Summary
Asitik sonrası kondisyonlama serebral işemiye karşı korur. Burada, APC'yi yürütmek için iki model sunuyoruz. Bu in vitro olarak oksijen glikoz yoksunluğu sonra asidik tampon Kortikostriatal dilimleri aktarılarak ve in vivo olarak orta serebral arter oklüzyonundan sonra% 20 CO2 solunması ile sırasıyla gerçekleştirilir.
Abstract
İnme, sınırlı terapötik yaklaşımlarla dünyadaki mortalite ve sakatlığın önde gelen nedenlerinden biridir. Nöroproteksiyon için endojen bir strateji olarak, kondisyon sonrası tedavilerin serebral iskemiye karşı umut verici tedaviler olduğu kanıtlanmıştır. Bununla birlikte, karmaşık prosedürler ve olası güvenlik sorunları, klinik uygulamalarını sınırlar. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için deneysel fokal serebral iskemi için bir terapi olarak asidik sonrası düzeltme (APC) geliştirdik. APC iskemi sonrası reperfüzyon esnasında CO2 solunması ile hafif asidoz tedavisi anlamına gelmektedir. Burada APC'yi in vitro ve in vivo olarak yürütmek için sırasıyla iki model sunuyoruz. Farelerin oksijen-glikoz yoksunluğu (OGD) tedavisi ve farelerin kortikostriatal oklüzyonu ve orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) serebral iskemiyi taklit etmek için kullanıldı. APC, beyin dilimlerini,% 20 CO 2 ile kabarmış olan asidik tampona aktararak basitçe elde edilebilir;% 20 CO 2 teneffüs fareler tarafından r. APC, doku canlılığı ve beyin enfarktüsü hacmi tarafından yansıtıldığı gibi serebral iskemiye karşı önemli koruyucu etkiler gösterdi.
Introduction
İnme, dünya çapındaki mortalite ve engelliliğin önde gelen nedenlerinden biridir. Son on yılda inme için etkili tedavileri bulmak için büyük çabalar gösterildi, ancak başarı oldukça yetersiz. Sonradan şartlandırma, iskemik bir aşamayı takiben alttoksik stresler tarafından manipüle edilen bir işlemdir. İskemik, hipoksik, düşük glukoz ve uzak iskemik postkondisyon dahil olmak üzere kondisyon düzeltme, endojen uyarlamalı mekanizmaları tetiklemektedir ve serebral iskemiye karşı umut verici tedaviler olduğu kanıtlanmıştır 1 , 2 , 3 , 4 . Bununla birlikte, iskemik son şartlandırma ek yaralanmaya neden olabilir. Ekstremitenin uzak iskemik son kondisyonu genellikle ipsilateral veya bilateral arka bacaklarda 5 , 6 , 7'de 5-20 dakika oklüzyon ve reperfüzyona ihtiyaç duyar. thBu nedenle, bu kondüsyon sonrası manipülasyonlar klinik uygulamada tehlikeli veya pratik değildir. Bu dezavantajları aşmak için, fareler 8 fokal serebral iskemi için bir tedavi olarak APC geliştirdik. Sadece% 20 CO 2'yi teneffüs ederek indüklenen APC, iskemik beyin hasarını daha uygulanabilir ve daha güvenli bir şekilde önemli ölçüde azaltır. Yakın zamanda APC felç tedavi 9 için APC önemini vurgulayarak, reperfüzyon penceresini genişletir kanıtlamıştır.
Burada serebral iskemiye karşı APC'nin nöroproteksiyonunu incelemek için iki deneysel model sunmaktayız. Bunlardan ilki, kortikostriatal dilimdeki oksijen glukoz yoksunluğu (OGD) modelidir. Yapay ortam içine hızlı hazırlanması ve beyin kesitleri devri, genellikle yapay serebrospinal akışkan (ASCF), mümkün in vitro 10 <beyin fonksiyonu çalışma yapar, hücre canlılığı ve nöronal devre korumakSup>, 11 . ASCF'deki OGD, serebral iskemi taklit eder ve iskemik hasar oluşturur 12 , 13 , 14 . OGD'den sonra, beyin dilimleri reperfüzyon sağlamak için düzenli ASCF (r-ASCF) içinde yenilenir ve daha sonra% 20 CO 2 ile kabarmış asidik ASCF kullanılarak APC ile muamele edilir. Kortikostriatal dilim, birincil kültürlenmiş hücrelere kıyasla sağlam histolojik karakterizasyonunu korur.
