Summary
Gli esperimenti tradizionali di elettroforesi a gel di lastre (SGE) richiedono un apparato complicato e un elevato consumo di sostanze chimiche. Questo lavoro presenta un protocollo che descrive un metodo a basso costo per separare i frammenti di DNA entro un breve lasso di tempo.
Abstract
L'elettroforesi del gel di pannello (SGE) è il metodo più comune per la separazione dei frammenti di DNA; Quindi, è ampiamente applicato al campo della biologia e degli altri. Tuttavia, il protocollo tradizionale SGE è abbastanza noioso e l'esperimento richiede molto tempo. Inoltre, il consumo chimico negli esperimenti SGE è molto elevato. Questo lavoro propone un metodo semplice per la separazione dei frammenti di DNA basati su un chip SGE. Il chip è fatto da una macchina per incisione. Due lenzuola in plastica vengono utilizzate per le lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione del segnale ottico. Il segnale di fluorescenza delle bande del DNA viene raccolto da smartphone. Per convalidare questo metodo, sono state separate le scale di DNA da 50, 100 e 1000 bp. I risultati dimostrano che una scala del DNA inferiore a 5.000 bp può essere risolta entro 12 minuti e con alta risoluzione quando si utilizza questo metodo, indicando che è un sostituto ideale per il metodo tradizionale SGE.
Introduction
L'elettroforesi del gel di pannello (SGE) è il metodo più efficace per la separazione dei frammenti di DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 e quindi è considerato uno strumento versatile in analisi biochimiche e biologiche 6 , 7 , 8 . Tuttavia, molti esperimenti indicano che il SGE è limitato dai seguenti quattro problemi: (1) le separazioni richiedono molte ore e anche giorni; (2) il consumo di sostanze chimiche è molto elevato; (3) richiede un apparato complicato ( ad esempio, cella elettroforesi 2D, alimentazione elettroforesi e sistema di imaging gel); (4) il sistema di imaging del gel può osservare solo i frammenti di DNA separati quando l'esperimento è terminato. Inoltre, il bromuro di etidio (EtBr), comunemente usato in SGE 9 ,Ass = "xref"> 10, è mutageno e cancerogeno 11 , 12 . Quindi, i guanti devono essere sempre indossati durante la consegna di gel contenenti EtBr.
L'elettroforesi capillare (CE) presenta numerosi vantaggi di 13 , 14 , 15 , 16 , 17 rispetto a SGE, come l'azionamento automatico, il tempo di separazione breve e il minor consumo. Tuttavia, lo strumento CE è piuttosto costoso. Pertanto, per superare tali limiti, è stato sviluppato un sistema ( Figura 1 ) per la separazione del DNA. Un tale sistema non solo può ridurre notevolmente il consumo chimico e risparmiare tempo sperimentale SGE (<8 min), ma può anche eseguire il monitoraggio in tempo reale del processo di separazione del DNA nel gel agarosio tramite smartphone. Seguendo le procedure descritte nel presente protocollo, gli studenti vengono presentatiPossiamo progettare e realizzare il chip SGE, preparare il gel agarosio nel chip, creare un semplice sistema SGE con uno smartphone e registrare il processo di migrazione del DNA nel gel agarosio.
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Protocol
1. Disegno di base del chip SGE
- Utilizzare qualsiasi plastica trasparente, come polimetilmetacrilato (PMMA) o policarbonato.
Nota: il chip SGE è mostrato in Figura 1B . Il chip SGE è costituito da fori cilindrici per il tampone TBE, canali per la separazione del DNA e due corsie incastrate lungo i fori per l'elettrodo. - Fabbricare array di canali SGE nel blocco PMMA utilizzando una macchina di incisione laser.
Nota: I parametri geometrici del chip dipendono dalla dimensione del DNA da separare. Ad esempio, i parametri di canale ottimali per il chip SGE sono 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (larghezza x profondità x lunghezza) se il frammento DNA è inferiore a 1000 bp. - Sulla base del progetto SGE, costruire pettini per creare i pozzetti del chip per caricare il campione del DNA.
2. Preparazione del gel agarosico
- Preparare 0.5 × TBE mescolando 10 × TBE (1 × TBE =89 mM Tris, 89 mM acido borico e 2 mM EDTA; PH 8,4) e acqua distillata in rapporto 1:19.
- Preparare il gel agarosico dell'1,0% per la separazione delle scale a DNA da 100 bp.
Nota: La concentrazione di agarosio in tampone TBE 0,5x dipende dalle dimensioni dei frammenti di DNA da separare. - Posizionare 0,1 g di agarosio in un pallone e aggiungere 10 ml di tampone TBE 0,5 volte.
Nota: Il volume della soluzione preparata deve essere inferiore a 1/3 della capacità del pallone. - Sigillare il pallone con pellicola di conservazione e quindi riscaldare la miscela di agarosio / tampone in un forno a microonde (mezzo, 1,0 min). Prima di mettere il pallone nel forno a microonde, fare qualche foratura nel film di conservazione in caso di esplosione.
- Versare 2,7 ml di soluzione di agarosio fuso in 4 canali del chip SGE. Collocare il pettine nella soluzione agarosica per creare i pozzetti.
