Summary
Detta manuskript beskriver standardprotokoll för mätning av tau hyperphosphorylation, mäta tau bindning till mikrotubuli och lokalisering av intracellulära tau efter läkemedelsbehandlingar. Dessa protokoll kan användas upprepade för screening droger eller andra föreningar som riktar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande.
Abstract
Det mikrotubulära-associerade proteinet tau är ett neuronala protein som lokaliserar mestadels i axoner. Allmänhet är tau viktigt för normal neuronal funktion eftersom det är engagerade i mikrotubuli montering och stabilisering. Förutom nervceller uttrycks tau i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, gastric, kolorektal, och pankreas cancer där det visar nästan liknande struktur och utövar liknande funktioner som den neuronala tau. Mängden av tau och dess fosforylering kan ändra dess funktion som en stabilisator av mikrotubuli, och leda till utveckling av Parade spiralformade filament i olika neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Det är viktigt att fastställa tillståndet fosforylering av tau och dess mikrotubulära-bindande egenskaper. Dessutom är undersöker den intracellulära lokaliseringen av tau viktigt i olika sjukdomar. Detta manuskript Detaljer standard protokoll för mätning av tau fosforylering och tau bindning till mikrotubuli i kolorektal cancerceller med eller utan curcumin och LiCl behandling. Dessa behandlingar kan användas för att stoppa cancer cell spridning och utveckling. Intracellulära lokalisering av tau undersöks med hjälp av immunohistokemi och konfokalmikroskopi medan du använder låga mängder antikroppar. Dessa analyser kan användas upprepade för screening föreningar som påverkar tau hyperphosphorylation eller mikrotubulära bindande. Romanen therapeutics används för olika tauopathies eller relaterade cytostatika kan potentiellt karakteriseras med hjälp av dessa protokoll.
Introduction
Tau identifierades ursprungligen som ett heat-stable mikrotubulära-associerade protein som var samtidig renat med tubulin1. Tau uttrycks enbart i högre eukaryotes2,3,4. Tau huvudsakliga funktion är att styra mikrotubulära montering1,5,6. Det bidrar också till polymerisation av mikrotubuli7, axonal transport8, förändringar i axonal diameter9, bildandet av neurom polaritet och neurodegeneration10. Tau fungerar också som en protein byggnadsställning att styra vissa signalvägar. Rat hjärnan studier tyder på att tau är neuron-specifika och att det primärt lokaliserar i axoner11. Eftersom tau är viktigt för mikrotubuli polymerisation och neuronal utveckling, antogs tau för att spela en viktig roll i axonal utveckling i det centrala nervsystemet; Denna hypotes var senare verifierade av in vitro- och in-vivo experiment. Förutom nervceller uttrycks tau i olika icke-neuronala celler, inklusive lever, njure och muskel celler12,13. Tau uttrycks också i mänskliga bröstcancer, prostatacancer, kolorektal-, ventrikel, och bukspottskörteln cancer cell linjer och vävnader14,15,16,17,18, 19. tau finns även i inkludering-body myosit som vridna tubulofilaments i organ i inkludering20.
Tau kan bära flera post-translationella modifieringar. Alla post-translationella modifieringar är fosforylering den vanligaste. Ökad tau fosforylering minskar dess affinitet för mikrotubuli, slutligen destabiliserande cytoskelettet. Åttiofem fosforylering platser har beskrivits i tau-protein som isolerats från mänskliga Alzheimers sjukdom hjärnans vävnader. Av dessa webbplatser utgör 53% serine, 41% treonin och bara 6% tyrosin rester21,22,23. Tau fosforylering påverkar dess lokalisering, funktion, bindande, löslighet och dess känslighet för andra post-translationella modifieringar. Även tau fosforylering till mer än den normal omfattningen (eller helt mättade med fosfatgrupper) kallas hyperphosphorylation som replikerar strukturella och funktionella egenskaper hos Alzheimers sjukdom24. Tau upprätthåller fungerande de axonal mikrotubuli och garanterar normal neuronal funktion under fysiologiska betingelser. Men misslyckas hyperphosphorylated tau att upprätthålla en välorganiserad mikrotubulära bindning, orsakar neuronala förlust på grund av mikrotubuli isärtagning. Normala nivåer av tau fosforylering krävs för korrekt tau funktion, men tau misslyckas att fungera normalt om dess karakteristiska fosforylering nivå ändras och om det är hyperphosphorylated25. I Alzheimers sjukdom och vissa andra åldersrelaterade neurodegenerativa sjukdomar, tau blir hyperphosphorylated och bildar Parade spiralformade filament och fibrillnystan26,27. Metoder för att bestämma tau fosforylering och mikrotubuli bindning är alltså viktigt.
