Summary
מאמר זה מתאר פרוטוקול RNA מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו, במיוחד עבור גנים של קולטנים (OR), המופיעים ברמה נמוכה, וכן בגנים אחרים, באנטנות חרקים באמצעות בדיקות דיגוקיגנין (DIG) או תוויות ביוטין.
Abstract
חרקים פיתחו מערכות מתוחכמות של קליטת חוש הריח לחוש אותות כימיים אקסוגניים. אלה האותות הכימיים הם transduced על ידי נוירונים קולטן חוש הריח (ORNs) שוכנים במבנים דמויי שיער, המכונה chemosensilla, של האנטנות. על קרום של ORN, Odorant קולטנים (ORs) הם האמינו להיות מעורב ריחוף ריח. לפיכך, היכולת לזהות גנים הממוקמים ל- ORN נחוצה כדי לזהות גנים, ומספקת בסיס יסודי לתפקוד תפקודי נוסף באתרו . רמות ביטוי RNA של ספציפיים או S אנטנות חרקים הם נמוכים מאוד, ושימור רקמות חרקים עבור היסטולוגיה מאתגרת. לכן, קשה למקם OR לסוג מסוים של sensilla באמצעות RNA ב הכלאה באתרו . במאמר זה, רנ"א מפורט ויעיל בפרוטוקול הכלאה באתרו במיוחד עבור גנים לידי ביטוי נמוך של חרקים, הוא הציג. בנוסף, או ספציפי גןS זוהה על ידי ביצוע ניאון פעמיים צבע ניסויי הכלאה באתרו באמצעות שיתוף קולטן ביטוי קולטן, אורקו , כסמן.
Introduction
אנטנות חרקים, שהן האיברים הכימוזנריים החשובים ביותר, מכוסים במבנים רבים דמויי שיער - הנקראים סנסיליה - המושרשים על ידי נוירונים של קולטן חוש הריח (ORN). על הממברנה של חרקים ORN, רצפטורים אודורנט (ORs), סוג של חלבון המכיל שבעה תחומים transmembrane, באים לידי ביטוי עם corceptor (ORCO) כדי ליצור heteromer המתפקד כמו ערוץ יון מלוטש יון 1 , 2 , 3 . ORs שונים מגיבים לשילובים שונים של חומרים כימיים 4 , 5 , 6 .
ארבה ( Locusta migratoria ) בעיקר להסתמך על רמזים חוש הריח כדי להפעיל התנהגויות חשובות 7 . ORS ארבה הם גורמים מרכזיים להבנת מנגנוני הריח המולקולריים. לוקליזציה של ארבה או גן ספציפי לנוירון שלמורפולוגית ספציפית סוג sensillum על ידי RNA ב הכלאה Situ (RNA ISH) הוא הצעד הראשון בחקר הפונקציה ORs.
רנ"א משתמשת בדיקה מסומנת RNA משלים למדוד ולמקם רצף מסוים RNA בסעיף של רקמות, תאים או mounts כולו באתרם , מתן תובנות תהליכים פיזיולוגיים מחלה פתוגנזה. Digoxigenin שכותרתו (DIG שכותרתו) ו ביוטין שכותרתו בדיקות RNA כבר בשימוש נרחב הכלאה RNA. RNA תיוג עם digoxigenin-11-UTP או biotin-16-UTP יכול להיות מוכן על ידי שעתוק במבחנה עם SP6 ו T7 RNA פולימריות. DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יש את היתרונות הבאים: לא רדיואקטיבי; בטוח; יַצִיב; רגיש מאוד; ספציפיים מאוד; וקל לייצר באמצעות PCR ו שעתוק במבחנה . DIG ו- biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות chromogenically ו זוהה fluorescently. DIG שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אלקלי דיגוקסגנין אנטיNe-phosphatase (AP) נוגדנים conjugated כי ניתן לדמיין גם עם המצעים chemiluminescent רגיש nitroblue tetrazolium כלוריד / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine מלח (NBT / BCIP) באמצעות מיקרוסקופ אופטי או עם 2 הידרוקסיה -3-naphtoic חומצה -2 '-phenylanilide פוספט (HNPP) יחד עם 4-chloro-2-methylbenzenediazonium חמי אבץ כלוריד מלח (אדום מהיר) באמצעות מיקרוסקופ confocal. Biotin שכותרתו בדיקות RNA יכול להיות מזוהה עם אנטי ביוטין streptavidin צנון סוס צחצוח Peroxidase (HRP) - conjugated נוגדנים שיכולים להיות דמיינו עם tyramides פלואורסצין באמצעות מיקרוסקופ confocal. לכן, פעמיים צבע פלואורסצנט הכלאה באתרו יכול להתבצע כדי לזהות שני גנים היעד בפרוסה אחת באמצעות בדיקות DIG ו ביוטין שכותרתו RNA.
RNA ISH עם DIG- ו / או בדיקות שכותרתו ביוטין שימש בהצלחה למקם גנים ההרחה הקשורות, כגון OR, ionotropic קולטן, חלבון odorant מחייבואת החלבון נוירון חישה, ב אנטנות חרקים של, אך לא רק, תסיסנית melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria ואת ארבה המדבר Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . עם זאת, ישנם שני אתגרים משמעותיים בעת ביצוע RNA ISH עבור חרקים ORS: (1) או גנים (למעט ORCO ) באים לידי ביטוי ברמות נמוכות ורק במספר תאים, מה שהופך זיהוי האות קשה מאוד, (2) שימור רקמת חרקים עבור היסטולוגיה, כך שהמורפולוגיה נשמרת ורעש הרקע נמוך, יכול להיות מאתגר. במאמר זה פרוטוקול מפורט ויעיל המתאר RNA ISH עבור לוקליזציה או גנים חרקיםאנטנות מוצג, כולל הן Chromogenic ו Tyramide איתות הגברה (TSA) גילוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כדי להגביל השפלה RNA, להכין פתרונות באמצעות מים מזוקקים רטוב autoclaved (ב 121 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות) וגם חומרים אוטוקלאב רטוב.
