Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone

Published: June 1, 2017 doi: 10.3791/55926

Summary

Traditionele platengelektroforese (SGE) experimenten vereisen een ingewikkeld apparaat en een hoog chemisch verbruik. Dit werk bevat een protocol dat een goedkope methode om DNA-fragmenten te scheiden binnen een kort tijdsbestek beschrijft.

Abstract

Slabelelektroforese (SGE) is de meest voorkomende methode voor de scheiding van DNA-fragmenten; Zo wordt het ruim toegepast op het gebied van biologie en anderen. Het traditionele SGE-protocol is echter nogal vervelend, en het experiment duurt een lange tijd. Bovendien is het chemische verbruik in SGEO-experimenten zeer hoog. Dit werk stelt een eenvoudige methode voor de scheiding van DNA-fragmenten op basis van een SGE-chip voor. De chip wordt gemaakt door een gravure machine. Twee plastic bladen worden gebruikt voor de excitatie- en emissiegolflengten van het optische signaal. Het fluorescentie signaal van de DNA-banden wordt verzameld door de smartphone. Om deze methode te valideren werden 50 ladingen van 50, 100 en 1000 bp gescheiden. Uit de resultaten blijkt dat een DNA ladder kleiner dan 5000 bp binnen 12 minuten kan worden opgelost en met hoge resolutie bij gebruik van deze methode, hetgeen aangeeft dat het een ideale vervanging voor de traditionele SGE-methode is.

Introduction

Slabelelektroforese (SGE) is de meest effectieve methode voor DNA-fragment scheiding 1 , 2 , 3 , 4 , 5 en wordt dus beschouwd als een veelzijdig hulpmiddel in biochemische en biologische analyses 6 , 7 , 8 . Veel experimenten geven echter aan dat SGE beperkt is door de volgende vier problemen: (1) de scheidingen duurt vele uren en zelfs dagen; (2) het chemische verbruik is zeer hoog; (3) het vereist een ingewikkeld apparaat ( bijv. 2D elektroforese cel, elektroforese stroomvoorziening en gel imaging systeem); (4) het gel imaging systeem kan alleen de gescheiden DNA fragmenten waarnemen wanneer het experiment is afgerond. Bovendien wordt ethidiumbromide (EtBr), die algemeen gebruikt wordt in SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, is mutageen en kankerogeen 11 , 12 . Zo moeten handschoenen altijd gedragen worden bij het afleveren van gels die EtBr bevatten.

Capillaire elektroforese (CE) heeft talrijke voordelen 13 , 14 , 15 , 16 , 17 vergeleken met SGE, zoals automatische werking, korte scheidingstijd en lager verbruik. Het CE-instrument is echter vrij duur. Om deze beperkingen te overwinnen is derhalve een systeem ontwikkeld ( Figuur 1 ) voor de scheiding van DNA. Een dergelijk systeem kan niet alleen het chemische verbruik sterk verminderen en bespaart op de SGE-experimenttijd (<8 min), maar het kan ook real-time tracking van het DNA-scheidingsproces in de agarosegel door de smartphone uitvoeren. Door de procedures die in dit protocol worden beschreven, te volgen, zullen de leerlingen het volgende doenIk kan de SGE-chip ontwerpen en fabriceren, de agarosegel voorbereiden in de chip, een eenvoudig SGE-systeem opzetten met een smartphone en het DNA-migratieproces in de agarosegel opnemen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Basis Ontwerp van de SGE-chip

  1. Gebruik een transparant kunststof, zoals polymethylmethacrylaat (PMMA) of polycarbonaat.
    Opmerking: De SGE-chip is aangetoond in figuur 1B . De SGE-chip bestaat uit cilindrische gaten voor de TBE-buffer, kanalen voor DNA-scheiding, en twee banen die langs de gaten voor de elektrode ingebed zijn.
  2. Maak arrays van SGE-kanalen in het PMMA-blok met behulp van een lasergravermachine.
    Opmerking: De geometrische parameters van de chip zijn afhankelijk van de grootte van het te scheiden DNA. De optimale kanaalparameters voor de SGE-chip zijn bijvoorbeeld 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (breedte x diepte x lengte) als het DNA-fragment kleiner is dan 1000 bp.
  3. Op basis van het SGE-ontwerp, vervaardig kammen om de putjes in de chip te maken voor het laden van het DNA-monster.

