Summary
이 프로토콜의 목표 경도 평가 vivo에 는 반자동된 microcomputed 단층 기반 정량적 구조 분석을 사용 하 여 될 수 있는 누드 쥐 척추 압축 골다공증 관련 골절 모델을 생성 하는 것입니다.
Abstract
골다공증 관련 척추 압축 골절 (OVCFs)는 세계 인구 나가로 보급 증가 함께 일반적이 고 임상 unmet 필요. 동물 OVCF 모델 변환 조직 엔지니어링 전략의 전 임상 개발에 필수적입니다. 다양 한 모델은 현재 존재 하는 동안 단일 누드 쥐에서 여러 높은 재현성 척추 결함을 유도 하는 최적화 된 방법을이 프로토콜에 설명 합니다. 소설 경도 반자동된 microcomputed 단층 촬영 (µCT)-척추 결함의 정량적 구조 분석을 기반으로 또한 선발. 간단히, 쥐 여러 시간 포인트 수술에 몇 군데 있었다. 1 일 검사 표준 위치로 방향도 고 관심의 표준 볼륨 정의 되었다. 각 쥐의 후속 µCT 스캔 했다 동일한 볼륨의 다음 새로운 뼈 형성에 대 한 평가 분석 그래서 하루 1 스캔을 자동으로 등록 됩니다. 이 다재 다능 한 접근 어디 경도 영상 기반 분석 정확한 3 차원 반자동된 정렬에서 혜택을 수 있는 다른 모델의 다양 한 적응 될 수 있다. 함께 찍은,이 프로토콜에서는 골다공증 및 뼈 연구를 위한 쉽게 정량 하 고 쉽게 재현 가능한 시스템을 설명 합니다. 제안 된 프로토콜은 4 개월 누드 ovariectomized 쥐 및 생성, 이미지, 조직 크기와 장비에 따라 두 개의 척추 결함 분석을 2.7 그리고 4 h 사이 골다공증을 유발 합니다.
Introduction
200 백만 이상의 사람들이 전세계 골다공증1에서 고통. 기본 병 적인 감소 뼈 미네랄 밀도 (BMD)에 하 고 변경 된 뼈 마이크로아키텍처 뼈 취약성 및, 따라서, 골절2의 상대 위험 증가. 골다공증은 너무 유행 하 고는 WHO가 정의 그것은 중요 한 공중 위생 관심사는 건강에 해로운. 또한, 세계의 인구는 예상 대로 나이에, 골다공증 되 더 일반적으로 예상 된다.
골다공증성 척추 압축 골절은 가장 일반적인 취약성 골절, 미국에서 1 년 이상 750000 추정. 그들은 많은 중요 한 병 적 상태와 관련 된 9 배 높은 사망률 평가3입니다. 임상 시험에서 현재 사용할 수 외과 개입, vertebroplasty, kyphoplasty, 등 가짜 치료4,5,이 환자에 게 통증 관리만 사용할 수를 떠나 보다 더 더 효과적인 것을 발견 했다. 현재 OVCF 치료 제한 때문에, 장애6,,78을 복제할 수는 동물 모델을 개발 하는 것이 필수적입니다. 현재 치료 방법의 조사와 임상 연습으로 번역할 것 이다 새로운 치료법의 개발에 수 같은 동물 모델을 용이 하 게. 골다공증 유발 되 고 ovariectomy1,,910,11, 와 함께에서 낮은 칼슘 식단 (LCD)의 관리를 통해 모델 동물에서 입은 12 , 13 , 14 , 15. 추가 모델 OVCFs와 관련 된 뼈 손실, 척추 뼈 결함 골다공증성 immunocompetent 쥐 16,17,,1819에 설치 되었다 20,,2122,,2324. 이 작품에서 모델 골다공증 immunocompromised 쥐의 척추 결함 모델 제공 됩니다. 이 새로운 모델은 다양 한 소스와 OVCFs 같은 어려운 골절의 복구에 대 한 종에서 파생 된 줄기 세포 관련 세포 기반 요법 평가 하 사용할 수 있습니다.
뼈 이미징 골절 및 뼈 질병의 평가의 중요 한 부분 이다. 고급 이미징 방법 뼈 구조 변경 및 재생 전략25의 정확한 평가 위해 개발 되었다. 그 중 µCT 이미징 고해상도 3D 이미지를 제공 하는 비-침략 적, 쉬운--사용, 그리고 저렴 한 방법으로 떠오르고 있다. 고해상도 3D 마이크로아키텍처26 다음 양적 분석 수 있는 뼈 제공 µCT 이미징 골다공증 환자 평가에 다른 modalities에 몇몇 이점이 있다. 후자는 다음 사용할 수 있습니다 제안 된 치료의 치료 효과 비교. 실제로, µCT 이미징 vivo에서 척추 결함 재생1,,1627모니터링에 대 한 황금 표준입니다. 그러나, 몇 가지 간행물28,29,,3031 고용 사용자 종속성, 보간 편견, 및 µCT의 정밀도 오류를 최소화 하기 위해 자동화 등록 도구 이미징 기반 분석입니다. 최근에, 우리는이 프로토콜32 에 설명 된 대로, 표준화 된 뼈에서 뼈 재생의 분석을 개선 하기 위해 등록 절차를 사용 하는 첫번째 했다.
여기 설명 하는 방법을 OVCFs에 대 한 새로운 세포 치료의 효과 연구 하는 데 사용 될 수, 방해 받지 않는 호스트에 의해 T 세포 응답을 xenogeneic 또는 수용자 세포를 거부할 수 있습니다. 골다공증은 젊은 쥐 ovariectomy (OVX) 통해과 LCD의 4 개월에에서 유도 된다. OVX 쥐, LCD와 결합의 젊은 나이 있었습니다, 돌이킬 수 없는 뼈 손실을 선도 하 여 폐 경 후 골다공증을 흉내 낸 낮은 피크 뼈 질량에 도달. 이 사실은, LCD 중 리 모델링을 모델링 하는 뼈에서 쥐 전환 나이의 3 달 주변에 상 추33, 위에 골다공증을 유지의 가능성을 증가에 의해 분할 설명 될 수 있다 시간입니다. 젊은 동물을 사용 하 여 게이 모델 보다 비용 효과적인, 그들은 적은 비용으로. 그럼에도 불구 하 고, 그것은 본질적으로 하지 노화 동물의 생물 학적 변화에 대 한 회계에 의해 제한 됩니다.
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Protocol
모든 동물 실험 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 삼목 시 나이 의료 센터 (프로토콜 # 3609)의 프로토콜에서 수행 했다. 마 취는 모든 이미징 및 수술 절차에 대 한 관리 되었다. 모든 동물 승인된 IACUC 프로토콜에 따라 보관 되어 있었다.
참고:이 프로토콜의 실험 설계는 그림 1에 표시 됩니다. 그들의 난소를 수술로 제거 하 고 그들을 먹 여 0.01% 칼슘과 0.77% 인산으로 구성 된 LCD와 6 주 된 쥐를 구입. LCD의 4 개월의 기간 후에 네 번째 및 다섯 번째 요 추 척추 기관 (L4-L5) 중요 한 크기 척추 결함 드릴. 수술, 다음 주 1와 주 2, 4, 8, 및 12 결함 설립 후에 쥐를 이미지. 하루 1 스캔에 결함 여백, 표준 위치로 방향을 찾아서 관심 (목소리 야)의 원통형 볼륨을 정의 합니다. 자동으로 해당 주 1 스캔에 대해 정의 된 표준 위치에 각 쥐의 후속 µCT 검사 (즉, 2, 4, 8, 및 12 주)을 등록 합니다. 하루에 1 미리 목소리 야 등록된 검사에 적용. 볼륨 골밀도 및 명백한 조밀도 내가의 평가.
1. 골다공증의 유도
- 0.01% 칼슘과 0.77% 인산으로 구성 된 LCD의 4 개월 6 주 오래 된 athymic ovariectomized 쥐 입었다.
- 스위치 다시 정상적인 다이어트.
참고: 이러한 쥐 것 이다 라고도 " 골다공증성 쥐 "이.
2. 척추 결함 모델
참고: 타이밍은 동물 마다 40-50 분.
- 압력솥 모두 수술 전에 수술 도구.
- 여러 수술의 경우 모든 수술 도구를 소독.
- 도구를 세척 하 고 배치할 sonicator 욕조에 5 분 넣어 뜨거운 비드 소독 기 세트 20 미 허용에 대 한 250 ° c에서 5 분에 대 한 진정 도구에 대 한
- 뽑기 마 취.
- 장소 유도 실에서 골다공증성 쥐를 마 취 기계 중앙 청소 시스템에 첨부. 100% 산소에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유발 하 고 2-3 %isoflurane 원뿔을 통해 유지. 눈에 마 취에서 건조를 방지 하기 위해 수 의사 연 고를 사용.
- 는 발가락 꼬집어 자극 마 취의 적절 한 평면을 보장 하기 위해 적용 됩니다. 응답을 언급 하는 경우 프로시저 시작.
- 마 취 쥐 지 recumbency 난방 패드 (37 ° C)에 놓고 자기 fixator 철회 시스템 ( 그림 2A)를 사용 하 여 팔 다리를 스트레칭.
참고:가 열 패드의 온도 저체온증, 예방에 대 한 중요 한 마 취 쥐의 체온을 조절할 수 없기 때문. - 쉐이브 전기 면도기를 사용 하 여 복 부 지역. 70% 에탄올 뒤 0.5% 요오드 기반 살 균과 액체 gluconate와 면봉.
- 수술 절차를 시작 하기 전에 carprofen (5 mg/kg 체중 (BW), 피하 (SQ))와 쥐를 주입.
- 살 균 메스를 사용 하 여 피부를 잘라. 칼 프로세스 아래 1 ㎝ 절 개를 시작 하 고 중간 선 (~ 5-8 cm) ( 그림 2B) 극복.
- 수술가 위는 교육을 통해 aponeurosis의 절 개를 사용 하 여 복 부 구멍 ( 그림 2C)에 액세스 하는 알바.
- 브래킷으로 ( 그림 2D)를 사용 하 여 복 부 구멍 노출.
- 편향 복 부 대동맥과 왼쪽된 신장 ( 그림 2E) 노출 하는 쥐의 오른쪽에 내장. 그것을 폭로 하기 전에 허리 척추를 만져 탈수를 피하기 위해를 사용 하 여 메 마른 젖된 gauzes 멸 균 생리 식 염 수와 내부 장기를 포장.
- 층에서 요 추 척추 기관 L4-5의 앞쪽 측면을 노출 하 고 주변 결합 조직 및 근육에서 그들을 격리 사용 thermocautery ( 그림 2F -G).
참고: Thermocautery는 해 부 동안 출혈 제어 하에 사용 해야 합니다. - L4 척추에서 혈액과 잔여 조직을 제거 하는 멸 균 면봉 멸 균 식 염 수로 포화를 사용 합니다. 살 균 판형 드릴 가시 (지름 ~ 2 mm)를 사용 하 여 척추 체의 노출된 앞쪽 측면의 중앙에 5 m m-깊은 뼈 결함 드릴 (그림 2 H-나).
참고:만 복 부 피 질과 기본 배수 뼈; 드릴스루 최소한의 압력 등 피 질을 드릴을 하지 마십시오. 참고 골다공증 쥐의 척추는 매우 허약 하다. 면봉을 사용 하 여 결함을 청소 하 고 있는 경우, 출혈을 멈추게 하는 압력을 적용 하. - 쥐 ( 그림 2J) 당 2 결함의 총 만들 L5 척추 골에 반복 단계 2.11.
- 복 강 내장 돌아갑니다.
- Vicryl 합성 흡수 성 수술 용 봉합을 사용 하 여 (3-0 vicryl 미색 27 " SH 테이퍼) aponeurosis ( 그림 2 K) 봉합에 연속 패턴.
- 간단한 중단된 패턴 ( 그림 2 L)에 4-0 monofilament 나일론 비 흡수 봉합 사를 사용 하 여 피부를 닫습니다.
- 피부 봉합의 위에 그리고 피부의 완전 한 폐쇄 되도록 그들 사이 국 소 피부 접착제의 적용 100 µ L.
- 따뜻한 (37 ℃) lactated 벨 쥐 주입 ' 저체온증과 탈수를 방지 하기 위해 s 솔루션 (1CC/100 g BW, SQ).
- 필요에 따라 수술 및 수술 후 통증에 대 한 모든 8-12 h 이전 buprenorphine (0.5 mg/kg BW, SQ)와 쥐를 주입.
- 두지 마십시오 동물 무인 sternal recumbency를 유지 하기 위해 충분 한 의식 회복 될 때까지. 또한, 그것은 완전히 복구 될 때까지 다른 동물의 회사를 수술 겪은 동물을 반환 하지 않습니다.
- 동물 난방 패드에 회복 후 돌아가기 그것의 감 금.
참고: 집 쥐 개별적으로 (즉, 별도 새 장에)는 봉합의 쥐 쥐 절단을 방지 하 여 상처. - 차 우 쥐 음식에 도달 수 있도록 몇 일 수술에 대 한 새 장 바닥에 페 트리 접시에 물에 담가 놓습니다.
- Carprofen (5 mg/kg BW, SQ) 통증 모든 24 h에 대 한 수술 24 시간 후 필요에 따라 관리.
- 동물 2% 미만 동안 피부 봉합을 제거 isoflurane 마 취 10-14 일 후 작업.
3. MicroCT 스캔
참고: 타이밍은 동물 마다 30 ~ 40 분.
- 수술 다음 날에는 마 취 기계 중앙 청소 시스템에 연결 된 유도 실에서 골다공증성 쥐 장소. 100% 산소에 5 %isoflurane 사용 하 여 마 취를 유도 하 고 2-3 %isoflurane 원뿔을 통해 유지.
- 쥐 vivo에서 µCT 스캐너를 사용 하 여 검색 합니다. 뼈 재생의 경도 분석에 대 한 검사를 반복.
참고: 모든 동물 (즉, x-선 에너지, 매체, 강도, 복 셀 크기와 이미지 해상도 스캔)에 동일한 설정을 사용 하 여 검색을 확인 한 simila에r 방향입니다. 예: x 선 에너지, 55 kVP; 전류, 145 µ A; 복 셀 크기, 35 µ m; 증가, 115 µ m; 그리고 통합 시간, 200 ms; 와 함께 PBS에서 샘플. Bouxtein 외. 참조 추가 설명 및 설치류 µCT 뼈 미세의 평가 대 한 검색에 관련 된 고려 사항에 대 한 34. 이상적으로, 가능한 높은 스캔 해상도 사용 모든 검사; 그러나, 높은 해상도 스캔 긴 수집 시간을 요구, 큰 데이터 세트를 생성 고 동물 더 이온화 방사선을 노출. 후자는 원치 않는 효과 줄된 골절 치유를 포함 하 여 발생할 수 있습니다. 따라서, 추가적인 데이터 및 검색 시간 사이의 거래와 신중 하 게 고려해 야.
4. 척추 분리
참고: 타이밍은 샘플 당 20-30 분.
- 그림 3A에서 같이 관심의 척추를 등고선-I. 인접 척추에 속하는 부분을 제외 하는 동안 척추의 모든 부분을 포함 하도록 확인 하십시오.
- 클릭 " µCT 평가 프로그램 " 하 고 메뉴에서 샘플을 선택 합니다.
- 마우스를 사용 하 여 각 슬라이스에 컨투어.
- 사용 된 " Z " 다음 슬라이스로 이동 바.
- Contoured 척추를 별도 파일로 저장 ( 그림 3J -K)를 클릭 하 여 " 파일 " → " 저장 GOBJ " 조각 2.
5. 경도 양적 평가 대 한 정의 목소리 야의
참고: 다음 단계 (참조 척추) 수술 후 1 일에서 또는 후속 시간 포인트 (스캔 인지에 따라 달라 집니다 척추를 대상).
- 참조 척추.
참고: 타이밍 샘플 당 20-30 분입니다.- Z-회전, 결함의 센터에서 XY 슬라이스를 사용 하 여 여백의 각도 측정 ( 그림 4A -B).
- Z 평면에는 척추 결함이 대부분 명확 하 고 화면 캡처는 척추 골의 영역으로 이동.
- 프레 젠 테이 션 소프트웨어에서 결함에 맞는 사각형 모양의 개체를 준비.
- 그런 결함 얼굴 위쪽 척추의 이미지를 회전 및 결함 여백은 사각형의 양쪽에 병렬.
- 회전의 각도 측정 (이미지를 마우스 오른쪽 단추로 클릭 → " 형식 그림 " → " 크기 ").
- 측정된 각도 사용 하 여 ( 그림 4C) 척추를 회전.
- 새로운 DECterm 창을 열고 (" 세션 관리자 " → " 응용 프로그램 " → " DECterm ").
- 실행 " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -입력 [in] >
- -출력 [out] >
- -turnaxis_angles [0.000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0.000] > 측정된 각도
- -img_interpol_option [1] >
- X-회전, 결함의 센터에서 YZ-슬라이스를 사용 하 여 여백의 각도 측정 ( 그림 4D -E). 측정된 각도 사용 하 여 ( 그림 4 층) 척추를 회전.
- 클릭 " YZ "에 " uCT 평가 프로그램 " 및 반복 단계 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -[에] aim_name >
- -isq_filename [default_file_name] > 삽입 ISQ 파일 디렉터리 (예: " DK0: [MICROCT. 데이터입니다. GAZIT입니다. MAXIM.80.DAY1]Z2102970입니다. ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -희미 한 [-1-1-1] >
- ZX 평면 XY-평면을 변경 하 여 회전 된 척추를 플립.
- 새로운 DECterm 창을 열고 (" 세션 관리자 " → " 응용 프로그램 " → " DECterm ").
- 실행 " ipl ":
- Ipl > 플립
- -입력 [in] > 밖으로
- -입력 [out] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- 정의 목소리 야.
- 무승부는 원형에서 원형 윤곽 아이콘을 선택 하 여 결함의 센터에서 분할 영역을 사용 하 여 결함의 컨투어 " uCT 평가 프로그램 " ( 그림 6A). 등고선을 결함 ( 그림 6B)에서 모든 조각에 그것을 붙여 복사.
참고: 모든 결함은 동일한 절차를 사용 하 여 생성 된, 이후 분석 조각 하 고, 그 후, 모든 샘플에 대 한 전체 볼륨 (TV)의 동일한 수.
- 무승부는 원형에서 원형 윤곽 아이콘을 선택 하 여 결함의 센터에서 분할 영역을 사용 하 여 결함의 컨투어 " uCT 평가 프로그램 " ( 그림 6A). 등고선을 결함 ( 그림 6B)에서 모든 조각에 그것을 붙여 복사.
- Z-회전, 결함의 센터에서 XY 슬라이스를 사용 하 여 여백의 각도 측정 ( 그림 4A -B).
- 대상 척추.
참고: 타이밍 샘플 당 10-20 분입니다. 대상 및 이미지 분석 소프트웨어의 메인 윈도우를 참조 척추의- 부하는 DICOM 파일.
참고: 회색 음영 값 변화를 피하기 위해, 같은 정의 출력 데이터 형식 로드 메뉴에 원래 DICOM 파일로. - 레지스터 참조에 척추입니다.
- 발사는 " 3 차원 복 등록 " 모듈 입력으로 참조 척추는 " 베이스 볼륨 " 고로 대상 척추는 " 일치 볼륨. " 클릭 " 등록 " 척추 등록 ( 그림 5).
- 는 등록 된 파일을 사용 하 여 동일한 데이터 형식 및 µCT 환경에 가져올 저장.
- 는 목소리 야 적용 됩니다.
클릭 하 여 등록된 대상 척추를 참조 척추에 대해 정의 된
- 적용은 목소리 야 " uCT 평가 프로그램 " → " 파일 " → " 부하 GOBJ " 이전에 만든 GOBJ를 선택 하 고. 목소리 야와 결함 동심 되는지 확인 하십시오.
- 부하는 DICOM 파일.
6. MicroCT 분석
참고: 타이밍은 샘플 당 10-20 분.
- 보내기 µCT 평가 프로그램 ( 그림 6)를 사용 하 여 평가 대 한 목소리 야.
참고: 모든 내가 분석할 때 동일한 매개 변수를 사용 하 여 있는지 확인 합니다. 임계값 생략 하는 최소한의 손실 뼈의 배경 잡음을 충분히 높게 설정 되어 있는지 확인 합니다. 방사선 불 투과성 소재를 사용 하는 경우 다양 한 전략 뼈 형성 분석에 사용 될 수 있습니다. 소재 및 뼈 조직 밀도 차이 경우는 소재 35 , 36 개 세그먼트 수 있습니다. 그렇지 않으면, 조사 실험 그룹 사이 뼈 형성에 차이 평가 질적 수.
7. 안락사
- PPlace 골다공증성 쥐 유도 실에서 마 취 기계에 연결. 100% 산소를 사용 하 여 5 %isoflurane 마 취 유도.
- 코 콘을 통해 마 취를 유지 하 고 안락사를 수행 incising 양자 매 37 생산 하 흉으로.
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Representative Results
이 프로토콜을 사용 하 여, 하나 이미지 수와 n의 재생성을 계량 다른 시간 지점에서 8 모델된 골다공증성 척추 결함을 =. 등록 절차에 의해 얻은 해부학 경기 모든 시간 지점에서 동일한 목소리 야의 분석에 대 한 수 있습니다. 이 원래 결함의 여백은 더 이상 인식할 수 있는 경우에 정확한 경도 3D histomorphometric 분석 결과. 우리는 뼈 재생 (그림 7)의 경도 평가 대 한 예를 들어 5 시간 포인트 (1 일, 2 주, 4 주, 주 8, 및 12 주)을 사용. 재생 ( 그림 7A에서 그림)로 3D 영상과 2D 횡단면의 질적 평가 뼈 수량 (BVD) 및 품질 (광고) (그림 7B)의 양적 비교 하 여 평가할 수 있습니다. 새로 형성된 된 뼈에 대 한 다음과 같은 형태학 인덱스를 확인할 수 있습니다: (i) TV, 뼈 및 소프트-조직 볼륨 (TV, m m3);를 포함 하 여 (ii) 양의 광물 화 된 조직 (BV, m m3); (iii) 골밀도 볼륨 (BV/텔레비젼); 그리고 (iv) 뼈 미네랄 밀도 (BMD, cm3당 mg hydroxyapatite). 특히, 최소한의 골 형성 (골밀도 볼륨 5% 증가) 결함 설립 후 2 주 동안 관찰 되었다. 2 주 후, 뼈 형성에 중요 한 차이가 나중 시간 포인트에 비교 될 때 관찰 되었다. 전반적으로, 어느 정도의 주 8에 의해 약 10%를 뾰족해지고, 뼈 형성 되었지만 시간이 지남에 void 뼈를 유지 하기 위해 충분히 최소한의 이었다.
그림 1: 프로토콜 디자인. 프로토콜의 주요 단계에 설명 되어 있습니다. 첫째, ovariectomized 낮은 칼슘 식단 (LCD)의 4 개월을 복종 된 누드 쥐 두 요 추 척추 기관에서 표준 크기의 중요 한 결함을 만들에 따라 운영 했다. 쥐 주 1와 2, 4, 8, 및 12 주 수술에 몇 군데 있었다. 1 일 검사 표준 위치로 방향도 이었고 원통형 목소리 야 결함 여백 사용 하 여 정의 되었다. 각 쥐의 후속 µCT 검사는 해당 주 1 스캔에 대해 정의 된 표준 위치에 자동으로 등록 되었다. 하루 1 미리 정의 된 목소리 야 후 등록된 검사에 적용 했다. 볼륨 골밀도는 목소리 야의 명백한 조밀도 새로운 뼈 형성을 평가 하기 위해 사용 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 척추 결함 수술. 척추 결점의 외과 생성에 중요 한 단계는 설명 됩니다. 먼저, 쥐가 열 패드 (A)에 배치 했다. 중간 절 개를 통해 피부 (B) 그리고에 교육 되었다 알바 (C) 복 부 구멍 (D) 노출. 내장 노출 후부 복 벽 (E), 반영 했다 고 허리 척추 thermocautery (화살표, F-G)을 사용 하 여 노출 되었다. 결함 4 (H, 드릴;를 가리키는 화살표에에서 교 련된 했다 나, 결함을 가리키는 화살표) 및 5 (J, 결함을 가리키는 화살표가) 요 추 척추 기관. 마지막으로, aponeurosis (K)와 피부 (L) 봉합 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 척추 분리. 관심의 척추 골의 윤곽에 주요 단계가 표시 됩니다. (A-난) Contoured (녹색 선) 대표적인 2D 조각 길이 축는 척추의 표시 됩니다. 전체 척추 (J)의 3D 표현 분리 된 척추 (K)에 비교할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 척추 위치 참조. 표준 위치로 회전 전후는 척추의 대표적인 조각 2 개의 비행기에 표시 됩니다. 첫째, 사용 하 여 대표 XY-슬라이스 (A), (B, 녹색) 각도 회전 결함 (B, 붉은 광장) (B, 노란색) y 축에 평행 하 게 되도록 하는 데 필요한 결정 고 (C 회전 된 이미지를 생성 하는 데 사용 ). 다음, 대표 YZ-슬라이스 (D)를 사용 하 여 각도 (E, 녹색) (E, 붉은 광장) (E, 노란색) z 축에 평행 되는 결함을 회전 하는 데 필요한 결정 이며 (F 회전 된 이미지를 생성 하는 데 사용 ). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 척추 등록 대상. 대상 척추 (에 표시 된 녹색) 및 (A C) 전에 참조 척추 (빨간색으로 표시 된)의 3 개의 평면에서 대표적인 조각 후 (D-E) 등록 표시 됩니다. 대상 및 기준 척추 및 재생, 뼈 형성을 나타내는 후 녹색 뼈를 가리키는 하얀 화살표 사이의 중복을 나타내는 노란색 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 목소리 야 분석. 대표적인 조각 contoured 볼륨의 2 개의 비행기에 표시 됩니다. 원형 컨투어 대표 ZX-조각 (A)에서 결함의 중심에 배치 됩니다. 모든 ZX-조각 컨투어링, 후 완전 한 결함 볼륨 XY-평면 (B)에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 척추 결함 중생의 경도 분석. 질적 및 양적 대표 뼈 재생 분석 결과가 표시 됩니다. 다양 한 시간 시점 (A) A 대표 척추 결함 빨간색에서 표시 무효에 뼈 대형 정면 3D 이미지 (맨 위 패널), 화살 2D 이미지 (중간 패널), 및 축 2D 이미지 (하단 패널)으로 각 패널에 묘사 된다. 빈 공간에 뼈 형성의 정량 분석을 수행 했습니다. 볼륨을 뼈 밀도 (B) 및 명백한 조밀도 (C) 계산 했다를 반복 사용 하 여 비교 다중 비교 Bonferroni 보정으로 양방향 ANOVA를 측정. 오차 막대를 나타내는 SEM. * * *-p < 0.0001. 그녀를 클릭 하십시오이 그림의 더 큰 버전을 볼 e.
| 단계 | 문제 | 가능한 이유 | 솔루션 |
| 2.3 | 동물 마 취 허 걱 | 초과 isoflurane 배달 | 동물에 전달 isoflurane의 농도 줄일 수 있습니다. |
| 핀치를 발가락에 응답 하는 동물 | 부족 isoflurane 배달 | Isoflurane의 농도 증가. | |
| 2.7-2.12 | 무거운 출혈 | 혈관 손상 | 멸 균 면봉을 사용 하 여 압력 또는 출혈을 멈추게 하는 적용. |
| 동물에는 호흡 곤란 | 횡 경 막 구멍은 | 질 식 방지 하기 위해 동물 안락사 | |
| 장 내용 누설 | 위장은 구멍 | 추가 합병증을 방지 하기 위해 동물 안락사 자르기 전에 기본 창에서 aponeurosis를 해제 하 여 그것을 방지. | |
| 혈액 드릴링 사이트에서 나온다 | 혈관은 구멍 | 출혈이 중지까지 멸 균 면봉을 적용 합니다. | |
| 동물 훈련 도중 갑자기 떨 려 | 너무 깊이 드릴 갔다가 척수 손상 | 추가 합병증을 방지 하기 위해 동물 안락사 | |
| 뼈 결함 보이는 불완전 한 | 드릴 깊이 만큼 가지 않 았 어 | 결함 내부 드릴 머리를 재배치 하 고 깊은 드릴 | |
| 2.15-2.24 | 봉합 나누기 | 봉합은 너무 밀접 하 게 끌려 | 전체 봉합을 교체 합니다. 자주 깨는 경우 크기 두꺼운 봉합을 사용 합니다. |
| 동물 마 취에서 회복 하는 | 동물은 저체온증 | 가 열 패드의 온도 증가 하거나 (예: 난방 램프) 난방의 추가 소스를 적용 합니다. | |
| 봉합은 오픈 | 봉합 느슨하게, 배치 또는 동물 격렬 한 활동 | 봉합을 다시 적용 하 고 그들 사이 Dermabond는 봉합에 직접 적용. | |
| 3 | 스캔 한 이미지는 낮은 해상도, 시끄러운 또는 흩어져 나타납니다. | 검색 매개 변수를 조정할 필요가 | 검색 프로토콜의 매개 변수를 조정 합니다. 검색에 대 한 자세한 지침을 Bouxsein 그 외 여러분을 참조 하십시오. |
| 스캔 한 이미지 흐리게 나타납니다. | 스캔 과정에서 이동 하는 동물 | 동물을 재검색 합니다. 운동 계속 되 면 isoflurane 농도 증가. | |
| 5 | 대상 척추의 등록 성공 하지 | 척추 분리가 제대로 완료 되지 않았습니다. | Recontour는 척추: 척추의 모든 부분 포함 및 제외 모든 인접 한 구조 다는 것을 확인. |
| 척추의 위치에 큰 차이 | 대상 척추 회전을 사용 하 여 참조 척추로 같은 방향으로 위치를 변경 하 고 (단계 29A)를 플립. | ||
| 분석 뼈 구조를 인식할 수 없습니다 제대로 | 등록 모듈 뼈 샘플에서 배경 잡음을 제거 하는 임계값을 적용 합니다. | ||
| 등록 된 척추는 다른 | 당신의 샘플의 3d 이미지를 생성 하 고 다른 시간 지점에서 올바른 척추를 일치. | ||
| 6 | 총 볼륨 (TV)는 견본 사이 다른 | 조각의 다른 번호 또는 다른 윤곽 사용 되었다 | 항상 동일한 윤곽선 크기와 조각 같은 수를 사용 해야 합니다. |
| 뼈 미네랄 밀도 (BMD) 값은 비정상적인 | MicroCT의 불 충 분 한 교정 | 올바른 hydroxyapatite 표준 microCT 보정 |
표 1: 문제 해결. 잠재적인 문제 및 솔루션에 대 한 프로토콜에서 다른 단계 제공 됩니다.
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Discussion
골다공증은 척추 압축 골절은 척추와 척추 체의 붕괴에서 그 결과에 로드가 증가 의해 발생의 가장 널리 퍼진 원인. 그러나, 그것은 실질적으로 진정한 비슷한 척추 붕괴를 복제 하는 설치류에서 상해를 생성할 수입니다. 대신, 연구원은 OVCFs16,17,18,19,20,,2124 를 모방 하기 위해 척추 신체 중앙에 원통형 무효 만들 , 38 , 39. 결함 크기 측면에서 문학에 아니 일관성이 있기 때문에, 임계 크기 결함 치유 하지 않는 자발적으로 완전히 3 개월 수술16,17이내 개입 없이 하나로 정의 되었다.
빠르게 골다공증을 유발 하는 LCD와 ovariectomy을 결합 하는 방법 이전에 게시1,13, 비록 우리가 최초로 보여 그를 athymic 쥐, 급속,이 접근을 적용 하 고 배수 척추에 돌이킬 수 없는 감소 볼륨 및 미네랄 밀도40뼈. 이 설치류 면역 시스템에 의해 방해 받지 않는 재현할 수 작은 동물 모델 이며 그 않습니다 하지 위한 필요 추가 면역 억제, 다른 사람에 의해 사용 되는24.
우리의 수술 프로토콜 여러 중요 한 요 추 척추 결함의 동일한40생성. 동물에서 매우 일관 되 고 쉽게 비교 고 같지는 결함 발생합니다. 우리가 믿는이 접근을 사용 하 여 제작 결함 척추 결함 모델 쥐 꼬리 있는 biomechanical 세력에 복종 하기 때문에 꼬리 척추1,,1941 에서 생성 된 우수 하다는 크게 그 쥐 요 추 척추와 관련 된 다른.
이 프로토콜 내에서 중요 한 단계는 LCD 후 ovariectomized 누드 쥐의 깨지기 쉬운 척추를 드릴 때 내 요원 저체온증과 복용 주의 피하고 포함 됩니다. 척추 결함, 생성 후 그것 뼈 수리의 경도 평가 대 한 설정된 시간 포인트에서 µCT 검사 vivo에서 의 시간적 순서를 통해 모니터링 됩니다. 같은 스캔 설정을 유지 하는 것이 중요 합니다. 척추 contoured 그리고 검사의 나머지 부분에서 분리 됩니다. 모든 검사는 척추의 동일한 총 볼륨 컨투어링 및 회색 음영 값 변화를 피하는 중요 합니다. 상업적으로 사용할 수 있는 여러 이미지 등록 알고리즘의 추출을 용이 하 게 해부학 해당 기준선 내가 모든 후속 시간 포인트. 마지막으로,이 내가 뼈 볼륨, 명백한 조밀도, 등등에 대 한 분석 된다. 그것은 모든 내가 동일한 매개 변수를 사용 하 여 분석 하는 중요 한입니다. 이 기술은 사용자에 종속 되지 않는 매우 정확 하 고 간단 경도 3D µCT 분석을 제공 합니다.
이 메서드는 모든 경도 뼈 결함 재생 분석에 적용할 수 있습니다. 여기에 사용 되는 척추 결함 모델은이 응용 프로그램에 대 한 편리한 모델의 뼈 구조 고유와 동일한 해부학 적 위치를 쉽게 등록할 수 있습니다. 그러나, 어떤 뼈 재생 제대로 경도 검사 통해 관심의 동일한 뼈를 분리 하 여 동일한 조건 하에서 분석 될 수 있습니다. 동일한 해 부 특징을 가진 분리 된 뼈 샘플을 포함 하는 것이 필수적입니다. 이 문제 및 다른 사람 설명 표 1을 가능한 원인 및 제안 합니다. 등록 절차에 의해 얻은 해부학 일치 샘플 같은 해부학 적 기능을 포함 하는 경우에 발생할 수 있습니다. 등록 첫 번째 스캔의 정확한 미리 정의 된 목소리 야 시간이 지남에 따라 고도로 정확한 3D histomorphometric 분석 결과 모든 나머지 시간 포인트를 적용할 사용자를 허용할 것 이다. 볼륨 골밀도 및 명백한 조밀도 목소리 야의 새로운 뼈 형성을 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.
잠재적으로 광범위 하 게 적용 하는 동안 제한 없이 여기에 제시 된 모델 하지은. 그것은 잠재적으로 중요 한 재생 될 수 있습니다. 있는 몇 가지 면역 중재 프로세스를 마스크 수 있습니다.로 athymic 누드 쥐의 사용 제한, 간주 될 수 있습니다. 둘째, 이전에 게시1,13, ovariectomy와 젊은 쥐에서 LCD의 결합을 통해 골다공증을 모델링 노인 환자 인구의 생물학을 모방 하는 기능에 제한 됩니다. 셋째, OVCFs 했다 골다공증 관련 골절을만 하 게 다른 동물이 영장류42로, 수술에 의해 모델링 됩니다. 마지막으로, 쥐 동안 요 추 척추 인간의 허리 척추에 대 한 최상의 가능한 모델은-대부분 척추 골절 개발-설치류 척추에 베어링 축 중량의 부족은 또한 제한.
이 프로토콜은 모듈형 이며 따라서 쉽게 수정할 수 연구자의 요구에. 예를 들어 athymic ovariectomized 쥐 다른 골다공증 관련 골절 연구 사용 될 수 있습니다. 연구원 반자동된 뼈 재생 분석에 우리의 접근을 사용 하 여 선택 해야, 경도 구조 이미징, 하지 반드시 마이크로-단층 촬영을 사용 하 여 모든 골절 모델에 적용 될 수 있습니다. 또한, 동시에 자기 공명 영상 같은 추가적인 이미징 형식을 사용 하 여 추가 정보를 수집 될 수 있습니다.
이 프로토콜에서 제시 하는 OVCF 모델은이 임상 unmet 필요에 새로운 치료 접근을 공부 하 사용 될 수 있습니다. 또한, 우리의 반자동된 분석 접근 덜 사용자 종속적 이며16다른 방법 보다 더 나은 정확도 제공 한다 유사한 분석을 수행을 성공적으로 사용할 수 있습니다. 특히 주목할 만한 사실은 우리가 사용 하는 모든 연구원에 의해 사용 될 수 있는 상업적으로 사용 가능한 시각화 및 분석 소프트웨어-자기 공명 영상, 핵 영상 등 추가 이미징 형식을 지 원하는 소프트웨어. 따라서, 우리는이 방법은 매우 받아들이기는 이며 vivo에서 이미징 기능과 등록 소프트웨어의 가용성에 의해 제한만 믿습니다.
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Disclosures
이 연구에 대 한 재생 의학 (CIRM) (TR2 01780) 캘리포니아 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Acknowledgments
연구에 대 한 재생 의학 (CIRM) (TR2 01780) 캘리포니아 연구소에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
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