Nota: la soluzione di agarosio fuso si raffredda allo stato di gel a temperatura ambiente 3 minuti più tardi. - Rimuovere il pettine dal gPrima e aggiungere 0,9 ml di tampone TBE 0,5 volte per coprire il gel.
3. Esecuzione dell'elettroforesi nel SGE Chip
- Accendere la sorgente luminosa del LED e posizionare un filtro a passacavo da 425 a 505 nm sopra la sorgente luminosa.
- Mescolare 14,4 μL di una scala del DNA da 100 bp e 1,6 μL di SYBR Green usando un vortexer.
- Caricare 4 μL di miscela in ogni pozzetto del gel agarosio nel chip SGE ( Figura 2 ).
- Mettere l'elettrodo nelle due corsie del chip SGE.
- Posizionare un filtro a banda da 550 a 700 nm sopra il chip SGE.
- Accendere la fonte di alimentazione. Impostare la tensione elettrica a 180 V (20 V / cm). Accendere lo smartphone per registrare il processo di separazione del frammento di DNA ( Figura 3 ).
- Quando l'elettroforesi è terminata 10 minuti dopo, spegnere l'alimentazione e la luce del LED.
- Pulire il chip SGE.
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Representative Results
La Figura 4 , la Figura 5 e la Figura 6 rappresentano un risultato tipico dopo l'elettroforesi di gel di scale da 50, 100 e 1000 bp di DNA. Dopo l'esperimento, i frammenti del DNA erano ben separati. Inoltre, gli stessi campioni sono stati separati nei 4 canali del chip SGE, mostrando che i frammenti di DNA della stessa dimensione muovono la stessa distanza in ogni esperimento.
La prestazione di separazione della scala del DNA può essere valutata analizzando la relazione della distanza di migrazione e il logaritmo del formato del DNA; Quindi, SGE può essere applicato per calcolare la dimensione di frammenti di DNA sconosciuti. Nella figura 3 si è scoperto che la distanza di migrazione è linearmente correlata al logaritmo del formato del DNA quando il formato del DNA è inferiore a 700 bp.
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Figura 1 : Schema e immagini. ( A ) Schema schematico del sistema di separazione del DNA di monitoraggio in tempo reale. Include l'array LED come sorgente luminosa, filtro ottico e chip CGE. Lo smartphone può registrare il processo di migrazione del DNA. ( B ) Il chip SGE. ( C ) Il dispositivo assemblato per elettroforesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Uno studente che carica il gel. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Figura 3 : Uno studente che registra la migrazione su uno smartphone. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : Separazione delle scale del DNA da 50 bp sul chip SGE. I parametri geometrici per il canale nel chip SGE sono 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (larghezza x profondità x lunghezza). La tensione di separazione è di 120 V. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5 : Separazione delle scalette del DNA da 100 bp sul chip SGE. La GI parametri eometrici per il canale nel chip SGE sono 2,5 mm x 4,0 mm x 90 mm (larghezza x profondità x lunghezza). La tensione di separazione è di 120 V. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 6 : Separazione delle scale del DNA da 1000 bp sul chip SGE. I parametri geometrici per il canale nel chip SGE sono 3,6 mm x 4,0 mm x 90 mm (larghezza x profondità x lunghezza). La tensione di separazione è di 180 V. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'elettroforesi del gel agarosso è ampiamente impiegato per la separazione del DNA, dell'RNA e della proteina. Questo lavoro propone un nuovo metodo per sostituire il tradizionale protocollo di elettroforesi gel. I risultati dimostrano che le scalette del DNA di 50, 100 e 1000 bp possono essere separate bene in un piccolo dispositivo assemblato. Il grande vantaggio di questo metodo è che non solo può separare gli acidi nucleici con poco consumo di sostanze chimiche, ma può anche registrare il processo di separazione. Sebbene i frammenti di DNA siano larghi nella figura 2 , i risultati possono essere migliorati ottimizzando i parametri del chip SGE e la concentrazione del gel agarosio. Inoltre, il processo totale SGE non richiede più di 10 minuti se si utilizzano gel prefabbricati nel chip.
La prestazione di separazione della scala del DNA è abbastanza diversa se si modifica la larghezza del canale nel chip. Ad esempio, quando una scala del DNA da 1.000 bp è separata, la fascia di DNA sembra più ampia seLa larghezza del canale è piccola. Questo è forse perché il riscaldamento del joule nel gel agarosico è molto alto 18 , che influenza la prestazione di separazione.
Il metodo SGE proposto qui è molto semplice. Un dispositivo portatile mini-SGE può essere sviluppato se il sistema è ottimizzato. Tale dispositivo può essere applicato ai test di laboratorio di puntamento.
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Disclosures
Non vengono dichiarati conflitti di interesse.
Acknowledgments
Accogliamo con gratitudine il sostegno della Fondazione Nazionale di Scienze Naturali della Cina (n. 21205078) e del Fondo di Ricerca per il Dottorato di Ricerca dell'Istruzione Superiore della Cina (No.20123120110002). Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto dal Programma Nazionale di Ricerca e Sviluppo della Cina (2016YFB1102303), dal Programma Nazionale di Ricerca di Base della Cina (973Program; 2015CB352001) e dalla National Natural Science Foundation of China (61378060).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 | |
| 50 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A | |
| 100 bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A | |
| 1 kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A | |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A | |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
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