Kolorektal cancer, en åldrande-associerade, är tredje vanligaste diagnosen cancer och tredje framträdande död-orsakar cancer för både män och kvinnor28. Kolorektal cancer är en av de viktigaste död som orsakar cancer i västvärlden29. Eftersom både kolorektal cancer och Alzheimers sjukdom är associerad med åldrande och båda sker främst i de utvecklade länderna där människor njuta av liknande matvanor, kan de två sjukdomarna på något sätt vara korrelerade. Dessutom reagerar tau-positiv och tau-negativ cancerceller olika på kemoterapeutika, t.ex., paklitaxel16.
Curcumin är en av de främsta derivat av Curcuma longa, Indisk krydda gurkmeja30. I århundraden har södra asiatiska populationer konsumeras gurkmeja i sin kost på en daglig basis. Curcumin är används för att behandla olika sjukdomar, inklusive kolorektal cancer, Alzheimers sjukdom, diabetes, cystisk fibros, inflammatorisk tarmsjukdom, artrit, hyperlipidemi, åderförkalkning och ischemisk hjärtsjukdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litium kan också döda kolorektal cancerceller eller förhindra deras spridning39. Litium kan också användas för att behandla Alzheimers sjukdom40 som den minskar tau aggregering och motverkar dess hyperphosphorylation som observerats i en transgen mus modell41,42,43, 44.
Detta manuskript syftar till att: 1) mäter totalt tau och phospho-tau uttrycksnivåerna i behandlade celler; (2) Beskriv ett fosfatas-test för att mäta övergripande tau fosforylering; (3) undersöka mikrotubulära-bindningen av tau; och 4) lokalisera tau av konfokalmikroskopi i kolorektal cancer cellinjer behandlas med curcumin eller LiCl. Resultaten visar att cellen behandling med curcumin, som är en förment bra kemoterapeutiska medel för tjocktarmscancer, och behandling med LiCl kan minska uttryck för båda totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancer cellinjer. Dessa behandlingar kan också orsaka translokationen i cellkärnan Tau. Men oväntat, misslyckas curcumin att förbättra bindningen av tau till mikrotubuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning av reagens
- Lägg till 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor lösning, 10 µL (1 x 100 x lagervara) proteas hämmare cocktail lösning och 10 µL (1 x 100 x lagervara) fosfatas hämmare cocktail lösning 1 ml 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysbuffert att förbereda den komplett RIPA lyseringsbuffert.
- Förbered 10 x allmänna tubulin buffert (PEM) buffert.
- Lägg till 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95,1 mg) etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic acid, 10 mM (51 mg) MgCl 2 och 1,25 M (3 mL 10 m) NaOH i en 50 mL tub , blanda med 15 mL destillerat vatten och lös upp med hjälp av en virvel. Kontrollera pH-värdet (bör 6,9). Om pH > 6,9, kasta bufferten och remake en färsk hel.
Obs: NaOH bör vara under 1,25 M till säkerställa att pH inte överstiger 6,9. Det är inte klokt att använda HCl för att justera pH > 6,9. - Lägg till NaOH droppvis tills pH är 6,9. Tillsätt destillerat vatten för att göra upp till 25 mL 10 X PEM buffert. Slutligen, filtrera med hjälp av en spruta och ett 0,2 µm spruta filter. Dela denna buffert i alikvoter i 1,5 mL rör och förvaras vid 4 ° C.
- Lägg till 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95,1 mg) etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic acid, 10 mM (51 mg) MgCl 2 och 1,25 M (3 mL 10 m) NaOH i en 50 mL tub , blanda med 15 mL destillerat vatten och lös upp med hjälp av en virvel. Kontrollera pH-värdet (bör 6,9). Om pH > 6,9, kasta bufferten och remake en färsk hel.
- Förbered 5 x provet buffert med reduktionsmedel och dye.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) 50% glycerol, 1 mL (2%) av 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) och 1,2 mL destillerat vatten för att kompensera 5 mL 5 x SDS prov buffert. Lagra på − 20 ° C.
