma yeteneği ile slayt bildirdi; Örneğin, bir protein molekülü veya DNA10,11,12,13,14boyunca PCR astar.
Son 15 yıl içinde tek molekül akışı uzanan tahlil yaygın bağlama ve DNA2,15,16boyunca moleküllerin Difüzyon çalışmaya kullanılmıştır. Bu tür tahlil, biotinylated çift iplikçikli DNA molekülün yüzeye immobilize ve laminar akış uygulandığı akış streç DNA. > % 80 gergin DNA'lar hizmet bağlama ve taşıma etkinliği ile fluorophores etiketli moleküllerin çalışmak için dağınık şekilde genişletilmiş Şablonlar olarak nerede DNA boyunca tek moleküllerin yörüngeleri hızlandırılmış Floresans görüntüleme tarafından izlenir. Bizim uygulama tekrarlanabilirlik ve rahat bir kullanım için optimize edilmiş, bu tahlil beş önemli adımlardan oluşur: biotin-λ-DNA, coverslip functionalization, akış hücre inşaat, Floresans görüntüleme ve veri analizi hazırlanması. Önceki iletişim kuralları17' de ilk tepki (3-Aminopropyl) ile triethoxysilane (APTES) ve sonra da direnir bir PEG katman oluşturmak için Amin-reaktif polietilen glikol (PEG) reaktifler (örneğin, NHS-PEG-biotin) ile cam coverslips functionalized nonspesifik adsorpsiyon tahlil bileşenleri coverslip yüzeye. Functionalized coverslips kalitesini büyük ölçüde PEG reaktifler ve reaksiyon koşulları her aşamada kalite bağlıydı. Basitleştirilmiş functionalization Protokolü ve hiçbir sıvı yapıştırıcı veya saat gün akışı hücrelerdeyse kür monte gerektiren çok katmanlı akışı hücre İnşaat bizim protokolünü açıklar. Biz de yoğun hesaplama regresyon adımları centroid Yerelleştirme18 ve Kovaryans tabanlı Difüzyon için Radyal simetri yöntemi uygulayarak ortadan kaldırır bir aerodinamik ve sağlam veri çözümleme yordamı11 tarif sürekli Tahmincisi19.
Burada, biz basit, sağlam raporu ve yüksek işlem hacmi tek molekül ile önemli gelişmeler coverslip functionalization, akış hücre yapı ve veri analizi yapılan germe tahlil uygulama akışı. Özellikle, temiz kuru coverslips doğrudan silane-PEG-biotin ile tepki bir tek adımlı coverslip functionalization Protokolü geliştirdik. Bu iletişim kuralı coverslip hazırlık basitleştirir ve standart iki aşamalı reaksiyon protokole göre functionalized yüzey kalitesini güvenilirliğini artırır. Coverslips functionalized-bu yüzden tutkal yapılacak sağlam boru bağlantıları etkinleştirmek çok kanallı PDMS akışı hücreleri ile nasıl kullanılacağını açıklar. Bu akış hücreleri daha fazla kurulum ve artan tahlil üretilen iş sırasında uygulamalı süresini azaltmak otomatik reaktif akışı sağlayan birden çok bilgisayar kontrollü giriş her akış odası için ekleyin.
Protocol
1. hazırlık biotin-λ-DNA'ın
Not: Biotin-λ-DNA molekülleri biotin etiketli Oligonükleotid, 5 birleştirilmesi (ligasyon) tarafından hazırlanmış '-AGGTCGCCGCCC(A) 20 - biotin - 3 ' için Λ-DNA molekülleri 20.
- Hazırla 0,1 mM biotin etiketli oligo TE arabellekte.
- Isı 0,5 mg/mL λ-DNA stok 65 ° c 60 s ve hemen ıslak buz içine dalma.
Not: Hızlı yavaşlaması soğutma λ-DNA concatemerization azaltır. - Pipet 100 µL microcentrifuge tüp içine λ-DNA çözüm.
- 0,1 mM oligo TE arabelleği 9 µL içine eklemek 1 µL.
- Ekleyin 2 µL λ-DNA içeren microcentrifuge Tube oligo çözüm. İyice karıştırın.
Not: Oligo yaklaşık bir 12-fold molar fazla tamamlayıcı λ-DNA sonuna üzerinden mevcuttur. - λ-DNA/oligo karışımı 60 65 ° C'de ısı s.
- Oda sıcaklığında karışıma yavaş yavaş serin.
Not: Bu adımı tamamlayıcı λ-DNA sonuna kadar TAV oligo sağlar. - Karışımı Buza koyun. T4 DNA ligaz tepki arabelleği 11 µL ekleyin (son arabellek konsantrasyonu 1 x). Hafifçe karıştırın. Sonra T4 DNA ligaz enzim 2 µL (800 adet) ekleyin. Karışımı yavaşça.
- Karışımı 2 h 16 ° C veya gecede 4 için kuluçkaya ° C.
- Santrifüj filtre tüpler 100 kDa bir nominal moleküler ağırlık limiti ile kullanarak ürün arındırmak. Özellikle, adım 1.9 karışımı bir santrifüj filtre tüp ve 5 min için 14.000 x g, santrifüj içine transfer, yıkama 400 µL TE arabellek ile iki kez ve arıtılmış ürün toplamak.