2. Bereiding van de agarosegel

  1. Bereid 0,5 × TBE door 10 × TBE te mengen (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM boorzuur en 2 mM EDTA; PH 8,4) en gedestilleerd water in een 1:19 verhouding.
  2. Bereid 1,0% agarosegel voor de scheiding van 100-bp DNA ladders op.
    Opmerking: De concentratie van agarose in 0,5x TBE-buffer is afhankelijk van de grootte van de gescheiden DNA-fragmenten.
  3. Plaats 0,1 g agarose in een fles en voeg 10 ml 0,5x TBE-buffer toe.
    Opmerking: Het volume van de bereide oplossing moet minder dan 1/3 van de inhoud van de fles zijn.
  4. Zet de fles met conserverende film en verhit vervolgens het agarose / buffer mengsel in een magnetron (medium, 1,0 min). Voordat u de kolf in de magnetron plaatst, maak dan een paar gaten in de conserveringsfilm in geval van een explosie.
  5. Giet 2,7 ml gesmolten agarose-oplossing in 4 kanalen van de SGE-chip. Plaats de kam in de agaroseoplossing om de putjes te maken.
    Opmerking: De gesmolten agarose oplossing zal 3 minuten later op kamertemperatuur naar de gel staat afkoelen.
  6. Verwijder de kam uit de gEls en voeg 0,9 ml 0,5x TBE buffer toe om de gel te bedekken.

3. Rijden van de elektroforese in de SGE-chip

  1. Zet de LED-lichtbron aan en plaats een bandpassfilter van 425 tot 505 nm boven de lichtbron.
  2. Meng 14,4 μL van een 100 bp DNA ladder en 1,6 μL SYBR Green met behulp van een vortexer.
  3. Laad 4 μL mengsel in elke putje van de agarosegel in de SGE-chip ( Figuur 2 ).
  4. Zet de elektrode in de twee rijstroken van de SGE-chip.
  5. Plaats een bandpassfilter van 550 tot 700 nm boven de SGE-chip.
  6. Schakel de stroombron in. Stel de elektrische spanning op 180 V (20 V / cm). Schakel de smartphone in om het DNA-fragment scheidingsproces op te nemen ( Figuur 3 ).
  7. Zodra de elektroforese 10 minuten is afgerond, zet u de stroombron en het LED-lampje uit.
  8. Maak de SGE-chip schoon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 4 , Figuur 5 , en Figuur 6 vertegenwoordigen een typisch resultaat na de gelelektroforese van 50, 100 en 1000 bp DNA ladders. Na het experiment werden de DNA-fragmenten goed gescheiden. Bovendien werden dezelfde monsters gescheiden in de 4 kanalen van de SGE-chip, waardoor bleek dat DNA-fragmenten van dezelfde grootte dezelfde afstand verplaatsen in elk experiment.

De scheidingsprestaties van de DNA ladder kunnen geëvalueerd worden door de relatie van de migratieafstand en de logaritme van DNA-grootte te analyseren; Zo kan SGE toegepast worden bij het berekenen van de grootte van onbekende DNA-fragmenten. In Figuur 3 bleek dat de migratieafstand lineair verband houdt met de logaritme van DNA-grootte wanneer de DNA-grootte kleiner is dan 700 bp.

