Summary
Les expériences traditionnelles d'électrophorèse sur gel en dentelle (SGE) nécessitent un appareil compliqué et une forte consommation chimique. Ce travail présente un protocole qui décrit une méthode peu coûteuse pour séparer les fragments d'ADN dans un court laps de temps.
Abstract
L'électrophorèse sur gel de dalle (SGE) est la méthode la plus commune pour la séparation des fragments d'ADN; Ainsi, il est largement appliqué au domaine de la biologie et d'autres. Cependant, le protocole SGE traditionnel est assez fastidieux, et l'expérience prend beaucoup de temps. De plus, la consommation chimique dans les expériences SGE est très élevée. Ce travail propose une méthode simple pour la séparation des fragments d'ADN basée sur une puce SGE. La puce est fabriquée par une machine à gravure. Deux feuilles de plastique sont utilisées pour les longueurs d'onde d'excitation et d'émission du signal optique. Le signal de fluorescence des bandes d'ADN est collecté par un smartphone. Pour valider cette méthode, des échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb ont été séparées. Les résultats démontrent qu'une échelle d'ADN inférieure à 5 000 pb peut être résolue en 12 min et à haute résolution lors de l'utilisation de cette méthode, ce qui indique qu'il est un substitut idéal de la méthode SGE traditionnelle.
Introduction
L'électrophorèse sur gel de dalle (SGE) est la méthode la plus efficace pour la séparation des fragments d'ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 et est donc considéré comme un outil polyvalent dans les analyses biochimiques et biologiques 6 , 7 , 8 . Cependant, de nombreuses expériences indiquent que SGE est restreinte par les quatre problèmes suivants: (1) les séparations prennent beaucoup d'heures et même des jours; (2) la consommation chimique est très élevée; (3) il nécessite un appareil compliqué ( par exemple, cellule électrophorèse 2D, alimentation électrique et système d'imagerie en gel); (4) le système d'imagerie en gel ne peut observer que les fragments d'ADN séparés lorsque l'expérience est terminée. En outre, le bromure d'éthidium (EtBr), qui est couramment utilisé dans le SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, est mutagène et cancérogène 11 , 12 . Ainsi, les gants doivent toujours être portés lors de la distribution de gels contenant EtBr.
L'électrophorèse capillaire (CE) présente de nombreux avantages 13 , 14 , 15 , 16 , 17 par rapport au SGE, comme le fonctionnement automatique, le temps de séparation court et la consommation réduite. Cependant, l'instrument CE est assez coûteux. Par conséquent, pour surmonter ces limitations, un système a été développé ( Figure 1 ) pour la séparation de l'ADN. Un tel système peut non seulement réduire considérablement la consommation de produits chimiques et économiser sur le temps de l'expérience SGE (<8 min), mais il peut également effectuer un suivi en temps réel du processus de séparation de l'ADN dans le gel d'agarose par un smartphone. En suivant les procédures décrites dans ce protocole, les étudiants shouLd pourrait concevoir et fabriquer la puce SGE, préparer le gel d'agarose dans la puce, mettre en place un système SGE simple avec un smartphone et enregistrer le processus de migration de l'ADN dans le gel d'agarose.
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Protocol
1. Conception de base de la puce SGE
- Utilisez n'importe quel plastique transparent, tel que le polyméthylméthacrylate (PMMA) ou le polycarbonate.
Remarque: La puce SGE est démontrée à la figure 1B . La puce SGE comprend des trous cylindriques pour le tampon TBE, des canaux pour la séparation de l'ADN et deux voies intégrées le long des trous de l'électrode. - Fabriquer des réseaux de chaînes SGE dans le bloc PMMA à l'aide d'une machine à gravure laser.
Remarque: Les paramètres géométriques de la puce dépendent de la taille de l'ADN à séparer. Par exemple, les paramètres de canal optimum pour la puce SGE sont de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largeur x profondeur x longueur) si le fragment d'ADN est inférieur à 1000 pb. - Basé sur la conception SGE, fabriquer des peignes pour créer les puits dans la puce pour charger l'échantillon d'ADN.
2. Préparation du gel d'agarose
- Préparer 0,5 x TBE en mélangeant 10 × TBE (1 × TBE =89 mM de Tris, 89 mM d'acide borique et 2 mM d'EDTA; PH 8,4) et de l'eau distillée dans un rapport 1:19.
- Préparer 1,0% de gel d'agarose pour la séparation des échelles d'ADN de 100 pb.
Note: La concentration d'agarose dans un tampon TBE 0,5x dépend des tailles des fragments d'ADN à séparer. - Placer 0,1 g d'agarose dans un ballon et ajouter 10 ml de tampon TBE 0,5x.
Note: Le volume de la solution préparée doit être inférieur à 1/3 de la capacité du flacon. - Sceller le flacon avec du film de conservation et ensuite chauffer le mélange d'agarose / tampon dans un micro-ondes (moyen, 1,0 min). Avant de mettre le flacon dans le micro-ondes, faire quelques trous dans le film de conservation en cas d'explosion.