İn vivo olarak beyin fonksiyonunu incelemek için fare orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli kullanılmıştır. Orta serebral arter, ortak karotis atardamarından alevle köreltilmiş bir monofilament yerleştirilerek engellenir. En yaygın vuruş modellerinden biri olan MCAO modeli klinik önemi göstermektedir ve bir monofilamanın uygulanması reperfüzyonu kolaylaştırmaktadır. Reperfüzyon başladıktan sonra% 20 CO 2 içeren normoksik karıĢık gaz teneffüs edilerekN, APC azalmış beyin enfarktüsü hacimleri ile gösterilen serebral iskemiye karşı önemli koruyucu etkiler gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler, Zhejiang Üniversitesi Hayvan Deneyleri Komitesinin etik kurallarına göre onaylanmış ve yürürlüğe girmiş ve Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Ulusal Sağlık Enstitüleri ile tam bir uyum içindedir. Herhangi bir ağrı veya rahatsızlığı en aza indirmek için çaba gösterildi ve asgari hayvan sayısı kullanıldı.
1. Corticostriatal dilimlerin OGD'leri
- Çözelti hazırlığı:
- 1.000 ml r-ACSF (124 mmol / L NaCl hazırlanması, 5 mmol / L KCl, 1,25 mmol / L KH2 PO 4, 2 mmol / L MgSO 4, 26 mmol / L NaHCO 3, 2 mmol / L CaCl2, 10 mmol / L glukoz, nihai pH 7.4). Deney boyunca% 5 CO 2 ve% 95 O 2 ile kabarcık.
- % 5 CO2 ve% 95 N2 ile köpürtüldü glikoz üstünde, ancak hariç tutulmasıyla 200 ml glukoz içermeyen ACSF (GF-ACSF), hazırlayın. Br uygulamadan önce gazları 30 dakika kabarcık haline getirinÇözeltideki oksijen içeriğini azaltmak için dilimler. OGD işlemi tamamlanıncaya kadar köpürmeye devam edin.
- % 20 CO2 ve% 80 O2 ile 200 ml r-ACSF dengelenmesi ile asidik ACSF (a-ACSF) hazırlayın. Çözeltinin pH'ını 6.8'e düşürmek için beyin dilimine uygulamadan önce gazları 30 dakika kabarcık haline getirin ve APC işlemi sona erene kadar köpürmeye devam edin.
- Üç doku tutucu sırasıyla r-ACSF, gf-ACSF, a-ACSF'ye yerleştirin.
- Beyin dilim preparatı:
Not: Bu çalışmada 8 haftalık erkek C57Bl / 6J fareleri kullanılmıştır. Hayvanlar, kontrollü bir sıcaklıkta (22 ± 2 ° C), 12 saat ışık-karanlık döngü periyoduyla barındırıldı ve pellet haline getirilmiş yiyecek ve suya erişildi.- Bir indüksiyon odasında izofluran doz aşımı ile bir fare kurban. Fareyi kes. Küçük makas ve forseps kullanarak beyni ayırın. İnce bir spatula ile beyni çıkarın ve dikkatlice bir cam beher kabına koyuntaining buz soğukluğunda r-ACSF% 5 CO2 ve% 95 O2 ile dengelenmiştir.
NOT: Bu adımlar mümkün olduğunca hızlı ancak titizlikle yapılmalıdır. - Beyni 5 dakika buz soğuk r-ACSF'de tutun. Beynin hareketlerinden kaçınmak için gaz basıncını ayarlayın.
- İki şerit halinde vibratome plaka üzerine kriyopresipit tutkal yerleştirin. Beyni desteklemek için yapışkan şerit üzerine bıçaktan uzakta bir parça% 3 agaroz koyun.
- Buz üzerinde 10 cm'lik bir Petri kabını ters çevirin ve çanağa bir filtre kağıdı koyun. Filtre kağıdını buz soğukluğundaki r-ACSF damlaları ile nemlendirin.
- Forsep ile beyin filtre kağıdına aktarın. Bıçak ve forsepsle frontal direği ve serebellumu kesin.
