Summary
पारंपरिक स्लैब जेल वैद्युतकणसंच (SGE) प्रयोगों में एक जटिल उपकरण और उच्च रासायनिक खपत की आवश्यकता होती है। यह काम एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो कम समय की सीमा के भीतर डीएनए टुकड़ों को अलग करने के लिए कम लागत वाली विधि का वर्णन करता है।
Abstract
स्लैब जेल वैद्युतकणसंचलन (एसजीई) डीएनए टुकड़ों के अलग होने के लिए सबसे आम तरीका है; इस प्रकार, यह व्यापक रूप से जीव विज्ञान और अन्य लोगों के क्षेत्र में लागू होता है हालांकि, पारंपरिक SGE प्रोटोकॉल काफी थकाऊ है, और प्रयोग में एक लंबा समय लगता है। इसके अलावा, एसजीई प्रयोगों में रासायनिक खपत बहुत अधिक है। यह काम एक एसजीई चिप के आधार पर डीएनए टुकड़ों के अलग होने के लिए एक सरल विधि का प्रस्ताव करता है। चिप एक उत्कीर्णन मशीन द्वारा बनाई गई है। ऑप्टिकल संकेत के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के लिए दो प्लास्टिक शीट का उपयोग किया जाता है। डीएनए बैंड के प्रतिदीप्ति संकेत स्मार्टफोन द्वारा एकत्र किया जाता है इस पद्धति को मान्य करने के लिए, 50, 100, और 1,000 बीपी डीएनए सीढ़ी अलग हो गए थे। परिणाम दर्शाते हैं कि 5,000 बीपी से छोटा डीएनए सीढ़ी 12 मिनट के भीतर हल किया जा सकता है और इस पद्धति का उपयोग करते समय उच्च संकल्प के साथ यह इंगित करता है कि यह पारंपरिक एसजीई विधि के लिए आदर्श विकल्प है।
Introduction
स्लैब जेल वैद्युतोसोरिसिस (एसजीई) डीएनए टुकड़ा अलग 1 , 2 , 3 , 4 , 5 के लिए सबसे प्रभावी तरीका है और इस प्रकार 6 , 7 , 8 के जैव रासायनिक और जैविक विश्लेषणों में एक बहुमुखी उपकरण माना जाता है। हालांकि, कई प्रयोगों से संकेत मिलता है कि एसजीई निम्नलिखित चार समस्याओं से प्रतिबंधित है: (1) पृथक्करण कई घंटे और दिन भी लेते हैं; (2) रासायनिक खपत बहुत अधिक है; (3) इसके लिए एक जटिल तंत्र की आवश्यकता होती है ( उदाहरण के लिए, 2 डी वैद्युतकणसंचलन सेल, वैद्युतकणसंचलन बिजली की आपूर्ति, और जेल इमेजिंग सिस्टम); (4) जेल इमेजिंग सिस्टम केवल जब प्रयोग समाप्त हो जाता है तो अलग डीएनए टुकड़े का निरीक्षण कर सकता है। इसके अलावा, नैदानिक ब्रोमाइड (एटीबीआर), जो सामान्यतः एसजीई 9 में प्रयोग किया जाता है ,Ass = "xref"> 10, उत्परिवर्तनीय और कैंसरजन्य 11 , 12 है । इस प्रकार, एटब्रे युक्त जैल सौंपते समय दस्ताने को हमेशा पहना जाना चाहिए
एसईजी की तुलना में केशिलरी वैद्युतोसोरिसिस (सीई) के कई फायदे 13 , 14 , 15 , 16 , 17 हैं , जैसे स्वत: संचालन, छोटे पृथक्करण समय और कम खपत। हालांकि, सीई यंत्र काफी महंगा है। इसलिए, उन सीमाओं पर काबू पाने के लिए, डीएनए के विभाजन के लिए एक प्रणाली विकसित की गई है ( चित्रा 1 )। इस तरह की प्रणाली न केवल रासायनिक खपत को कम कर सकती है और एसजीई प्रयोग के समय (<8 मिनट) को बचा सकती है, लेकिन यह स्मार्टफोन द्वारा एगारोस जेल में डीएनए अलग प्रक्रिया की रीयल-टाइम ट्रैकिंग भी कर सकती है। इस प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करके, छात्रों shouएलडी एसजीआई चिप डिजाइन और तैयार करने में सक्षम हो, चिप में agarose जेल तैयार करें, एक स्मार्टफोन के साथ एक सरल एसजीई प्रणाली की स्थापना करें, और agarose जेल में डीएनए प्रवासन प्रक्रिया रिकॉर्ड करें।
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Protocol
1. एसजीआईपी चिप के बुनियादी डिजाइन
- किसी भी पारदर्शी प्लास्टिक का प्रयोग करें, जैसे पोलीमेथाइलमैथैक्रीलाट (पीएमएमए) या पॉली कार्बोनेट
