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Biochemistry

인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932

Summary

이 원고는 타우 hyperphosphorylation, 타우에 바인딩 microtubules, 및 약물 치료에 따라 세포내의 지역화를 측정을 측정 하기 위한 표준 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 프로토콜은 약물 또는 다른 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩 대상 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다.

Abstract

Microtubule 관련 단백질 타우 주로 축 삭에서 localizes 신경 단백질 이다. 일반적으로 타우 그것은 microtubule 어셈블리 및 안정화에 관여 하기 때문에 정상적인 신경 기능을 위해 필수적 이다.입니다. 뉴런, 게다가 타우 인간 유 방, 전립선, 위, 대 장, 췌 장의 암 거의 비슷한 구조를 보여줍니다 하 고 신경 타우로 유사한 기능을 발휘 하는 있는으로 표현 된다. 타우와의 인 산화의 금액 microtubules, 안정제로 서의 기능을 변경 하 고 다른 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병 등에서 쌍을 이루는 나선형 필 라 멘 트의 발전으로 이어질 수 있습니다. 타우와 microtubule 바인딩 특성의 인 산화 상태를 결정 하는 것이 중요 합니다. 또한, 검사의 세포내 지역화 다른 질병에서 중요 하다. 이 원고 내용 표준 프로토콜 타우 인 산화 및 대 장 암 세포 또는 curcumin와 LiCl 치료 없이 microtubules 타우 바인딩을 측정. 이러한 치료는 암 세포 증식 및 개발을 중지 사용할 수 있습니다. 세포내 지역화의 낮은 양의 항 체를 사용 하는 동안 immunohistochemistry 그리고 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 검사 합니다. 이 분석 실험 화합물 타우 hyperphosphorylation 또는 microtubule 바인딩에 영향을 주는 심사에 대 한 반복적으로 사용할 수 있습니다. 다른 tauopathies에 대 한 새로운 치료제 사용 또는 관련된 항 암 에이전트 나타낼 수 있다 잠재적으로 이러한 프로토콜을 사용 하 여.

Introduction

타우 원래 공동 tubulin1순화 했다 열 안정 microtubule 관련 단백질으로 확인 되었다. 타우는 높은 진핵생물2,,34에 독점적으로 표현 된다. 주요 기능 microtubule 어셈블리1,,56을 제어 하는 것입니다. 그것은 또한 합 microtubules7, axonal 전송8, axonal 직경9에 변화, 싱 경종 극성과 neurodegeneration10의 형성에 기여 한다. 타우는 또한 일부 신호 경로 제어 하는 단백질 비 계 역할을 합니다. 쥐 뇌 연구 제안 그 타우는 신경 및 그것은 주로 축 삭11에서 localizes. 타우 중앙 신경; axonal 개발에 중요 한 역할을 가상 했다 타우 microtubule 중 합 및 신경 발달에 필수적 이므로, 이 가설이 나중에 이었다 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험에 의해 확인. 신경, 외에도 타우 다른 비 신경 세포, 간, 신장 및 근육 세포12,13를 포함 하 여 표현 됩니다. 타우는 표현 또한 인간의 유 방, 전립선, 대 장, 위, 및 췌장암 세포 라인 조직14,15,16,17,18, 19. 타우 또한 포함 시체20꼬인된 tubulofilaments로 포함-몸 근육에서 발견.

타우는 몇 가지 포스트 번역 상 수정을 있습니다. 모든 포스트 번역 상 수정의 인 산화는 가장 일반적입니다. 증가 타우 인 산화 microtubules, 마지막으로 골격을 불안정에 대 한 선호도 감소 합니다. 85 인 산화 사이트 타우 단백질 Alzheimer의 질병이 인간의 뇌 조직에서 분리에 설명 했습니다. 이 사이트의 53% 구성 떠들고, 41% 트레오닌, 유일한 6% 티로신 잔류물21,,2223입니다. 타우 인 산화의 현지화, 기능, 바인딩, 가용성, 및 다른 포스트 번역 상 수정에의 민감성에 영향을 줍니다. 정상 범위 보다도 타우 인 산화 (또는 인산 염 그룹으로 채도가) 알 츠 하이 머 병24의 구조 및 기능적인 특성을 복제 하는 hyperphosphorylation로 알려져 있다. 타우 axonal microtubules의 적절 한 작동 하 고 생리 적 조건 하에서 정상적인 신경 기능을 보장 합니다. 그러나, hyperphosphorylated 타우 microtubule 해체 때문에 신경 손실의 원인이 조직적된 microtubule 바인딩을 유지 하기 위해 실패 합니다. 타우 인 산화의 정상 수준 기능, 적절 한 타우 필요 하지만 타우의 특성 인 산화 수준을 변경 하는 경우 및 경우 hyperphosphorylated25정상적으로 작동 하는 데 실패. Alzheimer의 질병 그리고 다른 나이 관련 된 신경 장애, 타우 hyperphosphorylated 되 고 형성 하는 대응된 나선형 필 라 멘 트 및 neurofibrillary tangles26,27. 따라서, 타우 인 산화 및 microtubule 바인딩 결정 하는 방법 중요 하다.