NOT: Enine kesitler mümkün olduğunca pürüzsüz olmalı ve sagital plana dik olmalıdır. - Geride kalan beyin dokusunu diğer tutkal şeridine dikey olarak yerleştirin ve beyindeki agaroza yaslanmasını sağlayın. Buz soğuğu r-ACSF'yi kesme haznesine ekleyerekBeyni suya batırın ve buz tutucuya buz ekleyin. Rezervuardaki r-ACSF'yi% 5 CO 2 ve% 95 O 2 ile kabarcık halde tutun.
- Hazneyi kaldırın ve traş makinesini mümkün olduğunca beynin yakınında ve beynin hemen üzerinde olacak şekilde tıraş makinesinin konumunu ayarlayın.
- Beyin bölümlerini kesintisiz kesmek için "CONT" modunu seçin. Kesme kalınlığını 400 μm, titreşim frekansı 6 - 8 ve hız 3 - 4 olarak ayarlayın. Otomatik kesmeye başlamak için "start / stop" düğmesine basın.
- Beyin dilimlerinin boyutlarına uyan bir açılım yapmak için 3 mL Pasteur pipetinin ucunu kesin.
NOT: Açılma, beyin dilimlerine ek hasar gelmesini önleyecek kadar büyük olmalıdır. - Beş Beyin dilimleri uç cutPasteur pipet ile bir bir çizme ve buz soğukluğunda, r-ACSF doku tutucu içine yerleştirin% 5 CO2 ve% 95 O2 ile fokurdatıldı. Üretilen ilk dilimini toplamayın. Gaz basıncını avoi'ye ayarlayınBeyin dilimlerinin hareketleri.
NOT: Beyin dilimleri birbirlerini örtmemelidir. - Sinaptik fonksiyonları kurtarmak için 30 dakika boyunca oda sıcaklığında r-ACSF ile beyin dilimleri yerleştirin ve daha sonra sinaptik fonksiyonları iyileştirmek için bir su banyosunda başka bir 10 dakika boyunca 37 ° C'de tutun.
- Bir indüksiyon odasında izofluran doz aşımı ile bir fare kurban. Fareyi kes. Küçük makas ve forseps kullanarak beyni ayırın. İnce bir spatula ile beyni çıkarın ve dikkatlice bir cam beher kabına koyuntaining buz soğukluğunda r-ACSF% 5 CO2 ve% 95 O2 ile dengelenmiştir.
- OGD ve APC:
- Gf-ACSF ve a-ACSF'yi 37 ° C'lik bir su banyosuna yerleştirin ve yukarıda belirtilen 1.1.2 ve 1.1.3'de belirtildiği gibi ilgili gazlarla tamponları 30 dakika boyunca kabarcıklandırın.
- Kontrol olarak r-ACSF'de bir dilim bırakın. Diğer dört beyin dilimini önceden ısıtılmış gf-ACSF ile doku tutucusuna dikkatlice aktarın ve 15 dakika inkübe edin. Reperfüzyonu sağlamak için dilimleri r-ACSF'deki doku tutucusuna geri aktarın.
- APC'nin zaman penceresini incelemek için, bir dilimi doğrudan gf-ACSF'den a-ACSF'ye aktarın. Diğer üç parçayı ilk önce r-ACSF'ye aktarın ve daha sonra reperfüzyondan 5 ve 15 dakika sonra iki tanesini a-ACSF'de doku tutucusuna aktarın.
- IncubatE-ACSF'deki iki dilimi 3 dakika boyunca çalkalayın ve sonra onları r-ACSF'ye geri gönderin. Üç parçayı r-ACSF'de 1 saat daha inkübe edin. Geri kalan dilimleri r-ACSF'de OGD grubu olarak ayarlayın.
- Bir doz yanıtı çalışması için, OGD'den sonra başlangıçta r-ACSF doku tutucusuna dört dilim aktarın ve 5 dakika inkübe edin. OGD grubu olarak r-ACSF'ye bir dilim bırakın ve diğer üç dilimi a-ACSF'ye aktarın. Dilimleri bir-ACSF'de sırasıyla 1, 3 ve 5 dakika inkübe edin ve daha sonra r-ACSF'ye aktarın. Üç parçayı r-ACSF'de 1 saat daha inkübe edin.
- Dilim canlılığı belirleme:
- % 0.25 2,3,5-trifeniltetrazolyum hidroklorür (TTC) normal tuz çözeltisi hazırlayın. 1.25 g TTC tozu 500 mL normal salin solüsyonuna ilave edin.
NOT: Toz tamamen çözündükten sonra, çözeltiyi folyo ile kaplanmış 24 delikli bir plaka (oyuk başına 500 uL) içine aktarın ve 4 ° C'de saklayın. TTC ve doku dokusu TTC ile boyandığında ışık sensitive. - Dilimleri, TTC çözeltisi içeren 24 delikli bir tabağa (oyuk başına bir dilim) aktarın ve çözeltideki dilimi uzatın. Dilimleri TTC çözeltisi içinde 37 ° C'de sığ bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- Dilimleri folyo ile kaplanmış temiz 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın ve dilimlerin kuru ağırlığını ölçün.
- Formazan çıkarmak için santrifüj tüplerine (v: w = 10: 1) etanol / dimetil sülfoksit (1: 1) ekleyin. Dilimleri etanol / dimetil sülfoksit içinde oda sıcaklığında 24 saat boyunca ışığa bırakın.
- Tüplerdeki tüm etanol / dimetil sülfoksitleri 96 oyuklu bir plaka içine ilave edin ve bir plaka okuyucu tarafından 490 nm'de absorbansı ölçün.
- Emiciliği dilimin kuru ağırlığına göre normalleştirin ve canlılık oranını kontrol dilimi yüzdesi olarak ifade edin.
- % 0.25 2,3,5-trifeniltetrazolyum hidroklorür (TTC) normal tuz çözeltisi hazırlayın. 1.25 g TTC tozu 500 mL normal salin solüsyonuna ilave edin.
2. MCAO
- Hazırlık:
- Tezgah, Lazer Doppler Flowmetr yüzeyini dezenfekte edinY (LDF) aletinin ve aksesuarlarının% 70 etil alkol ile kullanılması.
- Otoklavlı aletleri hazırlayın: iki makas, 10 cm; Iki forseps, 10 cm; Bir oftalmik forseps, 11 cm; Bir mikro oftalmik makas, 9 cm; Bir mikro damar kelepçesi, 1,8 cm; Oneneedle tahrik, r 12.5 cm; Çeşitli cerrahi sütürler (△ 1/2 4 × 10); Pamuklu çubuklar.
- Sulu bir çalışma alanı korumak için salin solüsyonu ile bir şırınga (iğne olmadan) hazırlayın.
- Anestezi gazı hazırlayın (% 100 O 2 + izofluran).
- Beyin kan akışının saptanması:
- LDF aletini kurun.
- Analjezikler intraperitoneal fare içine enjekte edilir: metamizol 200 mg / kg, karprofen 4 mg / kg ve buprenorfin 0.1 mg / kg.
- Vücudun spontan hareketi ve vibrissae durana kadar anestezi için oksijen% 4 izofluran ile bir indüksiyon odasına fare yerleştirin.
- Fareyi, yüzeye takılı olan burnunu eğilimli bir konuma getirin.Burun konisi ve takip prosedürü için izofluran'ı% 1.5'de tutun.
- Her iki gözde dexpanthenol göz merhemi uygulayın.
- Kafayı% 70 etil alkol ile dezenfekte edin.
- Bregma'yı ortaya çıkarmak için bir bistül kullanarak gözler ve kulaklar arasında doğru bir paramedian cilt insizyonu yapın.
- Kafatasını steril pamukla ovun.
- Kafatasının yüzeyine bir ila iki damla cerrahi tutkal uygulayın.
- Fiber optik ucun ucunu bregma'ya kaudal 5 mm ve orta hattın 6 mm yanına yerleştirin.
- Bilgisayar yazılımında kan akışını kaydetmeye başlayın. Kararlı bir kan akımı taban çizgisi oluşana kadar bekleyin ve sonra probu sabitlemek için tutkalın üzerine 20 mcL bir katalizör uygulayın.
NOT: İdeal bir taban çizgisi 500'den fazla akış olmalıdır. - Taban çizgisi 200 akışın altında ise, uygun bir taban çizgisi elde etmek için konumu iyice ayarlayın. Deney süresince probu kafatasına tutun.
- Başınızı iyodofor af ile dezenfekte edinBağlı fiber optik prob.
- MCAO:
- Anestezi uygulanmış fareyi (LDF probu kafatasına takılı haldeyken) yatırarak yerleştirin ve ameliyat boyunca bir ısı lambası kullanarak vücut sıcaklığını koruyun. Boynu% 70 etil alkol ile dezenfekte edin.
