Summary
والهدف من هذا البروتوكول هو إنشاء نموذج كسر ضغط الفقرات المتعلقة بهشاشة العظام التي يمكن تقييمها طوليا في فيفو استخدام ميكروكومبوتيد سيميوتوماتيد على أساس التصوير المقطعي كمي هيكلية تحليل الفئران عارية.
Abstract
الكسور المتعلقة بهشاشة العظام ضغط العمود الفقري (أوفكفس) حاجة لم تلب سريرياً والمشتركة مع زيادة انتشار كسن سكان العالم. نماذج حيوانية أوفكف ضرورية لتطوير استراتيجيات هندسة الأنسجة متعدية الإكلينيكية. على الرغم من وجود عدد من نماذج حاليا، يصف هذا البروتوكول أسلوب أمثل لحمل عدة عيوب العمود الفقري استنساخه بدرجة عالية في الفئران عارية واحدة. ميكروكومبوتيد سيمياوتوماتيد طولية رواية التصوير المقطعي (µCT)-كما هو مفصل استناداً إلى التحليل الهيكلي الكمية من عيوب العمود الفقري. باختصار، تم تصويرها الفئران في نقاط متعددة وقت بعد العملية. المسح يوم 1 توجيه إلى موضع قياسية، ومعرف وحدة تخزين قياسية للفائدة. وسجلت µCT اللاحقة بالأشعة لكل الفئران تلقائياً للمسح يوم 1 حيث كان ثم تحليل نفس الحجم من الاهتمام تقييم لتكوين العظام الجديدة. هذا النهج متعدد الاستخدامات يمكن تكييفها مع مجموعة متنوعة من نماذج أخرى حيث يمكن أن تستفيد التحليل القائم على التصوير الطولي من محاذاة سيميوتوماتيد 3D دقيقة. أخذت معا، يصف هذا البروتوكول نظام سهولة قابلة للقياس الكمي واستنساخه بسهولة لأبحاث هشاشة العظام والعظام. البروتوكول المقترح يأخذ 4 أشهر للحث على هشاشة العظام في الفئران ovariectomized عارية وبين 2.7 و 4 ح لتوليد والصورة، وتحليل عيوب العمود الفقري اثنين، تبعاً لحجم الأنسجة والمعدات.
Introduction
أكثر من 200 مليون شخص في العالم يعانون من مرض هشاشة العظام1. المرضية الكامنة وراء الانخفاض في كثافة المعادن في العظام (BMD)، وزيادة المصغرة غيرت العظام وهشاشة العظام، ونتيجة لذلك، الخطر النسبي للكسر2. ترقق العظام من ذلك انتشارا ومضرة بالصحة أن منظمة الصحة العالمية قد عرف أنه أحد الشواغل رئيسية لصحة العامة. وعلاوة على ذلك، كما سكان العالم المتوقع أن العمر، ترقق العظام يتوقع أن تصبح أكثر شيوعاً.
كسور في العظام هشاشة ضغط العمود الفقري هي كسور هشاشة الأكثر شيوعاً، ﺑ أكثر من 000 750 سنوياً في الولايات المتحدة. أنها ترتبط باعتلال كبير وقدر حسب معدل وفيات أعلى تسع مرات3. حاليا في التجارب السريرية، وعثر على التدخلات الجراحية المتاحة، مثل فيرتيبروبلاستي وكيفوبلاستي، أن يكون لا أكثر فعالية من شام معاملة4،5، تاركة فقط إدارة الألم المتاحة لهؤلاء المرضى. حيث أن العلاجات أوفكف الحالية محدودة، من الضروري استحداث نموذج لحيوانات التي يمكن إجراء نسخ متماثل اضطراب6،،من78. ويمكن تسهيل هذه النماذج الحيوانية التحقيق في أساليب العلاج الحالية وتطوير علاجات جديدة سوف تترجم إلى الممارسة السريرية. تم التي يسببها ترقق العظام والمستدام في الحيوانات النموذجية من خلال إدارة نظام غذائي منخفض الكالسيوم (LCD) بالاقتران مع أوفاريكتومي1،،من910،11، 12 , 13 , 14 , 15-كذلك نموذج فقدان العظام المرتبطة أوفكفس، أنشئ عيوب العمود الفقري العظام في الفئران الأشخاص العظام هشاشة 16،17،،من1819، 20،،من2122،،من2324. في هذا العمل، يقدم نموذجا عيب العمود الفقري للفئران المناعة مع هشاشة العظام على غرار. يمكن استخدام هذا النموذج الجديد لتقييم يستند إلى الخلية العلاجات المتعلقة بالخلايا الجذعية المشتقة من مختلف المصادر والأنواع للإصلاح الكسور الصعبة، مثل أوفكفس.
تصوير العظام جزء حاسم من تقييم الكسور وأمراض العظام. تم وضع أساليب التصوير المتقدم للتقييم الدقيق للتغيرات الهيكلية العظام و استراتيجيات التجديد25. فيما بينها، برز تصوير µCT كطريقة غير الغازية، وسهلة الاستخدام، وغير مكلفة توفر صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة. تصوير µCT مزايا عديدة على طرائق أخرى في تقييم مرضى هشاشة العظام، كما أنها توفر 3D عالية الدقة العظام المصغرة26 ثم يمكن تحليلها كمياً. هذا الأخير يمكن ثم استخدامها لمقارنة الآثار العلاجية من العلاجات المقترحة. وفي الواقع، في فيفو التصوير µCT معيار الذهب للتجديد عيب العمود الفقري رصد1،،من1627. ومع ذلك، استخدمت بعض المنشورات28،،29،30،31 أدوات التسجيل الآلي للتقليل من المستخدم-تبعية، والتحيز الاستيفاء، وخطأ الدقة من µCT التحليل القائم على التصوير. في الآونة الأخيرة، كنا الأول من استخدم إجراء تسجيل لتحسين تحليل التجدد العظام في العظام موحدة باطلة، كما هو موضح في هذا البروتوكول32 .
يمكن استخدامها لدراسة أثر العلاجات خلية رواية عن أوفكفس الطريقة الموضحة هنا، دون عوائق من المضيف تي خلية الردود التي قد ترفض الخلايا إكسينوجينيك أو متمكنة. هي التي يسببها ترقق العظام في الفئران الصغار عن طريق أوفاريكتومي (أف) و 4 أشهر من شاشات الكريستال السائل. يسمح سن مبكرة من الفئران أوفكس، جنبا إلى جنب مع شاشات الكريستال السائل، تمكننا من الوصول إلى كتلة عظم ذروة منخفض، محاكاة ترقق العظام بعد سن إلياس التي تؤدي إلى فقدان العظام لا رجعة فيه. وهذا يمكن تفسيره جزئيا بحقيقة أنه خلال شاشات الكريستال السائل، وفي حوالي 3 أشهر من العمر، الانتقال الفئران من العظم والنمذجة لإعادة عرض المرحلة في الفقرات القطنية33، مما يزيد من احتمالات الاحتفاظ هشاشة العظام على الوقت. استخدام الحيوانات الشباب يجعل هذا النموذج أكثر فعالة من حيث التكلفة، كما أنها أقل تكلفة. على الرغم من ذلك، فإنه محدود بطبيعته لا تستأثر بالتغيرات البيولوجية في الحيوان الشيخوخة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب على الحيوانات تحت بروتوكول أقرته "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (إياكوك) من مركز سيدرز-سيناء الطبي (البروتوكول رقم 3609). تدار التخدير لجميع الإجراءات الجراحية والتصوير. تم إيواء جميع الحيوانات وفقا للبروتوكولات المعتمدة في إياكوك-
ملاحظة: التصميم التجريبي لهذا البروتوكول ويرد في الشكل 1. شراء الفئران عمرها ست الأسبوع مع المبايض إزالتها جراحيا وإطعامهم شاشات الكريستال السائل تتكون من فوسفات الكالسيوم و 0.77 في المائة 0.01 في المائة. وبعد فترة 4 أشهر من شاشات الكريستال السائل، حفر عيب الحرجة حجم العمود الفقري في الرابعة والخامسة القطنية العمود الفقري الهيئات (L4-L5). في أعقاب عملية جراحية، صورة الفئران في اليوم الأول وبعد أسابيع من 2, 4 و 8 و 12 إنشاء عيب. تحديد هوامش عيب على الفحص يوم 1 وإعادة توجيه إلى وضع معيار وتحديد وحدة تخزين أسطواني للفائدة (أصوات العراق). تسجيل تلقائياً بمسح µCT اللاحقة (أي لمدة أسابيع 2، 4 و 8 و 12) من كل الفئران إلى موقف القياسية المحددة للمسح يوم 1 المقابلة. تطبيق اليوم 1 مسبقاً أصوات العراق لفحص المسجلين. تقييم كثافة العظام بحجم وكثافة الظاهر فويس-
1-"التعريفي ترقق العظام"
- وضعت عمرها ست الأسبوع athymic ovariectomized الفئران في 4 أشهر من شاشات الكريستال السائل تتكون من فوسفات الكالسيوم و 0.77 في المائة 0.01 ٪.
- التبديل مرة أخرى إلى اتباع نظام غذائي عادي.
ملاحظة: هذه الفئران وسوف يشار إليها " الفئران العظام هشاشة " الآخرة.
2. نموذج عيب العمود الفقري
ملاحظة: التوقيت 40-50 دقيقة للحيوان الواحد.
- اﻷوتوكﻻف الجراحية جميع الأدوات السابقة للجراحة-
- في حالة عمليات جراحية متعددة، تعقيم جميع الأدوات الجراحية.
- تغسل الأدوات اللازمة ووضعها في حمام سونيكاتور لمكان لهم في مجموعة معقم حبة حار إلى 250 درجة مئوية للسماح س. 20 دقيقة 5 الأدوات اللازمة لتهدئة للحد الأدنى 5
- التخدير الحث.
- مكان الفئران العظام هشاشة في قاعة توجيهي يعلق على جهاز تخدير مع نظام مركزي للمسح. حمل التخدير استخدام isoflurane 5% في الأكسجين 100% والمحافظة عليها عن طريق الآنف مخروط في إيسوفلوراني 2-3%. استخدام مرهم البيطرية على العينين لمنع جفاف بينما تحت التخدير.
- تطبيق حافز تو-قرصه لضمان الطائرة كافية للتخدير. إذا لوحظ أي رد، الشروع في الإجراءات.
- أنيسثيتيزيد الفئران في ريكومبينسي الظهرية على وسادة تدفئة (37 درجة مئوية) وتمتد أطرافه باستخدام نظام سحب التبعي المغنطيسي ( الشكل 2A).
ملاحظة: درجة الحرارة لوحة تدفئة مهم للوقاية من انخفاض درجة حرارة الجسم، إذ هو جرذ أنيسثيتيزيد غير قادرة على تنظيم درجة حرارة الجسم. - يحلق في منطقة البطن باستخدام ماكينة حلاقة كهربائية. مسحه مع غلوكونات الكلورهيكسيدين ومطهر اليود-على أساس 0.5% تليها الإيثانول 70%-
- حقن الفئران مع والايبوبروفين (وزن الجسم 5 مغ/كغ (الأسلحة البيولوجية)، تحت الجلد (ميدان)) قبل بداية العملية الجراحية.
- استخدام مشرط معقم لقطع الجلد. يبدأ شق 1 سم تحت عملية الرهابه وقطع طريق خط الوسط (~ 5-8 سم) ( الشكل 2)-
- استخدام مقص الجراحية جعل شق من أبونيوروسيس عن طريق ينيا ألبا الوصول إلى تجويف البطن ( الشكل 2).
- فضح تجويف البطن باستخدام الكامشات ( الشكل 2D).
- يصرف الأمعاء بحق الفئران في فضح الشريان الاورطي البطني واستئصال كليته اليسرى ( الشكل 2E). جس العمود الفقري القطني قبل الشروع في الكشف عن ذلك. لتجنب الجفاف، استخدم جاوزيس غارقة العقيمة مع المحلول الملحي المعقم لالتفاف الأجهزة الداخلية-
- استخدام ثيرموكوتيري فضح في طبقات الجانب الأمامي من الهيئات الفقري القطنية L4-5 وعزلها من العضلات والنسيج الضام المحيطة بها ( الشكل 2 واو -ز)-
ملاحظة: يجب استخدام ثيرموكوتيري للتحكم في النزيف أثناء التشريح. - استخدام مسحه القطن معقمة مشبعة بالمحلول الملحي المعقم لإزالة أنسجة الدم وبقايا من الفقرات L4. استخدام بر حفر ترفين عقيمة (~ 2 ملم في القطر) لحفر عيب 5 مم عمق العظام في وسط الجانب الأمامي المكشوفة من الجسم الفقري (الشكل 2 ح-أنا)-
ملاحظة: تطبيق ضغط الحد الأدنى لحفر من خلال فقط قشرة البطني وعظم trabecular الكامنة؛ تجنب الحفر من خلال القشرة الظهرية. علما بأن فقرات الفئران العظام هشاشة هشة جداً. استخدم مسحه القطن لتنظيف العيب وممارسة الضغط لوقف النزيف، إذا كان موجوداً. - كرر الخطوة 2.11 في فقرة L5 لإنشاء مجموعة عيوب 2 كل الفئران ( 2J الشكل)-
- إرجاع الأمعاء إلى تجويف البطن.
- استخدام فيكريل اصطناعية قابلة لامتصاص جراحية خياطة (فيكريل 3-0 أوندييد 27 " تفتق SH) في نمط مستمر خياطة أبونيوروسيس ( الشكل 2 ك)-
- إغلاق الجلد باستخدام 4-0 شعيرات نايلون خياطة غير امتصاص في نمط توقف بسيطة ( الشكل 2 لتر).
- تطبيق 100 ميليلتر من لاصق الجلد الموضعية على رأس خيوط الجلد وفيما بينها لضمان الإغلاق الكامل للجلد.
- حقن الفئران بالحارة (37 درجة مئوية) في المسابقة لاكتاتيد ' s الحل (1CC/100 جرام وزن الجسم، مربعا) لمنع انخفاض حرارة الجسم والجفاف-
- حقن الفئران البوبرينورفين (0.5 ملغ/كغ وزن الجسم، ميدان) قبل الجراحة وكل ح 8-12 لتخفيف الألم بعد العملية حسب الحاجة.
- لا تترك الحيوان غير المراقب حتى قد وعيه كافية للحفاظ على ريكومبينسي القصية. أيضا، لا يعود حيوان الذي خضع لجراحة لشركة الحيوانات الأخرى حتى أنه قد تعافي تماما.
- بعد أن تعافي الحيوان على منصة التدفئة، إعادته إلى قفصة.
ملاحظة: بيت الفئران على حدة (أي، في أقفاص منفصلة) لمنع تشويه الفئران للفئران خياطة الجروح والجرح. - مكان تشو غارقة في الماء في طبق بتري في الطابق قفص لبضعة أيام بعد العملية لمساعدة الفئران الوصول إلى الغذاء-
- إدارة والايبوبروفين (5 مغ/كغ وزن الجسم، ميدان) 24 ساعة ما بعد الجراحة لتخفيف الألم كل 24 ساعة حسب الحاجة.
- إزالة خيوط الجلد بينما يكون الحيوان تحت 2% isoflurane التخدير 10-14 يوما بعد انتهاء العملية.
3. مسح ميكروكت
ملاحظة: التوقيت 30-40 دقيقة للحيوان الواحد.
- في اليوم التالي للعملية الجراحية، ضع الفئران العظام هشاشة في قاعة توجيهي يعلق على جهاز تخدير مع نظام مركزي للمسح. حمل التخدير استخدام isoflurane 5% في الأكسجين 100% والحفاظ على عن طريق الآنف مخروط في 2-3% إيسوفلوراني-
- تفحص الفئران باستخدام ماسح µCT في فيفو. كرر المسح الضوئي للتحليل الطولي للتجدد العظام.
ملاحظة: تأكد من أن جميع الحيوانات هي الممسوحة ضوئياً باستخدام نفس الإعدادات (أي الطاقة الأشعة السينية، مسح المتوسطة وكثافة وحجم فوكسل ودقة وضوح الصورة) وفي لعاتجاه البحث والتطوير. فعلى سبيل المثال: الطاقة الأشعة السينية، كفب 55؛ الحالي, µA 145؛ حجم فوكسل، 35 ميكرون؛ زيادات، ميكرومتر 115؛ ووقت التكامل، 200 مرض التصلب العصبي المتعدد؛ مع العينات في برنامج تلفزيوني. الرجوع إلى بوكستين et al. 34 لمزيد من الإيضاحات واعتبارات في القوارض µCT مسح لتقييم المجهرية العظام. ومن الناحية المثالية، ستستخدم أعلى دقة المسح الضوئي متاح لجميع عمليات التفحص؛ ومع ذلك، فحص دقة أعلى تحتاج إلى وقت أطول للحصول على توليد مجموعات كبيرة من البيانات وتعرض الحيوانات للإشعاع المؤين أكثر. قد يعرض الآثار غير المرغوب فيها، بما في ذلك تناقص الكسر الشفاء. ولذلك ينبغي إمعان النظر المفاضلة بين بيانات إضافية والمسح الضوئي الوقت.
4. فصل العمود الفقري
ملاحظة: التوقيت 20-30 دقيقة كل عينة.
- كفاف الفقرة الاهتمام، كما هو موضح في الشكل 3 ألف-"أولاً تأكد من" أن تشمل جميع أجزاء من الفقرة مع استبعاد الأجزاء التي تنتمي إلى فقرات المجاورة.
- فوق " برنامج التقييم µCT " وحدد النموذج من القائمة.
- كفاف كل شريحة باستخدام الماوس.
- استخدام " Z " بار للانتقال إلى الشريحة التالية.
- فقرة أحيط بحفظ كملف منفصل ( 3J الرقم -ك) بالنقر فوق " ملف " → " "جوبي حفظ" " كل زوجين من شرائح.
5. تعريف أصوات العراق "التقييم الكمي طولية"
ملاحظة: الخطوات التالية تتوقف على ما إذا كان المسح الضوئي من اليوم الأول بعد الجراحة (فقرة مرجع) أو من (النقاط في وقت لاحق الهدف لفقرات).
- فقرة مرجع.
ملاحظة: التوقيت 20-30 دقيقة كل عينة.- ض--التناوب، قياس زاوية الهوامش باستخدام شريحة س وص من مركز العيب ( 4A الرقم -ب).
- في Z-الطائرة، اذهب إلى منطقة الفقرة أين هو العيب واضح وشاشة القبض على معظم الفقرة.
- في برنامج العرض تقديمي، إعداد كائن مستطيل الشكل التي سوف تدخل في العيب.
- تدوير الصورة للفقرة أن العيب يواجه صعودا والهوامش عيب في موازاة جانبي المستطيل.
- قياس زاوية الدوران (انقر بالزر الأيمن على الصورة → " "تنسيق الصورة" " → " حجم ").
- استخدام زاوية قياسها لتدوير الفقرة ( الشكل 4).
- فتح نافذة جديدة من ديكتيرم (" مدير الدورة " → " تطبيقات " → " ديكتيرم ")-
- تشغيل " الشعيرات ":
- الشعيرات > turn3d
- -الإدخال [في] >
- --إخراج [خارج] >
- -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -تورنانجلي [0.000] > قياس زاوية
- -img_interpol_option [1] >
- للعاشر--التناوب، قياس زاوية الهوامش باستخدام شريحة YZ من مركز العيب ( الشكل 4 -E). استخدام زاوية قياسها لتدوير الفقرة ( 4F الشكل).
- فوق " YZ " في " uCT تقييم برنامج " وكرر الخطوات 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- الشعيرات > إيسق
- -aim_name [في] >
- -isq_filename [default_file_name] > إدراج دليل ملف إيسك (مثلاً، " DK0: [ميكروكت. البيانات. غازيت. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. إيسك ")
- -نقاط البيع [0 0 0] >
- -تعتيم [-1-1-1] >
- الوجه فقرة تدويرها عن طريق تغيير تخطيط س ص-الطائرة إلى زد إكس-الطائرة.
- فتح نافذة جديدة من ديكتيرم (" مدير الدورة " → " تطبيقات " → " ديكتيرم ")-
- تشغيل " الشعيرات ":
- الشعيرات > الوجه
- -الإدخال [في] > على
- -الإدخال [خارج] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- تعريف أصوات العراق.
كفاف
- رسم تعميما العيب باستخدام شريحة من مركز العيب عن طريق تحديد رمز مخطط دائري في " uCT تقييم برنامج " ( الشكل 6A). نسخة كفاف ولصقه في كل الشرائح في العيب ( الشكل 6B).
ملاحظة: نظراً لجميع العيوب تم إنشاؤها باستخدام نفس الإجراء، تحليل نفس العدد من الشرائح، وفي وقت لاحق، الحجم الإجمالي (التلفزيون) لجميع العينات-
- رسم تعميما العيب باستخدام شريحة من مركز العيب عن طريق تحديد رمز مخطط دائري في " uCT تقييم برنامج " ( الشكل 6A). نسخة كفاف ولصقه في كل الشرائح في العيب ( الشكل 6B).
- ض--التناوب، قياس زاوية الهوامش باستخدام شريحة س وص من مركز العيب ( 4A الرقم -ب).
- فقرة الهدف.
ملاحظة: التوقيت 10-20 دقيقة لكل عينة. ملفات- تحميل DICOM الهدف والفقرات الإشارة إلى الإطار الرئيسي لبرنامج تحليل الصور-
ملاحظة: لتجنب تغيير قيمة الرمادي، قم بتعريف نفسه إخراج نوع البيانات كملفات DICOM الأصلي في القائمة تحميل.
فقرة - السجل للإشارة.
- إطلاق " ثلاثي الأبعاد فوكسل التسجيل " الوحدة النمطية وإدخال فقرة مرجع " "حجم قاعدة" " وفقرة المستهدفة " مباراة وحدة التخزين. " انقر فوق " تسجيل " تسجيل الفقرات ( الشكل 5)-
- حفظ الملف المسجل باستخدام كتابة نفس البيانات واستيرادها إلى بيئة µCT.
- تنطبق أصوات العراق.
- تطبيق أصوات العراق تعريفها لفقرة إشارة إلى فقرة الهدف المسجل بواسطة النقر فوق " uCT تقييم برنامج " → " ملف " → " "جوبي تحميل" " وتحديد جوبي التي تم إنشاؤها مسبقاً. تحقق من أن أصوات العراق وعيب متحدة.
- تحميل DICOM الهدف والفقرات الإشارة إلى الإطار الرئيسي لبرنامج تحليل الصور-
6. تحليل ميكروكت
ملاحظة: التوقيت 10-20 دقيقة لكل عينة.
- إرسال أصوات العراق لتقييم استخدام برنامج تقييم µCT ( الشكل 6).
ملاحظة: تأكد من استخدام نفس المعلمات عند تحليل جميع فويس. تأكد من تعيين العتبة عالية بما فيه الكفاية لحذف الضوضاء الخلفية مع فقدان الحد الأدنى من العظام. إذا تم استخدام مادة بيولوجية راديوباك، يمكن استخدام عدد من الاستراتيجيات لتحليل تكوين العظام. إذا كان هناك اختلاف في كثافة بين الأنسجة مادة بيولوجية والعظام، يمكن مجزأة مادة بيولوجية من 35 ، 36. خلاف ذلك، يمكن أن المحققين نوعيا إلى تقييم الاختلافات في تكوين العظام بين المجموعات التجريبية.
7. القتل الرحيم
- بليس الفئران العظام هشاشة في قاعة التعريفي المرفقة بجهاز تخدير. حمل التخدير استخدام isoflurane 5% في الأكسجين 100%-
- المحافظة على التخدير عن طريق الآنف مخروط وتنفيذ القتل الرحيم قبل إينسيسينج تجويف الصدر لإنتاج استرواح الصدر ثنائية 37-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
باستخدام هذا البروتوكول، واحد صورة والتحديد الكمي لتجديد n = 8 عيوب العمود الفقري العظام هشاشة على غرار عبر نقاط زمنية مختلفة. المباراة التشريحية التي حصل عليها إجراءات التسجيل يسمح بتحليل أصوات العراق نفسه عند كل من النقاط الزمنية. يؤدي هذا إلى تحليل هيستومورفوميتريك 3D طولية دقيقة للغاية، حتى عندما لم يعد معترف بها على هامش العيب الأصلي. كنا خمس نقاط الوقت (اليوم 1 والأسبوع الثاني والأسبوع 4، الأسبوع 8 والأسبوع 12) كمثال لتقييم طولية التجدد العظام (الشكل 7). ويمكن تقييم التجديد من جانب التقييم النوعي للمقاطع العرضية في 2D و 3D صور (كما هو مبين في الشكل 7 أ) والكمية مقارنة كمية العظام (دي) ونوعية (AD) (الشكل 7). يمكن تحديد المؤشرات التالية شكلي لعظم المشكلة حديثا: (ط) التلفزيون، بما في ذلك حجم العظام والأنسجة اللينة (تلفزيون، مم3)؛ (ثانيا) حجم الأنسجة غضاريف (BV، مم3)؛ (ثالثا) عظم حجم الكثافة (BV والتلفزيون)؛ وكثافة المعادن في العظام (رابعا) (BMD، هيدروكسيباتيت مغ كل سم3). على وجه التحديد، لوحظ تكوين العظام الحد الأدنى (5 في المائة زيادة في كثافة حجم العظام) 2 أسابيع بعد إنشاء عيب. وبعد أسبوعين، لوحظت لا اختلافات كبيرة في تكوين العظام عند نقاط زمنية لاحقة بالمقارنة. عموما، على الرغم من أن هناك درجة معينة من تكوين العظام، والتي بلغت ذروتها في حوالي 10% من الأسبوع 8، كان الحد الأدنى للحفاظ على العظام باطلا على مر الزمن.
رقم 1: بروتوكول تصميم. ويرد على الخطوات الأساسية في البروتوكول. أولاً، ovariectomized الفئران عارية تعرض لأربعة أشهر من اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم (LCD) كان يعمل عليها لإنشاء معيار العيوب الحجم الحرج في الهيئتين العمود الفقري القطني. تم تصويرها على الفئران في اليوم 1، والبروتوكول الاختياري بعد أسابيع 2، 4 و 8 و 12. المسح يوم 1 إعادة توجيه إلى موضع قياسي، وعرف أصوات العراق أسطواني باستخدام الهوامش عيب. وسجلت µCT اللاحقة بالأشعة لكل الفئران تلقائياً إلى موقف القياسية المحددة للمسح يوم 1 المقابلة. ثم طبقت بالأشعة المسجلة اليوم 1 مسبقاً أصوات العراق. استخدمت بكثافة العظام بحجم وكثافة الظاهر من أصوات العراق لتقييم تكوين العظام الجديدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: جراحة العمود الفقري عيب. يتم توضيح الخطوات الرئيسية في توليد الجراحية من عيوب العمود الفقري. أولاً، وضعت الفئران في وسادة تدفئة (A). وقدم شق خط الوسط عن طريق الجلد (ب) ومن ثم ينيا ألبا (ج) لفضح تجويف البطن (د). وانعكست في الأمعاء لفضح جدار البطن الخلفي (ه)، وتعرضت القطنية باستخدام ثيرموكوتيري (سهم، وز). تم حفر العيوب في الرابع (ح، السهم مشيراً إلى الحفر؛ أناوالسهم يشير إلى العيب) والخامسة (ي، أسهم تشير إلى العيوب) الهيئات العمود الفقري القطني. وأخيراً، كانت خياطة أبونيوروسيس (K) والجلد (L). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: فصل فقرة. تظهر الخطوات الرئيسية في الكنتوري لفقرة فائدة. (A--أنا) تظهر الشرائح 2D الممثل أحيط (الخط الأخضر) على طول المحور لفقرة. ويمكن مقارنة تمثيل ثلاثي الأبعاد للعمود الفقري الكامل (ي) إلى فقرة منفصلة (K). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: الإشارة في فقرة لتحديد المواقع- تظهر الشرائح الممثل في طائرتين لفقرة قبل وبعد التدوير إلى موضع قياسي. أولاً، استخدام ممثل س ص-شريحة (A)، الزاوية (ب، الأخضر) اللازمة لتدوير العيب (ب، الساحة الحمراء) لتصبح موازية للمحور ص (ب، الأصفر) مصممة وثم استخدامه لإنشاء الصورة الذي تمت استدارته (ج ). ثم، باستخدام ممثل YZ-شريحة (د)، الزاوية (ه، الأخضر) اللازمة لتدوير العيب (ﻫ، الساحة الحمراء) لتصبح موازية لمحور ع (ﻫ، الأصفر) مصممة وثم استخدامه لإنشاء الصورة الذي تمت استدارته (و ). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: استهداف فقرة التسجيل- شرائح ممثلة في ثلاث طائرات المستهدفة فقرة (ملحوظة في الأخضر) وفقرة المرجعية (باللون الأحمر) قبل (أ-ج) وبعد أن يتم عرض التسجيل (د-ه). ملاحظة اللون الأصفر، مما يشير إلى التداخل بين فقرات الهدف والمرجعية، والأسهم البيضاء التي تشير إلى عظم الخضراء بعد التجديد، مشيراً إلى تكوين العظام. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: تحليل أصوات العراق. تظهر الشرائح الممثل في طائرتين مع أحيط حجم الاهتمام. يتم وضع المنحنى دائري في مركز العيب في ممثل زد إكس-شريحة (A). بعد نحت جميع زد إكس-شرائح، يتبين حجم عيب كاملة في الطائرة التي س ص (ب). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: التحليل الطولي للتجديد عيب العمود الفقري- وتظهر نتائج التحليل التجدد العظام التمثيل النوعي والكمي. ويرد (A) A عيب العمود الفقري الممثل في نقاط زمنية مختلفة في كل لوحة صورة 3D أمامي (اللوحة العلوية) مع تكوين العظام في الفراغ المبين باللون الأحمر، وصورة ثنائية الأبعاد السهمي (الفريق الأوسط)، وصورة ثنائية الأبعاد محورية (أسفل اللوحة). وأجرى التحليل الكمي لتكوين العظام في الفراغات. العظام حجم الكثافة (ب) وكثافة واضحة (ج) حسبت ومقارنة تكرار استخدام تدابير ANOVA ثنائي الاتجاه مع تصحيح بونفيروني لمقارنات متعددة. أشرطة الخطأ تمثل sem. * * *-ف < 0.0001. الرجاء انقر فوق لها(ه) لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| الخطوات | المشكلة | السبب المحتمل | الحل |
| 2.3 | الحيوان يلهث تحت التخدير | تسليم إيسوفلوراني الزائدة | خفض تركيز isoflurane تسليمها للحيوان. |
| الحيوان ويستجيب إلى أخمص القدمين قرصه | التسليم غير كافية إيسوفلوراني | زيادة تركيز إيسوفلوراني. | |
| 2.7-2.12 | الثقيلة النزيف | تلف الأوعية الدموية | استخدم مسحه القطن معقمة لتطبيق الضغط أو الكي لإيقاف النزيف. |
| الحيوان لديه صعوبة في التنفس | وكان ثقب الحجاب الحاجز | Euthanize الحيوان لمنع الاختناق. | |
| تسرب محتويات الأمعاء | وكان ثقب الجهاز الهضمي | Euthanize الحيوان لمنع المزيد من المضاعفات. منع ذلك برفع أبونيوروسيس بعيداً عن الأمعاء الأساسية قبل قطع. | |
| الدم يخرج من موقع الحفر | وكان ثقب في الأوعية الدموية | تطبيق مسحه القطن معقمة حتى يتوقف النزف. | |
| فجأة يهز الحيوان أثناء الحفر | التدريبات ذهب عميق جداً وتلف النخاع الشوكي | Euthanize الحيوان لمنع المزيد من المضاعفات. | |
| عيب العظام تبدو غير مكتملة | لم يذهب الحفر العميق ما يكفي | تغيير موضع رأس الحفر داخل العيب وحفر أعمق | |
| 2.15-2.24 | فواصل خياطة | وسحبت الخياطة مسرف | محل خياطة كاملة. في حالة حدوث كسر غالباً، استخدام خياطة سمكا حجم. |
| الحيوانات بطيئة للتعافي من التخدير | الحيوان باردا | زيادة درجة حرارة لوحة التدفئة أو تطبيق مصدر إضافي لتدفئة (مثل تدفئة مصباح). | |
| يتم خياطة الجروح المفتوحة | ووضعت خيوط فضفاضة، أو الحيوان لم نشاط المضنية | تطبيق خياطة الجروح ويطبق ديرمابوند مباشرة خيوط وبينهما. | |
| 3 | تظهر الصورة الممسوحة ضوئياً بدقة منخفضة، صاخبة أو متفرقة | تحتاج إلى تعديل معلمات المسح الضوئي | ضبط معلمات بروتوكول المسح الضوئي. الرجوع إلى بوكسسين وآخرون لمزيد من المبادئ التوجيهية للمسح الضوئي. |
| تظهر الصورة الملتقطة بالماسح الضوئي الضبابية | نقل الحيوان أثناء عملية المسح الضوئي | إعادة تفحص الحيوان. إذا ما زالت الحركة، زيادة تركيز إيسوفلوراني. | |
| 5 | تسجيل فقرة الهدف لم يكن ناجحاً | لم يكن يتم فصل العمود الفقري بشكل صحيح | ريكونتور الفقرة: تأكد من جميع أنحاء فقرة مدرجة، واستبعاد أي هياكل مجاورة. |
| اختلاف كبير في تحديد المواقع من فقرات | تغيير موضع فقرة الهدف في نفس اتجاه كفقرة مرجع باستخدام عمليات التناوب والوجه (الخطوة 29 ألف). | ||
| تحليل لا يمكن التعرف بشكل صحيح على الهياكل العظمية | تطبيق عتبة في وحدة التسجيل لإزالة الضوضاء الخلفية من عينات العظام. | ||
| تختلف الفقرات المسجلة | إنشاء صور ثلاثية الأبعاد للعينات الخاصة بك، وتطابق الفقرات الصحيحة عبر نقاط زمنية مختلفة. | ||
| 6 | إجمالي الحجم (التلفزيون) يختلف بين العينات | واستخدمت أرقام مختلفة من الشرائح أو محيط مختلفة | تأكد من استخدام دائماً بنفس الحجم كفاف ونفس العدد من شرائح. |
| قيمة الكثافة المعدنية (BMD) العظام غير طبيعي | عدم كفاية معايرة ميكروكت | معايرة ميكروكت للمعايير الصحيحة هيدروكسيباتيت |
الجدول 1: استكشاف الأخطاء وإصلاحها. يتم عرض المشاكل والحلول المحتملة لمختلف الخطوات في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ترقق العظام هو السبب الأكثر شيوعاً لكسور العمود الفقري ضغط نتيجة زيادة العبء على العمود الفقري وتؤدي إلى انهيار الجسم الفقري. ومع ذلك، من المستحيل عمليا لتوليد ضرر في القوارض التي يتطابق أصلي من انهيار العمود الفقري مماثلة. بدلاً من ذلك، إنشاء الباحثين فراغاً أسطواني في مركز الهيئة العمود الفقري لتقليد16،أوفكفس،من1719،18،20،،من2124 , 38 , 39-حيث لا يوجد اتساق في الأدب من حيث حجم عيب، عيب الحرجة الحجم عرف أنه واحد أن لا عفويا شفاء تاما دون تدخل خلال 3 أشهر بعد العملية16،17.
على الرغم من أن أسلوب الجمع بين أوفاريكتومي مع شاشات الكريستال السائل للحث على سرعة ترقق العظام المنشورة سابقا1،13، كنا الأول من تبين أن تطبيق هذا النهج إلى athymic الفئران ينتج كفاءة، سريع، و لا رجعة فيه انخفاض في العمود الفقري العظام ترابيكولار الحجم والثروة المعدنية كثافة40. هذا هو نموذج استنساخه بالحيوانات الصغيرة التي هي دون عوائق من القوارض الجهاز المناعي وأن هل لا حاجة لإضافة الكبت المناعي، كما يستخدمها الآخرون24.
ولدت لدينا بروتوكول الجراحية متعددة متماثلة عيوب العمود الفقري القطني الحاسمة40. هذه النتائج في عيوب عاليا متسقة وقابلة للمقارنة بسهولة والقابلة للقياس الكمي عبر الحيوانات. أننا نعتقد أن العيوب التي أنتجت باستخدام هذا النهج متفوقة على نماذج خلل العمود الفقري ولدت في فقرات والذيلية1،،من1941 لأن ذيل الفئران، يخضع للنشاط الحيوي القوى التي تختلف اختلافاً كبيرا عن تلك التي تنطوي على الفئران في الفقرات القطنية.
وتشمل الخطوات الحاسمة في إطار هذا البروتوكول تجنب انخفاض حرارة الجسم داخل المنطوق وأخذ الحذر عند حفر الفقرات الهشة ovariectomized الفئران عارية بعد شاشات الكريستال السائل. بعد إنشاء العمود الفقري العيب، يتم رصد عبر تسلسل زمني في فيفو بمسح µCT عند نقطة زمنية محددة لتقييم إصلاح العظام الطولية. المحافظة على نفس إعدادات المسح الضوئي أمر بالغ الأهمية. ثم أحيط الفقرات وفصلها عن بقية المسح الضوئي. نحت حجم إجمالي مطابق لجميع عمليات التفحص لفقرة، وتجنب التغييرات قيمة الرمادي الحاسمة. متوفرة تجارياً خوارزمية التسجيل صورة متعددة يسهل الاستخراج الأساس المطابق تشريحيا فويس لجميع النقاط الزمنية اللاحقة. وأخيراً، يتم تحليل هذه فويس لعظم حجم وكثافة الظاهر، إلخ. من المهم لتحليل جميع فويس باستخدام نفس المعلمات. هذا الأسلوب يوفر تحليلاً µCT 3D طولية دقيقة للغاية وواضحة لا تعتمد على المستخدم.
ويمكن تطبيق هذا الأسلوب لأي تحليل التجديد عيب العظام الطولية. عيب العمود الفقري النموذج المستخدم هنا نموذج مناسب لهذا التطبيق، هيكلها العظام فريدة من نوعها ويمكن تسجيلها بسهولة إلى نفس الموقف التشريحية. ومع ذلك، يمكن تحليل أي تجديد العظام تحت نفس الظروف بفصل العظام نفس الاهتمام في جميع أنحاء عمليات التفحص الطولي بشكل صحيح. من الضروري أن تدرج عينات العظام المنفصلة مع نفس الميزات التشريحية. يتم وصف هذه المشكلة المحتملة وغيرها في الجدول 1، جنبا إلى جنب مع الأسباب المحتملة والحلول المقترحة. يمكن أن يحدث التطابق التشريحية التي حصل عليها إجراءات التسجيل فقط إذا تدرج العينات نفس الميزات التشريحية. التسجيل سوف تسمح للمستخدم بتطبيق يمكن معرفة مسبقاً الدقيق لأول مسح لجميع النقاط الزمنية المتبقية، أسفر تحليل هيستومورفوميتريك 3D عالية دقة على مر الزمن. كثافة العظام بحجم وكثافة الظاهر من أصوات العراق يمكن استخدامها لتقييم تكوين العظام الجديدة.
بينما التطبيق المحتمل على نطاق واسع، ليس النموذج المعروض هنا دون قيود. يمكن النظر في استخدام الفئران athymic عارية القيد، كما أنه يمكن أن يحتمل أن تخفي بعض عمليات وساطة المناعية التي قد تكون ذات أهمية بالنسبة للتجديد. ثانيا، النمذجة ترقق العظام من خلال مزيج من أوفاريكتومي، وشاشات الكريستال السائل في الفئران الصغار، كما نشرت سابقا1،13، محدودة في قدرتها على تقليد بيولوجيا السكان المرضى المسنين. وثالثاً، كانت على غرار أوفكفس بإجراء العمليات جراحية، كالحيوانات الأخرى إلا أن الكسور المتعلقة بهشاشة العظام بالرئيسات42. أخيرا، في حين الفئران القطنية هو أفضل نموذج متاح للبشرية القطنية – حيث تضع معظم كسور العمود الفقري – عدم تحمل في العمود الفقري القوارض الوزن المحوري أيضا حد.
هذا البروتوكول هو نمطي ولذلك يمكن بسهولة تعديل الاحتياجات للباحث. على سبيل المثال، يمكن استخدام الفئران athymic ovariectomized على دراسة أخرى الكسور المتعلقة بهشاشة العظام. ينبغي اختيار باحث لاستخدام النهج الذي نتبعه لتحليل التجدد العظام سيميوتوماتيد، فإنه يمكن تطبيقها على أي نموذج الكسر باستخدام هيكلية طولية التصوير، والتصوير المقطعي ليس بالضرورة المحسوبة الدقيقة. وعلاوة على ذلك، يمكن جمع معلومات إضافية باستخدام أساليب التصوير إضافية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي في نفس الوقت.
يمكن استخدام النموذج أوفكف الذي قدم في هذا البروتوكول لدراسة رواية النهج العلاجي لهذه الحاجة غير الملباة سريرياً. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام نهجنا تحليل سيميوتوماتيد بنجاح لإجراء تحليل مماثل هو أقل تعتمد على المستخدم ويوفر دقة أفضل من الأساليب الأخرى16. الجدير بالذكر خاصة أن نحن تستخدم البرمجيات المتاحة تجارياً التصور والتحليل التي يمكن استخدامها بواسطة أي باحث – البرامج التي تدعم طرائق التصوير إضافية، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي والتصوير النووي. ولذلك، نعتقد أن هذا الأسلوب درجة عالية من التعميم ويقتصر فقط بتوافر قدرات التصوير في فيفو وبرامج التسجيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وأيد هذا البحث بمنحه من معهد كاليفورنيا للتجدد الطب (سيرم) (TR2-01780).
Acknowledgments
وأيد البحث على منحة من معهد كاليفورنيا للتجدد الطب (سيرم) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