1. הכנת RNA ISH Antisense והרגשות בדיקה
- המטרה הגברה הגן וטיהור
- ראשית, לייצר קטע BP 387 כפול stranded של L. Migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) מן הפלסמיד המכיל את cDNA באורך מלא של LmigOR1 עם פולימרז DNA Taq שמוסיף adenines לשני הקצוות של שברי.
- השתמש 100 μL נפח התגובה הסופי, המכיל 50 μL של תערובת תגובה 2x, 4 μL כל תחושות חושים antisense ( טבלה 1 ), 1 μL של תבנית פלסמיד, ו 41 μL של RNase חינם H 2 O. השתמש PCR הבאים פרוטוקול: 94 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות, ואחריו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 s, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 72 מעלות צלזיוס למשך דקה 1, ואחריו 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- חזור על שלבים אלה כדי לייצר את 1,303 bp פעמיים נתקע קטע של LmigOR2 (GenBank: JQ766966) ו 1,251 bp פעמיים נתקע קטע של Lmigorco (GenBank: JN989549). פריימרים המשמשים בניסויים אלה מוצגים בלוח 1 .
- הפעל מוצרים PCR על 1.2% agarose ג'ל 1x חיץ טריס אצטט-EDTA לדמיין באמצעות מכתים ethidium bromide.
- חלץ מוצרים אלה PCR באמצעות ערכת מיצוי ג 'ל.
- בעקבות אלקטרופורזה, להקות ה- DNA הבלו מן הג'ל ומניחים את פרוסות ג'ל בצינור 1.5 מ"ל. לאחר מכן, להוסיף 100 μL של חיץ מחייב (Buffer PN) לכל 0.1 גרם של פרוסת ג'ל. וורטקס ו דגירה על 50 מעלות צלזיוס עד פרוסת ג'ל הוא מומס לחלוטין.
- הכנס עמודה ספיחה CA2 לתוך צינור איסוף ולהוסיף 500 μL למאגר איזון (מאגר B). זה משפר את יכולת קליטה ויציבות של קרום סיליקה. CentriFuge ב 12,400 xg עבור 1 דקות.
- מעבירים את תערובת ג'ל מומס על הרכבה טור הספינה ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2 דקות. ואז, צנטריפוגה צינורות ב XG 12,400 דקות. מחק את הזרימה דרך מחדש את עמודה ספיחה לתוך צינור אוסף.
- הוסף 600 μL של פתרון לשטוף (הוסיף אתנול, PW הצפת) פעמיים. צנטריפוגה ב XG 12,400 במשך 1 דקות. מחק זרימת דרך מחדש את עמודה ספיחה לתוך צינור אוסף.
- רוקן את צינור איסוף ו modernrifuge הרכבה עמודה ב XG 12,400 למשך 2 דקות כדי לאפשר אידוי של אתנול שיורית כלשהי.
- בזהירות העברת עמודה ספיחה לצינור 1.5 מ"ל צנטריפוגה נקי. אוויר יבש את הכדור במשך 5-10 דקות ו redissolve את הדנ"א בנפח מתאים ( למשל, 30 μL) של מים ללא nuclease.
- דגירה ב RT במשך 2 דקות. צנטריפוגה ב XG 12,400 במשך 2 דקות. מחק עמודה ספיחה ולאחסן את ה- DNA ב 4 מעלות צלזיוס או -20 מעלות צלזיוס.
- ראשית, לייצר קטע BP 387 כפול stranded של L. Migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) מן הפלסמיד המכיל את cDNA באורך מלא של LmigOR1 עם פולימרז DNA Taq שמוסיף adenines לשני הקצוות של שברי.
- לבנות את הפלסמידים רקומביננטי
- בנפרד ligate את קטע 387 bp של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע bp של Lmigorco לתוך וקטור T המכיל האמרגן עבור T7 (במעלה) ו SP6 (במורד הזרם) פולימרים RNA צמוד דנ"א מוכנס באמצעות ליגז T4 DNA. הכן את התגובה הבאה 10 μL: 5 μL של חיץ קשירת 2x, 1 μL של וקטור T, 3 μL (~ 100 ng) של ה- DNA של הגן מוכנס 1 μL של ליגז DNA T4, ו דגירה O / N ב 4 מעלות צלזיוס.
- הוסף 5 μL של כל פלסמיד רקומביננטי המכיל את קטע bp 387 של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של LmigORco בנפרד לתוך 50 μL של תאים Escherichia coli DH5α מוסמך ב סטרילי צינורות 1.5 מ"ל.
- מערבבים בעדינות ולשים את צינורות לתוך הקרח במשך 30 דקות ולאחר מכן דגירה אותם עבור 90 s ב 42° C. מעבירים אותם בחזרה לקרח במשך 3 דקות.
- הוסף 450 μL של Luria-Bertani בינוני (LB) נוזל בינוני ללא ampicillin לכל צינור ו דגירה אותם שייקר בסל"ד 150 עבור 1 שעה ב 37 ° C כדי לשחזר את E. coli DH5α.
- קח 100 aliquot μL של כל transformant ולהשתמש בהם כדי לחסן LB מוצק צלחות המצע המכיל 50 מיקרוגרם / mL ampicillin, 24 מיקרוגרם / מ"ל isopropyl β-D-1-thiogalactopyranנוסide (IPTG), ו 40 מיקרוגרם / מ"ל 5-bromo-4 כלורו -3-אינדוליל-β-D-galactopyranoside (X-gal).