대 장 암, 암, 노화 관련 된 세 번째는 가장 자주 암과 세 번째 눈에 띄는 죽음을 일으키는 남성, 여성 모두28암 진단 이다. 대 장 암 서방 세계29주요 사망 원인 암 중 하나입니다. 대 장 암과 Alzheimer의 질병 노화와 관련 된 둘 다 사람들이 비슷한 식습관을 즐길 있는 선진국에서 주로 발생 하기 때문에, 두 질병 어떻게든 상관 될 수 있습니다. 또한, 타우 양수와 음수가 타우 암 세포는 화학요법 대리인, 예를 들면, paclitaxel16에 다르게 응답.

Curcumin은 longa 되더라도, 인도 향미료 심 황30의 주요 파생 상품 중 하나입니다. 수세기 동안, 남쪽 아시아 인구는 매일 그들의 규정식에 있는 심 황을 소모 하 고. Curcumin는 대 장 암, Alzheimer의 질병, 당뇨병, 낭 성 섬유 증, 염증 성 장 질환, 관절염, 혈, 동맥 경화 증 및 허 혈 성 심장 질환31, 등 다른 질병을 치료 하는 데 사용 됩니다. 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. 리튬 또한 대 장 암 세포를 죽 일 수 있다 또는39그들의 확산 방지. Alzheimer의 질병40 타우 집계를 감소 하 고 유전자 변형 마우스 모델41,,4243에 관측 된 그것의 hyperphosphorylation를 방지 치료를 위한 리튬을 사용하실 수 있습니다. 44.

이 원고를 목표로: 1) 총 타우 및 치료 세포; 인 타우 식 레벨 측정 2) 측정 전체 타우 인 산화; 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 3) 검사의; microtubule 바인딩 그리고 4) 타우 confocal 현미경 검사 법 대 장 암 세포 라인 curcumin와 LiCl 치료 하 여 지역화. 결과 curcumin와 세포 치료, 대 장 암에 대 한 일 걸 요 좋은 화학요법 에이전트 그리고 LiCl 치료 두 총의 식을 줄일 수 있으며, 대 장 암 세포 라인에 타우 phosphorylated 공개. 이러한 치료의 핵 전 좌를 발생할 수 있습니다. 그러나, 예기치 않게, curcumin microtubules에의 바인딩 개선 실패 합니다.

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Protocol

1. 시 약의 준비

프로 테아 제 억제 물 칵테일 솔루션,
  1. 추가 10 µ L (1 mM) phenylmethylsulfonyl 불 소 솔루션, 10의 µ L (1 x 100 x 사진에서)와 인산 가수분해 효소의 10 µ L (1 x 100 x 사진에서) 완전 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼 준비 1 x radioimmunoprecipitation 분석 결과 (RIPA) 버퍼의 1 mL에 억제 물 칵테일 솔루션.
  2. 준비 10 일반 tubulin 버퍼 (PEM) 버퍼 x.
    1. 추가 800 mM (6.0474 g) piperazine-N-N '-두번째-2-ethanesulfonic 산, 10 m m (95.1 mg) 에틸렌 글리콜-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic 산, 10 m m (51 mg) MgCl 2 및 50 mL 튜브에 1.25 M (10 M 3 mL) NaOH 15 mL 증 류 물으로 혼합 하 고 소용돌이 사용 하 여 해산. PH (6.9 이어야 한다)을 확인 합니다. 만약 pH > 6.9, 버퍼를 삭제 하 고 신선한 많은 리 메이크.
      참고: NaOH를 pH 6.9 오버 슈트 하지 않습니다 보장 하기 위해 1.25 M 미만 이어야 합니다. HCl을 사용 하 여 pH를 조정 하는 권고 하지 않습니다 > 6.9.
    2. 추가 NaOH pH 6.9까지에 dropwise입니다. 증류수 10 X PEM 버퍼의 최대 25 mL을 추가 합니다. 마지막으로, 주사기와 0.2 µ m 주사기 필터를 사용 하 여 필터링 합니다. 1.5 mL 튜브에 aliquots로이 버퍼를 분할 하 고 저장 4 ° c.
  3. 준비 5 환 원제와 염료 샘플 버퍼 x. 1의
    1. 믹스 300 µ L (60 밀리미터) M Tris-HCl (pH 6.8), 50% 글리세롤, 10% 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS), 및 1.2 mL 증 류 물 1 mL (2%)의 2.5 mL (25%) SDS 샘플 버퍼 x 5의 5 mL을 만들기 위해. 에 저장 − 20 ° c.
      참고: 글리세롤 점성 때문에 1.25 mL 측정 글리세롤이 어렵습니다. 100% 글리세롤의 1 mL 1.26 g 무게. 따라서, 100% 글리세롤의 1.575 g의 무게 (는 100%의 1.25 mL 같음 또는 50% 글리세롤의 2.5 mL) 15 mL 튜브. 다른 구성 요소와 잘 혼합.

