Summary
Tradisjonelle slabelelektroforeseeksperimenter (SGE) -forsøk krever et komplisert apparat og høyt kjemisk forbruk. Dette arbeidet presenterer en protokoll som beskriver en billig metode for å skille DNA-fragmenter innenfor en kort tidsramme.
Abstract
Slabelelektroforese (SGE) er den vanligste metoden for separering av DNA-fragmenter; Dermed er det stort sett brukt på feltet av biologi og andre. Den tradisjonelle SGE-protokollen er imidlertid ganske kjedelig, og forsøket tar lang tid. Dessuten er det kjemiske forbruket i SGE-eksperimenter svært høyt. Dette arbeidet foreslår en enkel metode for separering av DNA-fragmenter basert på en SGE-brikke. Brikken er laget av en graveringsmaskin. To plastplater brukes til eksitasjons- og utslippsbølgelengdene til det optiske signalet. Fluorescenssignalet til DNA-båndene oppsamles av smarttelefonen. For å validere denne metoden ble 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger separert. Resultatene viser at en DNA-stige mindre enn 5000 bp kan løses innen 12 minutter og med høy oppløsning ved bruk av denne metoden, noe som indikerer at det er en ideell erstatning for den tradisjonelle SGE-metoden.
Introduction
Slabelelektroforese (SGE) er den mest effektive metoden for DNA-fragment separasjon 1 , 2 , 3 , 4 , 5 og er derfor ansett som et allsidig verktøy i biokjemiske og biologiske analyser 6 , 7 , 8 . Mange eksperimenter indikerer imidlertid at SGE er begrenset av følgende fire problemer: (1) separasjonene tar mange timer og til og med dager; (2) det kjemiske forbruket er svært høyt; (3) det krever et komplisert apparat ( f.eks. 2D elektroforese celle, elektroforese strømforsyning og gel bildebehandling system); (4) gelbildesystemet kan bare observere de separerte DNA-fragmentene når forsøket er ferdig. Videre er etidiumbromid (EtBr), som vanligvis brukes i SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, er mutagent og kreftogen 11 , 12 . Hansker bør derfor alltid brukes når de gir geler som inneholder EtBr.
Kapillærelektroforese (CE) har mange fordeler 13 , 14 , 15 , 16 , 17 sammenlignet med SGE, som automatisk drift, kort separasjonstid og lavere forbruk. Men CE-instrumentet er ganske dyrt. For å overvinne disse begrensningene er det derfor utviklet et system ( Figur 1 ) for separasjon av DNA. Et slikt system kan ikke bare sterkt redusere det kjemiske forbruket og spare på SGE-eksperimentet (<8 min), men det kan også utføre sanntidssporing av DNA-separasjonsprosessen i agarosegelen ved hjelp av smarttelefonen. Ved å følge prosedyrene beskrevet i denne protokollen, skal studenteneJeg kan designe og lage SGE-brikken, lage agarosegelen i brikken, sette opp et enkelt SGE-system med en smarttelefon og registrere DNA-migrasjonsprosessen i agarosegelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Grunnleggende design av SGE Chip
- Bruk noen gjennomsiktig plast, som polymetylmetakrylat (PMMA) eller polykarbonat.
Merk: SGE-brikken er vist i figur 1B . SGE-brikken består av sylindriske hull for TBE-bufferen, kanaler for DNA-separasjon, og to baner innebygd langs hullene for elektroden. - Fremstil arrays av SGE-kanaler i PMMA-blokken ved hjelp av en lasergraveringsmaskin.
Merk: De geometriske parametrene til brikken er avhengig av størrelsen på DNA som skal separeres. For eksempel er de optimale kanalparametrene for SGE-brikken 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x lengde) dersom DNA-fragmentet er mindre enn 1000 bp. - Basert på SGE-designet, fremstiller kammer for å lage brønnene i brikken for å laste DNA-prøven.
2. Fremstilling av agarosegelen
- Forbered 0,5 × TBE ved å blande 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM borsyre og 2 mM EDTA; PH 8,4) og destillert vann i et 1:19 forhold.
- Klargjør 1,0% agarosegel for separasjon av 100-bp DNA-stiger.
Merk: Konsentrasjonen av agarose i 0,5x TBE buffer er avhengig av størrelsene av DNA-fragmentene som skal separeres. - Plasser 0,1 g agarose i en kolbe og tilsett 10 ml 0,5x TBE buffer.
Merk: Volumet av den tilberedte løsningen skal være mindre enn 1/3 av kapasiteten til kolben. - Tetning flasken med konserveringsfilm og oppvarm deretter agarose / bufferblandingen i en mikrobølgeovn (medium, 1,0 min). Før du setter kolben inn i mikrobølgeovnen, må du lage hull i konserveringsfilmen ved eksplosjon.
- Hell 2,7 ml smeltet agaroseløsning til 4 kanaler i SGE-brikken. Plasser kammen i agaroseoppløsningen for å lage brønnene.
Merk: Den smeltede agaroseoppløsningen vil avkjøles til gelstanden ved romtemperatur 3 minutter senere. - Fjern kammen fra gEls og tilsett 0,9 ml 0,5x TBE buffer for å dekke gelen.
3. Kjører elektroforeseen i SGE Chip
- Slå på LED-lyskilden og plasser et båndpassfilter på 425 til 505 nm over lyskilden.
- Bland 14,4 μL av en 100 bp DNA-stige og 1,6 μL SYBR Green ved hjelp av en vortexer.
- Legg 4 μl blanding i hver brønn av agarosegelen i SGE-brikken ( figur 2 ).
- Sett elektroden inn i de to banene i SGE-brikken.
- Plasser et båndpassfilter på 550 til 700 nm over SGE-brikken.
- Slå på strømkilden. Sett elektrisk spenning til 180 V (20 V / cm). Slå på smarttelefonen for å registrere DNA-fragment separasjonsprosessen ( Figur 3 ).
- Når elektroforese er ferdig 10 minutter senere, slå av strømkilden og LED-lampen.
- Rengjør SGE-brikken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 , Figur 5 , og Figur 6 representerer et typisk resultat etter gelelektroforeseen på 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger. Etter forsøket ble DNA-fragmentene godt separert. Videre ble de samme prøvene separert i de 4 kanalene i SGE-brikken, som viste at DNA-fragmenter av samme størrelse beveger seg i samme avstand i hvert eksperiment.
Separasjonsprestasjonen av DNA-stigen kan evalueres ved å analysere forholdet mellom migrasjonsavstanden og logaritmen til DNA-størrelsen; Dermed kan SGE brukes til å beregne størrelsen på ukjente DNA-fragmenter. I figur 3 ble det funnet at migreringsavstanden er lineært relatert til logaritmen av DNA-størrelse når DNA-størrelsen er mindre enn 700 bp.
Jpg "/>
Figur 1 : Skjematisk og bilder. ( A ) Et skjematisk diagram av sanntidssporings-DNA-separasjonssystemet. Det inkluderer LED-array som lyskilden, det optiske filteret og CGE-brikken. Smarttelefonen kan registrere DNA-migrasjonsprosessen. ( B ) SGE-brikken. ( C ) Enheten montert for elektroforese. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 : En student laster gelen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
5926fig3.jpg "/>
Figur 3 : En student som registrerer overføringen på en smarttelefon. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4 : Separasjon av 50-bp DNA-stiger på SGE-brikken. De geometriske parametrene for kanalen i SGE-brikken er 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x lengde). Separasjonsspenningen er 120 V. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5 : Separasjon av 100-bp DNA-stiger på SGE-brikken. GEmetriske parametere for kanalen i SGE-brikken er 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x lengde). Separasjonsspenningen er 120 V. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6 : Separering av 1000-bp DNA-stiger på SGE-brikken. De geometriske parametrene for kanalen i SGE-brikken er 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (bredde x dybde x lengde). Separasjonsspenningen er 180 V. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Agarosegelelektroforese er i stor grad benyttet for separasjon av DNA, RNA og protein. Dette arbeidet foreslår en ny metode for å erstatte den tradisjonelle gelelektroforeseprotokollen. Resultatene viser at 50, 100 og 1000 bp DNA-stiger kan separeres godt i en så liten, samlet enhet. Den store fordelen med denne metoden er at den ikke bare kan skille nukleinsyrene med lite kjemisk forbruk, men det kan også registrere separasjonsprosessen. Selv om DNA-fragmentene ser bredt ut i figur 2 , kan resultatene forbedres ved å optimalisere parametrene til SGE-brikken og konsentrasjonen av agarosegelen. Videre tar den totale SGE-prosessen ikke mer enn 10 minutter dersom forgassede geler blir brukt i brikken.
Separasjonsytelsen til DNA-stigen er ganske forskjellig hvis kanalbredden i brikken endres. For eksempel, når en 1000-bps DNA-stige separeres, ser DNA-båndet seg ut omBredden på kanalen er liten. Dette er muligens fordi ulevarmen i agarosegelen er svært høy 18 , noe som påvirker separasjonsytelsen.
SEG-metoden som foreslås her er veldig enkel. En bærbar mini-SGE-enhet kan utvikles hvis systemet er optimalisert. En slik enhet kan brukes til laboratorieforsøk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Vi anerkjenner takknemlig støtte fra National Natural Science Foundation of China (21205078) og Forskningsfondet for doktorgradsprogrammet for høyere utdanning i Kina (No.20123120110002). Dette arbeidet ble delvis støttet av Kinas nasjonale nøkkelforsknings- og utviklingsprogram (2016YFB1102303), Kinas nasjonale grunnforskningsprogram (973Program; 2015CB352001) og Nasjonalt naturvitenskapelig fundament i Kina (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