- Bir neşter kullanarak boynunda paramedian cilt insizyonu yapın; Kapları açığa çıkarmak için yumuşak dokuları forsepsle inceleyin. Onların susuz kalması için maruz kalan dokulara bir damla tuz bırakın.
- Oftalmik forseps kullanarak ortak karotis atardamarını çevresindeki doku ve vagus sinirinden ayırın. Vagus sinirine zarar vermemek için dikkatli olun. Genel karotid arter maruz kaldıktan sonra boyun derisini tekrar iyodofor ile dezenfekte edin.
- Genel karotid arterin distal ucuna bir mikrodamar kelepçesi yerleştirin ve sonra proksimal ucunda ölü bir düğümü 6-0 ipek dikişlerle bağlayın. Müteakip işlemler için kelepçeyi mümkün olduğunca proksimal yapın. Emin olun kiKelepçe ile ölü düğüm arasındaki gemi daha sonraki işlemler için mümkün olduğunca uzun sürebilir.
- Gevşek bir düğüm bağlayarak kelepçenin yakınından geçici bir sütür yapın. Monofilament yerleştirilmesi için iki düğüm arasında yeterli boşluk bulunduğundan emin olun.
- Mikro oftalmik makas ile iki düğüm arasındaki küçük boyuna bir insizyon yapın. Müteakip işlemler için kesi mümkün olduğunca ölü düğümün yakınında olduğundan emin olun. Gemiyi kesmemeye dikkat edin.
- Arter lümenini girmek için insizyona 12 mm'lik uç-köreltilmiş bir monofilament yerleştirin ve birkaç mm ilerletin. Monofilamanın ucundaki gevşek düğüm sıkıştırın ve kelepçeyi çıkarın.
- LDF yazılımı, kan akışında keskin bir düşüş (başlangıçtaki kan akışından% 80'lik bir düşüş) gösterecek şekilde filamenti oftalmik forseps ile iç karotid artere (orta serebral arteri tıkamak için 10 mm'ye) ilerletin. Oklüzyonun başlama zamanını kaydedin.
NOT: LDF cihazı kurulumuBölüm 2.2'de açıklanmıştır. - Orta serebral arteri 1 saat tıkayın. LDF probunu kesin ve oklüzyon süresince fareleri 30 ° C inkübatörde bırakın.
- Reperfüzyon ve APC:
- Oklüzyonun başlamasından 55 dakika sonra izofluran ile hayvanlara tekrar tekrar anestezi uygulayın. Fareleri sırtüpe yatırın ve sabitleyin. Boyun kesiğini açın ve genel karotid arteri tekrar açın.
- Reperfüzyon elde etmek için oklüzyon periyodundan sonra oftalmik forseps ile hafifçe filaman çekin ve düğümü sıkarak geçici bir dikiş yerleştirin.
- Asidoz tedavisi için, reperfüzyondan sonra 5, 50 ya da 100 dakika ile 20% 5 dakika için CO2,% 20 O2 ve% 60 N2 içeren bir karışım gazlara burun konisi ile inhale gaz değiştirin. Kesiyi kesilmiş bir cerrahi dikişle kapatın.
- Fareler, bilinçliliğini kurtarana kadar 30 ° C'lik bir ısı kafesine yerleştirinVe sonra fareleri temizlemek için tek tek kafeslerine geri verin. Farelere bir Petri tabağı ve nemli yiyecek koyun. Ameliyattan sonra aşırı ağrı ve ölüm için fareleri yakından izleyin.
- Beyin Enfarktüsü hacim ölçümü:
- Reperfüzyondan 24 saat sonraTTC boyaması ile beyin enfarktüsü hacmini ölçün.
- Belirtilen fedakarlık zamanından önce 1.4.1. Adımda belirtildiği gibi% 0.25 TTC solüsyonu hazırlayın. Çözümü, folyo ile kaplanmış 24 oyuklu bir plakaya (oyuk başına 1 mL) aktarın ve 4 ° C'de saklayın.
NOT: TTC ile boyanmış TTC ve doku ışığa duyarlıdır. - Reperfüzyondan 24 saat sonra, bir indüksiyon odasında bir isofluran aşırı dozuyla hayvanı feda edin. Fareleri keselim. Küçük makas ve forseps kullanarak beyinleri ayırın. Willis Çemberi'nde subaraknoid kanama geçirmiş farelerin hariç tutulması için beyinlerin bloğundaki noktaları inceleyin.
- Beyni, -20 ° 'de temiz bir cam slayt üzerine yerleştirin ; Buzlu paket. Beyni daha kolay hale getirmek için beyni ve cam sürgüsünü -20 ° C buzdolabında 5 dakika bekletin.
- Beyni ve cam sürgüsünü -20 ° C'den çıkarın ve -20 ° C buz torbasına geri koyun. Frontal direği ve serebellumu bıçak ve forseps ile parçalara ayırın.
- 5 dilim üretmek için beyin bölümlerini bir bıçakla 1 mm kalınlığa yatay olarak dilimleyin. Dilimleri, forseps ile TTC çözeltisi (oyuk başına 1 dilim) içeren 24 yuvalı plakaya aktarın ve çözeltideki dilimleri uzatın. Dilimleri TTC çözeltisi içinde 37 ° C'de sığ bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin.
- TTC çözümünü aspire. % 10 formaldehit (oyuk başına 1 mL) ilave edin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Dilimleri, bir selofan levha üzerine kesildikleri sırada yerleştirin ve parçaları fotoğrafik plaka görüntüleyiciye tarayın.
- ImageJ analiz yazılımını kullanarak infarkt boyutunu tüm beyin diliminin bir yüzdesi olarak analiz edinLass = "xref"> 8 görsel tanıma dayalı; Bkz. Şekil 2 (sol).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda tarif edilen kortikostriatal dilim modelinde, reperfüzyondan 1 saat sonra, kortikostriatal dilim canlılığı, TTC analizi ile nicelleştirildi. TTC dönüşümü, 490 nm'deki absorpsiyonu kontrol dilimine normalleştirerek hesaplandı. TTC dönüşümüne göre, APC, başlangıç zamanı ve süreye bağlı olarak OGD kaynaklı reperfüzyon hasarına karşı korunmuştur. Ayrıntılı olarak, hem 1 ve 3 dakika asidoz tedavisi, 15 dakika OGD'den sonra 5 dakika içinde yaşama kabiliyetini önemli ölçüde geliştirdi, oysa 5 dakika sürdü (OGD: 0.609 ± 0.029, 5/1: 0.758 ± 0.034, 5/3: 0.821 ± 0.041, 5/5: 0.672 ± 0.053, ortalama ± SEM) (Şekil 1 A) halinde bildirilmiştir. Asitoz tedavisi ile nörokoruma reperfüzyon sonrası 5 dakika içinde korundu, buna karşılık 15 dakika süresince (OGD: 0.584 ± 0.044, 0/3: 0.762 ± 0.036, 5/3: 0.833 ± 0.062, 15/3: 0.627 ± 0.038) Şekil 1 B ).
MCAO modelinde, 5 dakikalık asidoz tedavisi, reperfüzyon başlangıcından 5 dakika sonra iskemik hasara neden olan hücre ölümünü kurtardı ve daha küçük enfarktüs hacimleriyle (MCAO: 33.4 ± 4.4%, 5/5: 16.6 ± 2.7, 50 / 5: 19.5 ± 2.1, 100/5: 37 ± 2.1). Nöroproteksiyon, reperfüzyondan 50 dakika sonra başlangıçta geciktiğinde bile sağlamdı. Bununla birlikte, 100 dakikada başlatılan asidoz tedavisi iskemik yaralanmaları bloke etmemiştir ( Şekil 2 ).
Tüm veriler toplandı ve kör bir biçimde analiz edildi. Veriler ortalama ± SEM olarak sunulmuştur. Kortikostriyal dilim modelinde her grupta 6-8 örnek vardır. MCAO modelinde her grubun 9 - 10 örneği vardır. Çoklu karşılaştırmalar için en az anlamlı fark ile tek yönlü varyans analizi uygulanmıştır.
Şekil 1 . APC Corticostriatal Dilimlerde OGD'ye bağlı reperfüzyon hasarına karşı korur. Kortikostriatal dilim belirtilen sürelerde (A) asidoz (pH 6.8) ile muamele edilmiş ve OGD'ye sonrası iyileşme süreleri (B) belirtilmiştir. Reperfüzyondan 24 saat sonra 3- [4,5-dimetiltiyazol-2-il] -2,5-difeniltetrazolyum bromür tahlili ile hücre yaşayabilirliği değerlendirildi ve reperfüzyondan 1 saat sonra kortikostriyal dilim canlılığı TTC analizi ile ölçüldü. Değerler ortalama ± SEM gösterir. Her grup için n = 6 - 8; * Tek yönlü varyans analizi ile p <0.05 ve ** p <0.01; R, reperfüzyon. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 2 . APC, farelerde MCAO kaynaklı yaralanmaya karşı korur. Hayvanlar 60 dakika MCAO'ya tabi tutuldu ve reperfüzyondan sonra 5, 50 veya 100 dakika sonra 5 dakika% 20 C02 soluk alı ile tedavi edildi. İnfarkt hacmi, reperfüzyondan 24 saat sonra 2,3,5-trifeniltetrazolyum hidroklorit boyama ile nicelendirildi (sol panelde siyah noktalı çizgi ile gösterildi). Değerler ortalama ± SEM gösterir. Her grup için n = 8-10; * Tek yönlü varyans analizi ile p <0.05 ve ** p <0.01; R, reperfüzyon. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada serebral iskemiye karşı APC'nin nöroproteksiyonunu incelemek için iki deneysel model sunmaktayız. Beyin dilimlerinde APC, reperfüzyon başlangıcından sonra fare kortikostriyat dilimlerini% 20 CO 2 ile kabarcıklar halinde asidik tampon içinde kuluçkaya yatırarak elde edilirken, MCAO modelinde reperfüzyon sonrası farelere% 20 CO 2 soluk aldırarak APC elde edilir. Her iki model de serebral iskemiye karşı APC'nin nörokoruyorumunu yansıtmaktadır. Koruma, iskemik sonrası kondisyon ile elde edilenle karşılaştırılabilir, ancak daha geniş bir zaman penceresi ile. MCAO modelinde, zaman periyodu, reperfüzyondan 50 dakika sonra, iskemik sonrası kondisyon için 10 dakika ile karşılaştırıldığında, 15 kadar sürebilir. Buna ek olarak, APC prosedürü daha kolay ve daha güvenlidir.
Kortikostriyal dilim modelinde, beyin dilimlerinin canlılığını maksimum düzeyde garanti etmek için nazik ve hızlı işlemler önemlidir. MCAO performansı için serebral kan akışı denetimiGereklidir ve orta serebral arterin oklüzyonunu sağlamak için kan akışındaki keskin düşüşe dikkat edilmelidir. TTC boyaması için beyinler incelendikten sonra, subaraknoid kanamayı dışlamak için beyinlerin dikkatle incelenmesi gereklidir.
Asidozun uzatılması ve süresi, APC'nin nöroproteksiyonunu sağlamak için kritik öneme sahiptir. Uzun süren asidoz tedavisi, kortikostriyal dilim modelinde yararlı değildir ( Şekil A ). Buna ek olarak, önceki çalışmamız% 8'lik CO 2 inhalasyonundan ziyade hem% 10 hem de% 20 CO 2 inhalasyonunun farelerde nöroproteksiyonu sağladığını gösterdi. Bu hafif asidoz APC nöro için çok önemli olduğunu düşündürmektedir ve dolayısıyla CO2 konsantrasyonu ve APC süresi asidoz nöro için vazgeçilmezdir.
TTC boyamaya ek olarak, birçok teknik,Farklı araştırma ihtiyaçlarını karşılar. Örneğin, iskemi ve asidozun sinir potansiyelini nasıl etkilediğini gözlemlemek için son adıma ekstra-hücresel elektrik kaydı eklenebilir 16 . APC sonrasında amino asit nörotransmitterlerinin konsantrasyon değişimini HPLC 17 ile ölçmek için beyin diliminin perfüzyon çözeltisi de toplanabilir 17 . Belli bir beyin bölgesinin dilimleri, belirli bir alanın iskemi ve APC'ye yanıtlarını incelemek üzere hazırlanabilir. Genel olarak, iskemi ve asidozun etkilerini aydınlatmak için birçok alternatif getirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81573406, 81373393, 81273506, 81221003, 81473186 ve 81402907), Zhejiang Eyalet Doğa Bilimleri Vakfı (LR15H310001) ve S & T Yenilik Ekibinin Zhejiang Leading Team Programı (2011R50014) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma | S5886 | |
| Potassium chloride | Sigma | P5405 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma | P9791 | |
| Magnesium sulfate | Sigma | M2643 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma | C5080 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7021 | |
| Vibratome | Leica | VT1000 S | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium hydrochloride | Sigma | T8877 | |
| Absolute Ethanol | Aladdin Industrial Corporation | E111993 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D8418 | |
| Laser Doppler Flowmetry | Moor Instruments Ltd | Model Moor VMS-LDF2 | |
| Diethyl ether anhydrous | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 80059618 | |
| Trichloroacetaldehycle hydrate | Sinopharm Chemical Reagent Corporation | 30037517 | |
| 10% Formalin | Aladdin Industrial Corporation | F111936 | |
| 24-well plates | Jet Biofil | TCP-010-024 |
References
- Zhao, H., Sapolsky, R. M., Steinberg, G. K. Interrupting reperfusion as a stroke therapy: ischemic postconditioning reduces infarct size after focal ischemia in rats. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (9), 1114-1121 (2006).
- Leconte, C., et al. Delayed hypoxic postconditioning protects against cerebral ischemia in the mouse. Stroke. 40 (10), 3349-3355 (2009).
- Fan, Y. Y., et al. Transient lack of glucose but not O2 is involved in ischemic postconditioning-induced neuroprotection. CNS Neurosci Ther. 19 (1), 30-37 (2013).
- Hess, D. C., Hoda, M. N., Bhatia, K. Remote limb perconditioning [corrected] and postconditioning: will it translate into a promising treatment for acute stroke. Stroke. 44 (4), 1191-1197 (2013).
- Ren, C., Yan, Z., Wei, D., Gao, X., Chen, X., Zhao, H. Limb remote ischemic postconditioning protects against focal ischemia in rats. Brain Res. 1288, 88-94 (2009).
- Sun, J., et al. Protective effect of delayed remote limb ischemic postconditioning: role of mitochondrial K(ATP) channels in a rat model of focal cerebral ischemic reperfusion injury. J Cereb Blood Flow Metab. 32 (5), 851-859 (2012).
- Li, P., et al. Remote limb ischemic postconditioning protects mouse brain against cerebral ischemia/reperfusion injury via upregulating expression of Nrf2, HO-1 and NQO-1 in mice. Int J Neurosci. , 1-8 (2015).
- Fan, Y. Y., et al. A novel neuroprotective strategy for ischemic stroke: transient mild acidosis treatment by CO2 inhalation at reperfusion. J Cereb Blood Flow Metab. 34 (2), 275-283 (2014).
- Shen, Z., et al. PARK2-dependent mitophagy induced by acidic postconditioning protects against focal cerebral ischemia and extends the reperfusion window. Autophagy. 0, (2017).
- Skolnik, J., Takacs, L., Szende, E. In vitro oxygen consumption of slices from kidney, brain, cortex and liver in hypoxia. Nature. 209 (5020), 305 (1966).
- Lynch, G., Schubert, P. The use of in vitro. brain slices for multidisciplinary studies of synaptic function. Annu Rev Neurosci. 3, 1-22 (1980).
- Zheng, S., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces purkinje cell death in an in vitro model of rat cerebellar ischemia. Neuroscience. 118 (1), 99-106 (2003).
- Yin, B., Barrionuevo, G., Weber, S. G. Optimized real-time monitoring of glutathione redox status in single pyramidal neurons in organotypic hippocampal slices during oxygen-glucose deprivation and reperfusion. ACS Chem Neurosci. 6 (11), 1838-1848 (2015).
- Medvedeva, Y. V., Ji, S., Yin, H. Z., Weiss, J. H. Differential vulnerability of CA1 vs CA3 pyramidal neurons after ischemia: possible relationship to sources of Zn2+ accumulation and its entry into and prolonged effects on mitochondria. J Neurosci. , (2016).
- Pignataro, G., et al. In vivo and in vitro characterization of a novel neuroprotective strategy for stroke: ischemic postconditioning. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (2), 232-241 (2008).
- Zhang, X., Ding, H. Z., Jiang, S., Zeng, Y. M., Tang, Q. F. An in vitro study of the neuroprotective effect of propofol on hypoxic hippocampal slice. Brain Inj. 28 (13-14), 1758-1765 (2014).
- Niu, Y., et al. Chemical profiling with HPLC-FTMS of exogenous and endogenous chemicals susceptible to the administration of chotosan in an animal model of type 2 diabetes-induced dementia. J Pharm Biomed Anal. 104, 21-30 (2015).
