Summary
Цель настоящего Протокола заключается в создавать обнаженной крыса связанных остеопороза позвоночника сжатия перелом модель, которая может быть продольно оцененные в естественных условиях с помощью полу автоматизированное microcomputed томография основе количественных структурного анализа.
Abstract
Остеопороз связанных позвоночного компрессионных переломов (OVCFs) являются общие и клинически неудовлетворенные потребности с увеличением распространенности по мере старения населения мира. Животные модели OVCF имеют важное значение для доклинической разработки стратегий инженерных трансляционная ткани. Хотя в настоящее время существуют ряд моделей, этот протокол описывает оптимизированный метод для стимулирования несколько высокую воспроизводимость позвоночного дефекты в единый обнаженной крыса. Роман продольных полу автоматизированное microcomputed томография (µCT)-на основе количественных структурный анализ дефектов позвоночника также подробно. Кратко крысы были записи образа на несколько пунктов послеоперационное время. День 1 сканирования была переориентирована на стандартное положение, и стандартный объем интерес был определен. Последующие µCT сканирование каждого крысы были автоматически регистрируется для сканирования 1 день так же объем интерес был затем анализируется для оценки формирования новой кости. Этот универсальный подход может быть адаптирована к целый ряд других моделей, где продольного анализа на основе изображений могут воспользоваться точных 3D полу автоматизированное выравнивание. Взятые вместе, этот протокол описывает легко поддающихся количественному измерению и легко воспроизводимые системы для исследований остеопороза и кости. Предлагаемый протокол занимает 4 месяцев, чтобы побудить остеопороза в ню ovariectomized крыс и между 2.7 и 4 h, чтобы генерировать, изображение и проанализировать два позвонка дефектов, в зависимости от размера ткани и оборудования.
Introduction
Более 200 миллионов человек во всем мире страдают от остеопороза1. Лежащие в основе патологического снижение минеральной плотности костной ткани (BMD) и микроархитектуры кости измененных увеличения хрупкости костей и, соответственно, относительный риск переломов2. Остеопороз является настолько распространенным и вредно для здоровья, что ВОЗ определила его основных проблем здравоохранения. Кроме того как население мира ожидается возраста, остеопороз ожидается стать еще более распространенным.
Остеопорозом позвоночного компрессионных переломов являются наиболее распространенными хрупкости переломов, оценивается в более чем 750 000 в год в США. Они связаны с значительным заболеваемости и как много как девять раз выше смертности3. В клинических испытаниях в настоящее время доступны хирургических вмешательствах, например Вертебропластика и кифопластика, оказались не более эффективными, чем Шам лечения4,5, оставляя только боль управления доступны для этих пациентов. Поскольку текущий OVCF лечения ограничены, необходимо разработать модель животных, которые можно реплицировать в расстройство6,,78. Такие животные модели может облегчить расследование текущих методов лечения и развития Роман терапии, которые будут переводить в клиническую практику. Остеопороз индуцированных и выдержаны в модели животных через администрацию диеты низкий кальция (LCD) в сочетании с овариоэктомии1,9,10,11, 12 , 13 , 14 , 15. для дальнейшего моделирования костной потери, связанные с OVCFs, дефекты позвоночной кости были созданы в остеопорозом иммунокомпетентных крыс 16,,1718,19, 20,-21,-22,-23,-24. В этой работе представлена модель ослабленным крысы с лепной остеопороза позвоночника дефекта. Этот роман модель может использоваться для оценки на основе ячеек терапии с участием стволовые клетки, полученные из различных источников и видов для ремонта сложных переломов, например OVCFs.
Кость изображений является важной частью оценки переломов и костных заболеваний. Для точной оценки структурных костных изменений и стратегии регенерации25были разработаны передовые методы обработки изображений. Среди них µCT изображений появился как неинвазивный, easy-to-use и недорогой метод, который обеспечивает 3D изображения с высоким разрешением. µCT изображений имеет ряд преимуществ над других методов оценки больных остеопорозом, как это предлагает, с высоким разрешением 3D кости микроархитектуры26 , которые затем могут быть количественно проанализированы. Последний может затем использоваться для сравнения терапевтического воздействия предлагаемого лечения. Действительно в естественных условиях µCT изображений является золотым стандартом для позвоночных дефекта регенерации мониторинг1,16,27. Однако несколько публикаций28,29,,3031 использовали автоматизированная регистрация инструменты для сведения к минимуму пользователя зависимость, интерполяции предвзятости и точности ошибка µCT анализ на основе изображений. Недавно мы были первыми, чтобы использовать процедуру регистрации для улучшения анализа костной регенерации в стандартизированных кости недействительным, как описано в этом протоколе32 .
Метод, описанный здесь может использоваться для изучения влияния Роман клеточной терапии для OVCFs, презрев принимающей ответов Т-клеток, которые могут отклонить культивированная или аллогенных клеток. Остеопороз, индуцированной в молодых крыс через овариоэктомии (OVX) и 4 месяца ЖК. Молодой возраст крыс OVX, в сочетании с LCD допускается, нам достичь низкой пика костной массы, подражая постменопаузальный остеопороз, ведущих к необратимым костной потери. Это может быть частично объясняется тот факт, что во время LCD и около 3 месяцев, крысы переход от моделирования к реконструкции кости фазы в поясничных позвонков33, тем самым увеличивая вероятность сохранения остеопороза время. С помощью молодых животных делает эту модель более экономически эффективным, как они стоят меньше. Тем не менее он ограничен по своей сути не учета биологических изменений в старения животного.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
под протоколом, утвержденным на институциональный уход животных и использование Комитет (IACUC) от Медицинский центр Седарс-Синай (протокол № 3609) были выполнены все эксперименты на животных. Анестезии вводили для всех изображений и хирургических процедур. Все животные были размещены в соответствии с утвержденным протоколы IACUC.
