Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55926

Summary

Geleneksel kütük jel elektroforezi (SGE) deneyleri karmaşık bir aparat ve yüksek kimyasal tüketim gerektirir. Bu çalışma kısa bir zaman aralığında DNA parçalarını ayırmak için düşük maliyetli bir yöntemi açıklayan bir protokol sunmaktadır.

Abstract

Slab jel elektroforezi (SGE), DNA fragmanlarının ayrılması için en yaygın yöntemdir; Bu nedenle, biyoloji ve diğer alanlara genel olarak uygulanır. Bununla birlikte, geleneksel SGE protokolü oldukça sıkıcıdır ve deneyi uzun zaman almaktadır. Üstelik, SGE deneylerindeki kimyasal tüketim çok yüksektir. Bu çalışma, bir SGE çipine dayalı DNA fragmanlarının ayrılması için basit bir yöntem önermektedir. Çip bir gravür makinesi ile yapılır. Optik sinyalin uyarma ve emisyon dalga boyları için iki plastik levha kullanılır. DNA bantlarının floresan sinyali akıllı telefon ile toplanır. Bu yöntemi doğrulamak için 50, 100 ve 1.000 bp'lik DNA merdivenleri ayrılmıştır. Sonuçlar, 5.000 bp'den daha küçük bir DNA merdiveninin 12 dakika içinde çözünebileceğini ve bu yöntemi kullanırken yüksek özünürlükle çözülebildiğini gösteriyor, bu da bunun geleneksel SGE yönteminin ideal bir yerini belirttiğini gösteriyor.

Introduction

Slab jel elektroforezi (SGE), DNA fragman ayırma 1 , 2 , 3 , 4 , 5 için en etkili yöntemdir ve bu nedenle biyokimyasal ve biyolojik analizlerde 6 , 7 , 8 çok yönlü bir araç olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte, birçok deney, SGE'nin aşağıdaki dört problemle sınırlandığını göstermektedir: (1) ayrımlar birçok saat, hatta günler sürmektedir; (2) kimyasal tüketim çok yüksek; (3) karmaşık bir aparat gerektirir ( örn. 2D elektroforez hücresi, elektroforez güç kaynağı ve jel görüntüleme sistemi); (4) jel görüntüleme sistemi, deney sona erdikten sonra yalnızca ayrılmış DNA parçalarını gözlemleyebilir. Ayrıca, SGE 9'da yaygın olarak kullanılan etidyum bromür (EtBr)Ass = "xref"> 10, mutajenik ve kanserojen 11,12 . Bu nedenle, EtBr içeren jelleri verirken eldivenler giyilmelidir.

Kapiler elektroforez (CE), otomatik çalışma, kısa ayırma süresi ve daha düşük tüketim gibi SGE'ye kıyasla 13 , 14 , 15 , 16 , 17 birçok avantaja sahiptir. Bununla birlikte, CE cihazı oldukça pahalıdır. Bu nedenle, bu kısıtlamaların üstesinden gelmek için DNA'nın ayrılması için bir sistem geliştirilmiştir ( Şekil 1 ). Böyle bir sistem, kimyasal tüketimini büyük ölüde azaltamaz ve SGE deney süresinden (<8 dak) tasarruf sağlayamaz, aynı zamanda akıllıca agaroz jelinde DNA ayırma işleminin gerçek zamanlı izlenmesini de gerçekleştirebilir. Bu protokolde açıklanan prosedürleri izleyerek, öğrencilerSGE çipini tasarlayıp imal edip, agaroz jeli çipte hazırlayabilir, akıllı bir telefonla basit bir SGE sistemi kurabilir ve DNA migrasyon sürecini agaroz jelinde kaydedebilirim.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. SGE Chip'in Temel Tasarımı

  1. Polimetilmetakrilat (PMMA) veya polikarbonat gibi şeffaf bir plastik kullanın.
    Not: SGE yongası Şekil 1B'de gösterilmiştir. SGE yongası, TBE tamponu için silindirik delikler, DNA ayrılması için kanallar ve elektrot için delikler boyunca gömülü iki şeritten oluşur.
  2. Bir lazer gravür makinesi kullanarak PMMA bloğundaki dizileri SGE kanalları oluşturun.
    Not: Çipin geometrik parametreleri, ayrılması gereken DNA'nın boyutuna bağlıdır. Örneğin, DNA fragmanı 1,000 bp'den küçükse, SGE çipi için optimal kanal parametreleri 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (genişlik x derinlik x uzunluk) şeklindedir.
  3. SGE tasarımına dayanarak, DNA örneğini yüklemek için yonga kuyuları oluşturmak için tarakları imal edin.