- Verser 2,7 ml d'une solution d'agarose fondue dans 4 canaux de la puce SGE. Placez le peigne dans la solution d'agarose pour créer les puits.
Note: La solution d'agarose fondue refroidira à l'état de gel à température ambiante 3 min plus tard. - Retirer le peigne du gEt ajouter 0,9 ml de tampon TBE 0,5x pour recouvrir le gel.
3. Exécution de l'électrophorèse dans la puce SGE
- Allumez la source de lumière LED et placez un filtre passe-bande de 425 à 505 nm au-dessus de la source lumineuse.
- Mélanger 14,4 μL d'une échelle d'ADN de 100 pb et 1,6 μL de SYBR Green en utilisant un vortex.
- Chargez 4 μL de mélange dans chaque puits du gel d'agarose dans la puce SGE ( Figure 2 ).
- Mettez l'électrode dans les deux voies de la puce SGE.
- Placez un filtre passe bande 550 à 700 nm au-dessus de la puce SGE.
- Allumez la source d'alimentation. Réglez la tension électrique à 180 V (20 V / cm). Activez le smartphone pour enregistrer le processus de séparation des fragments d'ADN ( Figure 3 ).
- Lorsque l'électrophorèse est terminée 10 minutes plus tard, éteignez la source d'alimentation et la lumière LED.
- Nettoyez la puce SGE.
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Representative Results
La figure 4 , la figure 5 , et la figure 6 représentent un résultat typique après l'électrophorèse sur gel d'échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb. Après l'expérience, les fragments d'ADN étaient bien séparés. En outre, les mêmes échantillons ont été séparés dans les 4 canaux de la puce SGE, montrant que les fragments d'ADN de même taille se déplacent à la même distance dans chaque expérience.
La performance de séparation de l'échelle d'ADN peut être évaluée en analysant la relation entre la distance de migration et le logarithme de la taille de l'ADN; Ainsi, SGE peut être appliqué pour calculer la taille des fragments d'ADN inconnus. Dans la figure 3 , on a constaté que la distance de migration est linéairement liée au logarithme de la taille de l'ADN lorsque la taille de l'ADN est inférieure à 700 pb.
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Figure 1 : schéma et images. ( A ) Un diagramme schématique du système de séparation d'ADN de suivi en temps réel. Il comprend la matrice LED comme source lumineuse, le filtre optique et la puce CGE. Le smartphone peut enregistrer le processus de migration de l'ADN. ( B ) La puce SGE. ( C ) Le dispositif assemblé pour l'électrophorèse. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Un étudiant chargé du gel. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Figure 3 : Un étudiant qui enregistre la migration sur un smartphone. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Séparation des échelles d'ADN de 50 pb sur la puce SGE. Les paramètres géométriques du canal dans la puce SGE sont de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largeur x profondeur x longueur). La tension de séparation est de 120 V. Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5 : Séparation des échelles d'ADN de 100 pb sur la puce SGE. Le GLes paramètres éométriques du canal dans la puce SGE sont de 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (largeur x profondeur x longueur). La tension de séparation est de 120 V. Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6 : Séparation des échelles d'ADN de 1000 pb sur la puce SGE. Les paramètres géométriques du canal dans la puce SGE sont de 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (largeur x profondeur x longueur). La tension de séparation est de 180 V. Cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
L'électrophorèse sur gel d'agarose est largement utilisée pour la séparation de l'ADN, de l'ARN et de la protéine. Ce travail propose une nouvelle méthode pour remplacer le protocole traditionnel d'électrophorèse sur gel. Les résultats démontrent que des échelles d'ADN de 50, 100 et 1000 pb peuvent être bien séparées dans un tel dispositif assemblé. Le grand avantage de cette méthode est que non seulement il peut séparer les acides nucléiques avec peu de consommation chimique, mais il peut également enregistrer le processus de séparation. Bien que les fragments d'ADN soient larges dans la figure 2 , les résultats peuvent être améliorés en optimisant les paramètres de la puce SGE et la concentration du gel d'agarose. En outre, le processus SGE total ne prend pas plus de 10 minutes si des gels préfabriqués sont utilisés dans la puce.
La performance de séparation de l'échelle d'ADN est tout à fait différente si la largeur du canal dans la puce est modifiée. Par exemple, lorsqu'une échelle d'ADN de 1000 pb est séparée, la bande d'ADN semble plus large siLa largeur du canal est faible. Ceci est possible parce que le chauffage par joule dans le gel d'agarose est très élevé 18 , ce qui affecte les performances de séparation.
La méthode SGE proposée ici est très simple. Un appareil portable mini-SGE peut être développé si le système est optimisé. Un tel dispositif peut être appliqué aux tests de laboratoire au point de soins.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêts n'est déclaré.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n ° 21205078) et du Fonds de recherche pour le programme de doctorat de l'enseignement supérieur de la Chine (n ° 0031 3120110002). Ce travail a été partiellement soutenu par le Programme national de recherche et de développement clé de Chine (2016YFB1102303), le Programme national de recherche fondamentale de Chine (973Program, 2015CB352001) et la National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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