Примечание: экспериментальный дизайн настоящего Протокола показано на рисунке 1. Приобрести 6 week-old крыс с их яичники хирургически удалены и кормить их ЖК, состоящую из кальция и 0,77% фосфата 0,01%. По истечении 4 месяцев ЖК сверлите дефектом позвоночника критического размера в четвертом и пятом поясничных позвонков (L4-L5). После операции изображение крысы на 1 день и через недели 2, 4, 8 и 12 после создания дефекта. Найдите поля дефекта на 1 день сканирования, переориентировать на стандартное положение и определить цилиндрический объем интерес (VOI). Автоматически Зарегистрируйте сканирование последующих µCT каждого крысы стандартное положение, определенных для соответствующего сканирования 1 день (т.е., 2, 4, 8 и 12 недель). Примените день 1 предварительно VOI зарегистрированных сканирования. Оценить объем плотность костей и насыпная плотность VOIs.
1. индукция остеопороза
- положить 6 week-old Атинические ovariectomized крысы на 4 месяца ЖК, состоящий из фосфата 0,01% кальция и 0,77%.
- Переключатель назад к нормальной диете.
Примечание: Эти крысы будет именоваться " остеопорозом крысы " далее.
2. Позвонков модели дефект
Примечание: время является 40-50 мин на животное.
- Автоклав все хирургические инструменты перед хирургии.
- В случае несколько операций, все хирургические инструменты стерилизуют.
- Мыть инструменты и поместите их в ванну sonicator за 5 минут поместить их в наборе стерилизатор горячей шарик до 250 ° C для 20 s. разрешить инструменты, чтобы остыть в течение 5 мин.
- Анестезии побудить.
- Место остеопорозом крыса в зале индукции придает анестезия машины с центральной системой очистки. Вызвать обезболивание с помощью 5% изофлюрановая в 100% кислорода и поддерживать через носовой конус на 2-3% изофлюрановая. Используйте мазь ветеринар на глазах для предотвращения сухости под наркозом.
- Применять мыс щепотка стимул для обеспечения надлежащего плоскости анестезии. Если ответа не замечено, инициировать процедуру.
- Место наркотизированных крыс в спинной recumbency на грелку (37 ° C) и растянуть конечностей с использованием магнитных фиксаторов Ретракция системы ( рис. 2A).
Примечание: Температура грелки имеет важное значение для профилактики гипотермии, поскольку наркотизированных крыс не в состоянии регулировать свою температуру тела. - Бритья области живота, с использованием электробритвы. Тампон он с на основе йода антисептиком и хлоргексидин глюконат 0,5% следуют 70% этанол.
- Придать крыс с carprofen (5 мг/кг веса тела (BW), подкожно (SQ)) перед началом хирургической процедуры.
- Позволяет вырезать кожу стерильным скальпель. Начать разрез 1 см ниже мечевидного отростка и прорваться через срединной (~ 5-8 см) ( рис. 2B).
- Использовать Ножницы хирургические надрезать апоневроза через linea alba для доступа к брюшной полости ( рис. 2 c).
- Предоставляют брюшной полости с помощью ретракторы ( Рисунок 2D).
- Отвлечь кишечника справа крысы, чтобы разоблачить брюшной аорты и левой почки ( Рисунок 2E). Ощупывайте поясничного отдела позвоночника, прежде чем приступать к разоблачить его. Чтобы избежать обезвоживания, используйте стерильные пропитанной сеток с стерильным физиологическим раствором обернуть внутренних органов.
- Использования thermocautery подвергать в слои передней аспект поясничных позвонков L4-5 и изолировать их от окружающих соединительной ткани и мышцы ( Рисунок 2F -G).
Примечание: Thermocautery следует использовать для остановки кровотечения во время диссекции. - Использовать стерильные ватный тампон, пропитанный стерильного физиологического раствора для удаления крови и остаточной ткани из L4 позвонков. Используйте стерильные трепаном дрель Бур (~ 2 мм в диаметре) для сверления 5 мм глубокий кости дефект в центре подвергаются anterior аспект тела позвонка (рисунок 2 H-I).
Примечание: Приложите минимальное давление на детализацию только вентральной коры и базовой Трабекулярная кость; Избегайте бурения через спинной коры. Обратите внимание, что позвонки остеопорозом крыс очень хрупкие. Используйте ватный тампон, очистить дефекта и применить давление, чтобы остановить кровотечение, если он присутствует. - Повторите шаг 2.11 на L5 позвонок для создания в общей сложности 2 дефектов на крыса ( Рисунок 2J).
- Вернуться брюшной полости кишечника.
- Использовать Викрил синтетические рассасывающиеся хирургические шовные (3-0 Викрил неокрашенные 27 " SH конусом) в непрерывной шаблон шовные апоневроза ( рис. 2 K).
- Закройте кожи, с использованием 4-0 Леска капроновая не рассасывающиеся шовные в простой Прерванный шаблон ( рис. 2 L).
- Применить 100 мкл кожи клей на вершине кожи швами и между ними, чтобы обеспечить полное закрытие кожи.
- Придать Крыса с теплой (37 ° C) лактат Рингера ' раствор (1CC/100 g BW, SQ) s для предотвращения переохлаждения и обезвоживания.
- Придать Крыса с бупренорфин (0,5 мг/кг массы тела, кв) до операции и каждые 8-12 h для послеоперационное обезболивание при необходимости.
- Не оставляйте животное без присмотра до тех пор, пока он сознание достаточно для поддержания грудной recumbency. Кроме того, не возвращают животное, которое претерпел хирургии в компании других животных до тех пор, пока он полностью выздоровел.
- После того, как животное восстановился на грелке, вернуть его к своей клетке.
Примечание: Дом крысы индивидуально (т.е., в отдельных клетках) для предотвращения увечий крыса крыса швы и ранение. - Место Чоу, замачивают в воде в чашке Петри на дне клетки за несколько дней после операции помочь крысы достичь продовольственной.
- Управление carprofen (5 мг/кг массы тела, SQ) 24 ч после операции боли каждые 24 ч, при необходимости.
- Удаление кожи швами, в то время как животное составляет менее 2% изофлюрановая анестезии 10-14 дней после операции.
3. MicroCT сканирование
Примечание: время является 30-40 мин на животное.
- На следующий день после хирургической процедуры, место остеопорозом крыса в зале индукции, подключенных к машине анестезии с центральной системой очистки. Вызвать обезболивание с помощью 5% изофлюрановая в 100% кислорода и поддерживать через носовой конус на 2-3% изофлюрановая.
- Сканирования крысы с использованием сканера µCT в естественных условиях. Повторить сканирование для продольного анализа костной регенерации.
Примечание: Убедитесь, что все животные проверяются с теми же параметрами (т.е. энергии рентгеновского, сканирование среднего, интенсивности, voxel размер и разрешение изображения) и в similaориентация r. Например: рентген энергетического, 55 КВП; ток, 145 МКА; Voxel размер, 35 мкм; шагом, 115 мкм; и время интеграции, 200 мс; с образцами в PBS. Обратитесь к Bouxtein и др. 34 для дальнейшего разъяснения и соображений, связанных с грызунов µCT сканирования для оценки микроструктуры кости. В идеале максимально возможное разрешение сканирования будет использоваться для всех проверок; Однако более высоким разрешением сканирования требуют больше времени приобретения, создания больших наборов данных и подвергать животных более ионизирующего излучения. Последний может вызвать нежелательные эффекты, включая снижение переломов исцеления. Таким образом, следует тщательно рассмотреть компромисс между дополнительных данных и время сканирования.
4. Позвонка разделение
Примечание: время является 20-30 мин на сэмпл.
- Контур позвонка интерес, как показано на рисунке 3A-I. Убедитесь в том включить все части позвонка исключая частей, которые принадлежат к смежных позвонков.
- Нажмите на " µCT оценки программы " и выберите образец в меню.
- Контур каждый фрагмент с помощью мыши.
- Использования " Z " бар, чтобы перейти к следующему фрагменту.
- Сохранить контуры позвонков как отдельный файл ( Рисунок 3J -K), нажав на " файл " → " GOBJ сохранить " каждые несколько ломтиков.
5. Определение VOI для продольной количественной оценки
Примечание: следующие шаги зависят ли сканирование от 1 дня после операции (ссылка позвонка) или от последующее время очков ( Целевая позвонков).
- Ссылка позвонке.
Примечание: Время является 20-30 мин на сэмпл.- Для Z-вращение, измерить угол поля, используя XY-фрагмента от центра дефекта ( рис. 4A -B).
- В плоскости Z, перейдите к области позвонка где дефект является наиболее ясно и экран захвата позвонка.
- В презентации программного обеспечения, подготовить объект прямоугольной формы, который будет вписываться в дефект.
- Повернуть изображение позвонка, таким образом, что дефект смотрело вверх и дефект поля параллельны сторонам прямоугольника.
- Измерить угол поворота (щелкните правой кнопкой мыши на изображении → " формат рисунка " → " размер ").
- Использовать измеренных угол поворота позвонков ( рис. 4 c).
- Открыть новое окно DECterm (" менеджер сессий " → " применения " → " DECterm ").
- Запуск " ipl ":
- Ipl > turn3d
- -ввода [в] >
- -Выход [out] >
- -turnaxis_angles [0,000 90.000 90.000] > 90 90 0
- -turnangle [0,000] > измеренные угол
- -img_interpol_option [1] >
- Для X-вращение, измерить угол поля, используя YZ-фрагмента от центра дефекта ( рис. 4 d -E). Используйте измеренных угол поворота позвонка ( Рисунок 4F).
- Нажмите на " YZ " в " uCT оценки программы " и повторите шаги 5.1.1.1-5.1.1.5.2.
- Ipl > isq
- -aim_name [в] >
- -isq_filename [default_file_name] > вставить ISQ Каталог файлов (например, " DK0: [MICROCT. ДАННЫХ. ГАЗИТ. MAXIM.80.DAY1]Z2102970. ISQ ")
- -pos [0 0 0] >
- -тусклым [-1-1 -1] >
- флип повернутый позвонка, изменив XY-плоскость ZX-плоскости.
- Открыть новое окно DECterm (" менеджер сессий " → " применения " → " DECterm ").
- Запуск " ipl ":
- Ipl > флип
- -ввода [в] >,
- -ввода [out] > out2
- -new_xydir [yz] > zx
- Определить VOI.
- Рисования круговой контур дефекта с помощью фрагмента от центра дефекта, выбрав значок круговой контур в " uCT оценки программы " ( рис. 6A). Копию, контур и вставить его на все фрагменты в дефекта ( рис. 6B).