2. 세포 문화, Curcumin와 치료 또는 LiCl 치료 및 검사의 단백질 표정

  1. 추가 1 ~ 10 6 HCT 116 셀 x 100 m m로 조직 문화 요리는 최소 필수 미디어 (MEM) 10% 태아 소 보충 혈 청 (FBS) 그리고 1% 페니실린-스. 경작의 어느 날, 후 셀 60-70%의 합류를 도달할 것 이다.
    참고: 필요한 격판덮개의 수는 아래에서 설명 하는 치료의 수에 따라 다릅니다.
  2. 셀 ~ 65% 합류 (현미경 검사 법을 사용 하 여 접근)에 도달, MEM 보완 매체를 제거 하 고 혈 청 무료 메모리와 5 µ M, 10 µ M, 그리고 30 µ M curcumin 또는 25 m m, 50mm, 100mm LiCl 추가 하는 때. 포함 된 5% CO 2 습도 분위기에서 24 h 동안 37 ° C에서 품 어.
  3. 치료 후 24 h 1 mL 차가운 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS), 셀 세척 하 고 셀 스 크레이 퍼를 사용 하 여 셀을 다쳤어요. 1.5 mL로 긁힌 것된 셀 튜브 원심과 1800 x g 세포 알갱이를 4 ° C에서 4 분 동안 원심 전송.
  4. 는 정기적으로 튜브를 도청 하는 동안 20 분에 4 ° C에서 완전 한 RIPA 버퍼의 100 µ L에 펠 릿을 일시 중단 하 여 세포를 lyse. 간단히 샘플을 sonicate.
  5. 4 시 20 분에 대 한 22,570 x g에서 벤치탑 원심 분리기에 셀 homogenates 원심 ° c.를 피 펫을 사용 하 여 다른 레이블된 튜브는 supernatants 전송.
  6. 상업 단백질 분석 실험 키트를 사용 하 여 Bradford 분석 결과 45는 supernatants의 단백질 농도 측정.
  7. 4 세포 lysates의 동일한 단백질 농도 (10 µ g 단백질/13 µ L 샘플)의 준비 샘플 X SDS 겔-로딩 버퍼입니다. 4 x 400 m m dithiothreitol (DTT) 포함 된 신선한 SDS 겔-로딩 버퍼 준비.
    참고:이 단계에서 샘플에 저장 될 수 − 필요한 경우 20 ° C.
  8. 품 5 분 100 ° C에서 열 블록에 샘플 소용돌이 사용 하 여 샘플을 혼합 하 고 10 ~ 15에 대 한 그들을 기다리는 분
  9. 어셈블 전기 시스템입니다.
    1. 부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플) 10% SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS 페이지)에 대 한에 잘 당. 로드 한 차선에 젤에 분자 무게 사다리.
      참고: 전기 시작, 단백질 사다리의 명백한 분자 무게 단백질 밴드에 해결 됩니다. 이 밴드를 사용 하 여 알 수 없는 단백질 밴드의 분자 무게를 예측할.
    2. 샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음, 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 약 70-120 분 125 V로 전압을 증가.
    3. 젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 polyvinylidene difluoride (PVDF) 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후 전송. 전송 블록 대 100 ~ 100 분 약 25의 상 온에서 90 분 동안 4% 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 블로킹 버퍼에 막 ° c.
  10. 분자 무게 사다리 옆에 그것을 절단 하 여 오 점 표시. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 절단 오 점. (1:5, 000에서 안티 타우, 안티-인-타우 1:4, 000에서) 1 차 항 체 솔루션을 준비 하 고 하룻밤 4 ° C에서이 솔루션에 오를 품 어.
  11. 하룻밤 부 화 후 7 분 오 점 4 번에에서 씻어 인산 염 버퍼 식 염 수-트윈-20 (PBST) 솔루션.
  12. 관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 안티 토끼 또는 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 4 시간, 7 분 PBST에 약 25 ° C. 세척의 실 온에서 90 분 동안이 솔루션에서 얼룩을 품 어.
  13. 개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 ' s 권고. 투명 한 비닐 포장을 사용 하 여 얼룩을 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.

3. 인산 가수분해 효소 분석 결과

  1. 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼에 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 (2.5 단계)에서 세포 lysates 치료.
    1. 모두 제어 및 치료 샘플, 준비 20 µ L 포함 20 µ g 총 단백질을 샘플링 합니다. 20 µ g 총 단백질, 2 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼 및 10 µ L 알칼리 성 인산 가수분해 효소를 포함 하는 세포 lysates의 볼륨을 추가 합니다. 증류수 20 µ L을 만들기 위해 추가.
  2. 1 h. 50 m m의 최종 농도에 ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)를 추가 하 여 또는 10 m m의 최종 농도에 나트륨 orthovanadate (나 3 VO 4) 추가 하 여 반응을 중지에 대 한 37 ° C에서 샘플을 품 어. 반응 5 분에 75 ° C에 난방에 의해 중지 됩니다 수
  3. 인산 가수분해 효소와 부 화 완료, 전에 인산 가수분해 효소 처리 샘플 비교에 대 한 인산 가수분해 효소를 추가 하지 않고 같은 농도의 샘플을 준비.
  4. 추가 갓된 4 X SDS 겔-로딩 버퍼 400mm DTT를 포함.
  5. 는 소용돌이 사용 하 여 샘플 5 분 믹스 100 ° C에서 열 블록에 샘플을 품 어. 멋진 대 한 실 온에서 ~ 10-15 분
  6. SDS 페이지 10 %polyacrylamide 젤을 실행 하기 위한 전기 영동 시스템 조립.
    1. 10 %polyacry 잘 당 부하 10 µ g 단백질 (13 µ L 샘플)lamide 젤입니다. 분자 무게 사다리 로드.
    2. 샘플을 로드 한 후 일정 한 전압을 유지 하기 위해 전원에 전기 시스템의 긍정 및 부정적인 전극 연결. 처음, 해결 젤으로 겹쳐 쌓이는 젤에서 단백질 견본 이동 70 V 20 분에 시작 합니다. 그런 다음 125 V로 전압을 증가 하 고 약 70-120 분 젤 샘플 및 단백질 사다리 젤의 끝에 도달할 때까지 실행.
    3. 전송 젖은 electroblotting 시스템을 사용 하 여 PVDF 막에 젤 전기 이동 법의 완성 후. 대 100 ~ 100 분에 대 한 전송
    4. 분자 무게 사다리에 잘라 작은 함으로써 오 점을 표시 합니다. 투명 한 플라스틱 시트와 날카로운 커터를 사용 하 여 오 점 절단.
  7. 실 온에서 90 분 동안 4 %BSA 블로킹 버퍼에 막 차단.
  8. 하룻밤 4 ° C에서 1 차 항 체 용액 (1:5, 000에서 안티 타우)에 오를 품 어. 7 분 PBST에 오 점 4 번 씻어.
  9. 관련 2 차 항 체 솔루션 (염소 반대로 마우스 IgG 1:5, 000에서), 준비 하 고 실 온에서 90 분 동안 오를 품 어. PBST에 4 시간, 7 분 세척.
  10. 개발 제조 업체에 따르면 화학 키트를 사용 하 여 오 ' s 권고. 투명 한 플라스틱 포장 내 오 점 커버. 이미징 시스템 관련 소프트웨어와 화학을 위한 화학에 의해 이미지를 수집.

4. Microtubule 바인딩 분석 결과

  1. microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 단계를 반복 2.1 2.6.
  2. 준비 1 (2 mL) PEM 10 X PEM 버퍼에서 버퍼 X 4 ° C에서 20 µ M (40 µ L) paclitaxel 1 m m (20 µ L) GTP를 추가 하 여 저장. 박을 microtubule (MT)에서 − 80 ° C 냉동 고에서 대장균 타우 작업 재고 − 20 ° C 냉장고.
  3. 표 1에 의하여 샘플 준비.
  4. 100000 x g에서 60 분 동안 25 ° C에서 30 분 Ultracentrifuge에 대 한 37 ° C에서 품 어.
  5. 전송 120 µ L 포함 supernatants의 언바운드 타우, 청소 하 고 튜브.
  6. 5 X의 추가 120 µ L (상쾌한와 동일한 볼륨) 버퍼를 포함 하는 바인딩된 타우 펠 릿을 시음 하 고 철저 하 게 혼합. 레이블이 지정 된 튜브를 청소 하 여 철저 하 게 혼합 솔루션 전송.
  7. 단백질 농도 측정 (단계 2.6 참조).
    참고: 샘플을 준비 하는 동안 사용 하 여 솔루션 (단계 4.6)의 볼륨 펠 릿과 상쾌한 샘플 준비.
  8. 해당 단백질 농도의 샘플을 준비 하 고 갓된 4 SDS 겔-로딩 버퍼 DTT (400mm)를 포함 된 배 추가.
    참고: 샘플에 저장 될 수 있다 −이 단계에서 20 ° C.
  9. 3.5-3.10 단계 반복.
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샘플 이름 Microtubule 필요 주요 단백질 필요 PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-제어 (6.21 μ g/μ) 2 μ 9.66 μ (60 μ g) 108.34 μ
2 HCT 116-Curcumin 10 μ M (4.81 μ g/μ) 2 μ 16.63 μ (80 μ g) 101.37 μ
3 HCT 116-Curcumin 20 μ M (3.28 μ g/μ) 2 μ 30.49 μ (100 μ g) 87.51 μ
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μ g/μ) 2 μ 18.42 μ (100 μ g) 99.58 μ
5 대장균 타우 2 μ 1 μ 타우-352 117 μ
6 MT만 2 μ X 118 μ
120 μ

표 1: 샘플 microtubule 바인딩 분석 결과 대 한 준비.

5. 지역화 및 Curcumin와 세포 치료 후 타우 식

  1. coverslip 70% 에탄올을 사용 하 여 깨끗 하 고 건조 한 실험실 티슈를 사용 하 여. 단일 coverslip 레이블이 6 잘 조직 배양 플레이트의 각 음에 삽입 합니다. 접시에 생물 안전 캐비닛 놓고 적어도 3 h. 위해 자외선에 전환
  2. Subculture 셀 10 5 셀/잘 권장된 문화 매체에서 x 2.5에서 씨앗 6 잘 플레이트의 관련 웰 스도 하는 고.
  3. ~ 24 h 후 세포질 형태학 변화에 대 한 확인을 10 배 및 40 X 목표를 사용 하 여 거꾸로 현미경을 사용 하 여 셀을 검사. 필요한 경우 사진 기록.
  4. 는 PBS를 사용 하 여 두 번 셀 린스. 어둠 속에서 37 ° C 배양 기에서 3.7% 포름알데히드에 셀 수정.
    참고: 실 온에서 포 름 알 데히드에 의해 고정 잘 작동, 너무 합니다. 포 름 알 데히드를 처리할 때 적절 한 개인 보호 장비를 착용.
  5. 씻어 PBS에 셀. 셀에 얼음 처럼 차가운 메탄올에 수정 − 15 분 동안 20 ° C는 세포를 Permeabilize 0.1%와 3 %BSA 그들을 배양 하 여 10 분에 대 한 얼음에 PBS에 Triton X-100 PBS로 세포 세척.
  6. 블로킹 버퍼에 셀을 품 어 (0.1%와 3% BSA PBS 솔루션에서 트윈-20) 실 온에서 1 h.
    참고: 4 ° C에서 2 시간에 대 한 보육 작용도.
  7. 3 %BSA 0.1%에서 1 차 항 체 (1: 200에서 안티 타우) 솔루션 준비 PBS (예를 들어, 0.4 mL 버퍼에서 2 µ L 타우-13 항 체)에 트윈 20.
  8. 는 PVDF의 작은 조각을 잘라 막 조각; 6 잘 플레이트의 각 잘 제대로 맞게 되도록 물에 담가 5 분 장소에 대 한 각 잘에서 컷 PVDF.
  9. 추가 60 µ L 컷을 1 차적인 항 체 솔루션의 PVDF 조각에 각 잘. 장소는 coverslips 셀 주 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 어두운, 습 한 챔버에 4 ° C에서 밤새 품 어. PBS에서 4 번 씻어.
  10. 준비 3 %BSA 0.1%에서 이차 항 체 솔루션 (fluorescein 활용 594 반대로 마우스 IgG 1:400에) PBS에 트윈 20.
  11. 조각과 6 잘 플레이트의 각 음을 제대로 맞게 각 잘에서 컷 PVDF 5 분 장소에 대 한 물에 담가 있도록 PVDF 막의 작은 조각을 잘라.
  12. 6 잘 플레이트에 PVDF 조각의 각 이차 항 체 솔루션의 추가 80 µ L. 장소는 coverslip 셀 2 차 항 체 솔루션을 만질 수 있는 그런. 4 번 2 h. PBS로 세척에 대 한 실 온에서 어두운, 습 한 챔버에 품 어.
  13. 샘플 4 장착 매체에 마운트 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 고 수정 유리 슬라이드에 coverslips. 유리 슬라이드에 DAPI와 장착 매체의
    1. 하나 추가 드롭. 각 우물에서는 coverslips를 제거 하 고 DAPI와 설치 매체를 포함 하는 유리 슬라이드에 그들을 배치. 얼룩진된 셀을 포함 하는 각 coverslip의 표면에서 모은 접촉 확인해당 유리 슬라이드에 팅 매체.
    2. 적용 폴란드어 밀봉 하 고 그들을 수정 각 coverslip 주위 밀폐 유리 슬라이드에 손톱. 필요한 경우이 단계를 두 번 수행.
  14. 어두운 약 실에 있는 실내 온도에 1.5 h에 대 한 품.
  15. 검사 confocal 현미경을 사용 하 여 어두운 방에 coverslip에 침수 석유를 사용 하 여 슬라이드.

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Representative Results

식 총 타우와 인 타우의 curcumin 또는 LiCl (그림 1)의 다른 농도와 세포 치료 후 시험 되었다. Curcumin의 3 개의 다른 농도와 세포의 치료 감소 타우 식 수준; 그러나, 인 타우 식 치료 curcumin의 낮은 농도 따라 증가 하지만 높은 curcumin 농도와 세포 치료 시 감소. 안티-인-타우 (Ser396) 인 타우의 탐지를 위해 사용 되었다. 총 타우와 인 타우 LiCl (그림 1)의 세 가지 다른 농도와 세포의 치료 시 감소합니다. 이전 연구는 타우 식 수준 다 다른 암 종류에와 같은 암 종류의 서로 다른 사이트에 표시 했다. 대 장 암에 이전 데이터는 타우 두 셀 라인 (HCT 116와 SW480) 대 장 암 또한 phosphorylated19했다 표현 했다 보여주었다. 5 µ M curcumin으로 치료 하는 세포 인 타우 수준 치료 세포에 비해 높았다. 인 타우 레벨 curcumin의 동일한 농도로 처리 하는 셀에 총 타우 보다 높았다. 10 µ M curcumin와 셀의 치료 인 타우 레벨 치료 세포에 비해 감소 했지만 인 타우 식 아직도 이상의 총 타우 식 수준. 30 µ M curcumin 인하 인 타우 식 세포의 치료 비교 치료 세포와 총 타우 인 타우 같은 치료 세포 수준.

이 원고는 인산 가수분해 효소 분석 결과 (그림 2)에 의해의 인 산화 상태를 평가 하기 위한 쉬운 프로토콜을 설립. Curcumin 치료, 다음 전체 타우 인 산화 크게 변경 하지 않은 그리고 특정 아미노산 잔류물에 인 산화는 중요 한 (그림 1). 전반적으로 타우 인 산화는 세포 치료 세포에 비해 LiCl로 치료에 중단 됐다. 인산 가수분해 효소 처리 샘플 electrophoresed 치료 샘플 인산 가수분해 효소 처리 샘플 보다 더 hyperphosphorylated 했다 확인 치료 샘플 보다 더 빨리. Curcumin 치료 세포 거의 동일한 결과 나타내는 그림 1과 같이 대 장 암 세포 선의 치료 타우 인 산화를 축소 하지 않았다 보여주었다. 인산 가수분해 효소 치료 및 치료 샘플 샘플 LiCl로 치료 하는 세포의 거의 동일한 범위에서 electrophoresed,이 셀에는 타우 인 산화를 나타내는 했다 감소 (그림 2). 여기, curcumin 처리 샘플의 높은 농도 (20 µ M 또는 30 µ M) 전반적인 인 산화 상태, 낮은 농도 처리 했다 높은 사이트별 인 산화 특정 인-타우 (S396) 항 체에 의해 밝혀 비교 촬영 했다.

또한,이 실험실에서 세포 샘플의 microtubule 바인딩 분석 결과 성공적으로 사용 하 여 타우-352 긍정적인 제어 및만 산으로 부정적인 컨트롤 (그림 3)으로 설립 되었다. Curcumin와 LiCl 치료 microtubule 바인딩 분석 결과 의해 같이 microtubule 바인딩 활동 저해 했다. 이 실험에서 curcumin 치료 보여주지 않았다 microtubule 바인딩 기능 있지만 이전 연구46,47, 비슷한 바인딩 저해 반면에 사이트별 타우 인 산화를 억제 하는 효과가 높은 농도. 그림 1, 10 µ M curcumin 치료 결과의 인-제어 하지만 총 타우 보다 높은 식에 비해 최소한의 표현. 그러나, curcumin 치료 후 대 장 암의 microtubule 바인딩 용량 뿐만 아니라 LiCl 치료의 낮은 농도 치료 샘플에서 감소 했다. 사이트별 타우 인 산화 효과 microtubule 바인딩 및 자체 집계48. 프롤린-부유한 지구에서 인 산화 타우 장애가 microtubule 바인딩 속성 C 터미널 지역 증가 이러한 속성 고 MT 바인딩 지역 함께 두 지역 약 70%에 의해 그것의 바인딩 속성을 감소 및 무질서는 microtubules48 다른 요인 뿐만 아니라 다른 사이트 인 산화 타우의 curcumin와 LiCl 치료의 대 장 암이 microtubule 불안에 대 한 포함 될 수도 있습니다.