Obs: Eftersom glycerol är trögflytande, 1,25 mL glycerol är svårt att mäta. En mL 100% glycerol väger 1,26 g. Därför väger 1.575 g 100% glycerol (vilket motsvarar 1,25 mL 100% eller 2,5 mL 50% glycerol) i en 15 mL röret först; Blanda väl med de andra komponenterna.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) 50% glycerol, 1 mL (2%) av 10% sodium dodecyl sulfate (SDS) och 1,2 mL destillerat vatten för att kompensera 5 mL 5 x SDS prov buffert. Lagra på − 20 ° C.
2. Cell kultur, behandling med Curcumin eller LiCl behandling och undersökning av proteinuttryck
- Lägg till ~ 1 x 10 6 HCT 116 celler i 100 mm vävnadsodling rätter som innehåller minst viktigt Media (MEM) kompletteras med 10% fostrets nötkreatur serum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin. Efter en dag av odling, celler kommer att nå 60-70% sammanflödet.
Anmärkning: Antalet plattor som behövs beror på antalet behandlingar som beskrivs nedan. - När celler nå ~ 65% sammanflödet (approximeras med mikroskopi), ta bort MEM kompletteras medium och lägga till serumfritt MEM med 5 µM, 10 µM, och 30 µM curcumin eller 25 mM, 50 mM och 100 mM LiCl. Inkubera vid 37 ° C under 24 h i en fuktad atmosfär som innehåller 5% CO 2.
- 24 h efter behandling, tvätta cellerna med 1 mL iskallt fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och skrapa de celler som använder en cell skrapa. Överföring skrapade cellerna i 1,5 mL Centrifugera rören och Centrifugera i 4 min vid 1.800 x g vid 4 ° C att få cell pellets.
- Lyse celler genom att avbryta pellets i 100 µL av komplett RIPA bufferten vid 4 ° C i 20 min medan regelbundet trycka tuberna. Sonikera prover kort.
- Centrifugera i cell homogenates i en bänkmonterade Centrifugera vid 22,570 x g under 20 minuter vid 4 ° C. överför supernatanterna till andra märkta provrör med pipett.
- Mäta koncentrationen av protein i supernatanterna genom de Bradford assay 45 med kommersiella protein-assay kit.
- Förbereda prover av lika proteinkoncentration (10 µg protein/13 µL prov) av cellen lysates med 4 X SDS gel-lastning buffert. Förberett 4 x SDS gel-lastning buffert färska innehållande 400 mM Ditiotreitol (DTT).
Obs: I detta skede prover kan förvaras vid − 20 ° C om det behövs. - Inkubera proverna på en värme block vid 100 ° C i 5 min. Blanda proverna med hjälp av en virvel och vänta att kyla dem. för ~ 10-15 min.
- Montera ett electrophoresis system.
- Belastning 10 µg protein (13 µL prov) per brunn på en 10% SDS-polyakrylamidgel för elektrofores (SDS-PAGE). Ladda molekylvikt stegen på gelen till ett körfält.
Obs: Som elektrofores börjar, kommer protein stegen att lösa in protein band av uppenbara molekylvikter. Använd dessa band för att uppskatta molekylvikt av okänt protein banden. - Efter lastning proverna, Anslut positiva och negativa elektroderna av elektrofores systemet till en strömkälla för att upprätthålla en konstant spänning. Inledningsvis börja vid 70 V för 20 min flytta protein proverna från stapling gelen in i lösa gel. Sedan öka spänningen till 125 V för cirka 70-120 min tills prover och protein stege når slutet av gelen.
- Efter slutförandet av elektrofores, överföra gelen till ett polyvinylidene kryptondifluorid (PVDF) membran med hjälp av en våt electroblotting system. Överföra för ~ 100 min vid 100 V. Block membranet i 4% bovint serumalbumin (BSA) blockerande buffert för 90 min i rumstemperatur på runt 25 ° C.
- Belastning 10 µg protein (13 µL prov) per brunn på en 10% SDS-polyakrylamidgel för elektrofores (SDS-PAGE). Ladda molekylvikt stegen på gelen till ett körfält.
- Mark blot genom att skära den på sidan med molekylvikt stegen. Använda en genomskinlig plastfolie och en skarp fräs för att skära blot. Förbereda lösningarna som primär-antikropp (anti tau på 1:5, 000; anti-phospho-tau på 1:4 000) och inkubera blot i denna lösning vid 4 ° C över natten.
- Efter natten inkubation, tvätta blot för 7 min fyra gånger i fosfatbuffrad saltlösning-Tween-20 (PBST) lösning.
- Förbereder de relevanta sekundära-antikropp lösningarna (get anti-kanin eller antimus IgG på 1:5, 000) och inkubera blot i denna lösning för 90 min i rumstemperatur på runt 25 ° C. tvätt i PBST fyra gånger, 7 min varje.