Примечание: Поскольку все дефекты были созданы с использованием той же процедуры, анализировать одинаковое количество фрагментов и, впоследствии, общий объем (ТВ) для всех образцов.
- Рисования круговой контур дефекта с помощью фрагмента от центра дефекта, выбрав значок круговой контур в " uCT оценки программы " ( рис. 6A). Копию, контур и вставить его на все фрагменты в дефекта ( рис. 6B).
- Для Z-вращение, измерить угол поля, используя XY-фрагмента от центра дефекта ( рис. 4A -B).
- Целевой позвонке.
Примечание: Время является 10-20 мин на сэмпл.- Нагрузки DICOM файлов как целевой, так и позвонков ссылку в главном окне программного обеспечения для анализа изображения.
Примечание: Чтобы избежать изменения значений градации серого, определить же выходной тип данных исходных файлов DICOM в меню загрузки. - Регистр к ссылке на позвонке.
- Запуска " 3-D Voxel регистрации " модуль и ввода ссылки позвонка как " база тома " и целевой позвонка как " матч тома. " нажмите " зарегистрировать " зарегистрировать позвонков ( Рисунок 5).
- Сохранить зарегистрированный файл, используя те же данные типа и импортировать его в среде µCT.
- Применять VOI.
- Применить VOI определен для ведения позвонка до позвонка зарегистрированных целевых, нажав " uCT оценки программы " → " файл " → " GOBJ нагрузки " и выбрав ранее созданные GOBJ. Проверьте, что дефектов и VOI концентрических.
- Нагрузки DICOM файлов как целевой, так и позвонков ссылку в главном окне программного обеспечения для анализа изображения.
6. Анализ MicroCT
Примечание: время является 10-20 мин на сэмпл.
- Отправить VOI для оценки с помощью программы оценки µCT ( рис. 6).
Примечание: Не забудьте использовать те же параметры при анализе всех VOIs. Убедитесь, что порог установлена достаточно высоко, чтобы опустить фоновый шум с минимальной потерей кости. Если используется рентгеноконтрастных биоматериал, ряд стратегий может использоваться для анализа формирования костей. Если есть разница в плотности между биоматериала и костной ткани, биоматериал может дробиться из 36 35 ,. В противном случае, следователи могут качественно оценить различия в формировании костной ткани между экспериментальной группами.
7. Эвтаназия
- PPlace остеопорозом крыса в зале индукции придает анестезия машины. Вызвать обезболивание с помощью изофлюрановая 5% 100% кислорода в.
- Поддержания анестезии через носовой конус и выполнять эвтаназии на промо грудной полости для получения двусторонней пневмоторакс 37.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя этот протокол, можно изображения и количественно регенерации n = 8 моделируется остеопорозом дефектов позвоночника через разные временные точки. Анатомический матч, полученные путем процедуры регистрации позволяет для анализа же VOI во всех точках времени. Это приводит к весьма точные продольные 3D histomorphometric анализа, даже когда поля исходного дефекта больше не распознаются. Мы использовали пять очков время (день 1, 2 неделя, неделя 4, неделя 8 и 12 недели) в качестве примера для продольной оценки костной регенерации (рис. 7). Регенерация может оцениваться как качественной оценки 2D сечений и 3D-изображений (как показано на рис. 7A), так и количественные сравнения количества костей (БВД) и качество (AD) (рис. 7B). Следующие морфометрических показателей может быть определена для вновь образованной кости: (i) ТВ, включая тома костей и мягких тканей (ТВ,3мм); (ii) объем минерализованных ткани (BV,3мм); (iii) кости объемная плотность (BV/TV); и (iv) минеральной плотности костной ткани (BMD, мг гидроксиапатита на3см). В частности формирования минимального костей (5% увеличение плотности костей тома) было отмечено 2 недели после создания дефекта. После двух недель никаких существенных различий в формировании костей были замечены в сравнении с более поздних точек времени. В целом несмотря на некоторую степень формирования костей, попавшая на примерно 10% в неделю 8, было минимальным, сохранить кости недействительным с течением времени.