1 차 및 이차 항 체의 소량을 사용 하 여 간단한 프로토콜 curcumin 치료 (그림 4)에 따라 대 장 암 세포 선에서 지역화를 사용할 수 있습니다. 결과 나타났다 타우 curcumin 치료 따르는 핵에 translocated 했다, 이전 연구 보고는 핵 타우와 유사한 발견은 Alzheimer의 질병49 같은 신경 퇴행 성 질환에 신경 DNA 보호에 중요 한 선수 ,50.

Figure 1
그림 1: curcumin 또는 LiCl 치료 다음 대 장 암 세포에 타우와 인 타우 식. 샘플 컨트롤 셀에서 추출 또는 셀 (A) curcumin 및 (B) LiCl의 3 개의 다른 농도로 24 h에 대 한 치료 SDS 페이지 10 %polyacrylamide 젤에 해결 되었고 안티 타우 또는 안티-인-타우 항 체로 조사. 서쪽 오 점 결과 Densitometry 분석 오른쪽 패널에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 전체의 인 산화에 치료 또는 차동 인산 가수분해 효소 분석 결과 의해 감지 셀 샘플을 처리. 이상한 차선 표시 제어 반면 심지어 레인 curcumin 처리 또는 LiCl 처리 샘플의 인산 가수분해 효소 치료 추출 물, 셀. 인산 가수분해 효소 치료 타우 전기 이동 기동성을 phosphorylated 타우 포함 치료 샘플 보다 더 빨리 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Microtubule 바인딩 microtubule 바인딩 분석 결과 의해 감지 하는 대 장 암 세포에의. 제어 HCT 116 셀 샘플, curcumin 치료 또는 LiCl 치료 셀 샘플 및 대장균 타우 프로토콜 섹션 4에에서 설명된대로 microtubules와 인 큐베이 팅 했다. 상쾌한 (S)와 펠 렛 (P) 분수의 상응 하는 금액 안티 타우 항 체와 immunoblotted 했다. 부정적인 제어 차선만 MT을 포함 하는 산 모든 바운드 생 타우를 포함 하지 않은 것인지 실행 되었습니다. 하단 패널 densitometry 상쾌한 (언바운드 타우)와 펠 릿 (바인딩된 타우) 분수 사이 비교를 사용 하는 개별 샘플의 서쪽 오 점 분석을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 타우 단백질 지 방화 confocal 마이크 검사roscopy입니다.
대 장 암 세포에 핵소체를 주변 지역화 타우. 왼쪽된 패널 중간 패널 핵 DAPI에서 얼룩 반면 안티 타우 단일 클론 항 체를 사용 하 여 검출 하는 타우 지역화를 표시 합니다. 치료 세포 핵에 타우 전을 보여주는 대표적인 예도 표시 됩니다. 제어 셀 타우 치료 세포에는 핵 내부 또한 지역화 반면 타우 주로 주위와 핵, 외부를 보여주었다. 눈금 막대 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

이 원고 총 타우 감지에 대 한 서로 다른 절차 조건 고 대 장 암 세포 치료 curcumin와 LiCl 타우 phosphorylated. 단백질 견본에서의 전반적인 인 산화 상태를 평가 하기 위해 인산 가수분해 효소 분석 결과 설명 했다. 이 분석 결과 잠재적으로 어떤 단백질의 인 산화 상태 검사를 사용할 수 있습니다.

이 분석 결과 phosphorylated 단백질 이동 비 phosphorylated 상태로 보다 원칙을 기반으로 합니다. 알칼리 성 인산 가수분해 효소와 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼는이 프로토콜에 사용 됩니다. 세포 lysates를 분석 결과 구성 요소를 추가한 후 샘플 특정 온도에서 특정 최적의 기간 동안 incubated 한다. 부 화, 후 샘플 반응을 중지 SDS 샘플 버퍼에 비등 한다. 이전에 다른 실험 프로토콜 microtubules에 타우의 바인딩을 평가 하기 위해 사용 되었습니다 수 있습니다. 여기에 제시 된 microtubule 바인딩 분석 결과 상쾌한 및 펠 릿 분수를 사용 하 여 품질 보증을 제공 하는 긍정적이 고 부정적인 컨트롤 포함 하는 동안 수행 하기 쉽습니다. 산 전용 부정적인 제어 MT 모든 바운드 생 타우를 포함 하지 않는 확인을 사용 되었다. 더하여, 순수한 인간의 타우-352, microtubule 바인딩 타우 긍정적인 컨트롤으로 사용 되었다. 구속력이 분수 (표면에 뜨는) 울트라 속도 원심에서 microtubule 바인딩 분수 (펠 릿)를 분리 하는 사용 되었다; 이러한 ultracentrifuge은 비용과 널리 사용할 수 없습니다 때문에이 절차는 제한 수 있습니다. 또한, 낮은 양의 샘플 사용, 긴 때문에, 얇은 원심 분리기 튜브 어댑터와 ultracentrifuge로 터에 사용 하기 위해 필요 합니다. 그것은 다시 이러한 튜브를 사용 하 여, 비록 단일 사용은 교차 오염을 방지 하는 것이 좋습니다. 마지막으로,는 타우 지역화 프로토콜의 장점은 1 차 및 이차 항 체의만 소량 필요 하다입니다. 후 고정, permeabilization, coverslips에 세포 부착의 차단, 항 체의 작은 방울 6 잘 플레이트의 우물 내에 저장 되었다 PVDF의 작은 조각에 예금 되었다. coverslips 항 체 셀을 액세스할 수를 유지 했다. 이 프로토콜을 사용 하 여 사용 하는 항 체의 양을 최소화할 수 있습니다.

몇 가지 예방 조치는 안정적이 고 같지는 결과 보장 하기 위해 마음에 유지 한다. 첫째, 세포 배양에 오염을 피하기 위하여 엄격한 무 균 기법을 사용 해야 하 고 셀 추출 합니다. 완전 한 RIPA 세포의 용 해 버퍼 신선한 준비 되어야 한다. 인산 가수분해 효소 분석 결과에서는 3 분에 대 한 샘플을 삶아 인산 가수분해 효소 치료 및 치료 샘플의 부 화 후 즉시 SDS 페이지를 시작 하는 것이 중요입니다. 타우-352 해야 될 작은 aliquots로 나누어 −20 ° C 냉동 고에서 제거 후 얼음에 보관 하 고 사용 후 즉시 냉동 실에 다시 입금. −80 ° C, MT에서에서 제거 후 주식 얼음 72 h; 내에서 재사용 하는 경우에 보관 해야 그렇지 않으면, 실 온에서 그들을 유지. PEM 버퍼 10 x 1 x 버퍼 GTP와 paclitaxel 추가 되는 경우에 갓 만들어질 필요가 있기 때문에 솔루션을 집중적으로 준비 되어야 한다.

타우 함수는 그것의 인 산화의 정도 의해 통제 된다. 타우 hyperphosphorylation 정상 성인의 뇌 타우 타우-352, microtubule 바인딩 분석 결과에서 긍정적인 컨트롤로 사용 된 유사한 발생 하지 않습니다. 그러나, 타우 hyperphosphorylation 신경 퇴행 성 질환에서 발생합니다. 이 프로토콜 및 후속 결과 인간 대 장 암 세포 라인 또한 유사 하 게는 알 츠 하이 머 질환 두뇌에 phosphorylated 타우를 수행할 보여 줍니다. 높은 복용량의 curcumin와 특히 LiCl 치료 타우 인 산화를 최소화할 수 있습니다. 따라서, 신경 퇴행 성 질환, 알 츠 하이 머 병, 대 장 암 등 사이 좋은 상관 관계에 관해서 타우 hyperphosphorylation, 있을 수 있습니다 그리고 curcumin 또는 LiCl 대 장 암과 Alzheimer의 질병 치료에 사용할 수 있습니다. 마지막으로, 타우 인 산화 타우 microtubule 바인딩을 공부 하 고는 크게 뿐만 아니라 뿐만 아니라 일부 chemotherapeutics에 대 한 신경 퇴행 성 질환 타우 microtubule 바인딩을 수정 하는 에이전트는 동적으로 암으로 공부 하기 때문에 치료제51. 여기에 제시 된 프로토콜 발견 및 다른 tauopathies 및 암 치료에 새로운 치료제의 개발에 잠재적으로 도움이 됩니다.

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Disclosures

저자 들은 아무것도 공개 선언 합니다.

Acknowledgments

이 연구 프로젝트의 일환 '개발 및 해양 미세에서 높은 가치 화장품 원료 물질의 산업화' 라는, 지원 사역의 바다와 수 산, 한국, 그리고 교내 그랜트 (2Z04930)에 의해 지원 되었다 수행 되었다 KIST 강릉 연구소 천연 제품.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

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References

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인 산화 및 대 장 암 세포에 타우 단백질의 지역화 함께 Microtubule 바인딩 분석 결과
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Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

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