- דגירה אלה צלחות בחממה קבועה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 18 שעות. מסך היעד פלסמידים רקומביננטי באמצעות שיטת ההקרנה כחול לבן. רצף היעד פלסמידים רקומביננטי באמצעות סידור רצף ולזהות את שלושת הגנים או להוסיף כיוונים.
- בחר הגבלת endonucleases כדי ליניארי פלסמידים רקומביננטי
- השתמש endonucleases הגבלה לאלא רק לעכל באתר שיבוט מרובים של הווקטור, אלא גם לא לחתוך את ה- DNA להוסיף. בניסוי זה, כל 3 גנים מוכנסים לתוך וקטור T בכיוון המתאים לזה של וקטור.
- השתמש non אני הגבלה endonuclease כדי לינאריזציה רקומביננטי פלסמידים המכילים את החלק 387 BP של LmigOR1 , 1,303 קטע bp של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של Lmigorco לייצר את בדיקות antisense. השתמש Sp e אני הגבלה endonuclease לייצר בדיקות חוש.
הערה: אם הכיוון להוסיף מתאים לזה של וקטור, ולאחר מכן אתר הגבלה ייחודי מסוף T7 נבחר לינאריזציה רקומביננטי פלסמיד ו SP6 RNA פולימראז משמש להכנת בדיקה antisense. אתר הגבלה ייחודי מסוף SP6 נבחר ללינאריזציה של הפלסמיד רקומביננטי, ואת הפולימרז T7 RNA משמש להכנת בדיקה חוש. אחרת, אם כיוון ההוספה אינו מתאים ל - tהוא כיוון של וקטור, ואז אתר הגבלה ייחודי מסוף SP6 נבחר לינאריזציה רקומביננטי פלסמיד ו T7 RNA פולימראז משמש להכנת בדיקה antisense. אתר הגבלה ייחודי מסוף T7 נבחר לינאריזציה רקומבינציה רקומביננטי, ואת פולימרז SP6 RNA משמש להכנת בדיקה חוש.
- טיהור פלסמידים רקומביננטי ליניארי
- Digest 20 מיקרוגרם כל אחד משלושת פלסמידים רקומביננטי המכיל את קטע BP 387 של LmigOR1 , 1,303 קטע BP של LmigOR2 ו 1,251 קטע BP של LmigORco באמצעות endonuclease NCO אני הגבלה בתגובת 100 μL המכיל 10 μL של חיץ 10x, 40 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL פלסמיד, 3 μL של NCO אני ו 47 μL של RNase חינם H 2 O, ואחריו הדגירה 3 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
- באופן דומה, לעכל 20 מיקרוגרם של כל אלה שלושה פלסמידים רקומביננטי uלשיר את endonuclease הגבלת Spe לי.
- טיהור אלה פלסמידים מתעכל באמצעות ערכת מיצוי ג 'ל כמתואר 1.1.2. לקבוע את הריכוזים של אלה שחולצו linasmized רקומביננטי פלסמידים על ידי spectrophotometry ולהתאים 0.5 מיקרוגרם / μL.
- הכינו בדיקות אנטיסנס וחיישנים
- השתמש במערכת השעתוק T7 / SP6 RNA כדי ליצור בדיקות אנטיסנס וחוש. SP6 RNA פולימראז משמש לתעתוק RNA פעמיים תקועים עבור DIG ו- biotin שכותרתו antisense בדיקות אלה שלושה גנים באמצעות פלסמידים רקומביננטי לינארית כמו תבניות במבחנה . הפולימרז T7 RNA משמש לייצר בדיקות חוש. לבצע את התגובה בנפח סופי 20 μL, המכיל 2 μL של 10x תערובת NTP, 2 μL של חיץ תמליל 10X, 1 μL של מעכבי RNase, 2 μL של פולימרז T7 או SP6 RNA, 4 μL של 0.5 מיקרוגרם / μL linasmized פלסמיד ו 9 μL RNase חינם H 2 O, אחריועל ידי הדגירה 3 שעה ב 37 מעלות צלזיוס.
- דגירה DIG ו- biotin שכותרתו antisense והבחינות חוש במשך 30 דקות עם DNase 1 μL ב 37 מעלות צלזיוס. הוסף 2.5 μL של 5 M LiCl ו 75 μL של אתנול מוחלט, ולאחר מכן דגירה התגובות במשך 30 דקות ב -70 מעלות צלזיוס.
- צנטריפוגה ב XG 15,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C. בזהירות decant supernatant. הוסף 150 μL של אתנול 70% לשטוף את המשקע. הכן אתנול 70% (1 L) על ידי הוספת אתנול 95% (736.8 מ"ל) למים מזוקקים סטריליים (263.2 מ"ל).
- צנטריפוגה ב XG 15,000 במשך 30 דקות ב 4 ° C שוב ויבש את האוויר גלולה במשך 5-10 דקות ב RT. הוסף 25 μL של RNase חינם H 2 O כדי לפזר את antisense רנ"א בדיקות חוש.
- אם אורכו של הגן שהוכנס הוא יותר מ 1 kb, לאחר מכן רסיס RNA antisense בדיקות חוש לאורך ממוצע של 300 ~ BP על ידי הדגירה של bicarbonate-carbonate פתרונות חיץ. בצע את התגובה 50 נפח סופי μL, גOntaining 25 μL של בדיקה RNA ו 25 μL של פתרון חיץ ביקרבונט-פחמתי (80 מ"מ NaHCO 3 , 120 מ"מ Na 2 CO 3 , pH 10.2) ב 60 מעלות צלזיוס. זמן הידרוליזה נדרש על ידי נוסחה שפורסמה בעבר 17 .