Рисунок 1: протокол дизайн. Изложены основные шаги в протоколе. Во-первых, ovariectomized ню крыс, подвергали четыре месяца диетпитанием низким содержанием кальция (LCD) работали по для создания стандартных критических размеров дефектов в двух поясничных позвонков. Крысы были образы на день 1 и 2, 4, 8 и 12 недель после операции. День 1 сканирования была переориентирована на стандартное положение, и цилиндрических VOI был определен с помощью поля дефекта. Последующие µCT сканирование каждого крысы были автоматически регистрируется в стандартном положении, определенных для соответствующего сканирования 1 день. День 1 предварительно VOI затем был применен к зарегистрированным сканирования. Объемная плотность костей и VOI насыпная плотность были использованы для оценки новых формирования костей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: хирургия позвоночника дефект. Проиллюстрированы основные шаги в хирургической поколения позвоночного дефектов. Во-первых крысы были размещены на грелку (A). Срединная разрез был сделан через кожу (B) и затем linea alba (C) предоставлять брюшной полости (D). Кишечник были отражены подвергать задней брюшной стенки (E), и был разоблачен поясничного отдела позвоночника, с помощью thermocautery (стрелка, F-G). Дефекты были пробурены в четвертом (H, стрелка, указывая на дрель; Я, стрелка, указывая на дефект) и пятой (J, стрелки, указывающие на дефекты) поясничных позвонков. Наконец были зашивается апоневроза (K) и кожи (L). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: разделение позвонке. Показаны основные шаги в контурной позвонка интерес. (A-I) Показываются контурные (зеленая линия) представитель 2D ломтики вдоль длины оси позвонка. 3D представление полного позвоночника (J) можно сравнить с разлученными позвонка (K). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: ссылки позиционирования позвонке. Представитель ломтики в двух плоскостях показаны позвонка до и после вращения в стандартное положение. Во-первых определяется и затем используется для создания повернутое изображение (C использованием представитель XY-ломтик (A), угол (B, зеленый) необходимо повернуть дефекта (B, Красная площадь), чтобы стать параллельно оси y (B, желтый) ). Затем используя представитель YZ-ломтик (D), угол (E, зеленый) необходимо повернуть дефекта (E, Красная площадь), чтобы стать параллельна оси z (E, желтый) определяется и затем используется для создания повернутое изображение (F ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: цель регистрации позвонка. Представитель ломтики в трех плоскостях целевой позвонка (отмеченные в зеленый) и ссылка позвонка (отмечены красным) до (A-C) и после (D-E) регистрации отображаются. Обратите внимание, желтый цвет, указывающий дублирования между целевой и ссылка позвонков и белые стрелки, указывающие на зеленый кости после регенерации, указывающее формирования костей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6: анализ VOI. Представитель ломтики в двух плоскостях с фасонной объемом интерес показываются. Круговой контур располагается в центре дефекта в представитель ZX-ломтик (A). После контурной все ZX-ломтики, полный дефекта объем можно увидеть в плоскости XY (B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7: продольный анализ позвоночника дефекта регенерации. Приведены результаты анализа качественных и количественных представитель костной регенерации. (A) A представитель позвоночного дефект в различные моменты времени изображается в каждой панели лобной 3D изображения (Верхняя панель) с формирования костей в пустоту, указанных в красный, Сагиттальный 2D изображения (средняя группа) и осевой 2D изображения (Нижняя панель). Количественный анализ формирования костей в пустотах была выполнена. Кость объем плотность (B) и насыпная плотность (C) были рассчитаны и по сравнению с использованием неоднократные меры двустороннего ANOVA Бонферрони коррекции для нескольких сравнений. Планки погрешностей представляют SEM. ***-p < 0,0001. Пожалуйста нажмите здесьe, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Шаги | Проблема | Возможная причина | Решение |
| 2.3 | Животное задыхается под наркозом | Излишки изофлюрановая доставки | Снижения концентрации изофлюрановая, доставлены в животное. |
| Животное реагирует на палец щепотка | Недостаточная изофлюрановая доставки | Увеличение концентрации изофлюрановая. | |
| 2.7-2.12 | Сильное кровотечение | Сосудистые повреждения | Используйте стерильным ватным тампоном применять давление или Прижигающая остановить кровотечение. |
| Животное имеет затрудненное дыхание | Пробили диафрагмы | Усыпить животных во избежание удушения. | |
| Утечки кишечного содержимого | Пробили желудочно-кишечного тракта | Усыпить животных, чтобы предотвратить дальнейшие осложнения. Предотвратить его, подняв апоневроза от базовой кишечника перед резкой. | |
| Кровь выходит из буровой | Пробили кровеносный сосуд | Примените стерильным ватным тампоном до остановки кровотечения. | |
| Животное внезапно качает при бурении | Дрель пошел слишком глубоко и повреждения спинного мозга | Усыпить животных, чтобы предотвратить дальнейшие осложнения. | |
| Дефект кости выглядит неполной | Дрель не идет достаточно глубоко | Изменить положение буровой головки внутри дефекта и просверлить глубже | |
| 2.15-2.24 | Шовный материал перерывы | Шовный материал был разобран слишком плотно | Замените весь шов. Если разрыв происходит часто, используйте размер толще шов. |
| Животное медленно, чтобы оправиться от анестезии | Животное гипотермического | Увеличьте температуру грелки или применить дополнительный источник отопительные (например лампа). | |
| Швы открыты | Швы были поставлены слабо, или животное сделал напряженной деятельности | Повторно швы и Dermabond непосредственно на швы и между ними. | |
| 3 | Отсканированное изображение появляется с низким разрешением, шумно или рассеянного | Параметры проверки должны быть скорректированы | Отрегулируйте значения параметров сканирования протокола. Обратитесь к Bouxsein et al. Дополнительные рекомендации для сканирования. |
| Отсканированное изображение выглядит размытым | Животное, переехала во время процесса сканирования | Повторное сканирование животного. Если движение продолжается, повышают концентрацию изофлюрановая. | |
| 5 | Регистрация целевых позвонка не был успешным | Позвонка разделения не было сделано правильно | Recontour позвонок: убедиться, что все части позвонка включены и исключить любые смежные структуры. |
| Большая разница в позиционировании позвонков | Изменить целевой позвонка в ту же ориентацию как ссылка позвонка, используя вращений и флип (шаг 29а). | ||
| Анализ не может правильно распознать костных структур | Примените порог в модуле регистрации чтобы удалить фоновый шум из образцов костей. | ||
| Зарегистрированные позвонков отличаются | Создайте 3d изображения ваших образцов и соответствуют правильным позвонков через разные временные точки. | ||
| 6 | Общий объем (ТВ) отличается между выборками | Используется различное количество фрагментов или изменить контур | Убедитесь в том, чтобы всегда использовать тот же размер контура и такое же количество фрагментов. |
| Костной минеральной плотности (BMD) значение является ненормальным | Неадекватные калибровка microCT | Калибровка microCT для правильной гидроксиапатита стандартов |
Таблица 1: Устранение неполадок. Для различных шагов в протоколе представлены потенциальные проблемы и решения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Остеопороз является наиболее распространенной причиной позвоночного компрессионных переломов, вызванных повышенной нагрузки на позвоночник и, в результате распада тела позвонка. Однако это практически невозможно для получения травмы в грызун, которое достоверно повторяет аналогичные позвоночного краха. Вместо этого исследователи создать цилиндрические пустоты в центре тела позвонка, чтобы имитировать OVCFs16,,1718,19,20,,2124 , 38 , 39. Поскольку не существует согласия в литературе с точки зрения размера дефекта, критического размера дефекта был определен как один, который не залечить спонтанно полностью без вмешательства в течение 3 месяцев послеоперационные16,17.
