Summary
이 논문은 digoxigenin (DIG) 표지 또는 바이오틴 표지 프로브를 사용하는 곤충 안테나에서 특히 낮은 수준으로 발현 된 Odorant Receptor (OR) 유전자 및 기타 유전자에 대해 상세하고 매우 효과적인 RNA in situ hybridization 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
곤충은 외인성 화학 신호를 감지하기 위해 정교한 후각 수용체 시스템을 발전 시켰습니다. 이 화학적 신호는 안테나의 chemosensilla라고 불리는 모발 모양의 구조물에 수용된 후각 수용체 뉴런 (ORN)에 의해 전달됩니다. ORN의 멤브레인에서 악취 수용체 (OR)는 악취 코딩에 관여한다고 여겨집니다. 따라서, ORN에 국한 된 유전자를 동정 할 수있는 것은 OR 유전자를 인식하는 데 필요하며, 기능적 현장 연구 에 대한 근본적인 기초를 제공한다. 곤충 안테나에서 특정 OR 의 RNA 발현 수준은 매우 낮으며 조직학을 위해 곤충 조직을 보존하는 것은 어렵습니다. 따라서, RNA in situ hybridization을 사용하여 특정 종류의 감각 기관에 OR을 위치시키는 것은 어렵습니다. 이 논문에서는 특히 곤충의 저 발현 OR 유전자에 대한 상세하고 매우 효과적인 RNA in situ hybridization protocol을 소개한다. 또한 특정 OR 유전자 WAOrco 를 표지자로 사용하여 이중 형광 형광 in situ 하이브리드 화 실험을 수행함으로써 확인되었다.
Introduction
가장 중요한 화학 감각 기관인 곤충 안테나는 후각 수용체 뉴런 (ORN)에 의해 자극되는 많은 모발 모양의 구조 (sensilla라고 불리는)로 덮여 있습니다. 곤충 ORN의 멤브레인에서 7 개의 막 횡단 도메인을 포함하는 유형의 악취 수용체 (OR)는 보조 수용체 (ORco)로 발현되어 냄새 유발 이온 채널 1 , 2 , 3의 기능을하는 이종 체를 형성합니다. 다른 OR는 화합물 4 , 5 , 6 의 다양한 조합에 반응합니다.
메뚜기는 (로커 스타 migratoria)을 중심으로 중요한 행동 7을 실행하는 데 후각 단서에 의존하고 있습니다. 로커스트 OR는 분자 후각 메커니즘을 이해하는 핵심 요소입니다. 특정 메뚜기 또는 유전자를 a의 뉴런으로 국한시키기RNA에 의한 형태 학적으로 특이한 sensillum type In situ hybridization (RNA ISH)은 ORs 기능을 탐색하는 첫 번째 단계입니다.
RNA ISH는 생리 학적 과정 및 질환 발병 기전에 대한 통찰력을 제공 측정 조직, 세포 또는 시츄 전체 마운트 부에 특정 RNA 서열 현지화 표지 된 상보적인 RNA 프로브를 사용한다. Digoxigenin-labeled (DIG-labeled) 및 biotin-labeled RNA 프로브는 RNA 하이브리드 화에 널리 사용되었습니다. digoxigenin-11-UTP 또는 biotin-16-UTP를 이용한 RNA 표지는 SP6 및 T7 RNA 중합 효소를 사용하여 in vitro 전사에 의해 준비 할 수 있습니다. DIG 및 비오틴 표지 RNA 프로브는 다음과 같은 장점이 있습니다. 비 방사성; 안전한; 안정된; 매우 민감한; 매우 구체적; PCR 및 시험관 전사를 사용하여 생산하기 쉽습니다. DIG 및 비오틴으로 표지 된 RNA 프로브는 발색 적 및 형광 검출이 가능합니다. DIG로 표지 된 RNA 프로브는 항 디곡시 제닌 알칼리로 검출 할 수 있습니다광학 현미경을 사용하여 또는 2 (NBT / BCIP)를 사용하여 매우 민감한 화학 발광 기질 nitroblue tetrazolium chloride / 5- 브로 모 -4- 클로로 -3- 인돌 릴 - 인산 톨루이딘 염 (NBT / BCIP)으로 시각화 할 수있는 Phosphatase (HNPP)와 4- 클로로 -2- 메틸 벤젠 디아 조늄 헤미 - 아연 클로라이드 염 (Fast Red)을 커플 링 (confocal) 현미경을 사용하여 커플 링시켰다. 비오틴 - 표지 RNA 프로브는 공 촛점 현미경을 사용하여 fluorescein-tyramides로 시각화 할 수있는 항 비오틴 streptavidin Horse Radish Peroxidase (HRP) - 결합 항체로 검출 할 수 있습니다. 따라서 이중 색 형광 in situ 하이브리드 화를 수행하여 DIG 및 비오틴으로 표지 된 RNA 프로브를 사용하여 한 조각에서 두 개의 표적 유전자를 검출 할 수 있습니다.
DIG 및 / 또는 바이오틴 표지 된 프로브를 사용한 RNA ISH는 OR , 이온 성 수용체, 악취 - 결합 단백질과 같은 후각 관련 유전자의 위치를 파악하는 데 성공적으로 사용되었습니다Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria 및 사막 메뚜기 Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16의 곤충 안테나에서의 감각 뉴런 막 단백질 그러나 곤충 OR에 RNA ISH를 수행 할 때 두 가지 중요한 문제가 있습니다 : (1) OR 유전자 ( ORco 제외)는 낮은 수준에서 소수의 세포에서만 발현되므로 신호 검출이 매우 어렵고 (2) 곤충 조직을 형태학이 보존되고 배경 소음이 낮아지는 조직학은 어려울 수 있습니다. 이 논문에서는 곤충에 OR 유전자를 국한시키기위한 RNA ISH를 기술하는 상세하고 효과적인 프로토콜(Chromogenic) 및 티라 미드 신호 증폭 (Tyramide Signal Amplification, TSA) 검출을 포함한 안테나가 제시된다.
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Protocol
참고 : RNA 분해를 제한하려면 습식 오토 클레이브 증류수 (121 ° C에서 60 분) 및 습식 오토 클레이브 재료를 사용하여 용액을 준비하십시오.
1. RNA ISH 안티센스 및 센스 프로브의 제조
- 표적 유전자 증폭 및 정제
- 먼저, LmigOR1의 전장 cDNA를 포함하는 플라스미드로부터 L. migregia OR1 ( LmigOR1 , GenBank : JQ766965)의 387 bp 이중 가닥 단편을 생성하고, 단편의 양 말단에 아데닌 을 첨가하는 Taq DNA 중합 효소를 첨가한다.
- 2x 반응 믹스 50 μL, 센스 및 안티센스 프라이머 ( 표 1 ) 4 μL, 플라스미드 템플리트 1 μL 및 RNase가없는 H 2 O 41 μL를 포함하는 100 μL 최종 반응 부피를 사용하십시오. 다음 PCR 프로토콜 : 94 ℃에서 5 분간, 94 ℃에서 30 초간, 55 ℃에서 30 초간 및 72 ℃에서 1 분간의 30 사이클, 72 ℃에서 10 분간 반응시켰다.
- 이 단계를 반복하여 LmigOR2 (GenBank : JQ766966)의 1,303bp 이중 가닥 조각과 Lmigorco (GenBank : JN989549)의 1,251bp 이중 가닥 조각을 생산하십시오 . 이 실험에 사용 된 프라이머는 표 1에 제시되어있다.
- 1X 트리스 - 아세테이트 - EDTA 버퍼에 1.2 % 아가로 오스 겔에서 PCR 제품을 실행하고 에티 디움 브로마이드 염색법을 사용하여 시각화하십시오.
- 겔 추출 키트를 사용하여 이러한 PCR 제품을 추출합니다.
- 전기 영동 후, 겔로부터 DNA 밴드를 제거하고 겔 슬라이스를 1.5 mL 튜브에 넣는다. 그런 다음 겔 조각 0.1 g 당 100 μL의 결합 버퍼 (Buffer PN)를 첨가하십시오. 소용돌이 모양으로 만들고 젤 조각이 완전히 녹을 때까지 50 ° C에서 인큐베이션하십시오.
- 수집 튜브에 CA2 흡착 칼럼을 삽입하고 균형 버퍼 (버퍼 BL) 500 μL를 추가합니다. 이는 실리카 막의 흡수 능력 및 안정성을 향상시킨다. 센트리1 분 동안 12,400 xg에서 fuge.
- 용해 된 겔 혼합물을 흡착 컬럼 어셈블리로 옮기고 실온에서 2 분 동안 인큐베이션하십시오. 그런 다음 1 분 동안 12,400 xg에서 튜브를 원심 분리하십시오. 플로우 스루 (flow-through)를 버리고 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 넣으십시오.
- 세척 용액 (에탄올 첨가, Buffer PW) 600 μL를 두 번 첨가한다. 1 분간 12,400 xg에서 원심 분리하십시오. 플로우 스루 (flow-through)를 버리고 흡착 컬럼을 수집 튜브에 다시 삽입하십시오.
- 수집 튜브를 비우고 잔류 에탄올이 증발 할 수 있도록 2 분 동안 12,400 xg에서 칼럼 어셈블리를 다시 원심 분리하십시오.
- 조심스럽게 흡착 컬럼을 깨끗한 1.5 mL 원심 튜브로 옮긴다. 5 ~ 10 분 동안 펠렛을 공기 건조시키고 nuclease가없는 물의 적당한 부피 ( 예 : 30 μL)에 DNA를 재용 해하십시오.
- RT에서 2 분 동안 품어 낸다. 2 분 동안 12,400 xg에서 원심 분리하십시오. 흡착 컬럼을 버리고 DNA를 4 ° C 또는 -20 ° C에 보관하십시오.
- 먼저, LmigOR1의 전장 cDNA를 포함하는 플라스미드로부터 L. migregia OR1 ( LmigOR1 , GenBank : JQ766965)의 387 bp 이중 가닥 단편을 생성하고, 단편의 양 말단에 아데닌 을 첨가하는 Taq DNA 중합 효소를 첨가한다.
- 재조합 플라스미드 구축
- 개별 LmigOR1, LmigOR2의 1,303 bp의 단편과 T7 (상류)와 T4 DNA 리가 아제를 사용하여 삽입 DNA 인접 SP6 (하류) RNA 폴리머 라제에 대한 프로모터를 포함하는 T 벡터로 LmigORco의 1,251 bp의 단편의 387 bp의 단편을 결찰. 다음과 같은 10 μL 반응을 준비하십시오 : 2 x 결찰 버퍼 5 μL, T 벡터 1 μL, 삽입 된 유전자의 DNA 3 μL (~ 100 ng) 및 T4 DNA 리가 제 1 μL를 넣고 4 ° C에서 O / N을 배양하십시오.
- LmigOR1의 387 bp의 단편 LmigOR2의 1,303 bp의 단편과 1.5 mL의 멸균 튜브 유능한 대장균 DH5α 세포를 50 μL로 별도로 LmigORco의 1,251 bp의 단편을 각각 함유하는 재조합 플라스미드 5 μL를 추가한다.
- 부드럽게 혼합하고 30 분 동안 얼음에 튜브를 넣은 다음 42에서 90 초 동안 품어 둡니다.기음. 3 분 동안 다시 얼음으로 옮긴다.
- 각 튜브에 암피실린없이 Luria-Bertani (LB) 액체 배지 450 μL를 넣고 37 ℃에서 1 시간 동안 150 rpm으로 진탕 기에서 배양하여 E. coli DH5α를 복원합니다.
- 각 형질 전환 체를 100 μL로 나누어 50 μg / mL 암피실린, 24 μg / mL 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 사이드 (IPTG) 및 40 μg / mL 5- 브로 모 -4가 포함 된 LB 고체 기질 플레이트에 접종하십시오 β-D- 갈 락토 피 라노 시드 (X-gal)를 수득 하였다.
- 37에서 상수 배양기에서 이러한 플레이트를 품어 ° C. 18 H. 파란색 - 흰색 스크리닝 방법을 사용하여 표적 재조합 플라스미드를 스크리닝하십시오. Sanger 시퀀싱을 사용하여 표적 재조합 플라스미드를 시퀀싱하고 세 OR 유전자의 삽입 방향을 확인하십시오.
- 제한 효소를 선택하여 재조합 플라스미드를 선형화하십시오
- 사용 제한 효소 t모자는 벡터의 다중 클로닝 부위에서 소화 될뿐만 아니라 삽입 DNA를 절단하지 않는다. 이 실험에서, 3 개의 모든 유전자가 벡터의 방향에 대응하는 방향으로 T 벡터에 삽입된다.
- 안티센스 프로브를 생성하기 LmigOR1의 387 bp의 단편 LmigOR2의 1,303 bp의 단편과 LmigORco의 1,251 bp의 단편을 함유하는 재조합 플라스미드를 선형화 NCO I 제한 엔도 뉴 클레아 제를 사용한다. 감지 프로브를 생산하는 SP 전자 I 제한 효소를 사용합니다.
참고 : 삽입 방향이 벡터의 삽입 방향과 일치하면 재조합 플라스미드를 선형화하기 위해 T7 말단의 고유 한 제한 효소를 선택하고 SP6 RNA 중합 효소를 사용하여 안티센스 프로브를 준비합니다. 재조합 플라스미드를 선형화하기 위해 SP6 말단의 독특한 제한 효소 부위를 선택하고, T7 RNA 폴리머 라제를 사용하여 센스 프로브를 준비한다. 그렇지 않으면, 삽입 방향이 t에 대응하지 않으면그 벡터의 방향, SP6 말단의 독특한 제한 효소 부위가 재조합 플라스미드를 선형화하기 위해 선택되고, T7 RNA 폴리머 라제가 안티센스 프로브를 제조하는데 사용된다. T7 말단의 유일한 제한 효소 부위는 재조합 플라스미드를 선형화하기 위해 선택되고, SP6 RNA 폴리머 라제는 센스 프로브를 준비하는데 사용된다.
- 선형화 된 재조합 플라스미드의 정제
- 다이제스트 20 μg의 LmigOR1의 387 bp의 단편 LmigOR2의 1,303 bp의 단편과 10 배의 완충액 10 μL을 포함하는 100 μL의 반응의 NCO I 제한 엔도 뉴 클레아 제를 사용 LmigORco의 1,251 bp의 단편, 40 μL를 포함하는 세 가지 재조합 플라스미드 각 0.5 μg / μL 플라스미드, 3 μL 의 Nco I 및 47 μL의 RNase-free H 2 O를 넣고 37 ° C에서 3 시간 동안 배양했다.
- 마찬가지로, 이들 세 가지 재조합 플라스미드 각각 20 μgSpe I 제한 엔도 뉴 클레아 제를 부릅니다.
- 1.1.2에서 설명한대로 겔 추출 키트를 사용하여 이러한 분해 된 플라스미드를 정제하십시오. 분광 광도계로 이러한 추출 된 선형화 된 재조합 플라스미드의 농도를 결정하고 0.5 μg / μL로 조정하십시오.
- 안티센스 및 감각 프로브 준비
- T7 / SP6 RNA 전사 시스템을 사용하여 안티센스 및 센스 프로브를 생성하십시오. SP6 RNA 중합 효소는 선형화 된 재조합 플라스미드를 시험 관내에서 주형으로 사용하여 이들 3 개 OR 유전자에 대한 DIG- 표지 및 바이오틴 표지 된 안티센스 탐침을위한 이중 가닥 RNA를 전사하는 데 사용됩니다. T7 RNA 폴리머 라제는 센스 프로브를 생산하는 데 사용됩니다. 10X NTP 믹스 2 μL, 10X 전사 버퍼 2 μL, RNase 억제제 1 μL, T7 또는 SP6 RNA 중합 효소 2 μL, 0.5 μg / μL 선형화 된 플라스미드 4 μL를 함유하는 20 μL 최종 부피에서 반응을 수행하고 RNase-free H 2 O 9 μL37 ° C에서 3 시간 동안 배양한다.
- 37 ℃에서 1 μL DNase로 30 분 동안 DIG- 및 바이오틴 표지 된 안티센스 및 센스 프로브를 인큐베이션한다. 2.5 M LiCl과 무수 에탄올 75 μL를 넣고 -70 ° C에서 30 분 동안 반응물을 부화시킨다.
- 4 ° C에서 30 분 동안 15,000 xg에서 원심 분리하십시오. 조심스럽게 상층 액을 버린다. 침전제를 씻어 70 % 에탄올 150 μL를 추가합니다. 멸균 증류수 (263.2 ML)에 95 % 에탄올 (736.8 ML)을 추가하여 70 % 에탄올 (1 L)을 준비합니다.
- 4 ° C에서 30 분 동안 15,000 xg에서 다시 원심 분리하고 RT에서 5-10 분 동안 펠렛을 공기 건조시킵니다. 25 μL의 RNase-free H 2 O를 첨가하여 RNA 안티센스와 센스 프로브를 녹인다.
- 삽입 된 유전자의 길이가 1kb보다 길다면, 중탄산염 - 탄산염 완충액에서 인큐베이션하여 ~ 300bp의 평균 길이로 RNA 안티센스 및 센스 프로브를 조각 낸다. 50 ㎕의 최종 부피에서 반응을 수행하고, cRNA 프로브 25 μL 및 중탄산염 - 탄산염 완충 용액 (80 mM NaHCO 3 , 120 mM Na 2 CO 3 , pH 10.2) 25 μL를 60 ° C에서 접종한다. 가수 분해 시간은 이전에 발표 된 화학식 17에 의해 주어진다.
- 반응을 멈추기 위해 5 μL의 10 % 초산을 첨가한다. 이 실험에서는 LmigOR2 및 Lmigorco 안티센스와 탐침을 각각 24 분 및 23 분 동안 분열시킵니다.
t = (L - L의 오 F) / F KXL O XL
L o = kb 단위의 초기 조각 길이
L f = kb 단위의 최종 단편 길이
k = 가수 분해 속도 상수, 약 0.11 kb -1 min -1
t = 가수 분해 시간 (분) - 마지막으로, 하이브 리다이 제이션 버퍼 250 μL를 추가하고 -80 ° C에서 보관하십시오.
2. 저온 유지 장치 섹션의 준비
- 프리 징 프리지마이크로톰에서 -24 ° C.
- 활성화되어 있으며 손상되지 않은 안테나가있는 새끼를 털썩 내리는 성인 메뚜기를 선택하십시오. 멸균 면도기를 사용하여 2-3mm 조각으로 안테나를 자르십시오.
- 동결 microtome 홀더에 OCT 화합물을 넣고 화합물에 수평으로 하나 또는 두 개의 시료를 넣습니다. 그런 다음 홀더를 동결 마이크로톰에 옮겨 -24 ° C에서 화합물이 얼 때까지 평형을 이룹니다. 홀더를 꺼내 약간의 화합물로 샘플을 덮으십시오. 적어도 10 분 동안 -24 ° C에서 다시 동결 용 마이크로톰으로 홀더를 옮기십시오 ( 그림 1 ).
참고 : 화합물에 거품이 들어 가지 않도록하십시오. - 냉동 microtome에 샘플과 홀더를 고정 후 -24 ° C에서 12 μm의 두께 슬라이스로 냉동 샘플을 섹션.
- 슬라이드 (25 x 75 mm, nuclease-free)에 슬라이스를 하나씩 풀고 10 분간 공기 건조시킵니다.
3. 고정 부분
- 저온 유지 장치 준비 후절편을 플라스틱 용기 (~ 100 x 40 x 80 mm)에 넣고 4 ℃에서 30 분 동안 4 % 파라 포름 알데하이드 용액 (PFA)에서 슬라이드를 배양하여 조직을 고정시킵니다.
- 슬라이드를 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 1 분간 씻으십시오.
- 알칼리성 단백질을 제거하기 위해 10 분 동안 0.2 M HCl에 슬라이드를 옮기십시오.
- 핵산의 표면 단백질을 제거하기 위해 슬라이드를 1 % Triton X-100 1XPBS로 2 분 동안 옮긴다.
- 1x PBS에서 30 초 동안 슬라이드를 두 번 씻으십시오.
- 마지막으로, 슬라이드를 4 ℃에서 10 분 동안 포름 아미드 용액으로 헹군다.
4. 혼성화
- 안티센스 및 센스 프로브 준비
- 1.5 mL의 nuclease-free tube에서 RNA antisense 또는 sense probe를 희석하기 위해 hybridization buffer를 사용하십시오. 이 실험에서 모든 안티센스 및 센스 프로브 ( LmigOR1, LmigOR2 및 LmigOrco )에 대해 99μ 에 프로브 1μLL 하이브 리다이 제이션 완충액. 일반적으로, 1 : 100 희석액의 안티센스 프로브를 사용하면이 프로토콜을 사용하여 상당한 양의 신호와 낮은 배경을 생성합니다.
- 색소 검출을 위해서는 DIG 표지 된 프로브를 개별적으로 희석하십시오.
- TSA 검출을 위해, 바이오틴 - 표지 LmigOR1와 비오틴 표지 된 프로브 또는 LmigOrco DIG 표지 LmigOR2으로 LmigOR1을 DIG 표지는 혼성화 버퍼 함께 프로빙 희석.
- 희석액을 65 ℃에서 10 분간 가열하고, 얼음 위에 적어도 5 분 동안 놓는다.
- 이종 교잡
- 슬라이드를 배액하고 조직 섹션에 희석 된 안티센스 및 감지 프로브 (단계 4.1) 100 μL를 추가합니다. 그런 다음 coverslips (24mm x 50mm, nuclease없는) 조직 섹션에 놓으십시오.
- 덮개가 달린 슬라이드를 습기 찬 상자 (~ 300 x 180 x 50mm 3 ; 그림 2 )에 수평으로 놓고t 55 ° C에서 22 시간. 상자 바닥에 포름 아미드 용액 또는 1X PBS를 넣어 습기를 유지 시키지만 액체는 물에 잠기지 않도록하십시오.
- 세탁 및 차단.
- 하이브 리다이 제이션 후 커버 슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 60 ° C에서 0.1x Saline Sodium Citrate (SSC)로 30 분간 두 번 씻으십시오.
참고 : 세척이란 슬라이드 홀더에 슬라이드를 넣은 다음 플라스틱 용기에 넣고 로커에서 부드럽게 교반하는 것을 의미합니다 (~ 50 rpm, 그림 2 ). - 슬라이드를 30 초 동안 1x TBS (Tris-Buffered Saline)로 헹굽니다.
- 각 슬라이드에 0.03 % 트리톤 X - 100로 보충 TBS에 1 % 차단 시약 1 ML을 추가하고, 30 분 동안 품어. 그런 다음 차단 용액을 버립니다.