नोट: SGE चिप चित्रा 1 बी में प्रदर्शित किया गया है एसजीई चिप में टीबीई बफर के लिए बेलनाकार छिद्र, डीएनए पृथक्करण के लिए चैनल और इलेक्ट्रोड के लिए छेद के साथ दो लेन शामिल हैं। - लेज़र एनग्रेविंग मशीन का उपयोग करके पीएमएमए ब्लॉक में एसजीई चैनलों का निर्माण करना।
नोट: चिप के ज्यामितीय पैरामीटर अलग होने के लिए डीएनए के आकार पर निर्भर हैं। उदाहरण के लिए, एसजीआईपी चिप के लिए इष्टतम चैनल पैरामीटर 2.5 मिमी x 4.0 मिमी x 90 मिमी (चौड़ाई x गहराई x लंबाई) अगर डीएनए का टुकड़ा 1,000 बीपी से छोटा है - एसजीई डिजाइन के आधार पर, डीएनए नमूना लोड करने के लिए चिप में कुओं को बनाने के लिए कंघी बनाना।
2. Agarose जेल की तैयारी
- 10 × टीबीई (1 × टीबीई =) को मिलाकर 0.5 × टीबीई तैयार करें89 मिमी त्रि, 89 मिमी बोरिक एसिड, और 2 मिमी ईडीटीए; पीएच 8.4) और आसुत जल 1:19 अनुपात में।
- 100 बीपी डीएनए सीढ़ी के अलग होने के लिए 1.0% agarose जेल तैयार करें।
नोट: 0.5 एक्स टीबीई बफर में agarose की एकाग्रता अलग होने के लिए डीएनए टुकड़ों के आकार पर निर्भर है। - 0.1 ग्राम agarose को एक फ्लास्क में रखें और 10 एमएल 0.5x टीबीई बफर जोड़ें।
नोट: तैयार समाधान की मात्रा फ्लास्क की क्षमता के 1/3 से कम होनी चाहिए। - संरक्षक फिल्म के साथ फ्लास्क मुहरें और फिर एक माइक्रोवेव (मध्यम, 1.0 मिनट) में agarose / बफर मिश्रण गर्मी। फ्लास्क को माइक्रोवेव में लगाने से पहले, एक विस्फोट के मामले में संरक्षक फिल्म में कुछ छेद करें।
- SGE चिप के 4 चैनलों में 2.7 एमएल का पिघला हुआ agarose समाधान डालो। कुएं को बनाने के लिए agarose समाधान में कंघी रखें।
नोट: पिघला हुआ agarose समाधान कमरे के तापमान पर 3 मिनट बाद जेल राज्य के लिए शांत हो जाएगा। - जी से कंघी निकालेंएल्स और जेल को कवर करने के लिए 0.9 एमएल 0.5x टीबीई बफर जोड़ें।
3. SGE चिप में इलेक्ट्रोफोरेसीस चलाना
- एलईडी प्रकाश स्रोत चालू करें और प्रकाश स्रोत के ऊपर एक 425 से 505 एनएम बैंडपास फिल्टर रखें।
- एक 100 बीपी डीएनए सीढ़ी के 14.4 μL और एक vortexer का उपयोग करके 1.6 एमएल का एसआईबीआर ग्रीन मिलाएं।
- SGE चिप ( चित्रा 2 ) में agarose जेल के प्रत्येक कुएं में मिश्रण के 4 μL लोड करें।
- इलेक्ट्रोड को एसजीई चिप के दो लेन में रखें।
- SGE चिप के ऊपर 550 से 700 एनएम बैंडपास फिल्टर रखें।
- शक्ति स्रोत पर स्विच करें बिजली के वोल्टेज को 180 वी (20 वी / सेमी) में सेट करें डीएनए टुकड़ा अलग प्रक्रिया ( चित्रा 3 ) रिकॉर्ड करने के लिए स्मार्टफोन चालू करें।
- जब 10 मिनट बाद वैद्युतकणसंचलन समाप्त होता है, तो बिजली का स्रोत और एलईडी प्रकाश बंद करें।
- SGE चिप को साफ करें
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Representative Results
चित्रा 4 , चित्रा 5 , और चित्रा 6 50, 100, और 1,000 बीपी डीएनए सीढ़ी के जेल वैद्युतकणसंचलन के बाद एक सामान्य परिणाम का प्रतिनिधित्व करते हैं। प्रयोग के बाद, डीएनए टुकड़े अच्छी तरह से अलग थे। इसके अलावा, एक ही नमूने एसजीई चिप के 4 चैनलों में अलग हो गए थे, यह दिखाते हुए कि एक ही आकार के डीएनए टुकड़े प्रत्येक प्रयोग में एक ही दूरी पर ले जाते हैं।
डीएनए सीढ़ी के अलगाव प्रदर्शन का मूल्यांकन प्रवास की दूरी और डीएनए आकार के लघुगणक के विश्लेषण के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है; इस प्रकार, अज्ञात डीएनए टुकड़ों के आकार की गणना करने के लिए एसजीई को लागू किया जा सकता है। चित्रा 3 में , यह पाया गया कि माइग्रेशन दूरी डीएनए आकार का लघुगणक से समानांतर से संबंधित है जब डीएनए आकार 700 बीपी से छोटा होता है।
