Summary
Los experimentos de electroforesis en gel de placas tradicionales (SGE) requieren un aparato complicado y un alto consumo de productos químicos. Este trabajo presenta un protocolo que describe un método de bajo costo para separar los fragmentos de ADN dentro de un corto período de tiempo.
Abstract
La electroforesis en gel de placas (SGE) es el método más común para la separación de fragmentos de ADN; Por lo tanto, se aplica ampliamente al campo de la biología y otros. Sin embargo, el protocolo SGE tradicional es bastante tedioso, y el experimento lleva mucho tiempo. Además, el consumo de químicos en experimentos SGE es muy alto. Este trabajo propone un método simple para la separación de fragmentos de ADN basados en un chip SGE. El chip está hecho por una máquina de grabado. Se utilizan dos láminas de plástico para las longitudes de onda de excitación y emisión de la señal óptica. La señal de fluorescencia de las bandas de ADN se recoge por teléfono inteligente. Para validar este método, se separaron escaleras de ADN de 50, 100 y 1.000 pb. Los resultados demuestran que una escala de ADN inferior a 5.000 pb puede ser resuelta en 12 minutos y con alta resolución cuando se utiliza este método, lo que indica que es un sustituto ideal para el método SGE tradicional.
Introduction
La electroforesis en gel de placas (SGE) es el método más eficaz para separar los fragmentos de ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 y por lo tanto se considera una herramienta versátil en los análisis bioquímicos y biológicos 6 , 7 , 8 . Sin embargo, muchos experimentos indican que SGE está restringido por los siguientes cuatro problemas: (1) las separaciones toman muchas horas, e incluso días; (2) el consumo de productos químicos es muy alto; (3) requiere un aparato complicado ( por ejemplo, célula de electroforesis 2D, fuente de alimentación de electroforesis y sistema de formación de imágenes de gel); (4) el sistema de formación de imágenes de gel sólo puede observar los fragmentos de ADN separados cuando se termina el experimento. Además, el bromuro de etidio (EtBr), que se utiliza comúnmente en SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, es mutagénico y cancerígeno 11 , 12 . Por lo tanto, siempre se deben usar guantes al entregar geles que contienen EtBr.
La electroforesis capilar (CE) tiene numerosas ventajas 13 , 14 , 15 , 16 , 17 en comparación con SGE, tales como funcionamiento automático, tiempo de separación corto y menor consumo. Sin embargo, el instrumento de la CE es bastante caro. Por lo tanto, para superar esas limitaciones, se ha desarrollado un sistema ( Figura 1 ) para la separación del ADN. Un sistema de este tipo no sólo puede reducir considerablemente el consumo de sustancias químicas y ahorrar tiempo de experimento SGE (<8 min), sino que también puede realizar un seguimiento en tiempo real del proceso de separación de ADN en el gel de agarosa por teléfono inteligente. Siguiendo los procedimientos descritos en este protocolo, los estudiantes debenSer capaz de diseñar y fabricar el chip SGE, preparar el gel de agarosa en el chip, configurar un sencillo sistema SGE con un smartphone y registrar el proceso de migración de ADN en el gel de agarosa.
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Protocol
1. Diseño básico del chip SGE
- Utilice cualquier plástico transparente, como polimetilmetacrilato (PMMA) o policarbonato.
Nota: El chip SGE se muestra en la Figura 1B . El chip SGE consiste en agujeros cilíndricos para el buffer TBE, canales para la separación de ADN y dos carriles incrustados a lo largo de los orificios para el electrodo. - Fabricar matrices de canales SGE en el bloque PMMA usando una máquina de grabado láser.
Nota: Los parámetros geométricos del chip dependen del tamaño del ADN a separar. Por ejemplo, los parámetros de canal óptimos para el chip SGE son 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (anchura x profundidad x longitud) si el fragmento de ADN es menor de 1.000 pb. - Basado en el diseño SGE, fabricar peines para crear los pozos en el chip para cargar la muestra de ADN.
2. Preparación del gel de agarosa
- Preparar 0,5 × TBE mezclando 10 × TBE (1 × TBE =89 mM de Tris, 89 mM de ácido bórico y 2 mM de EDTA; PH 8,4) y agua destilada en una relación 1:19.
- Preparar gel de agarosa al 1,0% para la separación de las escaleras de ADN de 100 bp.
Nota: La concentración de agarosa en tampón TBE 0,5x depende de los tamaños de los fragmentos de ADN a separar. - Se colocan 0,1 g de agarosa en un matraz y se añaden 10 ml de tampón TBE 0,5x.
Nota: El volumen de la solución preparada debe ser inferior a 1/3 de la capacidad del matraz. - Sellar el matraz con película conservante y luego calentar la mezcla de agarosa / tampón en un microondas (medio, 1,0 min). Antes de poner el matraz en el microondas, haga algunos agujeros en la película de conservante en caso de una explosión.
- Verter 2,7 ml de solución de agarosa fundida en 4 canales del chip SGE. Coloque el peine en la solución de agarosa para crear los pozos.
Nota: La solución de agarosa fundida se enfriará hasta el estado de gel a temperatura ambiente 3 min después. - Retire el peine de la gY añadir 0,9 ml de tampón TBE 0,5x para cubrir el gel.
3. Ejecución de la electroforesis en el chip SGE
- Encienda la fuente de luz LED y coloque un filtro de paso de banda de 425 a 505 nm por encima de la fuente de luz.
- Mezclar 14,4 μL de una escala de ADN de 100 bp y 1,6 μL de SYBR Green usando un vórtex.
- Cargar 4 μL de mezcla en cada pocillo del gel de agarosa en el chip SGE ( Figura 2 ).
- Coloque el electrodo en los dos carriles del chip SGE.
- Coloque un filtro de paso de banda de 550 a 700 nm sobre el chip SGE.
- Encienda la fuente de alimentación. Ajuste el voltaje eléctrico a 180 V (20 V / cm). Encienda el teléfono inteligente para registrar el proceso de separación de fragmentos de ADN ( Figura 3 ).
- Cuando la electroforesis se termine 10 min más tarde, apague la fuente de alimentación y la luz LED.
- Limpie el chip SGE.
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Representative Results
La Figura 4 , la Figura 5 y la Figura 6 representan un resultado típico después de la electroforesis en gel de escaleras de ADN de 50, 100 y 1.000 pb. Después del experimento, los fragmentos de ADN estaban bien separados. Además, las mismas muestras se separaron en los 4 canales del chip SGE, mostrando que fragmentos de ADN del mismo tamaño se mueven a la misma distancia en cada experimento.
El rendimiento de separación de la escala de ADN se puede evaluar analizando la relación de la distancia de migración y el logaritmo del tamaño del ADN; Por lo tanto, el SGE se puede aplicar para calcular el tamaño de fragmentos de ADN desconocidos. En la Figura 3 , se encontró que la distancia de migración está linealmente relacionada con el logaritmo del tamaño del ADN cuando el tamaño del ADN es menor de 700 pb.
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Figura 1 : Esquema e imágenes. ( A ) Un diagrama esquemático del sistema de separación de ADN de seguimiento en tiempo real. Incluye la matriz LED como fuente de luz, el filtro óptico y el chip CGE. El smartphone puede registrar el proceso de migración del ADN. ( B ) El chip SGE. ( C ) El dispositivo montado para la electroforesis. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Un estudiante cargando el gel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Figura 3 : Un estudiante que registra la migración en un smartphone. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Separación de escaleras de ADN de 50 pb en el chip SGE. Los parámetros geométricos para el canal en el chip SGE son 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (anchura x profundidad x longitud). La tensión de separación es de 120 V. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Separación de escaleras de ADN de 100 bp en el chip SGE. El gLos parámetros eométricos para el canal en el chip SGE son 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (anchura x profundidad x longitud). La tensión de separación es de 120 V. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Separación de escaleras de ADN de 1.000 pb en el chip SGE. Los parámetros geométricos para el canal en el chip SGE son 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (anchura x profundidad x longitud). La tensión de separación es de 180 V. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La electroforesis en gel de agarosa se emplea ampliamente para la separación de ADN, ARN y proteína. Este trabajo propone un nuevo método para reemplazar el tradicional protocolo de electroforesis en gel. Los resultados demuestran que las escaleras de ADN de 50, 100 y 1.000 pb se pueden separar bien en un dispositivo ensamblado de este tipo. La gran ventaja de este método es que no sólo puede separar los ácidos nucleicos con poco consumo químico, sino que también puede registrar el proceso de separación. Aunque los fragmentos de ADN parecen amplios en la Figura 2 , los resultados se pueden mejorar optimizando los parámetros del chip SGE y la concentración del gel de agarosa. Además, el proceso SGE total no toma más de 10 minutos si se utilizan geles prefabricados en el chip.
El rendimiento de separación de la escala de ADN es muy diferente si se cambia el ancho de canal en el chip. Por ejemplo, cuando se separa una escala de ADN de 1.000 pb, la banda de ADN se ve más ancha siEl ancho del canal es pequeño. Esto es posiblemente porque el calentamiento de julio en el gel de agarosa es muy alto 18 , lo que afecta el rendimiento de separación.
El método SGE propuesto aquí es muy simple. Un dispositivo portátil de mini-SGE puede ser desarrollado si el sistema está optimizado. Tal dispositivo puede aplicarse a pruebas de laboratorio en el punto de atención.
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Disclosures
No se declaran conflictos de intereses.
Acknowledgments
Agradecemos el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 21205078) y el Fondo de Investigación para el Programa de Doctorado de Educación Superior de China (No.20123120110002). Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo de China (2016YFB1102303), el Programa Nacional de Investigación Básica de China (973Program; 2015CB352001) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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