- 하이브 리다이 제이션 후 커버 슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 60 ° C에서 0.1x Saline Sodium Citrate (SSC)로 30 분간 두 번 씻으십시오.
- 면역 조직 화학.
- 색소 검출을 위해서는 TBS에 블로킹 시약을 사용하여 750 units (U) / mL의 anti-digoxigenin AP-1.5 U / mL AP 용액으로 희석한다. 커버 된 (24mm x 50mm) 슬라이드 당 100μL의 AP 용액을 첨가하십시오.
- TSA 검출을 위해서는 AP / HRP 용액에 750U / mL의 anti-digoxigenin AP- 접합 항체와 anti-biotin streptavidin HRP- 결합 항체를 희석하기 위해 TBS에서 블로킹 시약을 사용하십시오. 커버 된 (24mm x 50mm) 슬라이드 당 100μL의 AP / HRP 용액을 첨가하십시오.
- 습도 상자 ( 그림 2 )에서 슬라이드를 37 ° C에서 60 분 동안 품어 낸다. 포름 아미드 용액 또는 1X PBS를 사용하여 상자를 촉촉하게 유지합니다.
5. 염색
- 커버 슬립을 조심스럽게 제거하십시오. 0.05 % 트윈 -20을 보충 한 1X TBS에서 5 분 동안 슬라이드를 3 번 씻으십시오. 슬라이드를 DAP- 버퍼 (색소 검출 : pH 9.5, TSA 검출 : pH 8.0)에서 5 분 동안 헹구십시오.
- 염색 (발색 검출)
- NBT (375 μg / ML) / BCIP (188 μg / ML) 기판 솔루션 (DAP에 희석의 100 μL를 추가;pH 9.5). 조심스럽게 슬라이드에 커버 슬립 (24 x 50mm)을 놓습니다.
- 37 ℃에서 O / N 10 분 동안 기질 용액으로 습한 상자에 슬라이드를 품는다.
참고 : 현미경으로 때때로 슬라이드를보고 개발 상황을 확인하십시오. - 발달이 준비되면 슬라이드를 물로 옮겨서 반응을 멈추십시오.
- 염색 (TSA 검출)
- 주사기를 사용하여 주사기 필터 (0.22 μm, 그림 2 )에서 HNPP (100 μg / mL) / Fast Red (250 μg / mL) 기판을 이동하십시오.
- coverslip (24 엑스 50mm)로 덮여 슬라이드 당 HNPP / 패스트 레드 기판 100 μL를 추가합니다. RT에서 HNPP / 패스트 레드 기판과 30 분 슬라이드를 품어.
- 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고, 0.05 % Tween-20이 첨가 된 1X TBS에서 5 분 동안 3 회 슬라이드를 씻는다.
- 100 μL의 TSA substrate / covered (24 x 50 mm 2 ) 슬라이드. RT에서 10 분 동안 TSA 기판과 슬라이드를 품어.
- 커버 슬립을 조심스럽게 제거하고 0.05 % Tween-20가 첨가 된 1x TBS에서 5 분 동안 3 번 슬라이드를 씻으십시오.
- PBS / 글리세롤 (1 : 3)에 슬라이드를 삽입합니다.
참고 :이 절차를 완료 한 후에는 형광 신호가 빨리 꺼지기 때문에 가능한 한 빨리 슬라이드를 관찰해야합니다.
6. 관측
- 염색체 검출
- 광학 현미경을 사용하여 조직 섹션을 관찰. 10X, 20X 및 40X 대물 렌즈를 선택하여 색 원 검출 결과를 관찰합니다.
- DP-BSW 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하고 이미지를 캡처하십시오.
- TSA 검출
- 공 촛점 현미경을 사용하여 조직 섹션을 관찰. DIG 표지 된 유전자는 543 nm 빛 아래에서 관찰되어야하며, 붉은 색을 나타내야하며, 바이오틴 표지 된 유전자는488 nm 빛 아래에서 관찰되었으며, 녹색을 나타냈다. 그들이 나올 때, 그들은 황색을 나타낸다.
- TSA 검출 결과를 관찰하기 위해 20X 및 40X 대물 렌즈를 선택하십시오.
- FV1000 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하고 이미지를 캡처하십시오.
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Representative Results
chromogenic 탐지, 모든 성인 antennal 섹션에서 antennal 세포의 작은 하위 집합은 DIG - 레이블 LmigOR1 및 LmigOR2 안티 센스 프로브 ( 그림 3 )로 표시되었다. RNA ISH는 국산화 연속 부에 LmigOR1 및 LmigOR2 두 유전자를 발현 더듬이 셀이 추정 LmigOR1 및 LmigOR2 실제로 ORNs에 (도 4a의 -4d)를 발현되었음을 나타내는 LmigORco 발현 ORN 클러스터에있는 것으로 나타났다. 때때로, 수상 돌기와 유사한 구조가 시각화되었습니다 ( 그림 4e -4f ). LmigOR1 과 LmigOR2 는 모두 basiconic sensilla ( 그림 5a-5b )의 뉴런에 국한되었지만 개개의 sensilla에서 공동 발현되지 않아 다른 basico에 존재 함을 나타냅니다 ( 그림 5c- 5d ).