2. Agaroz Jelinin Hazırlanması

  1. 0.5 × TBE'yi 10 × TBE (1 x TBE =89 mM Tris, 89 mM borik asit ve 2 mM EDTA; PH 8.4) ve damıtılmış suyun 1:19 oranında çözünmesi.
  2. 100 bp'lik DNA merdivenlerinin ayrılması için% 1.0 agaroz jeli hazırlayın.
    Not: 0.5x TBE tamponundaki agaroz konsantrasyonu, ayrılması gereken DNA fragmanlarının boyutlarına bağlıdır.
  3. Bir balona 0.1 g agaroz yerleştirin ve 10 mL 0.5x TBE tampon ekleyin.
    Not: Hazırlanan çözeltinin hacmi şişenin kapasitesinin 1 / 3'ünden daha az olmalıdır.
  4. Şişeyi koruyucu film ile sızdırın ve ardından agaroz / tampon karışımını bir mikrodalga fırında (orta, 1.0 dakika) ısıtın. Şişeyi mikrodalga fırına koymadan önce, bir patlama durumunda koruyucunun filminde bir miktar delik açın.
  5. 2.7 mL eritilmiş agaroz çözeltisini 4 kanal SGE çipine boşaltın. Kuyu oluşturmak için tarağı agaroz çözeltisine yerleştirin.
    Not: Erimiş agaroz çözeltisi, oda sıcaklığında 3 dakika sonra jel haline dönecektir.
  6. Tarağı taraktan çıkarınJel'i örtmek için 0.9 mL 0.5x TBE tampon ilave edin.

3. Elektroforezin SGE Chip'de Çalıştırılması

  1. LED ışık kaynağını açın ve ışık kaynağının üzerinde 425 ila 505 nm bant geçiren filtre yerleştirin.
  2. Bir vorteks kullanılarak, 14.4 uL'lik 100 bp'lik bir DNA merdiveni ve 1.6 uL SYBR Yeşil'ü karıştırın.
  3. SGE çipi içindeki agaroz jelinin her oyuğuna 4 μL karışım yükleyin ( Şekil 2 ).
  4. Elektrodu SGE yongasının iki şeridine koyun.
  5. SGE yongasının üzerinde 550 ila 700 nm bant geçiren filtre yerleştirin.
  6. Güç kaynağını açın. Elektrik voltajını 180 V (20 V / cm) olarak ayarlayın. DNA fragmanı ayırma işlemini kaydetmek için akıllı telefonu açın ( Şekil 3 ).
  7. Elektroforez 10 dakika sonra bittiğinde, güç kaynağını ve LED ışığını kapatın.
  8. SGE yongasını temizleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 4 , Şekil 5 ve Şekil 6 , 50, 100 ve 1.000 bp DNA merdivenlerinin jel elektroforezinden sonra tipik bir sonucu temsil etmektedir. Deneyden sonra, DNA parçaları iyi ayrılmıştı. Ayrıca, aynı numuneler SGE çipinin 4 kanalında ayrıldı ve aynı boyuttaki DNA fragmanlarının her deneyde aynı mesafeyi hareket ettirdiğini gösterdi.

DNA merdiveninin ayırma performansı, göç mesafesi ile DNA büyüklüğünün logaritması arasındaki ilişkiyi analiz ederek değerlendirilebilir; Bu nedenle, bilinmeyen DNA parçalarının boyutunu hesaplamak için SGE uygulanabilir. Şekil 3'te , DNA boyutu 700 bp'den küçük olduğunda, göç mesafesinin DNA boyutunun logaritması ile doğrusal olarak ilişkili olduğu bulunmuştur.

Jpg "/>
Şekil 1 : Şematik ve görüntüler. ( A ) Gerçek zamanlı izleme DNA ayırma sisteminin şematik bir diyagramı. Işık kaynağı olarak LED dizisini, optik filtreyi ve CGE yongasını içerir. Akıllı telefon DNA göç sürecini kaydedebilir. ( B ) SGE yongası. ( C ) Elektroforez için monte edilen cihaz. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2 : Jeli yükleyen bir öğrenci. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

5926fig3.jpg "/>
Şekil 3 : Bir akıllı telefondaki taşımayı kaydeden bir öğrenci. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4
Şekil 4 : 50 bp DNA merdivenlerinin SGE çipi üzerinde ayrılması. SGE yongasındaki kanalın geometrik parametreleri 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (genişlik x derinlik x uzunluk) şeklindedir. Ayırma voltajı 120 V'dur . Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız .

Şekil 5
Şekil 5 : 100 bp DNA merdivenlerinin SGE çipi üzerinde ayrılması. GSGE yongasındaki kanal için eometrik parametreler 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (genişlik x derinlik x uzunluk) 'dır. Ayırma voltajı 120 V'dur . Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız .

Şekil 6
Şekil 6 : 1,000 bp DNA merdivenlerinin SGE çipi üzerinde ayrılması. SGE yongasında kanalın geometrik parametreleri 3.6 mm x 4.0 mm x 90 mm (genişlik x derinlik x uzunluk) 'dır. Ayırma gerilimi 180 V'dur . Bu rakamın daha büyük sürümünü görmek için lütfen tıklayınız .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Agaroz jel elektroforezi, DNA, RNA ve proteinin ayrılması için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu çalışma, geleneksel jel elektroforez protokolünün yerini alacak yeni bir yöntem önermektedir. Sonuçlar, 50, 100 ve 1.000 bp'lik DNA merdivenlerinin böyle küçük bir şekilde monte edilmiş bir cihazda iyi ayrılabildiğini göstermektedir. Bu yöntemin en büyük avantajı, nükleik asitlerin az miktarda kimyasal tüketimi ile ayrılabilmesinin yanı sıra ayırma işlemini de kaydedebilmesidir. DNA fragmanları Şekil 2'de geniş görünse de, sonuçlar SGE çip parametrelerini ve agaroz jel konsantrasyonunu optimize ederek iyileştirilebilir. Ayrıca, çipte prekast jel kullanılıyorsa, toplam SGE işlemi en fazla 10 dakika sürer.

DNA merdiveninin ayırma performansı, çipteki kanal genişliği değiştirilirse oldukça farklıdır. Örneğin, 1,000 bp'lik bir DNA merdiveni ayrıldığında, DNA bandı daha geniş görünür;Kanalın genişliği küçüktür. Bunun nedeni, muhtemelen agaroz jelinde joule ısınmasının, ayırma performansını etkileyen çok yüksek 18 olmasıdır.

Burada önerilen SGE yöntemi çok basittir. Sistem optimize edildiğinde taşınabilir bir mini-SGE cihazı geliştirilebilir. Böyle bir cihaz, bakım noktası laboratuar testlerine uygulanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan edilmez.

Acknowledgments

Çin Ulusal Doğal Bilim Vakfı (No: 21205078) ve Çin Yüksek Öğrenim Doktora Programı Araştırma Fonu (No: 20123120110002) arasındaki desteği memnuniyetle karşılıyoruz. Bu çalışma, Çin Ulusal Temel Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFB1102303), Çin Ulusal Temel Araştırma Programı (973Program 2015CB352001) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (61378060) tarafından kısmen desteklendi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×TBE Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. T1051
50 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3421A
100 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3422A
1 kbp DNA ladder Takara Bio Inc. 3426A
SYBR GREEN Takara Bio Inc. 5760A
Agarose Sigma-Aldrich Corporate V900510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
  13. Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
  15. Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
  16. Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

Tags

Biyokimya Sayı 124 Genetik Jel elektroforezi Agaroz DNA ayrımı SYBR Green I Flüoresan
Akıllı Telefon ile DNA Parçalarının Ayırılmasının Gerçek Zamanlı İzlenmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang,More

Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone. J. Vis. Exp. (124), e55926, doi:10.3791/55926 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter