Summary
Традиционные эксперименты с электрофорезом на гелевом слое (SGE) требуют сложного аппарата и высокого потребления химических веществ. В этой работе представлен протокол, в котором описывается недорогой метод разделения фрагментов ДНК за короткий промежуток времени.
Abstract
Электрофорез на гелевом слое (SGE) является наиболее распространенным методом разделения фрагментов ДНК; Таким образом, он широко применяется в области биологии и других. Однако традиционный протокол SGE довольно утомительный, и эксперимент занимает много времени. Более того, химическое потребление в экспериментах SGE очень велико. В этой работе предлагается простой способ разделения фрагментов ДНК на основе микросхемы SGE. Чип сделан гравировальной машиной. Для длины волны возбуждения и излучения оптического сигнала используются два пластиковых листа. Сигнал флуоресценции полос ДНК собирается смартфоном. Для проверки этого метода были разделены ДНК-лестницы 50, 100 и 1000 пар оснований. Результаты показывают, что лестница ДНК размером менее 5000 пар оснований может быть разрешена в течение 12 мин и с высоким разрешением при использовании этого метода, что указывает на то, что она является идеальной заменой традиционного метода SGE.
Introduction
Электрофорез в гелевом слое (SGE) является наиболее эффективным методом разделения фрагментов ДНК 1 , 2 , 3 , 4 , 5 и, таким образом, он считается универсальным инструментом в биохимических и биологических анализах 6 , 7 , 8 . Однако многие эксперименты показывают, что SGE ограничивается следующими четырьмя проблемами: (1) отрыв занимает много часов и даже дней; (2) потребление химикатов очень велико; (3) он требует сложного устройства ( например, ячейки двумерного электрофореза, электрофореза и системы формирования изображений геля); (4) система гелеобразования может наблюдать только отделенные фрагменты ДНК, когда эксперимент закончен. Кроме того, бромид этидия (EtBr), который обычно используется в SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, является мутагенным и канцерогенным 11 , 12 . Таким образом, перчатки всегда следует носить при передаче гелей, содержащих EtBr.
Капиллярный электрофорез (CE) имеет многочисленные преимущества 13 , 14 , 15 , 16 , 17 по сравнению с SGE, такие как автоматическая работа, короткое время разделения и более низкий расход. Однако, прибор CE довольно дорог. Поэтому для преодоления этих ограничений была разработана система ( рис. 1 ) для разделения ДНК. Такая система может не только значительно снизить потребление химикатов и сэкономить время эксперимента SGE (<8 мин), но также может осуществлять отслеживание процесса разделения ДНК в агарозном геле в режиме реального времени с помощью смартфона. Следуя процедурам, описанным в этом протоколе, учащиесяLd сможет проектировать и изготовлять чип SGE, готовить агарозный гель в чипе, настраивать простую систему SGE со смартфоном и записывать процесс миграции ДНК в агарозном геле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Базовый дизайн SGE Chip
- Используйте любой прозрачный пластик, такой как полиметилметакрилат (ПММА) или поликарбонат.
Примечание. Микросхема SGE показана на рисунке 1B . Микросхема SGE состоит из цилиндрических отверстий для TBE-буфера, каналов для разделения ДНК и двух полос, встроенных в отверстия для электрода. - Создайте массивы каналов SGE в блоке PMMA с помощью лазерной гравировальной машины.
Примечание. Геометрические параметры кристалла зависят от размера ДНК, подлежащей разделению. Например, оптимальные параметры канала для микросхемы SGE составляют 2,5 мм х 4,0 мм х 90 мм (ширина х глубина х длина), если фрагмент ДНК меньше 1000 п.о. - На основе конструкции SGE изготовляйте гребенки для создания колодцев в чипе для загрузки образца ДНК.
2. Приготовление агарозного геля
- Подготовьте 0,5 × TBE путем смешивания 10 × TBE (1 × TBE =89 мМ Трис, 89 мМ борной кислоты и 2 мМ ЭДТА; РН 8,4) и дистиллированной воды в соотношении 1:19.
- Подготовьте 1,0% агарозный гель для разделения ДНК-лестниц 100 п.н.
Примечание. Концентрация агарозы в буфере 0,5х TBE зависит от размеров фрагментов ДНК, подлежащих разделению. - Поместите 0,1 г агарозы в колбу и добавьте 10 мл 0,5-кратного TBE-буфера.
Примечание: Объем готового раствора должен составлять менее 1/3 емкости колбы. - Уплотните колбу защитной пленкой, а затем нагрейте смесь агароз / буфер в микроволновой печи (среда, 1,0 мин). Перед тем, как положить колбу в микроволновую печь, сделать некоторые отверстия в защитной пленке в случае взрыва.
- Налейте 2,7 мл расплавленного раствора агарозы в 4 канала чипа SGE. Поместите гребенку в раствор агарозы для создания колодцев.
Примечание: расплавленный раствор агарозы остынет до состояния геля при комнатной температуре через 3 мин. - Удалите гребенку из gИ добавьте 0,9 мл 0,5-кратного TBE-буфера для покрытия геля.
3. Запуск электрофореза в чипе SGE
- Включите светодиодный источник света и установите полосовой фильтр от 425 до 505 нм над источником света.
- Смешайте 14,4 мкл ДНК-лестницы 100 п.н. и 1,6 мкл SYBR Green с использованием вихревого.
- Загрузите 4 мкл смеси в каждую лунку агарозного геля на чипе SGE ( рисунок 2 ).
- Поместите электрод в две полосы чипа SGE.
- Установите фильтр шириной от 550 до 700 нм над чипом SGE.
- Включите источник питания. Установите электрическое напряжение до 180 В (20 В / см). Включите смартфон для записи процесса разделения фрагментов ДНК ( рисунок 3 ).
- Когда электрофорез закончен через 10 минут, выключите источник питания и светодиодную лампу.
- Очистите чип SGE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Рисунок 4 , Рисунок 5 и Рисунок 6 представляют собой типичный результат после гель-электрофореза из 50, 100 и 1000 пар оснований ДНК-лестниц. После эксперимента фрагменты ДНК были хорошо разделены. Кроме того, те же самые образцы были разделены на 4 канала микросхемы SGE, показывая, что фрагменты ДНК одинакового размера перемещаются на одном и том же расстоянии в каждом эксперименте.
Эффективность разделения ДНК-лестницы можно оценить, проанализировав соотношение расстояния миграции и логарифма размера ДНК; Таким образом, SGE может применяться для расчета размера неизвестных фрагментов ДНК. На рисунке 3 было обнаружено, что расстояние миграции линейно связано с логарифмом размера ДНК, когда размер ДНК меньше 700 п.о.
Jpg "/>
Рисунок 1 : Схема и изображения. ( A ) Схематическое изображение системы разделения ДНК в режиме реального времени. Он включает в себя светодиодную матрицу в качестве источника света, оптического фильтра и чипа CGE. Смартфон может записывать процесс миграции ДНК. ( B ) Чип SGE. ( C ) Устройство, собранное для электрофореза. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2 : Студент загружает гель. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
5926fig3.jpg "/>
Рисунок 3 : Студент, записывающий миграцию на смартфон. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4 : Разделение ДНК-лестниц 50 п.н. на чипе SGE. Геометрические параметры канала в чипе SGE составляют 2,5 мм х 4,0 мм х 90 мм (ширина х глубина х длина). Напряжение разделения составляет 120 В. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5 : Разделение ДНК-лестниц 100 п.н. на чипе SGE. GЭометрические параметры для канала в чипе SGE составляют 2,5 мм х 4,0 мм х 90 мм (ширина х глубина х длина). Напряжение разделения составляет 120 В. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6 : Разделение ДНК-лестниц 1000 п.н. на чипе SGE. Геометрические параметры канала в чипе SGE составляют 3,6 мм х 4,0 мм х 90 мм (ширина х глубина х длина). Разделительное напряжение составляет 180 В. Пожалуйста , нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Электрофорез в агарозном геле широко используется для разделения ДНК, РНК и белка. В этой работе предлагается новый метод замены традиционного протокола электрофореза на геле. Результаты показывают, что ДНК-лестницы 50, 100 и 1000 пар оснований могут быть хорошо разделены на таком небольшом собранном устройстве. Большим преимуществом этого метода является то, что он может не только отделять нуклеиновые кислоты от небольшого количества химического вещества, но также может регистрировать процесс разделения. Хотя фрагменты ДНК широко представлены на фиг. 2 , результаты могут быть улучшены путем оптимизации параметров микросхемы SGE и концентрации агарозного геля. Кроме того, общий процесс SGE занимает не более 10 минут, если в чипе используются сборные гели.
Эффективность разделения ДНК-лестницы весьма различна, если ширина канала в чипе изменяется. Например, когда разделяют ДНК-лестницу емкостью 1000 п.о., полоса ДНК выглядит шире, еслиШирина канала мала. Возможно, это связано с тем, что джоулево нагревание в агарозном геле очень велико 18 , что влияет на характеристики разделения.
Предлагаемый здесь метод SGE очень прост. Портативное устройство mini-SGE может быть разработано, если система оптимизирована. Такое устройство может быть применено к лабораторным испытаниям в точках обслуживания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Конфликт интересов не объявляется.
Acknowledgments
Мы с благодарностью признаем поддержку Национального фонда естественных наук Китая (№ 21205078) и Фонда исследований докторской программы высшего образования Китая (No.20123120110002). Эта работа была частично поддержана Национальной ключевой программой исследований и развития Китая (2016YFB1102303), Национальной программой фундаментальных исследований Китая (973Program, 2015CB352001) и Национальным научным фондом Китая (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