- הוסף 5 μL של חומצה אצטית 10% כדי לעצור את התגובה. בניסוי זה, שבר את LmigOR2 ו Lmigorco antisense ואת תחושת בדיקות עבור 24 ו - 23 דקות, בהתאמה.
t = (L o -L ו) / KXL o XL F
O L = אורכי שהבר הראשוניים kb
L = F אורך השבר הסופי ב kb
K = קצב קבוע עבור הידרוליזה, כ 0.11 קילו -1 דקות -1
T = זמן הידרוליזה בדקה - לבסוף, להוסיף 250 μL של חיץ הכלאה ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס.
2. הכנת קטעי קרייסטט
- טפחו את הפריזיNg microtome ל -24 ° C.
- בחר ארבה מבוגר חדש, כי הם פעילים ויש להם אנטנות שלמות. חותכים את האנטנות לחתיכות 2-3 מ"מ באמצעות סכיני גילוח סטריליים.
- שים מתחם OCT על מחזיק microtome מקפיא והניח אחד או שניים דגימות על המתחם אופקית. לאחר מכן, להעביר את בעל לתוך microtome מקפיא ב -24 ° C כדי לאזן עד המתחם קופא. מוציאים את המחזיק ומכסים את הדגימות במתחם קטן. מעבירים את המחזיק לתוך microtome מקפיא ב -24 ° C שוב לפחות 10 דקות ( איור 1 ).
הערה: הימנע מקבל בועות במתחם. - תקן את בעל עם דגימות לתוך microtome מקפיא, ולאחר מכן סעיף דגימות קפוא לתוך פרוסות 12 מיקרומטר עבה ב -24 ° C.
- להפשיר את הפרוסות בזה אחר זה על שקופיות (25 x 75 מ"מ, nuclease חינם) ואוויר יבש במשך 10 דקות.
3. תיקון מדורים
- לאחר הכנת cryostatסעיפים, לשים את השקופיות במיכל פלסטיק (~ 100 x 40 x 80 מ"מ), ולתקן את הרקמות על ידי דוגרים את השקופיות בפתרון paraformaldehyde 4% (PFA) במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את השקופיות 1X פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) במשך 1 דקות.
- כדי לחסל את חלבונים אלקליין, להעביר את השקופיות 0.2 M HCl במשך 10 דקות.
- כדי לחסל את החלבונים פני השטח של חומצה גרעין, להעביר את השקופיות ל 1XPBS עם 1% Triton X-100 עבור 2 דקות.
- שטפו את השקופיות פעמיים במשך 30 שניות 1x PBS.
- לבסוף, לשטוף את השקופיות פתרון formamide במשך 10 דקות ב 4 ° C.
4. הכלאה
- הכינו את החיישנים האנטישמיים והחיוניים
- השתמש חיץ הכלאה לדלל RNA antisense או תחושת בדיקות צינורות 1.5 מ"ל nuclease חינם. בניסוי זה, עבור כל בדיקות antisense ואת תחושת ( LmigOR1, LmigOR2, ו LmigOrco ), להוסיף 1 μL של בדיקה 99 μL חיץ הכלאה לכל שקופית. בדרך כלל, השימוש בדילול של 1: 100 של בדיקות אנטיסנס מייצר איתותים חיוביים משמעותיים ורקעים נמוכים באמצעות פרוטוקול זה.
- עבור זיהוי כרומוגני, לדלל DIG שכותרתו בדיקות בנפרד.
- עבור זיהוי TSA, לדלל DIG שכותרתו LmigOR1 עם ביוטין שכותרתו בדיקות LmigOrco או DIG שכותרתו LmigOR2 עם בדיקות ביוטין LmigOR1 שכותרתו במאגר הכלאה.
- מחממים את דילולים למשך 10 דקות על 65 מעלות צלזיוס ולשים אותם על הקרח במשך 5 דקות לפחות.
- הַכלָאָה
- מסננים את השקופיות ומוסיפים 100 μL של antisense בדילול בדיקות חוש (שלב 4.1) על קטעי רקמות. ואז, coverslips מקום (24 מ"מ x 50 מ"מ, nuclease חינם) על קטעי רקמה.
- מניחים את השקופיות מכוסות אופקית לתוך תיבת לח (~ 300 x 180 x 50 מ"מ 3 , איור 2 ) ו דגירהT 55 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות. הוסף פתרון פורממיד או 1X PBS לחלק התחתון של התיבה כדי לשמור על לחות הסביבה, אבל לא להטביע את השקופיות בנוזל.
- כביסה וחסימה.
- לאחר הכלאה, להסיר את coverslips בזהירות. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 30 דקות ב 0.1x מלח נתרן ציטראט (SSC) ב 60 ° C.
הערה: כביסה פירושה לשים את השקופיות במחזיק שקופיות, ולאחר מכן להציב לתוך מיכל פלסטיק בעדינות agitated על נדנדה (~ 50 סל"ד, איור 2 ). - שוטפים את השקופיות 1x Tris-Buffered מלוחים (TBS) במשך 30 s.
- הוסף 1 מ"ל של 1% חסימת מגיב ב TBS בתוספת 0.05% Triton X-100 על כל שקופית, ו דגירה של 30 דקות. לאחר מכן, מחק את פתרון החסימה.
- לאחר הכלאה, להסיר את coverslips בזהירות. לשטוף את השקופיות פעמיים במשך 30 דקות ב 0.1x מלח נתרן ציטראט (SSC) ב 60 ° C.
- אימונוהיסטוכימיה.
- עבור זיהוי כרומוגני, להשתמש בחסימת מגיב ב TBS לדלל 750 יחידות (U) / מ"ל אנטי Digoxigenin AP מצומד antiboDy כדי 1.5 U / מ"ל פתרון AP. הוסף 100 μL של פתרון AP לכל שקופית (24 מ"מ x 50 מ"מ) שקופית.
- עבור זיהוי TSA, השתמש בחסימת מגיב ב- TBS כדי לדלל 750 U / mL של נוגדן אנטי-Digoxigenin AP- מצומדות ונגד נוגדנים נוגדי אנטי-ביוטין streptavidin HRP- מצמידים לפתרון AP / HRP. הוסף 100 μL של פתרון AP / HRP לכל מכוסה (24 מ"מ x 50 מ"מ) שקופית.
- דגירה השקופיות בתיבה לח ( איור 2 ) במשך 60 דקות על 37 מעלות צלזיוס. השתמש פתרון פורממיד או 1X PBS לשמור על תיבת לח אך לא רטוב.
5. מכתים
- הסר את coverslips בזהירות. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב 1x TBS בתוספת 0.05% Tween-20. שוטפים את השקופיות במאגר DAP (זיהוי כרומוגני: pH 9.5: זיהוי ה- TSA: pH 8.0) במשך 5 דקות.
- מכתים (זיהוי כרומוגני)
- הוסף 100 μL של NBT (375 מיקרוגרם / מ"ל) / BCIP (188 מיקרוגרם / מ"ל) פתרון המצע (מדולל DAP;PH 9.5) לכל שקופית. בזהירות במקום coverslips (24 x 50 מ"מ) על השקופיות.
- דגירה השקופיות בתיבה לח עם פתרון המצע עבור 10 דקות - O / N ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: בדוק את הפיתוח על ידי הסתכלות על השקופיות מעת לעת מתחת למיקרוסקופ. - כאשר הפיתוח מוכן, לעצור את התגובה על ידי העברת השקופיות לתוך המים.
- מכתים (זיהוי TSA)
- השתמש מזרק להעביר את HNPP (100 מיקרוגרם / מ"ל) / אדום מהיר (250 מיקרוגרם / מ"ל) המצע מסנן מזרק (0.22 מיקרומטר, איור 2 ).
- הוסף 100 μL של HNPP / מצע אדום מהיר לכל שקופית מכוסה coverslip (24 x 50 מ"מ). דגירה שקופיות במשך 30 דקות עם המצע HNPP / אדום מהיר ב RT.
- הסר את coverslips בזהירות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות 1X TBS בתוספת 0.05% Tween-20.
- השתמש 100 μL של מצע TSA / מכוסה (24 x 50 מ"מ 2 ) שקופית. דגירה שקופיות עם מצע TSA במשך 10 דקות ב RT.
- הסר את coverslips בזהירות, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך 5 דקות ב 1x TBS בתוספת 0.05% Tween-20.
- הטמיעו את השקופיות ב- PBS / גליצרול (1: 3).
הערה: לאחר סיום הליכים אלה, השקופיות יש לראות בהקדם האפשרי, כי האות ניאון יהיה להרוות במהירות.
6. תצפית
- איתור כרומוגני
- צפה סעיפים רקמות באמצעות מיקרוסקופ אופטי. בחר את 10X, 20X, ו 40X עדשות אובייקטיביות כדי לבחון את התוצאות של זיהוי כרומוגני.
- השתמש בתוכנה DP-BSW כדי לנתח את התוצאות וללכוד את התמונות.
- זיהוי TSA
- צפה בסעיפים רקמה באמצעות מיקרוסקופ confocal. DIG שכותרתו גנים יש לראות תחת 543 ננומטר אור, המציג צבע אדום, גנים שכותרתו ביוטין צריך להיותנצפו תחת 488 ננומטר אור, המציג צבע ירוק. כאשר הם מופיעים, הם מציגים צבע צהוב.
- בחר את 20X ו 40X עדשות אובייקטיביות כדי לבחון את התוצאות של זיהוי TSA, בהתאמה.
- השתמש בתוכנה FV1000 כדי לנתח את התוצאות וללכוד את התמונות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
עם זיהוי כרומוגני, תת קבוצה קטנה של תאים antennal בכל סעיף antennal המבוגר היה מסומן על ידי DIG שכותרתו LmigOR1 ו Lmigor2 בדיקות antisense ( איור 3 ). RNA על מקטעים רצופים כדי למקם LmigOR1 ו LmigOR2 הראה כי תאים אנטנלים המבטאים את שני הגנים היו ממוקמים באשכולות ORN להביע Lmigorco , המציין כי LmigOR1 ו LmigOR2 משוערים היו למעשה לידי ביטוי ORNs ( איור 4 א -4 ד ). מדי פעם, מתויגים מבנים דמויי דנדריטים היו דמיינו ( איור 4e -4f ). LmigOR1 ו- LmigOR2 היו ממוקמים גם לנוירונים בסינסילה הבסיסית ( איור 5a-5b ), אך הם לא היו שותפים לביטוי בסנסילה אינדיבידואלית, דבר המצביע על כך שהם נכחו בבסיס אחר תת subillium תת ( איור 5 ג -5 ד ).
בזיהוי TSA, צבע פלואורסצנטי בצבע כפול באתרו הראה כי תאים LmigOR1 -expressing (צבע אדום) היו ממוקמים אשכולות ORN להביע Lmigorco (צבע ירוק), המציין כי LmigOR 1 המוכר בא לידי ביטוי ORNs ( איור 6 א ). מבט מקרוב על האזורים המצורפים בתרשים 6 א מוצגים בתרשים 6 ב . LmigOR1 - מבטאים נוירונים (צבע ירוק, איור 7 א ) ו Lmigor2 - expressing נוירון (צבע אדום, איור 7b ) היו ממוקמים תת סוגים שונים sensillium basiconic ( איור 7 ג ).
4 / 55924fig1.jpg "/>
איור 1: הכנת חרקים אנטנאל חרקים עבור רנ"א בהכלאה באתרו . ( א ) מיקרוטרום מקפיא; ( Bc ) דגימות מוטבע מקפיא OCT. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: פריטים ניסיוניים עבור רנ"א בהכלאה באתרו . ( א ) מחזיק השקופיות ומיכל הפלסטיק. ( ב ) תיבת לח. ( ג ) נדנדה. ( ד ) מסנן הממברנה. ( ה ) מיקרוסקופ confocal. .jpg "target =" _ blank "> לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: לוקליזציה ניידת של Lmigor1 & Lmigor2 באורגני ריח . ( א ) סקירה כללית של תאים LmigOR1 -expressing במקטע אנטנה ארבה. ( ב ) סקירה כללית של תאים LmigOR2 -expressing במקטע אנטנה ארבה. ראשי חץ מצביעים על תאים המבטאים את LmigOR1 ( a ) ו- LmigOR2 ( b ). סולם ברים = 100 מיקרומטר (a ו- b). דמויות הותאמו מ Xu et al. 12 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: זהות עצבית של תאים אנטנלים מבטאים Lmigors על ידי בדיקות כרומוגניות . ( Ab ) דפוס תיוג של LmigOR1 ( a ) ו Lmigorco ( b ) antisense בדיקה על חלקים רצופים של האנטנה ארבה. ( Cd ) תבנית התווית של Lmigorco ( c ) ו LmigOR2 ( d ) antisense בדיקה על חלקים רצופים של האנטנה ארבה. ( Ef ) איור של מבנים שכותרתו לעתים דנדריטים (מסומנים בחצים אדומים). פסי סולם = 50 מיקרומטר (מודעה); 20 מיקרומטר (e ו- f). דמויות הותאמו מ Xu et al. 12 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה. Nt "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 5: LmigOR1 & LmigOR2 מבוטא ב ORNs השוכן Sensilla Basiconic. ( Ab ) Sensylum Basiconic שוכנו ORNs להביע LmigOR1 ( א ) ו Lmigor2 ( ב ). ( Cd ) הביטוי של LmigOR1 ו LmigOR2 בתת קבוצה נפרדת של ORNs antennal אומת על סעיפים עוקבים (cd). Arrowheads מציינים תאים antennal להביע LmigOR1 (א, ג) ו LmigOR2 (ב, ד). Ba: sensillum בסיסי. פסי סולם = 20 מיקרומטר (a ו- b); 50 מיקרומטר (c ו- d). דמויות הותאמו מ Xu et al. 12 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
Gether.within-page = "1"> 
איור 6: זהות עצבית של תא אנטנלים מבטא LmigOR1 על ידי גלאי TSA. ( א ) הכלאה בצבע שני באתרה בוצעה על קטע אנטנאל האורך כדי להמחיש את הביטוי של LmigOR1 (אדום) ו Lmigorco (ירוק). לוקליזציה של תאים Lemigor1 -expressing באשכולות התא להביע Lmigorco אישר את הזהות העצבית. ( ב ) סגור את התצוגה של אזורים מוקסנים ב. מדי פעם מתויגים מבנים דנדריטים כמו מסומנים בחץ. אזורים מעוגלים מצביעים על צביר ORN המבטא את Lmigorco ומשתפים אותו סנסילום . סולם ברים = 50 מיקרומטר (א); 20 מיקרומטר (b). דמויות הותאמו מ Xu et al. 12 אנא cללקק כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 7: LmigOR1 & LmigOR2 היו ממוקמים שונים בזיכרון Sensilla ORNs על ידי איתור TSA. אותות ניאון היו דמיינו באמצעות מערכות זיהוי, המציין LmigOR1 נוירונים תווית על ידי הקרינה הירוקה ( א ) ו LmigOR2 תאים חיוביים על ידי הקרינה האדומה ( ב ) באו לידי ביטוי תת סוגים sensilla בסיסיים בסיסיים ( c ). Arrowheads מציינים תאים antennal להביע LmigOR1 ו LmigOR2 . סולם ברים = 20 מיקרומטר. דמויות הותאמו מ Xu et al. 12 לחץ כאן כדי לראות אגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| שֵׁם | רצפים |
| Lmig OR1- בדיקה | 5'-AAGGGGTGGGAGACGGCCTG-3 ' |
| Lmig OR1- בדיקה - כמו | 5'-CAGCTCCTCCCCAACGACAGC-3 ' |
| Lmig OR2- בדיקה | 5'-ATGGGTGAGCGTGGAGAGGC-3 ' |
| Lmig OR2- בדיקה - כמו | 5'-GGTCATCGCTGTGGACGTGG-3 ' |
| Lmig Orco- בדיקה | 5-CTCGTCTGACAGCGTAACTCAC-3 ' |
| Lmig Orco- בדיקה - כמו | 5'-AAGACGCAGAAGAGGAAGCT-3 ' |
טבלה 1: רצפים של פריימרים PCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
זה קשה לבצע RNA ISH כדי למקם או גנים אנטנות חרקים בגלל רמות ביטוי של גנים או, למעט ORCO , הם נמוכים מאוד ושמירה פרוסות היסטולוגית של אנטנות חרקים קשה מאוד. בנוסף, זיהוי TSA הוא גם מאוד מסובך. כדי לטפל בבעיות אלה, יש לנקוט בצעדים הבאים. האנטנות נבחרות מתוך ארבה מבוגר החדש שיש להם עור רזה רך cuticles, אשר לשמור על המורפולוגיה שלהם על השקופית. הדגימות קפואים הם מחולקים לתוך 12 פרוסות עבה מיקרומטר. נעשה שימוש בבדיקות ביוטין ובדיג שכותרתו במיוחד. דטרגנטים, כגון Tween-20 ו- Triton X-100, משמשים להקטנת הרקע בצעדים רבים. בזיהוי ה- TSA, גן שהביע את ביטויו, יחסית לגן אחר שהביע ביטוי נמוך, צריך להיות מתויג עם biotin-16-UTP. השקופיות יש לראות בהקדם האפשרי כי האותות ניאון יהיה להרוות במהירות.
דיג - אNd בדיקות biotin שכותרתו יש את היתרונות של חיי מדף ארוכים יותר, אות גבוה יותר יחס רעש ורזולוציה הסלולר טוב יותר בדיקות רדיואקטיביות 18 , 19 . פרוטוקול המוצג במאמר זה יש כמה יתרונות על פני הר שלם הכלאה באתרו . פרוטוקול זה מזהה בקלות את לוקליזציה של גנים ברמה התאית, אבל לא ניתן להשתמש בהם בקלות כדי לחקור דפוסי הפצה גנים, אשר מבוצעת בקלות רבה יותר עם הר שלם הכלאה באתרו .
כדי לזהות גן OR, נלקחו שתי גישות. אחד מהם היה זיהוי כרומוגני בקטעים עוקבים, והשני היה זיהוי פלואורסצנטי בחלק אחד. ORCO הוא שיתוף הביע עם ספציפי או כמו סמן ORN 10 , 20 , 21 . תאים המביעים LmigOR1 או Lmigor2 היו שניהם ממוקמיםכדי אשכולות של תאים lmigorco -express אשר אימת באופן חד משמעי אותם כמו OR ( איור 4 ו איור 6 ). באמצעות אותן גישות, מצאנו כי Lmigor1 ו Lmigor2 אינם באים לידי ביטוי אחד sensillum. התוצאות של שתי הגישות הללו הן אגרסיביות.
פרוטוקול זה שימש בהצלחה גם כדי למקם Lmigorco, Sgreorco, SgreIR8a ו SgreIR25a באנטנות ארבה 10 , 14 . לאחרונה LmigOR3 היה מקומי ל טריכויד נוירונים סנסיל ב l migratoria באמצעות פרוטוקול זהה 15 . פרוטוקול זה שימש כדי למקם שני חלבונים חושי עצבי קרום SgreSNMP1 ו- SgreSNMP2 באנטנות של ס. גרגריה 16 . לפיכך, פרוטוקול זה אמין מקומי chemosensory הקשורים גנים באנטנות ארבה, אשר לא רק אימות אלהגנים מועמדים, אלא גם מיקמו גנים אלה לתאים ספציפיים השוכנים בסוגים שונים של סנסילה.
לסיכום, זה פרוטוקול יעיל מאוד של RNA ISH מתואר במיוחד כדי למקם או גנים, כמו גם גנים אחרים לידי ביטוי ברמות נמוכות, אנטנות חרקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף או כל ניגודי אינטרסים אחרים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכת על ידי מענק מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (No.31472037). אזכור שמות מסחריים או מוצרים מסחריים במאמר זה הוא אך ורק לצורך מתן מידע ספציפי ואין פירושו המלצה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 2×TSINGKETM Master Mix | TSINGKE, China | TSE004 | |
| RNase-free H2O | TIANGEN, China | RT121-02 | |
| REGULAR AGAROSE G-10 | BIOWEST, SPAIN | 91622 | |
| Binding buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Balance buffer | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| Wash solution | TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China | DP209-02 | |
| T Vector | Promega, USA | A362A | |
| T4 DNA Ligase | Promega, USA | M180A | |
| Escherichia coli DH5α | TIANGEN, China | CB101 | |
| Ampicillin | Sigma, USA | A-6140 | |
| Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside | Inalco, USA | 1758-1400 | |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside | SBS Genetech, China | GX1-500 | |
| Nco I | BioLabs, New England | R0193S | |
| Spe I | BioLabs, New England | R0133M | |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| Biotin RNA Labeling Kit | Roche, Switzerland | 11685597910 | |
| DNase | DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland | 11175025910 | |
| LiCl | Sinopharm, China | 10012718 | |
| Ethanol | Sinopharm, China | 10009257 | |
| Acetic acid | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands | 4583 | |
| Slides | TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China | FISH0010 | |
| HCl | Sinopharm, China | 80070591 | |
| Millex | Millipore, USA | SLGP033RS | |
| Tween 20 | AMRESCO, USA | 0777-500ML | |
| Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt | Roche, Switzerland | 11175041910 | |
| Glycerol | Sinopharm, China | 10010618 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | V900483-1KG | 0.04 mol/L Tris-Base |
| 1×Tris-acetate-EDTA | BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China | 10000292 | 0.12% acetic acid |
| 1×Tris-acetate-EDTA | Sigma, USA | 03677 | Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| Luria-Bertani (LB) liquid medium | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | Sinopharm, China | 10019392 | 10 g/L NaCl |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM335231 | 10 g/L Peptone from casein (Tryptone) |
| LB solid substrate plate | MERCK, Germany | VM361526 | 5 g/L Yeast extract |
| LB solid substrate plate | WISENT ING, Canada | 800-010-CG | 15 g/L Agar Bacteriological Grade |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sinopharm, China | 10019392 | 8.5% NaCl |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900041-500G | 14 mM KH2PO4 |
| 10×Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1) | Sigma, USA | V900268-500G | 80 mM Na2HPO4 |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sigma, USA | V900483-1KG | 1 M Tris-Base |
| 10×Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5) | Sinopharm, China | 10019392 | 1.5 M NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900483-1KG | 100 mM Tris-Base |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sinopharm, China | 10019392 | 100 mM NaCl |
| Detection Buffer (DAP) chromogenic detection pH 9.5 TSA detection pH 8.0 | Sigma, USA | V900020-500G | 50 mM MgCl2·6H2O |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sinopharm, China | 10019392 | 3 M NaCl |
| 20×saline-sodium citrate (pH 7.0) | Sigma, USA | V900095-500G | 0.3 M Na-Citrate |
| 4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5) | Sigma, USA | V900894-100G | 4% paraformaldehyde |
| Sodium Carbonate Buffer | Sigma, USA | V900182-500G | 0.1 M NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | V900182-500G | 80 mM NaHCO3 |
| Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2) | Sigma, USA | S7795-500G | 120 mM Na2CO3 |
| Formamide Solution (pH 10.2) | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Formamide Solution (pH 10.2) | 5×saline-sodium citrate | ||
| Blocking Buffer in TBS | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1% Blot |
| Blocking Buffer in TBS | AMRESCO, USA | 0694-500ML | 0.03% Triton X-100 |
| Blocking Buffer in TBS | 1×Tris buffered saline | ||
| Alkaline phosphatase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Roche, Switzerland | 11175041910 | 1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody |
| Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution | Blocking Buffer in TBS | ||
| Hybridization Buffer | MPBIO, USA | FORMD002 | 50% Deionized Formamide |
| Hybridization Buffer | 2×saline-sodium citrate | ||
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D8906-50G | 10% dextran sulphate |
| Hybridization Buffer | invitrogen, USA | AM7119 | 20 µg/mL yeast t-RNA |
| Hybridization Buffer | Sigma, USA | D3159-10G | 0.2 mg/mL herring sperm DNA |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate (10 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Roche, Switzerland | 11758888001 | 1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL) |
| 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2'-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate | Detection Buffer | ||
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | 2% fluorescein-tyramides |
| Tyramide signal amplification substrate | TSA kit, Perkin Elmer, USA | NEL701A001KT | Amplification Diluent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instrument | |||
| Freezing microtome | Leica, Nussloch, Germany | Jung CM300 cryostat | |
| Spectrophotometer | Thermo SCIENTIFIC, USA | NANODROP 2000 | |
| Optical microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus IX71microscope | |
| Confocal microscope | Olympus, Tokyo, Japan | Olympus BX45 confocal microscope |
References
- Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
- Smart, R., et al. Drosophila odorant receptors are novel seven transmembrane domain proteins that can signal independently of heterotrimeric G proteins. Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 770-780 (2008).
- Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
- Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7258), 66-71 (2010).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
- Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (9), 4418-4423 (2010).
- Hassanali, A., Njagi, P. G., Bashir, M. O. Chemical ecology of locusts and related acridids. Annu Rev Entomol. 50, 223-245 (2005).
- Schaeren-Wiemers, N., Gerfin-Moser, A. A single protocol to detect transcripts of various types and expression levels in neural tissue and cultured cells: in situ hybridization using digoxigenin-labeled cRNA probes. Histochemistry. 100 (6), 431-440 (1993).
- Vosshall, L. B., Amrein, H., Morozov, P. S., Rzhetsky, A., Axel, R. A spatial map of olfactory receptor expression in the Drosophila antenna. Cell. 96 (5), 725-736 (1999).
- Yang, Y., Krieger, J., Zhang, L., Breer, H. The olfactory co-receptor Orco from the migratory locust (Locusta migratoria) and the desert locust (Schistocerca gregaria): identification and expression pattern. Int J Biol Sci. 8 (2), 159-170 (2012).
- Schultze, A., et al. The co-expression pattern of odorant binding proteins and olfactory receptors identify distinct trichoid sensilla on the antenna of the malaria mosquito Anopheles gambiae. PLoS One. 8 (7), e69412 (2013).
- Xu, H., Guo, M., Yang, Y., You, Y., Zhang, L. Differential expression of two novel odorant receptors in the locust (Locusta migratoria). BMC Neurosci. 14, 50 (2013).
- Saina, M., Benton, R. Visualizing olfactory receptor expression and localization in Drosophila. Methods Mol Biol. 1003, 211-228 (2013).
- Guo, M., Krieger, J., Große-Wilde, E., Mißbach, C., Zhang, L., Breer, H. Variant ionotropic receptors are expressed in olfactory sensory neurons of coeloconic sensilla on the antenna of the desert locust (Schistocerca gregaria). Int J Biol Sci. 10 (1), 1-14 (2013).
- You, Y., Smith, D. P., Lv, M., Zhang, L. A broadly tuned odorant receptor in neurons of trichoid sensilla in locust, Locusta migratoria. Insect Biochem Mol Biol. 79, 66-72 (2016).
- Jiang, X., Pregitzer, P., Grosse-Wilde, E., Breer, H., Krieger, J. Identification and characterization of two "Sensory Neuron Membrane Proteins" (SNMPs) of the desert locust, Schistocerca gregaria (Orthoptera: Acrididae). J Insect Sci. 16 (1), 33 (2016).
- Angerer, L. M., Angerer, R. C. In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes. In situ hybridization. Wilkinson, D. G. , IRL Press. Oxford. 2 (1992).
- Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate. Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).
- Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots. Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).
- Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Cell. 117 (7), 965-979 (2004).
- Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution. Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).