Хотя метод объединения овариоэктомии с ЖК быстро вызвать остеопороза ранее опубликованной1,13, мы были первыми, чтобы показать, что применение этого подхода к Атинические крысы результаты в эффективный, быстрый, и необратимое сокращение позвоночного Трабекулярная костная объем и минеральной плотности40. Это воспроизводимый малых животных модель, которая беспрепятственно грызунов иммунной системой, и что делает не необходимо для добавили иммуносупрессия, как используемые другими24.
Наши хирургический протокол создается несколько идентичных критических поясничного позвонка дефекты40. Это приводит к весьма последовательной и легко сопоставимых и количественной оценке дефектов различных животных. Мы считаем, что дефектов производится с использованием этого подхода превосходит позвоночного дефект модели сгенерирована хвостового позвонков1,19,41 , потому что хвост крысы подвергается биомеханических сил, которые существенно отличаются от тех, с участием крыса поясничного отдела позвоночника.
Важнейшие шаги в рамках этого протокола включают, избегая интраоперационная гипотермии и принимая осторожностью при бурении хрупких позвонков ovariectomized обнаженной крыс после ЖК. После генерации позвоночного дефект, он контролируется с помощью височная последовательность в vivo µCT сканов в установленное время точках для продольной оценки костной ремонта. Сохранение же параметры сканирования имеет решающее значение. Позвонков затем фасонной и отделены от остальной части сканирования. Оконтуривание идентичные общий объем для всех проверок позвонка и избегая изменения значений серого являются критическими. Коммерчески доступные несколько алгоритм регистрации изображений облегчает извлечение анатомически соответствующего базового VOIs все последующее время точки. Наконец эти VOIs анализируются объем кости, насыпная плотность, и т.д. Важно проанализировать все VOIs, используя те же параметры. Этот метод обеспечивает очень точная и прямой продольной 3D µCT анализ, который не зависит от пользователя.
Этот метод может применяться к любой анализ регенерации дефектов продольной кости. Позвонка дефект модель, используемая здесь является удобной моделью для этого приложения, как его структура кости является уникальным и легко могут быть зарегистрированы в том же анатомические положение. Однако любой костной регенерации могут быть проанализированы на тех же условиях правильно отделять же кость интерес во всем Продольное сканирование. Крайне важно включить раздельный кости образцы с же анатомические особенности. Эту потенциальную проблему и другие описаны в таблице 1, а также возможные причины и предлагаемые решения. Анатомический матч, полученные процедура регистрации может произойти только если образцы включают в себя те же анатомические особенности. Регистрация позволит пользователю применять точное предопределенные VOI первого сканирования все оставшиеся точки время, что приводит к весьма точные 3D histomorphometric анализа с течением времени. Объемная плотность костей и VOI насыпная плотность может использоваться для оценки новых формирования костей.
Хотя потенциально широко применимо, модель, представленная здесь является не без ограничений. Использование Атинические обнаженной крыс можно считать ограничение, она потенциально может маскировать некоторые процессы, иммунной системы, которые могут иметь важное значение для регенерации. Во-вторых моделирования остеопороз через сочетание овариоэктомии и ЖК у молодых крыс, как ранее опубликованные1,13, ограничен в его способность имитировать биологии пациентов пожилого населения. В-третьих OVCFs были моделируется хирургическая процедура, как только животных иметь связанные с остеопорозом переломов приматов42. Наконец, хотя крыса поясничного отдела позвоночника является наилучшие имеющиеся модели для человека поясничного отдела позвоночника — где развивать большинство переломов позвоночника — также ограничением является отсутствие осевого отягощения грызунов позвоночника.
Этот протокол является модульной и поэтому может быть легко модифицирована для исследователя потребностей. К примеру Атинические ovariectomized крысы могут использоваться для изучения других связанных с остеопорозом переломов. Если исследователь решили использовать наш подход к полу автоматизированное костной регенерации анализа, он может применяться к любой модели разрушения с помощью продольных структурных изображений, не обязательно Микро Компьютерная томография. Кроме того одновременно с помощью дополнительных изображений способов как магнитно-резонансная томография может быть сбор дополнительной информации.
OVCF модель, представленная в настоящем Протоколе может использоваться для изучения новые терапевтические подходы к этой клинически неудовлетворенных потребностей. Кроме того наш подход полу автоматизированное анализа может успешно использоваться для выполнения аналогичный анализ, который является менее зависит от пользователя и обеспечивает точность лучше чем другие методы16. Особенно примечателен тот факт, что мы использовали коммерчески доступных визуализации и анализа программного обеспечения, которое может использоваться любой исследователь — программное обеспечение, которое поддерживает дополнительные условия изображений, такие как магнитно-резонансной томографии и ядерного изображений. Поэтому мы считаем, что этот метод является весьма обобщению и ограничивается только наличие в vivo изображений возможностей и регистрации программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Это исследование было поддержано грант от Калифорнийского института регенеративной медицины (CIRM) (TR2-01780).
Acknowledgments
Исследования была поддержана грантом от Калифорнийского института для регенеративной медицины (CIRM) (TR2-01780).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501017 | |
| BetadineSolution | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 4677 | |
| Chlorhexidine Gluconate 2% scrub | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 510083 | |
| Isopropyl Alcohol 70%-quart | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 501044 | |
| Carprofen | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 26357 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | MWI Animal Health, Pasadena, CA | 56163 | |
| Ovariectomized Athymic nude rats | Harlan Laboratories, Indianapolis, IN | Hsd:RH-Foxn1 rnu | |
| Low calcium food | Newco Distributors, Inc., CA | 1814948 (5AV8 AIN-93M w/low calcium) | |
| Phosphate Buffered Saline | Life Technologies Corporation | 14190250 | |
| Dermabond | J AND J ETHICON | DHVM12 | |
| Anesthesia machine | Patterson Scientific | TEC 3EX | |
| Slide Top Induction Chambers | Patterson Scientific | 78917833 | |
| ProStation Heated Workstation | Patterson Scientific | 78914731 | |
| Surgical drape | HALYARD HEALTH INC | 89101 | |
| Magnetic fixator retraction system | Fine Science Tools, Inc., CA | 18200-50 | |
| Dissecting Scissors, 10 cm, Curved, SS | World Precision Instruments, FL | 14394 | |
| Iris Scissors, 11.5 cm, 45 °Angle, Serrated, Sharp/Sharp | World Precision Instruments, FL | 503225 | |
| Forceps, no. 5 | World Precision Instruments, FL | 555048FT | |
| Micro Mosquito Hemostatic Forceps | World Precision Instruments, FL | 503360 | |
| Sterile cotton gauze | Medtronic, MINNEAPOLIS, MN | 9024 | |
| Absorption Spears - Mounted/Sterile | Fine Science Tools, CA | 18105-01 | |
| Syringe, 1 mL | TERUMO TERUMO MED | SS-01T | |
| Needle, 25 gauge | BD MED SYS INJECTION SYS | 305127 | |
| Laminar flow hood | Baker | SterilGARD e3-Class II Type A2 Biosafety Cabinet | |
| Thermal Cautery Unit | World Precision Instruments, FL | 501292 | |
| Micro-Drill OmniDrill115/230V | World Precision Instruments, FL | 503598 | |
| Trephines for Micro Drill, 2 mm diameter | Fine Science Tools, CA | 18004-20 | |
| 3-0 Vicryl undyed 27” SH taper | J AND J ETHICON | 1663G | |
| 4-0 Ethilon black 18” PC3 conventional cutting | J AND J ETHICON | 1954G | |
| Conebeam in vivo microCT (vivaCT 40) | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| SCANCO Medical microCT systems software suite | Scanco Medical | vivaCT 40 | |
| Analyze software | Biomedical Imaging, Mayo Clinic, Rochester, MN | Analyze 12 | Image analysis software |
| Veterenery eye ointment |
References
- Wang, M. L., Massie, J., Perry, A., Garfin, S. R., Kim, C. W. A rat osteoporotic spine model for the evaluation of bioresorbable bone cements. Spine J. 7 (4), 466-474 (2007).
- Consensus development conference: prophylaxis and treatment of osteoporosis. Am J Med. 90 (1), 107-110 (1991).
- Center, J. R., Nguyen, T. V., Schneider, D., Sambrook, P. N., Eisman, J. A. Mortality after all major types of osteoporotic fracture in men and women: an observational study. Lancet. 353 (9156), 878-882 (1999).
- Buchbinder, R., et al. A randomized trial of vertebroplasty for painful osteoporotic vertebral fractures. N Engl J Med. 361 (6), 557-568 (2009).
- Kallmes, D. F., et al. A randomized trial of vertebroplasty for osteoporotic spinal fractures. N Engl J Med. 361 (6), 569-579 (2009).
- Kado, D. M., et al. Vertebral fractures and mortality in older women: a prospective study. Study of Osteoporotic Fractures Research Group. Arch Intern Med. 159 (11), 1215-1220 (1999).
- Silverman, S. L. The clinical consequences of vertebral compression fracture. Bone. 13, Suppl 2. S27-S31 (1992).
- Ross, P. D. Clinical consequences of vertebral fractures. Am J Med. 103 (2A), 30S-43S (1997).
- Saito, T., Kin, Y., Koshino, T. Osteogenic response of hydroxyapatite cement implanted into the femur of rats with experimentally induced osteoporosis. Biomaterials. 23 (13), 2711-2716 (2002).
- Koshihara, M., Masuyama, R., Uehara, M., Suzuki, K. Effect of dietary calcium: Phosphorus ratio on bone mineralization and intestinal calcium absorption in ovariectomized rats. Biofactors. 22 (1-4), 39-42 (2004).
- Martin-Monge, E., et al. Validation of an osteoporotic animal model for dental implant analyses: an in vivo densitometric study in rabbits. Int J Oral Maxillofac Implants. 26 (4), 725-730 (2011).
- Agata, U., et al. The effect of different amounts of calcium intake on bone metabolism and arterial calcification in ovariectomized rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo). 59 (1), 29-36 (2013).
- Govindarajan, P., et al. Bone matrix, cellularity, and structural changes in a rat model with high-turnover osteoporosis induced by combined ovariectomy and a multiple-deficient diet. Am J Pathol. 184 (3), 765-777 (2014).
- Govindarajan, P., et al. Implications of combined ovariectomy/multi-deficiency diet on rat bone with age-related variation in bone parameters and bone loss at multiple skeletal sites by DEXA. Med Sci Monit Basic Res. 19, 76-86 (2013).
- Alt, V., et al. A new metaphyseal bone defect model in osteoporotic rats to study biomaterials for the enhancement of bone healing in osteoporotic fractures. Acta Biomater. 9 (6), 7035-7042 (2013).
- Liang, H., et al. Use of a bioactive scaffold for the repair of bone defects in a novel reproducible vertebral body defect. Bone. 47 (2), 197-204 (2010).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2014).
- Fujishiro, T., et al. Histological evaluation of an impacted bone graft substitute composed of a combination of mineralized and demineralized allograft in a sheep vertebral bone defect. J Biomed Mater Res A. 82 (3), 538-544 (2007).
- Sheyn, D., et al. Gene-modified adult stem cells regenerate vertebral bone defect in a rat model. Mol Pharm. 8 (5), 1592-1601 (2011).
- Phillips, F. M., et al. In vivo BMP-7 (OP-1) enhancement of osteoporotic vertebral bodies in an ovine model. Spine J. 6 (5), 500-506 (2006).
- Kobayashi, H., et al. Long-term evaluation of a calcium phosphate bone cement with carboxymethyl cellulose in a vertebral defect model. J Biomed Mater Res A. 88 (4), 880-888 (2009).
- Turner, T. M., et al. Vertebroplasty comparing injectable calcium phosphate cement compared with polymethylmethacrylate in a unique canine vertebral body large defect model. Spine J. 8 (3), 482-487 (2008).
- Zhu, X. S., et al. A novel sheep vertebral bone defect model for injectable bioactive vertebral augmentation materials. J Mater Sci Mater Med. 22 (1), 159-164 (2011).
- Vanecek, V., et al. The combination of mesenchymal stem cells and a bone scaffold in the treatment of vertebral body defects. Eur Spine J. 22 (12), 2777-2786 (2013).
- Geusens, P., et al. High-resolution in vivo imaging of bone and joints: a window to microarchitecture. Nat Rev Rheumatol. 10 (5), 304-313 (2014).
- Genant, H. K., Engelke, K., Prevrhal, S. Advanced CT bone imaging in osteoporosis. Rheumatology (Oxford). 47, Suppl 4. 9-16 (2008).
- Kallai, I., et al. Microcomputed tomography-based structural analysis of various bone tissue regeneration models. Nature Protocols. 6 (1), 105-110 (2011).
- Lambers, F. M., Kuhn, G., Schulte, F. A., Koch, K., Muller, R. Longitudinal assessment of in vivo bone dynamics in a mouse tail model of postmenopausal osteoporosis. Calcif Tissue Int. 90 (2), 108-119 (2012).
- de Bakker, C. M., et al. muCT-based, in vivo dynamic bone histomorphometry allows 3D evaluation of the early responses of bone resorption and formation to PTH and alendronate combination therapy. Bone. 73, 198-207 (2015).
- Lan, S. H., et al. 3D image registration is critical to ensure accurate detection of longitudinal changes in trabecular bone density, microstructure, and stiffness measurements in rat tibiae by in vivo microcomputed tomography (μCT). Bone. 56 (1), 83-90 (2013).
- Nishiyama, K. K., Campbell, G. M., Klinck, R. J., Boyd, S. K. Reproducibility of bone micro-architecture measurements in rodents by in vivo micro-computed tomography is maximized with three-dimensional image registration. Bone. 46 (1), 155-161 (2010).
- Sheyn, D., et al. PTH Induces Systemically Administered Mesenchymal Stem Cells to Migrate to and Regenerate Spine Injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2016).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comp Med. 58 (5), 424-430 (2008).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- de Lange, G. L., et al. A histomorphometric and micro-computed tomography study of bone regeneration in the maxillary sinus comparing biphasic calcium phosphate and deproteinized cancellous bovine bone in a human split-mouth model. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol. 117 (1), 8-22 (2014).
- Ramalingam, S., et al. Guided bone regeneration in standardized calvarial defects using beta-tricalcium phosphate and collagen membrane: a real-time in vivo micro-computed tomographic experiment in rats. Odontology. 104 (2), 199-210 (2016).
- Leary, S., et al. AVMA guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).
- Wang, M. L., Massie, J., Allen, R. T., Lee, Y. P., Kim, C. W. Altered bioreactivity and limited osteoconductivity of calcium sulfate-based bone cements in the osteoporotic rat spine. Spine J. 8 (2), 340-350 (2008).
- Liang, H., Li, X., Shimer, A. L., Balian, G., Shen, F. H. A novel strategy of spine defect repair with a degradable bioactive scaffold preloaded with adipose-derived stromal cells. Spine J. 14 (3), 445-454 (2013).
- Sheyn, D., et al. PTH induces systemically administered mesenchymal stem cells to migrate to and regenerate spine injuries. Mol Ther. 24 (2), 318-330 (2015).
- Matthieu, R., et al. A new rat model for translational research in bone regeneration. Tissue Eng Part C Methods. , (2015).
- Turner, A. S. Animal models of osteoporosis--necessity and limitations. Eur Cell Mater. 1, 66-81 (2001).