TSA 검출에서 double-color 형광 in situ hybridization은 LmigOR1 발현 세포 (적색)가 Lmigorco (녹색 색)를 발현하는 ORN 클러스터에 위치한다는 것을 보여 주며, 이는 추정 LmigOR1 이 ORN 으로 발현되었음을 나타냅니다 ( 그림 6a ). 도 6a 의 박스 영역의 종단면 이 도 6b에 도시되어 있다 . LmigOR1 - 표현 뉴런 (녹색 색상, 그림 7a )과 LmigOR2 - 표현 뉴런 (붉은 색, 그림 7b ) 다른 basiconic sensillium subtypes ( 그림 7c )에 위치하고있었습니다.
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그림 1 : RNA in situ 하이브리드 화를위한 곤충 안테나 섹션의 준비. ( a ) 동결 마이크로톰; ( bc ) 샘플은 동결 OCT 화합물에 내장되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : RNA in situ 하이브리드 화를 위한 실험 항목 . ( a ) 슬라이드 홀더와 플라스틱 용기. ( b ) 습기 찬 상자. ( c ) 로커. ( d ) 멤브레인 필터. ( e ) 공 촛점 현미경. .jpg "target ="_ blank ">이 그림의 확대 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : 후각 기관에서의 LmigOR1 & LmigOR2 의 세포 국산화. ( a ) locust antennal 세그먼트의 LmigOR1 - 표현 세포의 개요. ( b ) locust antennal 세그먼트에 LmigOR2 - 표현 세포의 개요. 화살촉은 LmigOR1 ( a ) 및 LmigOR2 ( b )를 발현하는 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 100 μm (a 및 b). 수치는 Xu et al. 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4 : Chromogenic 감지에 의한 LmigORs 를 표현하는 안테나 세포의 연결 정체성. (AB) 로커스트 안테나의 연속하는 부분에 LmigOR1 (a) 및 LmigORco (b) 안티센스 프로브의 표지 패턴. ( CD ) locust 안테나의 연속 섹션에 대한 Lmigorco ( c ) 및 LmigOR2 ( d ) 안티센스 프로브의 라벨링 패턴. ( ef ) 때로는 수상 돌기와 같은 구조의 그림 (빨간색 화살표로 표시). 스케일 바 = 50 μm (광고); 20 ㎛ (e 및 f). 수치는 Xu et al. 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. nt "fo : keep-together.within-page ="1 ">
그림 5 : Basicic Sensilla에 내장 된 ORN에서 LmigOR1 & LmigOR2 표현 ( ab ) basicic sensillum은 LmigOR1 ( a ) 및 LmigOR2 ( b )를 발현하는 ORN을 포함 하고있다. ( cd ) 연속 안테나 ORN의 하위 집합에서 LmigOR1 과 LmigOR2 의 표현은 연속 섹션 (CD)에서 확인되었습니다. 화살촉은 LmigOR1 (a, c)와 LmigOR2 (b, d)를 발현하는 촉각 세포를 나타낸다. 바 : basiconic sensillum. 스케일 바 = 20 μm (a 및 b); 50 ㎛ (c 및 d). 수치는 Xu et al. 12 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : TSA 검출에 의한 LmigOR1 을 발현하는 안테나 세포의 연결 관계. ( a ) LmigOR1 (적색)과 Lmigorco (녹색)의 발현을 설명하기 위해 종축 촉미 절편 에서 2 색 in situ hybridization을 수행 하였다. Lmigorco를 발현하는 세포 클러스터에서 LmigOR1- 발현 세포의 국소화 는 그의 신경 신원을 확인했다. ( b )에있는 박스 영역의보기 닫기 a. 때로는 표시된 돌기 모양의 구조가 화살표로 표시되었습니다. 원형 영역은 ORN이 Lmigorco를 표현하고 동일한 감각 을 공유하는 것을 나타냅니다. 스케일 바 = 50 μm (a); 20 ㎛ (b). 수치는 Xu et al. 12 제발이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 핥아 라.
그림 7 : LmigOR1 과 LmigOR2 는 TSA Detection에 의해 다른 Basiconic Sensilla ORN에 위치했습니다. 형광 신호는 검출 시스템을 사용하여 가시화되었으며, 녹색 형광 ( a )에 의한 LmigOR1- 표지 뉴런 및 적색 형광에 의한 LmigOR2 양성 세포 ( b )가 상이한 basiconic sensilla 아형 ( c )에서 발현되었다는 것을 나타낸다. 화살촉은 LmigOR1 과 LmigOR2를 발현하는 촉각 세포를 나타낸다. 스케일 바 = 20 μm. 수치는 Xu et al. 12 여기를 클릭하여이 그림의 더 큰 버전.
| 이름 | 시퀀스 |
| Lmig OR1-probe-s | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1-probe-as | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-s | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2-probe-as | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| Lmig Orco-probe-s | 5'-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco-probe-as | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGACCT-3 ' |
표 1 : PCR 프라이머의 서열.
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Discussion
ORCO를 제외한 OR 유전자의 발현 수준이 매우 낮고 곤충 안테나의 조직 학적 조각을 보존하는 것이 매우 어렵 기 때문에 곤충 안테나에서 OR 유전자를 국소화하기 위해 RNA ISH를 수행하는 것은 어렵다. 또한 TSA 탐지 또한 매우 까다 롭습니다. 이러한 문제를 해결하기 위해 다음과 같은 조치를 취해야합니다. 안테나는 얇고 부드러운 촉각 촉모가있는 새로 태어난 성인 메뚜기에서 선택됩니다. 냉동 된 시료는 12 μm 두께의 조각으로 구분됩니다. 매우 민감하고 특이적인 biotin- 및 DIG- 표지 된 probe가 사용됩니다. Tween-20 및 Triton X-100과 같은 세제는 여러 단계에서 배경을 감소시키는 데 사용됩니다. TSA 검출에서, 저 발현 유전자와 관련하여 고도로 발현 된 유전자는 바이오틴 -16-UTP로 표지되어야한다. 형광 신호가 빨리 감쇄되기 때문에 슬라이드를 가능한 빨리 관찰해야합니다.
DIG- a비오틴 표지 된 프로브는 방사성 프로브보다 긴 유효 기간, 더 높은 신호 대 잡음비 및 더 우수한 세포 분해능의 장점을 가지고 있습니다 18 , 19 . 이 논문에서 제시된 프로토콜은 전체 mount in situ hybridization 에 비해 몇 가지 장점을 가지고있다. 이 프로토콜은 쉽게 세포 수준에서 유전자의 현지화를 식별하지만, 전체 마운트 인 시츄 하이브리드 화를 통해보다 쉽게 수행되는 유전자 분포 패턴을 조사하는 데는 쉽게 사용할 수 없습니다.
OR 유전자를 확인하기 위해 두 가지 방법이 사용되었습니다. 하나는 연속 절편에서 발색 검출이었고 다른 하나는 한 절에서 형광 검출이었다. ORco 는 특정 OR 과 함께 ORN 마커 10 , 20 , 21로 표현 됩니다. LmigOR1 또는 LmigOR2를 발현하는 세포는 모두Lmigorco 발현 세포의 클러스터에 OR ( 그림 4 및 그림 6 )을 명확하게 증명했다. 동일한 접근법을 사용하여 우리는 LmigOR1 과 LmigOR2 가 하나의 감각 기관 에서 동시에 발현되지 않는다는 것을 발견했습니다. 이 두 가지 접근 방식의 결과는 확실합니다.
이 프로토콜은 또한 메뚜기 안테나 10 , 14 에서 Lmigorco, SgreORco, SgreIR8a 및 SgreIR25a 를 현지화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 최근 LmigOR3 동일한 프로토콜을 사용하여 15의 L. migratoria에 sensilla 뉴런 trichoid에 국한되었다. 이 프로토콜은 두 감각 신경 막 단백질을 지역화하는 데 사용되었습니다 S. gregaria 의 안테나에서 SgreSNMP1 과 SgreSNMP2 16 . 따라서이 프로토콜은 locust 안테나에서 화학 감각 관련 유전자를 안정적으로 국한 시켰는데,이들 유전자를 다양한 종류의 감각 기관에 수용된 특정 세포에 국한시켰다.
결론적으로, RNA ISH의이 매우 효과적인 프로토콜은 곤충 안테나에서 저수준으로 발현 된 다른 유전자뿐만 아니라 OR 유전자를 국한시키기 위해 구체적으로 기술되어있다.
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Disclosures
저자는 공개 할 내용이나 그 밖의 다른 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (No.31472037)의 지원으로 지원됩니다. 이 기사의 상호 또는 상업 제품에 대한 언급은 특정 정보를 제공 할 목적으로 만 사용되었으며 권장 사항을 의미하지는 않습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
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