Not: Olarak saf biotin-λ-DNA'lar TE arabellekte bir yıl için-20 ° C'de stabildir.
2. Coverslip functionalization
Not: cam coverslips functionalized silane-PEG-biotin ile tepki tarafından. Bu tek adımlı tepki daha basit ve daha güvenilir çift iki aşamalı reaksiyon protokolü 20 deneyimlerimize iletişim kuralıdır. Coverslip functionalization ile silane-PEG-biotin streptavidin için bağlayıcı siteleri oluşturur ve nonspesifik DNA ve protein adsorpsiyon coverslip yüzeye en aza indirir.
- Sonicate 5 No 1 coverslips bir boyama içinde % 95 etanol içinde kavanoz 10 dakikadır ve için üç kez ultrasaf su ile durulayın.
Not: Beşinci coverslip kırılması durumunda yedek sağlar. - Boyama kavanoz 1 M KOH ile doldurmak, 10 min için solüsyon içeren temizleyicide ve üç kez ultrasaf su ile durulayın.
- İki kez 2.1-2.2 döngüsünü tekrarlayın.
- Coverslips temiz kuru N 2 gaz akışı altında kuru.
- Daha temiz ve kuru hava plazma tedavi 5 dakika süreyle 900 mTorr basınçta uygulayarak coverslips
- Coverslips 25 mg/mL silane-peg-% 95 etanol, oda sıcaklığında 2 h. için özellikle çözünmüş biotin ile kuluçkaya, 50 µL silane-peg-biotin çözüm iki temiz kuru coverslips arasında sandviç ve coverslip kuluçkaya " sandviç " (değil coverslips) temas altındaki su yaklaşık 10 mL ile kapalı pipet ucu kutusunun içindeki çözücü buharlaşma en aza indirmek için.
- Aşırı PEG molekülleri ultrasaf su ve PEG kaplı coverslips altında temiz kuru kuru N 2 gaz akışı silsin.
Not: Functionalized coverslips ortam koşulları altında üç gün saklanabilir.
3. Akış hücre inşaat
Not: akış hücreleri bir çift-yapışkan bant ile önceden kesilmiş kanallar arasında sandviç tarafından inşa edilir bir PEG coverslip ve giriş ve çıkış delik içeren bir PDMS levha functionalized. Birden fazla kanal akımı hücre başına tümleşiktir.
- Tasarım CAD yazılım akış kanalları ve bir bant kesici kullanarak bir çift-yapışkan bant (genişlik, derinlik ve her kanal uzunluğu olan 1, 0,13 ve 12 mm, sırasıyla) kanalları kesme (genellikle sekiz kanal akımı hücre başına entegre edilmiştir). Akış kanalları oluşturmak için bant kalıntıları çıkarmak. PDMS döşeme, yapmak
- iyice karıştırın PDMS 45 g 5 g crosslinking reaktif (süresiz olarak ortam koşulları altında saklama on iki 5 mm kalınlığında PMDS döşeme yapmak için yeterli) ile bir mikser kullanarak, iki 10 cm Petri tabağı karışımı dökmek ve bırakın yemekleri içinde bir vakum odası aslında tüm kabarcıklar hava kadar gitti (bulaşıkları vakum odasından kaldırıldığında devam ederse el ile hava kabarcıkları kaldırın). (Yaklaşık 2 h) PDMS katılaşır kadar bulaşıkları bir 80 ° C fırın içine transfer.
- Önceden kesilmiş kanalları ile çift-yapışkan bant boyutlarıyla eşleşen bir PDMS levha kesip. Kabuğu bir koruma film çift-yapışkan bant kapalı ve filmin PDMS levhanın düz bir yüz için uygun. Çıkış ve giriş 23 Gauge iğne biyopsisi delik zımba kullanarak PDMS levha üzerinde delikler.
- İkinci koruma film çift-yapışkan bant kapalı soyma ve coverslip functionalized yüzeyine PDMS folyoları derleme uygun (coverslip düz olduğundan emin olun. Şekil 1a tam olarak birleştirilmiş akışı hücrede resmini görmek).
4. TIRF görüntüleme
Not: Biotin-λ-DNA'lar bir akışı kanal yüzeyine hayvan zinciri ve laminar akış uygulandığı akış streç DNA molekülleri ( Şekil 1b). > % 80 fluorescently etiketli moleküllerin bağlama ve taşıma faaliyet gözlemleyerek için dağınık şekilde genişletilmiş Şablonlar olarak DNA molekülleri hizmet gergin. Tek moleküllerin yörüngeleri izlenir yanında hızlandırılmış TIRF düşsel ( şekil 1 c & e).
- Saptamak mikroskop sahne ve yük önceden degassed boş arabellek (10 mM sodyum fosfat, 2 mM NaCl, 50 µM EDTA, 20 mM etanol, %5 (v/v) gliserol, %0.01 ara-20, %1 (v/v) β-mercaptoethanol, pH 7,4), akış cepten 0.2 mg/mL streptavidin çözüm, 1 mg / mL sığır Serum Albumin (BSA) çözüm ve 100 pM biotin-λ-DNA çözüm her Tygon boru solenoid değerine bağlı ve başka bir Tygon boru PEEK boru Tygon boru izolasyonlu kaplamalar küçük göz boru (bağlı dört rezervuar içine reaktifler, geri tepme) önler. Arabellek küçük hacimli vakum için gece pozlama veya daha kısa maruz kalma (kabarcıklar artık görünür hale gelene kadar) ile karıştırarak vakum degas.
- Göz boru boş arabellek rezervuar akış hücre, bir giriş deliğine takın. Boş bir arabellek akan tarafından kanal Başbakan ve akış her reaktif tahrik hava basıncı solenoid valfleri tarafından kontrol edilir ve tam otomatik bilgisayar komut dosyası giriş delikleri üç göz boru yerleştirin. Hava kabarcık oluşumunu kanaldaki teşvik değil dikkatli olun.
- Tygon boru atık bir kapsayıcı bir kısa göz boru çıkış deliği üzerinden bağlanmanız gerekir. Kısa göz boru çıkış, hava kabarcık oluşumu infüzyon sırasında pozitif basınç kanal içinde tutarak bastırmak yardımcı olur.
- Biotin-λ-DNA molekülleri bir akışı kanal yüzey için hayvan zinciri.
- Akışı 0.2 mg/mL streptavidin çözümünde, 5 min için kuluçkaya ve ilişkisiz streptavidin yıkamak için boş arabelleği akış.
- Akışı 1 mg/mL BSA çözümünde, 1 dk. için kuluçkaya ve ilişkisiz BSA yıkamak için boş arabelleği akış.
Not: Daha fazla BSA DNA bastırır ve örnek adsorpsiyon yüzeye. - Akışı 100 pM biotin-λ-DNA çözümünde, 10 dakikadır kuluçkaya ve ilişkisiz DNA'lar yıkamak için boş arabelleği akış.
Not: DNA yüzeye bağlı sonra önlemek için hayvan zinciri DNA molekülleri zarar önlemek için hızlı akar.
- Functionalized coverslip kalitesini kontrol etmek için akış kullanılmak üzere boya Sytox gibi tahlil koşullar altında turuncu boyama DNA ' (okuma 4,6 aşağıda) ve küçük 532 nm lazer aydınlatma Imaging Floresans başlatın.
Not: Functionalized coverslip kalitesi genellikle iyidir ve gergin akışı DNA molekülleri yoğunluğu yüksek olacaktır. DNA bağlama ve sürgülü/1 bir D Difüzyon olaylar görülebilir böylece gergin akışı DNA moleküllerinin yeterince yüksek yoğunluklu olması esastır. - İnce ayar en iyi sinyal gürültü oranı gergin DNA moleküllerinin ( şekil 1 d) görüntülerin elde etmek için TIRF açı.
- Yörüngeleri tek moleküllerinin DNA hareket kaydetmek için adımları 4.2-4.4 yeni bir kanal içinde (boya boyama DNA) yineleyin ve sonra önceden degassed alt-nanomolar fluorophore molekülleri bir yeterince yüksek akış hızı, bir şırınga pompa kullanarak etiketli demlemek ve bir kare hızı 100 Hz ile hızlandırılmış Floresans görüntüleri toplamak.
Not: Bir akış hızı Weissenberg sayıya eşdeğer (Wi: en uzun polimer gevşeme zamanı - yaklaşık 0.2 boyutsuz çarpımını λ-DNA - ve kesme hızı - akım hızı coverslip yüzey mesafe ile değişimi için s) 500 içinde Kanal 100 Hz 21 bir kare hızı ile tek molekül görüntüleme için önerilir.- Toplamak 10.000 çerçeveler içinde bir görünüm alan (bir film üretmek ve örnek başına birden çok (genellikle on) FOVs benzer Filmler toplamak FOV).
Not: Bir FOV tek parçacık yoğunluğu ne çok yüksek - hangi tek molekül olaylar düşük oluşumunu DNA üzerinde neden olabilir genelinde çerçeveler belirsiz, ne de çok düşük - nesne atama yaparak veri analizi zorlaştıracaktır olmalıdır. - Optimize Aydınlatma şiddeti böylece coverslip yüzeye bağlı hızlı bir şekilde fotoğraf-böylece uzun yörüngeleri tespit edilebilir DNA'LARINDA Difüzyon molekülleri çok hızlı bir şekilde ağartılmış değil iken arka plan bastırmak için ağartılmış moleküllerdir.
Not: Biz genellikle 200-800 W/cm 2 güç yoğunluğu içinde FOV kullanın.
- Toplamak 10.000 çerçeveler içinde bir görünüm alan (bir film üretmek ve örnek başına birden çok (genellikle on) FOVs benzer Filmler toplamak FOV).
- Adım 4,6 sonunda, DNA molekülleri hala akışı gergin olabilir onaylamak için boya boyama DNA demlemek.
- Her iki pozitif ve negatif kontrol örnekleri çalıştırmak.
Not: İyi bir olumlu bir tetrapeptide, TetraMethylRhodamine (TMR) denetimdir-KRRR (N-terminal Amin TMR akuple) olan bir ortalama 1D Difüzyon sabiti 10.5 ± 0.7 (standart hata) M (bp 2/s) nötr pH 11. İyi bir negatif kontrol etiketli ilgi gergin, nerede hiçbir DNA'sı üzerinde Difüzyon etkinlik tespit edilmelidir DNA sahip bir kanal arabellekte tahlil örnekleri ölçmek etmektir.
5. Veri analizi:
Not: izleme yazılımı özel bir tek parçacık tek moleküllerinin DNA Difüzyon yörüngeleri tanımlamak ve Difüzyon sabitler tahmin etmek için kullanılır. Bu bilgisayar yazılımı önce centroid pozisyonlar yüksek doğrulukla tek parçacıkların coverslip yüzeyinde sıkışmış parçacıkları tanımlar ve hızlandırılmış yörüngeler oluşturmak için farklı çerçeveler parçacıklar bağlar belirler. Bu yörüngeleri 1D Difüzyon sabitler tahmin ediliyor.
Veri analizi başlatmak için bir komut dosyası oluşturma yazılımını açın- (malzemelerin tabloya bakın) ve izleme yazılımı tek parçacık dizinine gidin. Adlı komut dosyasını açmak " largedataprocess3.m ". Tanımlanması gereken bir önemli parametredir tek parçacık algılama için eşik değerini.
- En uygun eşik değerini belirlemek için çalıştırmak " Determine_threshold_value.m " komut dosyası. Bu komut dosyasını nasıl tek parçacık algılama eşik değerini etkilediğini belirtir. En uygun eşik değeri belirledikten sonra çalıştırmak " largedataprocess3.m " filmi
- Tek parçacık tamamlanmasından sonra çalıştırarak ham yörüngeleri filtre izleme çözümlemesi, " Trajectory_filtering.m " komut dosyası. Bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) filtre uygulama adımında görselleştirmek için yerleşiktir.
- On GUI paneli, DNA, MinXDisp, boyunca en az deplasman 2 piksel olarak ayarlayın; maksimal deplasman enine DNA, MaxYDisp, 2 piksel olarak ayarlayın; çerçeveler, minFrames, en az sayısını 10'a ayarlayın; üçlüsü, minTriplets, durumları en az sayısını ayarlamak 10; DNA, D_par, boyunca en az Difüzyon sabiti 0 olarak ayarlayın; maksimal tahmini Difüzyon sabiti enine DNA, D_trans, 10 M (bp 2) S -1 için ayarla; en az Hayatinizda parametresi, Chi 2 _stat, -5 için ayarla; DNA, MinX/Y, bu levha enine 2 deplasman DNA boyunca en az oranını ayarlamak.
Not: Bunlar parametreleri filtreleme geçmek tüm ham yörüngeleri tablo 1'de listelenen ve o da yok tablo 3'te yer almaktadır. - Tıklama bir yörünge üzerinde tablo 1'numara, yörünge grafik 1'yerlerinden & 2. Tıkırtı üstünde " oyun " düğme-e doğru ham Floresans görüntüleri oynamak. Tıkırtı üstünde " Add_to_Table2 " yörünge yörünge kayma tek bir molekül tanımlamak için. Sonunda, tüm yörüngeleri tablo2 için eklendi GUI kapatırken kaydedilir.
- Ortalama Difüzyon sabitler hesaplamak için komut çalıştırmak " Calculate_mean_diffusion_constant.m ". Ortalama Difüzyon sabiti tüm filtre uygulama adımları geçti ve tablo 2'ye eklenmiş yörüngeleri dizi tahmin edilmektedir.
Representative Results
Şekil 2a gösterir pVIc Cy3B tespit edilen yörüngeler (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B sistein kalıntı Birleşik) DNA'LARINDA 2 mM NaCl Difüzyon molekülleri tampon pH 6,5. PVIc Difüzyon çift yönlü ve ortam termal enerji tarafından tahrik. Bu yörüngeleri 1D Difüzyon sabitleri (D1 değerler) her yörünge için tahmin edilmektedir ( şekil 2bhistogramda bakın). Demek bu pVIc eşlenik değerini D1 22,2 ± 0,9 (Standart her D1 değeri ortalama tarafından hata) M (bp2/s) tarafından her yörünge içinde bulunan üçlüsü ardışık pozisyon çağrı sayısı ağırlıklı yörüngeleri arasında hesaplanır.
Resim 1 : DNA boyunca tek moleküllerin hareket izleme cihazı.
bir) bir sekiz kanallı PDMS mikrosıvısal çip şeklinde olması gereken bir functionalized coverslip için DNA kaşif Balonlu keşif (ile ABD çeyrek coin için ölçek); b) hücre zum şematik akış gergin λ-DNA molekülleri gösterilen akışı; c) şematik DNA germe için TIRF mikroskop ve akış sistemi; d) TIRF görüntü akışı gergin λ DNA; e) pVIc-Cy3B görüntüsünü TIRF (pVIc: GVQSLKRRRCF; Cy3B sistein kalıntı Birleşik) molekülleri bağlı bir akış gergin λ-DNA için. Bu rakam izni2,12ile değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : PVIc (GVQSLKRRRCF) DNA'sı boyunca tek boyutlu Difüzyon.
bir). Difüzyon akış boyunca pVIc ve pH 6,5 2 mM NaCl arabellekte λ-DNA'lar (137 yörüngeleri) gergin. x(t) ve y(t) boyunca ve λ-DNA, enine talebiyle sırasıyla vardır. Noktalı yatay çizgiler boya yanıp sönmesini kaynaklanan eksik gösteriyor. b). Difüzyon sabiti histogramını, D1 λ-DNA'lar Difüzyon pVIc için. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Geleneksel iki adım coverslip functionalization tepki protokolü bir tek adımlı tepki protokole geçiş yaparken coverslip functionalization güvenilirliğini önemli ölçüde gelişmiş olduğunu fark ettim. Coverslip hazırlık için toplam uygulamalı süre az 30 dk olduğu, her gün tek molekül görüntüleme taze coverslips hazırlanması planlanan öneririz. Silane-PEG-biotin bozulma en aza indirmek için reaktif bölünmemeli ve kuru N2 gaz aldıktan sonra-20 ° C'de altında saklı olması gerekir. Burada biz -COO- üretmek PEG molekülleri veya son20dakika içinde kullanılan -CH3 terminal gruplarını kullanmayın. COO -- grupları ve hidrofobik -CH3 gruplar negatif suçlarından DNA molekülleri ve belirli protein örnekleri nonspesifik adsorpsiyon yüzeye, sırasıyla önlemek için kullanılmıştır. Silane-PEG-COOH ve/veya silane-PEG-CH3 -bazı protein örnekleri deneyleri için yararlı ya da koşullar ne zaman tahlil biz çok düşük yüzey adsorpsiyon küçük peptid örnekleri tam olarak biotin sonlandırılmış PEG yüzeyi tarafından gözlemlemek (pH gibi < 7,5) DNA-yüzey etkileşimleri teşvik.
Cam slayt akışı hücrelerden shift PDMS akışı akışı hücre inşaat hızlandırır hücreleri ve birden fazla kanal kolay entegrasyon sağlar. Biz sık sık functionalized coverslip başına sekiz bağımsız deneyler etkinleştirmek için akış hücre başına sekiz kanal mühendislik. Daha fazla coverslip başına iş çıkarma yeteneğini artırmak için mikro fabrikasyon kanalları daha büyük sayıda kullanılabilir.
İlk doldurma sonra herhangi bir kanal içinde hava kabarcık oluşumunu önlemek için tavsiye edilir. (Bu mümkün olmasına rağmen) genellikle, hava kabarcıkları gergin DNA'lar kaybına neden olmaz, ama oldukça akışını kesintiye uğratmak ve coverslip için sopa DNA'lar neden olabilirsiniz. Arabellek gaz giderme ve küçük yüzey aktif miktarları eklenmesi genellikle boru ve akışı kanal içinde kabarcık oluşumu önlemede etkilidir. Hava kabarcıkları için tüp nerede tanıtıldı durumlarda, Yavaș Akıș altında baloncuklar temizlemek ve onlar nerede DNA'lar gergin bölgeden akışı değil emin olmak deneyin.
Akıcı ve etkili veri analiz yazılımı oluşturulan veri büyük miktarda nedeniyle önemlidir. Genellikle ölçümleri bizim özel tek parçacık bir gün içinde dört çekirdekli işlemci ve 32 Gb bellek ile bir masaüstü bilgisayarda izleme yazılımı kullanarak işlenebilir bir akış cep 700.000 yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak. 1 D Difüzyon yörüngeler (Adım 5.5) yazılımı tarafından tespit yanlış pozitif oranı örnek bağımlı ve göz önüne alındığında oldukça düşük olabilir: 1) böylece küçük belirsizlik parçacıklar bağlama çerçeveleri () arasında FOV tek parçacık yoğunluğu düşük yeterli protein örnekleri genel peptid örnekleri daha fazla eğilimli coverslip için nonspesifik adsorpsiyon, ve böylece, örnek arabellek ve güç yoğunluğu her protein için optimize edilmiş olması gerekiyor); 2) böylece yanlış-parçacıklar tanımlaması ve olasılığı düşük olduğunu sinyal gürültü oranı tek parçacıkların kadar yüksektir. Yine de, belgili tanımlık bilgisayar yazılımı da zaman zaman hata yapabilir ve yazılım performansını değerlendirmek için sağlanan GUI kullanarak verilerin el ile muayene öneririz. Uygulamanın yanlış yörünge algılama için özellikle hassas, eşik değerini, minFrames, minTriplets ve Chi2_stat dahil olmak üzere işlem parametreleri doğru bağlama için daha düşük duyarlılık pahasına daha sıkı ayarlanabilir olaylar ve potansiyel olarak daha fazla istatistik önyargı yörünge tanımlama. Biz burada paylaşmak ve izleme yazılımı veri analiz yöntemleri standartlaştırmak ve en iyi uygulamalar hakkında tartışma teşvik yardımcı umut bizim tek parçacık açıklayın.
Sürekli akış DNA şablon molekülleri gergin durumunu korumak için görüntüleme sırasında gerektirir, bizim protokolünde atlamalı bir mekanizma ile diffüz veya eğer bazı proteinler DNA şablonları boyunca taşıma sıvı akış önyargı hidrodinamik etiketli fluorophore yarıçapı büyük22,23' tür. Böyle önyargı ölçülen ve çoğu veri kümelerini düzeltilmiş, proteinlerin taşıma ile küçük bir fluorophore etiketli ve sürgülü mekanizma tarafından Difüzyon tipik olarak algılanabilir bir ölçüde akışı2,4tarafındanönyargılı değil, 24. Özellikle, akım hızı proteinler DNA boyunca taşıma etkisini bir protein DNA23Difüzyon mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. A yakından akışının yokluğunda ölçümleri sağlayan alternatif bir yaklaşım kullanır DNA şablonları biotin geçici akışında uzatılır hem termini adlı ile ilgili ve DNA molekülün içinde kalır böyle coverslip için her iki uçta tarafından gergin bir Akış25,26,27,28açıldığında genişletilmiş yapılandırma. Çift-urgan yaklaşım akışı ücretsiz taşıma deneyler izin avantajı vardır ancak her iki ucunda da DNA şablon molekülleri, hayvan zinciri ve iki hayvan zinciri siteleri arasındaki mesafeleri karakterize sırasında dikkatli akış denetimi değiştirme gerektirir. Buna ek olarak, türdeş olmayan gerginlikler ve DNA konformasyon dinamikleri arasında DNA molekülün tek molekül tahlil üzerinde etkisi değerlendirilmesi gerekir.
Özet olarak, ek olarak 1 D Difüzyon boyunca DNA moleküllerinin eğitim, tek molekül olarak rapor tahlil birçok vitro biyokimyasal yararlanabilir ve DNA içeren tek molekül düzeyinde biyofiziksel çalışmaları ara işlemler tarafından hedef proteinler, DNA enzimatik faaliyetleri ve daha fazlası.
Sorun giderme
Sorun 1: Akış kanalları sızıntısı.
Çözüm: Öncelikle, akış kanalları tasarımı için sızdırmazlık çevresinde ve kanallar arasında en az 1,5 mm kenar boşluğu sağlar emin olun; ve, akış hücre montaj sırasında coverslip, çift-yapışkan bant ve PDMS levha arasında iletişim yüzeyler kuru, düz ve enkaz, mühür oluşturmak için uygulanan basınç üniforma, ücretsiz ve mühürleme işlemi olduğundan emin olun oda sıcaklığında gerçekleştirilen.
Sorun 2: Hayvan zinciri DNA'lar yoğunluğu çok düşüktür.
Çözüm: PEG functionalization verimliliği düşüktür veya DNA molekülleri ile biotin functionalized değil bu sorun ortaya çıkar. Bizim deneyim, hayvan zinciri DNA yoğunluğu için yüksek olmalıdır > coverslips % 90 ' taze hazırlanmış veya düzgün silane-PEG-biotin reaktif saklı. Hayvan zinciri DNA yoğunluğu biotin-λ-DNA kanıtlanmış bir toplu işlemle düşük olduğunda durumlarda DNA hayvan zinciri sırasında PEG functionalization ve streptavidin ve biotin-λ-DNA konsantrasyonları sırasında silane-PEG-biotin konsantrasyonları artırılması deneyin. Bu başarısız olursa, PEG ve streptavidin reaktifler değiştirin.
Sorun 3: DNA'lar coverslip için sopa bird akış tarafından uzatılmış olamaz.
Çözüm: PEG functionalization verimliliği düşük ve düşük tahlil pH tarafından ağırlaştırılmış olduğunda bu sorun da ortaya çıkabilir. Deneyin daha fazla BSA akan veya pH (örneğin 8,0 için) DNA adsorpsiyon (Adım 4.3.2) yüzeye bastırmak yardımcı yükselterek. DNA adsorpsiyon bir özel tahlil koşul altında kalıcı bir konudur, yukarıya sırasında PEG functionalization % 90 silane-PEG-COOH için dahil olmak üzere deneyin.
Veri Çözümleme Notları:
Biz takip yazılımı özel tek parçacık yörüngeleri tek moleküllerinin DNA üzerinden Difüzyon tanımlamada kullanmak hangi onların 1D Difüzyon sabitler, D1 tahmin edilmektedir. Veri Çözümleme geliştirmek için biz hayata parçacıklar ve önemli ölçüde veri analiz ödün vermeden hızlandırdı 1 D Difüzyon sabitler tahmin etmek için Kovaryans tabanlı Tahmincisi19 yerelleştirme için Radyal simetri algoritması18 doğruluk. Daha önce özel yazılım simüle veri11analiz ederek geçerliliği. Önemli adımları aşağıda açıklanmıştır.
Parçacık kimliği:
Bu tespit ve parçacıklar - kırınım-sınırlı noktalar - arka plan segmentlere için bir adımdır. İlk olarak, dağınık şekilde bant geçiren Filtre parçacıkların 3-5 (ki bizim sistemde noktası yayıldı fonksiyonu boyutunu karşılık gelir) piksel aralığı ve daha sonra üzerinde yoğunluk dayalı eşik sinyali artırmak için görüntüleri (komut dosyası bkz: spt2_SD_sandbox.m).
Centroid atama
Görüntü segmentlere yalnızca piksel düzeyinde Uzaysal çözünürlük moleküllerine yerelleştirir. Moleküller çok daha yüksek duyarlılığa yerelleştirmek için süper çözünürlüğü algoritması18 görüntülere filtre Radyal simetri yukarıdaki gibi istihdam. (Bu yöntem analitik bir hesaplamayı temel alır ve böylece büyük ölçüde 2D Gauss uydurma gibi diğer popüler yüksek doğruluk yöntemleri ile karşılaştırıldığında Hesaplamalı yükünü azaltır (komut dosyası bkz: spt2_SD_sandbox.m).)
Partikül: izleme
Çerçeveler arasında ilerlerken bir parçacık zaman yörüngesini izlemek için biz aynı parçacıkları yeniden tanımlamanız gerekir. Bileşenleri bir yörünge olarak başlatma, yanıp sönen ve fesih aşamaları göz önünde bulundurun. Bağlantı geçerli çerçeveler çerçeve başına izin verilen maksimum deplasman tarafından önceki çerçevelerde görünen bu parçacıkların sınırlamak. Birden çok bağlantıları nerede olası durumlarda, genel olarak en uygun bağlantı setleri vermeye Jonker-Volgenant algoritması kullanılır (komut dosyası bkz: traceTraj4_kx.3.m).
D1 tahmini:
Yörüngeler D1 değerleri tahmin etmek için Kovaryans tabanlı Tahmincisi (CVE)19kullanın. Analitik bir hesaplama üzerinde bağlı olarak, bu hesaplama açısından daha verimli bir yöntemdir ve istatistiksel olarak diğer daha sıkı sık kullanılan ortalama kare talebiyle gerileme gibi yöntemleri (komut dosyası bkz: runspt5_SD.m).
Yörünge filtreleme:
Bazı yörüngeleri bağlantı yüzey bağlı moleküllere gibi yapılar içeren ve kaldırılması gerekir. Biz birkaç şekil öyle aynı derecede en az öteleme paralel DNA, maksimum deplasman DNA, yörünge, olabildiğince az sayıda bağlantı tespit üçlüsü üst üste pozisyonlar ve (bkz: Xiong ark11 En düşük bir olasılık puanı en az uzunluğunu enine olarak hayata tanımı için) o filtre yörüngeleri Difüzyon üzerinde DNA molekülleri temsil etmek büyük olasılıkla en az önyargılı bir kümesini yalıtmak için (bkz: komut dosyası: sptViewFig2_update3x.m).
Disclosures
Broad Enstitüsü burada sunulan çalışma yönlerini içeren dosya patent başvuruları için tercih edebilir.
Acknowledgments
Tony Kulesa, Robin Kirkpatrick ve Evangelos Gatzogiannis ilk Araçları Kurulum ve test ile yardım için teşekkür. Biz daha fazla yazma ve izleme yazılımı özelleştirilmiş tek parçacık değerlendirilmesi önemli yardım için Tony Kulesa teşekkür ederim. Bu eser başlangıç finansman ve Burroughs Wellcome Vakfı bilimsel arabiriminden (PCB için) bir kariyer Ödülü tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biotin labeled oligo, 5’-AGGTCGCCGCCC(A)20-biotin-3’ | IDT | Custom oligo synthesis | Standard desalting purification is sufficient |
| λ-DNA | New England Biolabs Inc. | N3011S | Make aliquots and minimize freeze-thaw cycle number |
| T4 DNA ligase and ligation reaction buffer | New England Biolabs Inc. | M0202S | |
| Amicon centrifugal filter tubes with NMWL of 100k Dalton | EMD Millipore | UFC510008 | |
| No. 1 glass coverslips | VWR | 48393-106 | |
| Pure ethanol | VWR | 89125-186 | |
| Potassium hydroxide pellets | Fisher Scientific | P250-500 | |
| Plasma cleaner, model No. PDC-32G | Harrick Plasma | ||
| Silane-peg-biotin | Nanocs | PG2-BNSL-5k | Store at -20oC in dry nitrogen gas |
| A CAD software | Autodesk | AutoCAD | |
| Double-adhesive tape | Adhesive Applications | 8512-2-DP/DL | |
| Tape cutter, model No. CE5000-40-CRP | Graphtec America | ||
| PDMS and crosslink reagent kit | R.S. Hughes | RTV615 CLEAR 010 | |
| Degassing chamber, model No. F42010-0000 | BEL-ART Products | ||
| Mixer, model No. ARV-310 | Thinky | ||
| Hole puncher, Harris Uni-Cores, Size 0.5 mm | Harris Uni-Cores | This can be substituted with a manual biopsy punch with a similar needle size | |
| Tygon tubing | Cole Parmer | EW-06420-02 | 0.020" ID, 0.060"OD |
| Peek tubing | Western Analytical | PK007-031-Y | 0.007" ID, 0.031"OD |
| Streptavidin | New England Biolabs Inc. | N7021S | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs Inc. | B9000S | |
| Sytox orange nucleic acid stain | Invitrogen | S11368 | |
| Ti-E Microscope | Nikon | Microscope, camera, objective, dichroic mirror and bandpass filter can be substituted for similar equipment | |
| 100x Objective, NA/1.49, CFI Apo TIRF | Nikon | ||
| CMOS camera | Hammamatsu | Orca Flash 4.0 | |
| Dichroic mirror | Semrock | FF560/659-Di01-25x36 | |
| Bandpass filter | Semrock | FF01-577/690-25 | |
| 532 nm laser | Rayscience Innovation Limited, Shanghai | OEMLL-FN-532nm-C | Select wavelength to correspond to stain of choice |
| Syringe pump | Chemxy | Fusion 200 | |
| TMR-KRRR, >=85% purity | MIT Biopolymer lab | ||
| pVIc-Cy3B, HPLC purified | A gift from Dr. Walter Mangel at Brookhaven National lab | ||
| Script programming software | MathWorks | Matlab | |
| * see parts list for solenoid valves, computer interface, and assembly instructions at: https://sites.google.com/site/rafaelsmicrofluidicspage/valve-controllers |
References
- Berg, O. G., Winter, R. B., von Hippel, P. H. Diffusion-driven mechanisms of protein translocation on nucleic acids. 1. Models and theory. Biochemistry. 20, 6929-6948 (1981).
- Blainey, P. C., van Oijen, A. M., Banerjee, A., Verdine, G. L., Xie, X. S. A base-excision DNA-repair protein finds intrahelical lesion bases by fast sliding in contact with DNA. P Natl Acad Sci USA. 103, 5752-5757 (2006).
- Leith, J. S., et al. Sequence-dependent sliding kinetics of p53. P Natl Acad Sci USA. 109, 16552-16557 (2012).
- Blainey, P. C., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space IV. Viral proteinase slides along DNA to locate and process its substrates. J Biol Chem. 288, 2092-2102 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a Viral Proteinase by a Peptide and DNA in One-dimensional Space II. Adenovirus proteinase is activated in an unusual one-dimensional biochemical reaction. J Biol Chem. 288, 2068-2080 (2013).
- Graziano, V., et al. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: I. binding to DNA and to hexon of the precursor to protein VI, pVI, of human adenovirus. J Biol Chem. 288, 2059-2067 (2013).
- Baniecki, M. L., McGrath, W. J., Mangel, W. F. Regulation of a viral proteinase by a peptide and DNA in one-dimensional space: III. atomic resolution structure of the nascent form of the adenovirus proteinase. J Biol Chem. 288, 2081-2091 (2013).
- Kabata, H., et al. Visualization of single molecules of RNA polymerase sliding along DNA. Science. 262, 1561-1563 (1993).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophysical journal. 76, 709-715 (1999).
- Mangel, W. F., McGrath, W. J., Xiong, K., Graziano, V., Blainey, P. C. "Molecular sled"- vehicle of 11-amino acids that facilitates biochemical interactions via sliding components along DNA. Nature Communications. , (2016).
- Xiong, K., Blainey, P. C. Molecular sled sequences are common in mammalian proteins. Nucleic Acids Res. 44, 2266-2273 (2016).
- Xiong, K., Erwin, G. S., Ansari, A. Z., Blainey, P. C. Sliding on DNA: from peptides to small molecules. Angew. Chem. Int. Ed. 55, 15110-15114 (2016).
- Turkin, A., et al. Speeding up biomolecular interactions by molecular sledding. Chem Sci. 7, 916-920 (2016).
- Zhang, L., Zheng, L., Meng, Z., Balinin, K., Loznik, M., Herrmann, ,A. Accelerating chemical reactions by molecular sledding. Chem Commun (Camb). 47, 6331-6334 (2017).
- van Oijen, A. M., et al. Single-molecule kinetics of lambda exonuclease reveal base dependence and dynamic disorder. Science. 301, 1235-1238 (2003).
- Fazio, T., Visnapuu, M. L., Wind, S., Greene, E. C. DNA curtains and nanoscale curtain rods: high-throughput tools for single molecule imaging. Langmuir. 24, 10524-10531 (2008).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., Oijen, A. M. V. Direct Observation of Enzymes Replicating DNA Using a Single-molecule DNA Stretching Assay. J Vis. Expt. , e1689 (2010).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724 (2012).
- Vestergaard, C. L., Blainey, P. C., Flyvbjerg, H. Optimal estimation of diffusion coefficients from single-particle trajectories. Physical review. E, Statistical, nonlinear, and soft matter physics. 89, 022726 (2014).
- Schroeder, C. M., Blainey, P. C., Kim, S., Xie, X. S. Hydrodynamic Flow-stretching Assay for Single-Molecule Studies of Nucleic Acid-Protein Interactions. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2008).
- Blainey, P. C. Single-Molecule Studies of Protein-DNA Interaction: Diffusive Search and Sequence-Dependent Motors. , Harvard University. (2007).
- Gorman, J., Greene, E. C. Visualizing one-dimensional diffusion of proteins along DNA. Nat Struct Mol Biol. 15, 768-774 (2008).
- Lin, Y. H., et al. Using the Bias from Flow to Elucidate Single DNA Repair Protein Sliding and Interactions with DNA. Biophysical journal. 96, 1911-1917 (2009).
- Blainey, P. C., et al. Nonspecifically bound proteins spin while diffusing along DNA. Nat Struct Mol Biol. 16, 1224-1234 (2009).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H., Schroeder, C. M. Direct observation of TALE protein dynamics reveals a two-state search mechanism. Nat Commun. 6, 7277 (2015).
- Cuculis, L., Abil, Z., Zhao, H. M., Schroeder, C. M. TALE proteins search DNA using a rotationally decoupled mechanism. Nat Chem Biol. 12, 831-837 (2016).
- Yardimci, H., Loveland, A. B., van Oijen, A. M., Walter, J. C. Single-molecule analysis of DNA replication in Xenopus egg extracts. Methods. 57, 179-186 (2012).
- Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA Curtains for High-Throughput Single-Molecule Optical Imaging. Method Enzymol. 472, 293-315 (2010).