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चित्रा 1 : योजनाबद्ध और चित्र ( ए ) वास्तविक समय ट्रैकिंग डीएनए जुदाई प्रणाली का एक योजनाबद्ध आरेख। इसमें प्रकाश स्रोत, ऑप्टिकल फ़िल्टर और सीजीआईपी चिप के रूप में एलईडी सरणी शामिल है। स्मार्टफोन डीएनए प्रवासन प्रक्रिया को रिकॉर्ड कर सकता है। ( बी ) SGE चिप ( सी ) वैद्युतकणसंचलन के लिए इकट्ठा डिवाइस इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 2 : जेल लोड हो रहा है एक छात्र इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
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चित्रा 3 : एक छात्र एक स्मार्टफोन पर माइग्रेशन रिकॉर्डिंग करता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
चित्रा 4 : SGE चिप पर 50-बीपी डीएनए सीढ़ी का पृथक्करण। SGE चिप में चैनल के लिए ज्यामितीय पैरामीटर 2.5 मिमी x 4.0 मिमी x 90 मिमी (चौड़ाई x गहराई x लंबाई) है। जुदाई वोल्टेज 120 वी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5 : SGE चिप पर 100-बीपी डीएनए सीढ़ी का पृथक्करण। जीSGE चिप में चैनल के लिए एपेट्रिक पैरामीटर 2.5 मिमी x 4.0 मिमी x 90 मिमी (चौड़ाई x गहराई x लंबाई) है। जुदाई वोल्टेज 120 वी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6 : SGE चिप पर 1,000-बीपी डीएनए सीढ़ी का पृथक्करण। SGE चिप में चैनल के लिए ज्यामितीय पैरामीटर 3.6 मिमी x 4.0 मिमी x 90 मिमी (चौड़ाई x गहराई x लंबाई) है। जुदाई वोल्टेज 180 वी है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
एगरोस जेल वैद्युतकणसंचलन को व्यापक रूप से डीएनए, आरएनए, और प्रोटीन के अलग होने के लिए उपयोग किया जाता है। यह काम पारंपरिक जेल वैद्युतकणसंचलन प्रोटोकॉल को बदलने के लिए एक नई विधि का प्रस्ताव है। परिणाम दर्शाते हैं कि 50, 100, और 1,000 बीपी डीएनए सीढ़ी ऐसे छोटे इकट्ठे डिवाइस में अलग हो सकते हैं। इस विधि का महान लाभ यह है कि न केवल छोटे रासायनिक खपत के साथ न्यूक्लिक एसिड को अलग कर सकता है, लेकिन यह जुदाई प्रक्रिया को भी रिकॉर्ड कर सकता है। हालांकि डीएनए टुकड़े चित्रा 2 में व्यापक दिखते हैं, परिणाम एसजीआईपी के मापदंडों के अनुकूलन और agarose जेल की एकाग्रता से सुधार किया जा सकता है। इसके अलावा, कुल एसजीई प्रक्रिया 10 मिनट से ज्यादा नहीं लेती है अगर चिप में प्रीसेल जैल का उपयोग किया जाता है।
चिप में चैनल की चौड़ाई बदलती है तो डीएनए सीढ़ी के अलग प्रदर्शन काफी अलग है। उदाहरण के लिए, जब 1,000-बीपी डीएनए सीढ़ी अलग हो जाती है, तो डीएनए बैंड बड़े दिखता है अगरचैनल की चौड़ाई छोटा है यह शायद संभव है क्योंकि agarose जेल में जौल हीटिंग बहुत अधिक 18 है , जो अलग प्रदर्शन को प्रभावित करता है।
यहां प्रस्तावित एसजीई विधि बहुत सरल है। एक पोर्टेबल मिनी-एसजीई डिवाइस विकसित किया जा सकता है, यदि सिस्टम अनुकूल है। इस तरह की युक्ति को बिंदु-की-देखभाल प्रयोगशाला परीक्षण के लिए लागू किया जा सकता है।
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Disclosures
ब्याज के कोई संघर्ष घोषित नहीं किया जाता है
Acknowledgments
चीन की नेशनल नॅचुरल साइंस फाउंडेशन (नंबर 21205078) और चीन की उच्च शिक्षा के डॉक्टरल कार्यक्रम (नो .123-23120110002) के लिए हम रिसर्च फंड से आभार व्यक्त करते हैं। यह काम आंशिक रूप से चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान एवं विकास कार्यक्रम (2016 YFB1102303), चीन के राष्ट्रीय मूल अनुसंधान कार्यक्रम (973 कार्यक्रम, 2015 सीबी 352001) और चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (61378060) द्वारा समर्थित था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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