Jpg "/>
Figuur 1 : Schematische en afbeeldingen. ( A ) Een schematisch diagram van het real-time tracking DNA scheidingssysteem. Het omvat de LED-array als de lichtbron, het optische filter en de CGE-chip. De smartphone kan het DNA-migratieproces opnemen. ( B ) De SGE-chip. ( C ) Het apparaat is samengesteld voor elektroforese. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2 : Een student laadt de gel. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

5926fig3.jpg "/>
Figuur 3 : Een student die de migratie op een smartphone opneemt. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4 : Scheiding van 50-bp DNA ladders op de SGE chip. De geometrische parameters voor het kanaal in de SGE-chip zijn 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (breedte x diepte x lengte). De scheidingsspanning is 120 V. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 5
Figuur 5 : Afscheiding van 100-bp DNA ladders op de SGE chip. De GEmetrische parameters voor het kanaal in de SGE-chip zijn 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (breedte x diepte x lengte). De scheidingsspanning is 120 V. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Figuur 6
Figuur 6 : Scheiding van 1000 ladders van DNA ladders op de SGE-chip. De geometrische parameters voor het kanaal in de SGE-chip zijn 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (breedte x diepte x lengte). De scheidingsspanning is 180 V. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te zien.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Agarose gelelektroforese wordt wijd gebruikt voor de scheiding van DNA, RNA en eiwit. Dit werk stelt een nieuwe methode voor om het traditionele gelelektroforese protocol te vervangen. Resultaten tonen aan dat 50, 100 en 1000 bp DNA ladders goed kunnen worden gescheiden in zo'n klein gemonteerd apparaat. Het grote voordeel van deze methode is dat het niet alleen de nucleïnezuren kan scheiden met weinig chemisch verbruik, maar het kan ook het scheidingsproces opnemen. Hoewel de DNA-fragmenten breed in figuur 2 kijken , kunnen de resultaten worden verbeterd door de parameters van de SGE-chip en de concentratie van de agarosegel te optimaliseren. Bovendien duurt het totale SGE-proces niet meer dan 10 minuten als er in de chip gebruik wordt gemaakt van pre-gels.

De scheidingsprestatie van de DNA ladder is heel anders als de kanaalbreedte in de chip veranderd is. Bijvoorbeeld, wanneer een 1000 ladder DNA-ladder wordt gescheiden, ziet de DNA-band er breder uit alsDe breedte van het kanaal is klein. Dit komt mogelijk doordat de jeleverwarming in de agarosegel zeer hoog is 18 , wat de scheidingsprestatie beïnvloedt.

De hier voorgestelde SGE-methode is heel eenvoudig. Een draagbaar mini-SGE-apparaat kan worden ontwikkeld als het systeem is geoptimaliseerd. Een dergelijk apparaat kan worden toegepast op laboratoriumonderzoek van het laboratorium.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten worden verklaard.

Acknowledgments

Wij erkennen dankbaar steun van de Nationale Natuurwetenschappenstichting van China (nr. 21205078) en het Onderzoeksfonds voor het doctoraal programma van het hoger onderwijs in China (No.20123120110002). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Key Research and Development Programme van China (2016YFB1102303), het Nationaal Basisonderzoeksprogramma van China (973Programma, 2015CB352001) en de National Natural Science Foundation of China (61378060).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10×TBE Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. T1051
50 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3421A
100 bp DNA ladder Takara Bio Inc. 3422A
1 kbp DNA ladder Takara Bio Inc. 3426A
SYBR GREEN Takara Bio Inc. 5760A
Agarose Sigma-Aldrich Corporate V900510

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
  2. McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
  3. Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
  4. Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
  5. Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
  6. Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
  7. Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
  8. Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
  9. Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
  10. Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
  11. Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
  12. Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
  13. Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
  14. Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
  15. Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
  16. Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
  17. Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
  18. Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).

Tags

Biochemie Uitgave 124 Genetica Gelelektroforese Agarose DNA-scheiding SYBR Green I Fluorescentie
Real-time Tracking van DNA-fragment scheiding via Smartphone
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang,More

Tao, C., Yang, B., Li, Z., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone. J. Vis. Exp. (124), e55926, doi:10.3791/55926 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter