Summary
כתב יד זה מתאר פרוטוקולים סטנדרטיים למדידת hyperphosphorylation טאו, מדידת מחייב טאו microtubules, לוקליזציה של טאו תאיים בעקבות טיפולים תרופות. פרוטוקולים אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון סמים או תרכובות אחרות המכוונות איגוד hyperphosphorylation או microtubule טאו.
Abstract
טאו חלבונים הקשורים microtubule הוא חלבון עצביים רגישה בעיקר ב אקסונים. בדרך כלל טאו הוא חיוני לתפקוד נורמלי עצביים מכיוון מעורב microtubule הרכבה, מייצב. מלבד הנוירונים, טאו מתבטא בשד האנושי, הערמונית, קיבה, המעי הגס, סרטן הלבלב איפה זה מציג מבנה דומה כמעט ולא מפעילה פונקציות דומות כמו טאו עצביים. הסכום של טאו שלה זרחון יכול לשנות את תפקידה בתור מייצב של microtubules ולאחר להוביל להתפתחות של חוטים לוליינית לזווג הפרעות ניווניות שונות, כגון מחלת אלצהיימר. קביעת המדינה זירחון של טאו ומאפייניה microtubule מחייב חשוב. בנוסף, בחינת ההתאמה תאיים של טאו היא חשובה מחלות שונות. זה כתב היד פרטים פרוטוקולים סטנדרטיים עבור מדידת זרחון טאו טאו מחייב microtubules בתאי סרטן המעי הגס עם או בלי כורכומין וטיפול LiCl. טיפולים אלה יכולים לשמש כדי לעצור את התפשטות תאים סרטן ופיתוח. לוקליזציה תאיים של טאו נבדק על-ידי שימוש אימונוהיסטוכימיה מיקרוסקופיה קונפוקלית תוך שימוש כמויות נמוכות של נוגדנים. מבחני אלה ניתן להשתמש שוב ושוב לסינון תרכובות המשפיעים על hyperphosphorylation טאו או microtubule מחייב. הריפוי משמש tauopathies שונים או סוכנים נגד סרטן הקשורים יכול באופן פוטנציאלי להתאפיין באמצעות פרוטוקולים אלה.
Introduction
טאו זוהה במקור בחום-היציב הקשורים microtubule חלבון זה היה מזוכך במשותף עם טובולין1. טאו מתבטא באופן בלעדי גבוה פרוקריוטים2,3,4. הפונקציה העיקרית של טאו היא לשלוט microtubule הרכבה1,5,6. זה גם תורם פלמור של microtubules7, תחבורה עצב8, שינויים בעצב בקוטר9, היווצרות נירומה קוטביות, הקשורים ניוון מוחיים10. טאו פועלת גם בדומה לפיגום חלבון כדי לשלוט איזה איתות המסלולים. עכברוש המוח מחקרים מראים את טאו הוא נוירון ספציפי, זה בעיקר. רגישה אקסונים11. מכיוון טאו הוא חיוני microtubule הפילמור ופיתוח עצביים, טאו היה שיערו לשחק תפקיד מרכזי בהתפתחות עצב במערכת העצבים המרכזית; השערה זו היה אח כ אומתה על ידי ניסויים במבחנה , ויוו . בנוסף הנוירונים, טאו מתבטא תאים שאינם עצביים שונים, כולל הכבד, הכליה שרירים תאים12,13. טאו, מתבטאת גם אנושי השד, הערמונית, המעי הגס, קיבה, ו סרטן הלבלב תא קווים ורקמות14,15,16,17,18, 19. טאו נמצא גם הכללה-הגוף לומבגו כמו tubulofilaments מעוות הכללה גופות20.
טאו עשוי לבצע מספר שינויים post-translational. של כל השינויים post-translational, זרחון היא הנפוצה ביותר. טאו מוגברת זרחון מקטין את האהדה microtubules, בסופו של דבר יציב את שלד התא. אתרי זירחון 85 תוארו חלבון טאו מבודד ברקמות המוח האנושי מחלת אלצהיימר. האתרים האלה 53% מהווים סרין טראונין 41%, רק 6% טירוזין שאריות21,22,23. טאו זרחון משפיעה על לוקליזציה שלה, פונקציה, איגוד, המסיסות, והרגישות שלו כדי שינויים post-translational אחרים. גם טאו זירחון כדי יותר במידה נורמלית (או רווי לחלוטין עם קבוצות פוספט) המכונה hyperphosphorylation משכפל מאפיינים מבניים ופונקציונליים של מחלת האלצהיימר24. טאו שומר על התפקוד התקין של microtubules עצב ומבטיחה לתפקוד תקין עצביים בתנאים פיזיולוגיים. עם זאת, טאו hyperphosphorylated מצליח לשמור על איגוד microtubule מאורגן היטב, גרימת הפסד עצביים בגלל microtubule פירוק. רמות נורמליות של טאו זרחון נדרשים עבור טאו תקין בתפקוד, אך טאו לא יצליח לתפקד באופן נורמלי, אם רמת זירחון האופייני שלו היא שונה, ואם זה hyperphosphorylated25. מחלת אלצהיימר, הפרעות ניווניות הקשורות לגיל אחרים, טאו הופך hyperphosphorylated, יוצר חוטים לוליינית לזווג בין קשרים neurofibrillary26,27. לכן, שיטות לקביעת טאו זרחון ואיגוד microtubule חשובים.
סרטן המעי הגס, סרטן הקשורים להזדקנות, הוא שהשלישי מרבה אובחן סרטן וסרטן את השלישי בולטים גורמי המוות עבור גברים ונשים כאחד28. סרטן המעי הגס הוא אחד של סרטן סיבת המוות העיקרית העולם המערבי29. כי סרטן המעי הגס וגם מחלת אלצהיימר קשורים עם ההזדקנות ובמקרה שניהם בעיקר במדינות המפותחות בה אנשים נהנים הרגלי התזונה דומה, ייתכן ושתי המחלות איכשהו בקורלציה. בנוסף, תאים סרטניים טאו-חיוביים ושליליים -טאו להגיב באופן שונה על סוכנים כימותרפיות, למשל, פקליטקסל16.
כורכומין הוא אחד נגזרות הראשי של כורכום longa, כורכום תבלין הודי30. במשך מאות שנים, אוכלוסיות בדרום אסיה יש לצרוך כורכום בדיאטה שלהם על בסיס יומי. כורכומין משמש לטיפול במחלות שונות, כולל סרטן המעי הגס, מחלת אלצהיימר, סוכרת, סיסטיק פיברוזיס, מחלות מעי דלקתיות, דלקת פרקים, היפרליפידמיה, טרשת עורקים, מחלת לב איסכמית31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. ליתיום יכול גם להרוג תאים סרטן המעי הגס או למנוע את התפשטות39. ליתיום יכול לשמש גם לטיפול מחלת אלצהיימר40 כפי שהוא מקטין צבירת טאו מונע hyperphosphorylation שלה, כפי שנצפתה על העכבר הטרנסגניים דגם41,42,43, 44.
כתב יד זה שואף: 1) למדוד את טאו הכולל ואת רמות ביטוי פוספו-טאו בתאים שטופלו; 2) לתאר וזמינותו פוספטאז למדוד זרחון טאו הכללית; 3) לבחון microtubule-איגוד של טאו; . ו-4) בתרגום טאו מאת מיקרוסקופיה קונפוקלית בשורות תאים סרטן המעי הגס, מטופלים עם כורכומין או LiCl. תוצאות חושפים כי טיפול תאי עם כורכומין, אשר הוא סוכן טוב כביכול כימותרפיות לסרטן המעי הגס, טיפול עם LiCl יכול להפחית את הביטוי של טאו הכולל שני, phosphorylated טאו בשורות תאים סרטן המעי הגס. טיפולים אלה יכול גם לגרום רוברטסונית הגרעין של טאו. עם זאת, באופן בלתי צפוי, כורכומין נכשל לשפר את הכריכה של טאו כדי microtubules.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנה של ריאגנטים
µL- µL להוסיף 10 בפתרון פלואוריד phenylmethylsulfonyl (1 מ מ), 10 (1 x 100 x מניות) של פתרון קוקטייל של מעכבי פרוטאז, µL 10 (1 x 100 x מניות) של פוספטאז פתרון קוקטייל מעכב 1 מ"ל 1 x radioimmunoprecipitation assay (ריפה) המאגר כדי להכין מאגר שלם של פירוק ריפה.
- הכן 10 x טובולין כללי מאגר (PEM) מאגר.
- הוסף 800 מ מ (6.0474 g) piperazine-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic חומצה 10 מ מ (95.1 מ ג) אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic חומצה, 10 מ מ (51 מ ג) MgCl 2 ו- 1.25 מ' (3 מ"ל של 10 מ') NaOH בשפופרת 50-mL , לערבב עם מים מזוקקים 15 מ"ל, לפזר על-ידי שימוש מערבולת. בדוק את ה-pH (צריך להיות 6.9). אם ה-pH > 6.9, לבטל את המאגר, מהדורה מחודשת הרבה טריים.
הערה: NaOH צריך להיות מתחת 1.25 מ' כדי להבטיח שאת ה-pH לא להחטיא 6.9. לא מומלץ להשתמש HCl להתאמת pH > 6.9. - הוסף NaOH dropwise עד ה-pH הוא 6.9. להוסיף מים מזוקקים כדי להפוך עד 25 מ של מאגר X PEM 10. לבסוף, לסנן באמצעות מזרק ומסנן מזרק 0.2 µm. לחלק את המאגר aliquots 1.5 mL צינורות ולאחסן ב-4 מעלות צלזיוס
- הוסף 800 מ מ (6.0474 g) piperazine-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic חומצה 10 מ מ (95.1 מ ג) אתילן גליקול-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic חומצה, 10 מ מ (51 מ ג) MgCl 2 ו- 1.25 מ' (3 מ"ל של 10 מ') NaOH בשפופרת 50-mL , לערבב עם מים מזוקקים 15 מ"ל, לפזר על-ידי שימוש מערבולת. בדוק את ה-pH (צריך להיות 6.9). אם ה-pH > 6.9, לבטל את המאגר, מהדורה מחודשת הרבה טריים.
- הכן 5 x מדגם מאגר עם הסוכן צמצום וצבע.
µL
- מיקס 300 (60 מ מ) של 1 מ' טריס-HCl (pH 6.8), 2.5 מ ל (25%) של 50% גליצרול, 1 מ"ל (2%) של 10% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) ומים 1.2 מ"ל מזוקקים כדי לפצות 5 מיליליטר 5 x מרחביות דוגמת המאגר. חנות − 20 ° C
הערה: מכיוון גליצרול צמיגה, מדידת 1.25 mL גליצרול קשה. ML אחת של גליצרול 100% שוקל גרם 1.26. לפיכך, שוקל גרם 1.575 של 100% גליצרול (אשר שווה ל- mL 1.25 של 100% או 2.5 מ של גליצרול 50%) ב 15 מ"ל צינור ראשון; מערבבים היטב עם רכיבים אחרים.
- מיקס 300 (60 מ מ) של 1 מ' טריס-HCl (pH 6.8), 2.5 מ ל (25%) של 50% גליצרול, 1 מ"ל (2%) של 10% dodecyl נתרן גופרתי (מרחביות) ומים 1.2 מ"ל מזוקקים כדי לפצות 5 מיליליטר 5 x מרחביות דוגמת המאגר. חנות − 20 ° C
2. תא תרבות, וטיפול עם כורכומין או טיפול LiCl, בדיקה של ביטוי חלבון
- הוסף ~ 1 x 10 תאים 6 של HCT 116 לתוך 100 מ מראגנטים מנות המכיל את המינימום חיוני מדיה (MEM) בתוספת 10% שור עוברית סרום (FBS), 1% פניצילין-סטרפטומיצין. אחרי יום אחד של culturing, תאים יגיעו למפגש 60-70%-
הערה: מספר לוחות הדרושים תלוי מספר הטיפולים המתוארים להלן. - כאשר תאים להגיע למפגש ~ 65% (לקרב את ערכיהן באמצעות מיקרוסקופ), להסיר את המדיום MEM שיושלם ולהוסיף ללא סרום MEM עם 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, ו 30 מיקרומטר כורכומין או 25 מ מ, 50 מ מ 100 מ מ LiCl. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 24 שעות ביממה באווירה humidified, המכילה 5% CO 2.
- 24 שעות לאחר הטיפול, לשטוף את התאים עם 1 מ"ל כקרח באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS), לגרד את התאים באמצעות המגרד של התא. העברת התאים שרוטים 1.5 mL צנטריפוגה צינורות, צנטריפוגה במשך 4 דקות ב- 1,800 x g ב- 4 ° C כדי להשיג כדורי תא.
- Lyse התאים על ידי השעיית כדורי ב- 100 µL מאגר ריפה מלאה ב 4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות בעת ההקשה באופן קבוע הצינורות. Sonicate את הדגימות בקצרה.
- Centrifuge את homogenates תא ומפרידה benchtop ב 22,570 x g למשך 20 דקות ב- 4 מעלות צלזיוס. להעביר את supernatants אחרים צינורות עם תוויות באמצעות פיפטה של.
- למדוד ריכוז חלבון ב supernatants על ידי שיטת ברדפורד 45 באמצעות ערכות מסחריות-שיטת.
- הכן דוגמאות ריכוז חלבון שווה (10 µg חלבון/13 µL לדוגמה) של תאים lysates עם 4 X מרחביות ג'ל-טעינת מאגר. מוכן 4 x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר טריים המכילים 400 מ dithiothreitol (DTT).
הערה: בשלב זה, דוגמאות שניתן לאחסן ב − 20 ° C במידת הצורך. - Incubate הדגימות על גוש חום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לערבב את הדגימות באמצעות מערבולת, לחכות כדי לקרר אותם עבור ~ 10-15 דקות
- להרכיב מערכת אלקטרופורזה.
- µG 10 עומס חלבון (דוגמה µL 13) ליום טוב-10% מרחביות-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד). לטעון את הסולם משקל מולקולרי על גבי הג'ל ליין אחד.
הערה: כפי אלקטרופורזה מתחיל, הסולם חלבון יפתור לתוך להקות חלבון של משקולות מולקולרית נראית לעין. להשתמש הלהקות האלה כדי לאמוד את המשקולות מולקולרית של להקות חלבון לא ידוע. - לאחר טעינת הדגימות, חיבור האלקטרודות חיוביים ושליליים של מערכת אלקטרופורזה למקור כוח לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל להעביר את דגימות חלבון בג'ל הערימה לתוך הג'ל פתרון 70 V עבור 20 דקות. לאחר מכן, תגביר את המתח ל 125 V כ 70-120 דקות עד הסולם חלבון ודוגמאות להגיע לסוף של הג'ל.
- לאחר השלמת אלקטרופורזה, להעביר את הג'ל קרום difluoride (PVDF) polyvinylidene באמצעות מערכת electroblotting רטוב. העברת ~ 100 דקות ב-100 נ' בלוק הקרום במאגר חסימה 4% אלבומין שור (BSA), במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר בסביבות 25 מעלות צלזיוס
- µG 10 עומס חלבון (דוגמה µL 13) ליום טוב-10% מרחביות-לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (מרחביות-עמוד). לטעון את הסולם משקל מולקולרי על גבי הג'ל ליין אחד.
- לסמן את האבן החשופה על ידי חיתוך זה בצד עם הסולם משקל מולקולרי. להשתמש סדין פלסטיק שקוף וחותך חדה חותכים את האבן החשופה. להכין את הפתרונות ראשי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:5, 000; אנטי-פוספו-טאו-1:4, 000), דגירה את האבן החשופה בפתרון זה ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- לאחר דגירה לילה, לשטוף את האבן החשופה למשך 7 דקות ארבע פעמים בפתרון באגירה פוספט תמיסת מלח-Tween-20 (PBST).
- להכין את הפתרונות משנית-נוגדן הרלוונטיים (ארנב נגד עז או העכבר אנטי איג-1:5, 000), דגירה את האבן החשופה בפתרון זה במשך 90 דקות בטמפרטורת החדר כ-25 מעלות צלזיוס. לרחוץ PBST ארבע פעמים, 7 דקות כל אחד.
- לפתח את האבן החשופה באמצעות ערכת chemiluminescence על פי היצרן ' s המלצות. מכסים את האבן החשופה באמצעות ללאפה פלסטיק שקוף. לרכוש תמונות על-ידי chemiluminescence מערכת עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטי הדמיה-
3. פוספטאז Assay
- לפנק את lysates תא (מתוך שלב 2.5) עם phosphatase אלקליין המאגר phosphatase אלקליין.
- עבור שניהם לשלוט ולהכין דגימות שטופלו, 20 µL דוגמיות המכילה חלבון הכולל 20 µg. הוסף את עוצמת הקול של lysates תא המכיל 20 חלבון הכולל µg, ואחריו 2 מאגר phosphatase אלקליין µL, phosphatase אלקליין 10 µL. להוסיף מים מזוקקים כדי לפצות 20 µL-
- דגירה בדגימות ב 37 ° C עבור ה 1 להפסיק את התגובה על ידי הוספת חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ריכוז סופי של 50 מ מ, או על-ידי הוספת orthovanadate נתרן (Na 3 VO 4)-ריכוז סופי של 10 מ מ. גם ניתן לעצור את התגובה על ידי חימום ב 75 מעלות צלזיוס במשך 5 דק
- לפני הדגירה של דגימות עם פוספטאז מסיים, הכנת דוגמאות של ריכוז זהה ללא הוספת פוספטאז להשוואה עם דגימות שטופלו פוספטאז.
- הוסף 4 שזה עתה הוכנו X מרחביות ג'ל-טעינת מאגר המכיל 400 מ DTT.
- דגירה בדגימות על גוש חום ב 100 מעלות צלזיוס במשך 5 דק לערבב הדגימות באמצעות מערבולת. מגניב בטמפרטורת החדר במשך ~ 10-15 דקות
- להרכיב מערכת אלקטרופורזה להפעלת ג'ל לזיהוי 10% על ידי עמודים מרחביות.
- µG 10 עומס חלבון (דוגמה µL 13) ליום טוב על polyacry 10%lamide ג'ל. לטעון את הסולם משקל מולקולרי.
- לאחר טעינה הדגימה, חיבור האלקטרודות חיוביים ושליליים של מערכת אלקטרופורזה למקור כוח לשמור על מתח קבוע. בתחילה, התחל להעביר את דגימות חלבון בג'ל הערימה לתוך הג'ל פתרון 70 V עבור 20 דקות. לאחר מכן, תגביר את המתח ל 125 V ולהפעיל את הג'ל כ- 70-120 דקות עד הסולם חלבון ודוגמאות להגיע לסוף של הג'ל.
- לאחר השלמת אלקטרופורזה, להעביר את הג'ל על גבי קרום PVDF באמצעות מערכת electroblotting רטוב. העברת ~ 100 דקות ב-100 נ'
- לסמן את האבן החשופה על-ידי הפיכת קטן חתוך בצד הסולם משקל מולקולרי. להשתמש סדין פלסטיק שקוף וחותך חדה חותכים את האבן החשופה.
- לחסום את הקרום במאגר 4% BSA חסימה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר.
- דגירה את האבן החשופה בפתרון הראשי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:5, 000) ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף את האבן החשופה ב PBST ארבע פעמים, במשך 7 דקות כל אחד.
- להכין את הפתרון משנית-נוגדן הרלוונטיים (עז אנטי עכבר IgG-1:5, 000), דגירה את האבן החשופה למשך 90 דקות בטמפרטורת החדר. לכבס במים PBST ארבע פעמים, במשך 7 דקות כל אחד.
- לפתח את האבן החשופה באמצעות ערכת chemiluminescence על פי היצרן ' s המלצות. מכסים את האבן החשופה בתוך ללאפה פלסטיק שקוף. לרכוש תמונות על-ידי chemiluminescence מערכת עבור chemiluminescence עם תוכנה רלוונטי הדמיה-
4. מחייב microtubule Assay
- עבור microtubule איגוד וזמינותו, חזור על השלבים 2.1-2.6.
- הכן 1 X (2 מ"ל) PEM מאגר מהמאגר X PEM 10 מאוחסן ב 4 ° C על-ידי הוספת 20 מיקרומטר (40 µL) פקליטקסל ל GTP (20 µL) 1 מ מ. . קח microtubule מניות (MT) מ − מקפיא 80 ° C ו- e. coli טאו עובד המניה מ − מקפיא 20 ° C.
- הכין דוגמיות לפי טבלה 1-
- דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות Ultracentrifuge 25 ° c עבור 60 דקות ב 100,000 x g.
- µL 120 העברה של supernatants המכילה לא מאוגדים טאו, לנקות ומתויגים צינורות.
- µL להוסיף 120 (באותו אמצעי אחסון כמו תגובת שיקוע) של 5 X לטעום המאגר כדי בגדר המכיל טאו מאוגד ומערבבים ביסודיות. העברת הפתרון כדי לנקות צינורות שכותרתו ומערבבים היטב.
- מודדים את ריכוז חלבון (ראה שלב 2.6).
הערה: בעת הכנת דוגמאות, להשתמש באמצעי האחסון של פתרון (שלב 4.6) עבור הכנת דוגמאות צניפה והן תגובת שיקוע. - הכין דוגמיות של ריכוז החלבון המקביל ולהוסיף 4 שזה עתה הוכנו x מרחביות ג'ל-טעינת מאגר המכיל DTT (400 מ מ)-
הערה: הדוגמאות שניתן לאחסן ב − 20 ° C בשלב זה. - חזור על השלבים 3.5-3.10.
| מדגם | שם | Microtubule הדרושים | ראשי חלבון הדרוש | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | של HCT 116-Control (6.21 μg/μl) | 2 μl | 9.66 μl (60 μg) | 108.34 μl | ||||
| 2 | μM 116-כורכומין 10 של HCT (4.81 μg/μl) | 2 μl | 16.63 μl (80 μg) | 101.37 μl | ||||
| 3 | של HCT 116-כורכומין 20 μM (3.28 μg/μl) | 2 μl | μl 30.49 (100 μg) | 87.51 μl | ||||
| 4 | של HCT 116-LiCl 25 מ מ (5.43 μg/μl) | 18.42 μl (100 μg) | 2 μl | 99.58 μl | ||||
| 5 | טאו e. coli | 2 μl | 1 μl טאו-352 | 117 μl | ||||
| 6 | MT רק | 2 μl | X | 118 μl | ||||
| < td colspan = " 2"> | 120 μl | |||||||
טבלה 1: לטעום הכנה microtubule-איגוד וזמינותו.
5. לוקליזציה, ביטוי של טאו לאחר טיפול של תאים עם כורכומין
- coverslip באמצעות אתנול 70% יבש ונקי בעזרת טישו מעבדה. הכנס coverslip יחיד של כל טוב של צלחת שכותרתו 6-ובכן-תרביות רקמה. מניחים את הצלחת על בטיחות ביולוגית ארון ולעבור על אולטרה אור במשך לפחות 3 ח'
- תת-תרבות התאים ואת הזרעים אותם לתוך הבארות הרלוונטיים של צלחת 6-ובכן-2.5 x 10 5 תאים/היטב במדיום תרבות מומלצים-
- לאחר ~ 24 h, לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ הפוכה באמצעות ה-10 X והן מטרות X 40 כדי לבדוק שינויים מורפולוגיים הסלולר. להקליט תמונות אם יש צורך.
- לשטוף את התאים פעמיים באמצעות PBS. לתקן את התאים בפורמלין 3.7% בחממה 37 ° C בחושך.
הערה: קיבוע באמצעות פורמלין בטמפרטורת החדר, גם עובד. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים בעת טיפול פורמלדהיד. - לרחוץ את התאים ב- PBS. לתקן תאים מתנול כקרח-− 20 ° C במשך 15 דקות Permeabilize התאים על ידי המקננת בהם BSA 3% ו- 0.1% X-100 Triton ב- PBS בקרח במשך 10 דקות לשטוף את התאים עם PBS.
- דגירה התאים במאגר חסימה (BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 בפתרון PBS) לשעה בטמפרטורת החדר.
הערה: הדגירה עבור 2 h ב 4 ° C, גם עובד. - להכין את הפתרון העיקרי-נוגדנים (אנטי-טאו-1:200) BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 ב- PBS (למשל, 2 µL טאו-13 נוגדן במאגר 0.4 mL).
- לחתוך חתיכות קטנות של PVDF ממברנה כך החלקים התאימו כראוי בתוך כל טוב של צלחת 6-טוב; להשרות אותם במים למשך 5 דק מקום החתך PVDF היטב לכל.
- µL להוסיף 60 נוגדן ראשוני לפתרון החתך PVDF חתיכות מכל קידוח. מניחים את coverslips כך התאים יכולה לגעת הפתרון העיקרי-נוגדן. דגירה ב 4 ° C בחדר חשוך, לח בין לילה. לרחוץ ב- PBS ארבע פעמים.
- להכין את הפתרון המשני-נוגדנים (fluorescein מצומדת 594 אנטי עכבר IgG-1:400) BSA 3% ו- 0.1% Tween-20 ב- PBS.
- לחתוך חתיכות קטנות של קרום PVDF כך החלקים שיתאים כראוי כל טוב של צלחת 6-ובכן, להשרות אותם במים למשך 5 דק מקום החתך PVDF היטב לכל.
- 80 להוסיף µL של הפתרון המשני-נוגדן כל אחד מהחלקים PVDF בצלחת 6-. טוב. מניחים את coverslip כך התאים יכולה לגעת הפתרון המשני-נוגדן. דגירה בחדר חשוך, לחים בטמפרטורת החדר במשך 2 ח' לשטוף עם PBS ארבע פעמים.
- הר דגימות במדיום הרכבה עם 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) ולקבוע coverslips בשקופיות זכוכית-
- הוסף אחד טיפה של המדיום הרכבה עם דאפי בשקופיות זכוכית. הסר את coverslips מכל קידוח ומניחים בשקופיות זכוכית המכיל המדיום הרכבה עם דאפי. להבטיח כי פני השטח של כל coverslip המכיל תאים מוכתם נוגע אני הולך לשחקטינג בינוני בשקופית זכוכית המתאים.
- החל לק לציפורניים מסביב לכל coverslip חותם ולתקן אותם אטום בשקופיות זכוכית. במידת הצורך, לבצע שלב זה פעמיים.
- Incubate עבור h 1.5 בטמפרטורת החדר בחדר חשוך.
- לבחון את השקופיות בעזרת מיקרוסקופ קונפוקלי באמצעות טבילה שמן coverslip בחדר חשוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביטוי הכולל טאו טאו פוספו נבדקה לאחר טיפול תאי עם ריכוזים שונים של כורכומין או LiCl (איור 1). טיפול של תאים עם שלושה ריכוזים שונים של כורכומין ירד טאו רמות הביטוי; עם זאת, הביטוי פוספו-טאו מוגברת בעת טיפול עם ריכוז נמוך של כורכומין אך ירד על טיפול תאים עם ריכוז גבוה של כורכומין. אנטי-פוספו-טאו (Ser396) שימש לצורך זיהוי של פוספו-טאו. רמות של טאו הכולל והן פוספו-טאו ירד על הטיפול של התאים עם שלושה ריכוזים שונים של LiCl (איור 1). מחקרים קודמים הראו כי רמות הביטוי טאו לגוון בסוגי סרטן שונים באתרים שונים של סוגי סרטן אותו. הנתונים הקודמים על סרטן המעי הגס הראו שאת טאו בא לידי שתי שורות תאים (של HCT 116 ו- SW480) של סרטן המעי הגס וגם היו phosphorylated19. רמות פוספו-טאו תאים שטופלו 5 מיקרומטר כורכומין היו גבוהים מאלה בתאים אינו מטופל. רמות פוספו-טאו היו גבוהים יותר מאשר טאו הכולל תאים שטופלו ריכוז זהה של כורכומין. טיפול של תאים עם 10 מיקרומטר כורכומין ירד פוספו-טאו רמות לעומת תאים ללא טיפול אך הביטוי פוספו-טאו טאו עדיין יותר הכולל רמות הביטוי. טיפול של תאים עם 30 מיקרומטר כורכומין הוריד פוספו-טאו ביטוי לעומת פוספו-טאו תאים ללא טיפול, טאו הכולל רמות לאותם תאים שטופלו.
כתב יד זה הקים פרוטוקול קל להערכת המצב זירחון של טאו על ידי וזמינותו פוספטאז (איור 2). בעקבות הטיפול כורכומין, זרחון טאו הכללית לא השתנה באופן משמעותי, זרחון על שאריות חומצה אמינית ספציפית היה משמעותי (איור 1). בסך הכל טאו זרחון הופסק תאים שטופלו LiCl לעומת תאים ללא טיפול. דגימות שטופלו פוספטאז electrophoresed מהר יותר דגימות לא מטופל, וידוא כי דגימות לא מטופל היו hyperphosphorylated יותר מאשר הדגימות שטופלו פוספטאז. תאים שטופלו כורכומין הראה כמעט את אותן תוצאות, המציין כי הטיפול של שורות תאים סרטן המעי הגס לא להפחית טאו זרחון כמוצג באיור1. דגימות שטופלו פוספטאז והן לא מטופלת electrophoresed-כמעט אותו טווח בדגימות של תאים שטופלו LiCl, המציין את זרחון טאו בתאים אלה היה מופחת (איור 2). . הנה, ריכוזים גבוהים (מיקרומטר 20 או 30 מיקרומטר) של דגימות שטופלו כורכומין נלקחו כדי להשוות מצב זרחון הכוללת, כמו ריכוז הטיפול הראה גבוה יותר ספציפי לאתר זרחון התגלה על ידי נוגדנים ספציפיים פוספו-טאו (S396).
יתר על כן, במעבדה, microtubule איגוד וזמינותו של דגימות תאים הוקמה בהצלחה באמצעות טאו-352 בקרה חיובית, רק MT כפקד שלילי (איור 3). כורכומין וגם טיפול LiCl, מחייב microtubule פעילות היה עכבות, כפי שמגלה microtubule איגוד וזמינותו. בניסוי זה, טיפול כורכומין לא הראה microtubule מחייב יכולות אבל עכבות האיגוד דומה46,הקודם מחקרים47, ואילו זה היה יעיל לעכב זרחון טאו בייעודי לאתר- ריכוז גבוה יותר. איור 1, 10 מיקרומטר כורכומין הטיפול הביא בביטוי מינימלי של פוספו-טאו לעומת שליטה אך ביטוי גבוה יותר מאשר סך טאו. עם זאת, מחייב microtubule קיבולת של סרטן המעי הגס טאו לאחר הטיפול כורכומין, כמו גם ריכוז נמוך של טיפול LiCl היה ירד במדגם שאינו מטופל. טאו בייעודי לאתר זרחון אפקטים microtubule האיגוד לבין צבירת עצמית48. טאו זרחון על אזור עשיר פרולין המניע microtubule מחייב מאפיינים בעוד אזור C-מסוף גדל מאפיינים אלה, ולאחר שני האזורים יחד עם אזור MT-איגוד פחת תכונותיו איגוד בכ-70%, מגרה microtubules48. כמה גורמים אחרים, כמו גם אחרים זרחון בייעודי לאתר של טאו יכול להיות מעורב עבור זו הקשורה microtubule של סרטן המעי הגס טאו שטופלו כורכומין או LiCl.
פרוטוקול ישיר באמצעות כמויות קטנות של נוגדנים ראשיות ומשניות לזמין לוקליזציה של טאו בשורות תאים סרטן המעי הגס לאחר הטיפול כורכומין (איור 4). תוצאות המחקר הראו כי טאו היה translocated את הגרעין לאחר הטיפול כורכומין, ממצא דומה מחקרים מוקדמים יותר דיווח טאו הגרעין הזה הוא שחקן מפתח עצביים דנ א הגנה מפני מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר49 ,50.
איור 1: הבעה פוספו-טאו טאו בתאי סרטן המעי הגס בעקבות כורכומין או טיפול LiCl. דוגמאות מופק תאים שליטה או תאים שטופלו במשך 24 שעות ביממה עם שלושה ריכוזים שונים של כורכומין (A) ו- (B) LiCl היו נפתרה ב- 10% לזיהוי ג'לים מאת מרחביות-דף, ובחן עם נוגדן אנטי-טאו או אנטי-פוספו-טאו. Densitometry ניתוח של התוצאות תספיג מוצגים בלוח השמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: בסך הכל זירחון של טאו, מטופל או באופן שונה התייחסו דגימות תאים זוהה על ידי וזמינותו פוספטאז. מסלולים מוזרה להראות שליטה תא תמציות, ואילו מסלולים אפילו להראות פוספטאז טיפול של דגימות שטופלו כורכומין או שטופלו LiCl. פוספטאז הטיפול עשה את הניידות electrophoretic טאו מהר יותר דגימות ללא טיפול, אשר הכילה phosphorylated טאו. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Microtubule קשירה של טאו בתאי סרטן המעי הגס, זוהה על ידי microtubule-איגוד וזמינותו. שליטה של HCT 116 תא דגימות, שטופלו כורכומין, או דגימות שטופלו LiCl תא, e. coli טאו היו מודגרות עם microtubules כמפורט בפרוטוקול סעיף 4. כמויות שוות ערך של תגובת שיקוע (S) ושברים גלולה (P) היו immunoblotted עם נוגדן אנטי-טאו. נתיבי בקרה שלילית המכיל רק MT היו להפעיל כדי לאשר כי MT שלא מכילים כל טאו אנדוגני מאוגד. החלונית התחתונה מציגה ניתוח densitometry של המערב שהכלים של דוגמאות בודדות המאפשר השוואה בין תגובת שיקוע (טאו לא מאוגד) ושברים גלולה (טאו מאוגד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: לוקליזציה של חלבון טאו בחן על ידי מיקרופון קונפוקליroscopy.
טאו מקומית שמעניינת גרעינון בתאי סרטן המעי הגס. לוחות שמאלה הראה לוקליזציה טאו שאותרו באמצעות נוגדנים חד שבטיים של אנטי-טאו ואילו האמצעי מראות גרעין מכתים מאת דאפי. גם מוצגות דוגמאות מייצגות של תאים שטופלו מציג טאו רוברטסונית לתוך הגרעין. תאים שליטה הראה טאו בעיקר סביב ומחוץ הגרעינים, ואילו טאו בתאים טיפול מקומי גם בתוך האטומים. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כתב יד זה הוקמה תנאים פרוצדורליים שונים לגילוי טאו הכולל ואת phosphorylated טאו בתאי סרטן המעי הגס שטופלו כורכומין, LiCl. כדי להעריך את המצב זרחון הכוללת של טאו בדגימות חלבון, תוארה של assay פוספטאז. Assay הזה יכול לשמש באופן פוטנציאלי כדי לבחון את המצב זירחון של כל חלבון.
Assay זו מבוססת על העיקרון phosphorylated חלבון תנועות איטיות יותר למצבו הלא-phosphorylated. Phosphatase אלקליין ומאגר phosphatase אלקליין נמצאים בשימוש בפרוטוקול זה. לאחר הוספת הרכיבים וזמינותו lysates תא, דגימות צריך להיות מודגרות עבור משך אופטימלית מסוים בטמפרטורה מסוימת. לאחר דגירה, דגימות צריכים להיות מבושלים למאגר דגימה מרחביות לעצור את התגובה. בעבר, פרוטוקולים ניסויים שונים אולי שומש כדי להעריך את הכריכה של טאו כדי microtubules. וזמינותו microtubule מחייב המוצג כאן הוא קל לביצוע תוך כולל פקדי חיוביות ושליליות לספק אבטחת איכות באמצעות תגובת שיקוע, גלולה שברים. הפקד שלילי MT בלבד שימש כדי לוודא כי MT אינו מכיל כל טאו אנדוגני מאוגד. בנוסף, טאו אדם טהור-352, טאו microtubule מחייב שימש את הפקד חיובי. כדי להפריד את השבר microtubule מחייב (גלולה) צנטריפוגה האולטרה-מהיר מחייב שבר (supernatant) שימש; הליך זה יכול להיות מגבלה כי כזה ultracentrifuge הוא יקר ולא לא זמין נרחב. בנוסף, בגלל כמויות נמוכות של דגימות בשימוש, ארוך, דק צנטריפוגה צינורות עם מתאמים נחוצים לשימוש הרוטור ultracentrifuge. למרות שזה אפשרי לשימוש מחדש צינורות כזה, לשימוש יחיד מומלץ כדי למנוע זיהום צולב. לבסוף, יתרון של פרוטוקול טאו-לוקליזציה היא כי יש צורך כמויות קטנות בלבד של נוגדנים ראשיים ומשניים. לאחר קיבוע permeabilization, חסימת כנצרות תאים כדי coverslips, טיפה קטנה של נוגדן היה שהופקדו על חתיכה קטנה של PVDF, אשר הונחה. אז בתוך הבארות של צלחת 6-. טוב. Coverslips הוחזקו כזה הנוגדן יכול לגשת התאים. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן למזער את כמות נוגדנים בשימוש.
כמה אמצעי יש לשמור בראש כדי להבטיח תוצאות לכימות ואמין. ראשית, טכניקות aseptic קפדנית צריך לשמש כדי למנוע זיהום של תרביות תאים, תא תמציות. מאגר שלם של פירוק ריפה להכין טרי. פוספטאז וזמינותו, חשוב להרתיח את הדגימות למשך 3 דקות ולהתחיל מרחביות-דף מיד לאחר דגירה של דגימות שטופלו פוספטאז ולא טופלו. טאו-352 צריך להיות מחולק aliquots קטנה שמרה על הקרח לאחר הסרת מהמקפיא ° C −20, שהופקדו בחזרה למקפיא מיד לאחר השימוש. לאחר ההסרה של −80 ° C, MT מניות יש לשמור על קרח, אם לעשות שימוש חוזר בתוך 72 שעות; אחרת, לשמור אותם בטמפרטורת החדר. צריך להיות מוכן המאגר PEM כמו סימן x 10 מרוכזים פתרון כי המאגר 1 x צריך להיות טריות כאשר GTP ופקליטקסל נוספים.
טאו פונקציות מוסדרים על פי מידת זרחון שלה. טאו hyperphosphorylation אינה מתרחשת מוח מבוגרים נורמלי טאו הדומה טאו-352, אשר שימש שליטה חיובית microtubule-איגוד וזמינותו. עם זאת, טאו hyperphosphorylation מתרחשת מחלות ניווניות. פרוטוקול זה ותוצאות הבאים מדגימים כי שורות תאים סרטן המעי הגס האנושי לבצע גם טאו phosphorylated באופן דומה לזה במוח מחלת אלצהיימר. טיפול עם כורכומין במינון גבוה במיוחד LiCl באפשרותך למזער טאו זירחון. לפיכך, מתאם טוב בין מחלות ניווניות כגון מחלת אלצהיימר, סרטן המעי הגס יכול להתקיים לגבי hyperphosphorylation טאו, כורכומין או LiCl יכול לשמש לטיפול סרטן המעי הגס וגם מחלת אלצהיימר. לבסוף, לומד טאו זרחון ואיגוד microtubule טאו רלוונטי באופן משמעותי לא רק עבור מחלות ניווניות אלא גם עבור חלק chemotherapeutics כי סוכני שינוי איגוד microtubule טאו נלמדים באופן דינמי כמו סרטן הרפוי51. הפרוטוקולים המובאת כאן יעזור פוטנציאל בגילוי ופיתוח של סוכני טיפולית חדשה לטיפול tauopathies שונים של סרטן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם כלום לחשוף.
Acknowledgments
מחקר זה בוצע כפי חלק מהפרוייקט שכותרתו 'פיתוח ו ה תיעוש של חומרי גלם קוסמטיים ערך גבוה מ microalgae ימית', ממומן על ידי משרד של אוקיינוסים, חלוצת, קוריאה, נתמך על ידי מענק מגזר (2Z04930) ממוסד KIST Gangneung של מוצרים טבעיים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