- Utveckla blot med en chemiluminescence kit enligt tillverkaren ' s rekommendationer. Täcka blot med en genomskinlig plastfolie. Skaffa bilder genom en chemiluminescence imaging system för chemiluminescence med relevant programvara.
3. Fosfatas Assay
- behandla den cell lysates (från steg 2,5) med alkaliskt fosfatas i alkaliskt fosfatas bufferten.
- För både styra och behandlade prover, förbereda 20 µL prov innehållande 20 µg totalt protein. Lägga till volymen av cell lysates som innehåller 20 µg totalt protein, följt av 2 µL alkalisk fosfatas buffert och 10 µL alkalisk fosfatas. Tillsätt destillerat vatten för att kompensera 20 µL.
- Inkubera proverna vid 37 ° C för 1 h. stoppa reaktionen genom att lägga till etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) med en slutlig koncentration på 50 mM, eller lägga till natrium orthovanadate (Na 3 VO 4) med en slutlig koncentration på 10 mM. Reaktionen kan också stoppas genom uppvärmning vid 75 ° C i 5 min.
- Innan inkubering av prov med fosfatas är klar, förbereda prover av samma koncentration utan att lägga till fosfatas för jämförelse med fosfatas-behandlade prover.
- Lägg till den nylagade 4 X SDS gel-lastning buffert innehållande 400 mM DTT.
- Inkubera proverna på en värme block vid 100 ° C i 5 min. Blanda proverna med en virvel. Sval rumstemperatur för ~ 10-15 min.
- Montera ett electrophoresis system för att köra en 10% polyakrylamidgel av SDS-PAGE.
- Belastning 10 µg protein (13 µL prov) per brunn på en 10% polyacryLAMIDE gel. Ladda molekylvikt stegen.
- Efter lastning provet, Anslut de positiva och negativa elektroderna av elektrofores systemet till en strömkälla för att upprätthålla en konstant spänning. Inledningsvis börja vid 70 V för 20 min flytta protein proverna från stapling gelen in i lösa gel. Sedan öka spänningen till 125 V och kör gelen för cirka 70-120 min tills prover och protein stege når slutet av gelen.
- Efter slutförandet av elektrofores, överföra gelen på ett PVDF membran med hjälp av en våt electroblotting system. Transfer för ~ 100 min vid 100 V.
- Markera blot genom att göra ett litet klipp på sida molekylvikt stegen. Använda en genomskinlig plastfolie och en skarp fräs för att skära blot.
- Blockera membranet i 4% BSA blockerande buffert under 90 minuter vid rumstemperatur.
- Inkubera blot i primär-antikropp lösning (anti tau på 1:5, 000) vid 4 ° C över natten. Tvätta blot i PBST fyra gånger, för 7 min varje.
- Bereda relevanta sekundära-antikropp-lösning (Get antimus IgG på 1:5, 000) och inkubera blot under 90 minuter vid rumstemperatur. Tvätta i PBST fyra gånger, för 7 min varje.
- Utveckla blot med en chemiluminescence kit enligt tillverkaren ' s rekommendationer. Täcka blot inom en genomskinlig plastfolie. Skaffa bilder genom en chemiluminescence imaging system för chemiluminescence med relevant programvara.
4. Mikrotubuli-bindande Assay
- för mikrotubuli bindande analysen, upprepa steg 2.1-2.6.
- Förbered 1 X (2 mL) PEM buffert från 10 X PEM buffert lagras vid 4 ° C genom att lägga till 20 µM (40 µL) paklitaxel och 1 mM (20 µL) GTP. Inventera mikrotubuli (MT) från − 80 ° C frys och E. coli tau arbetar beståndet från − 20 ° C frys.
- Förbereda prover enligt tabell 1.
- Inkubera vid 37 ° C i 30 min. ultracentrifugen vid 25 ° C i 60 min vid 100 000 x g.
- Överföra 120 µL supernatanterna som innehåller obundna tau, att rengöra och märkta rör.
- Lägga till 120 µL (samma volym som supernatanten) 5 X prova buffert att pelleten som innehåller bundna tau och blanda väl. Överför lösningen för att rengöra märkta rör och blanda noggrant.
- Mätning av protein koncentrationen (se steg 2,6).
Obs: Medan du förbereder prover, använda volymen av lösningen (4.6 steg) för att förbereda både pellets och supernatanten prover. - Förbereda prover av motsvarande proteinkoncentration och lägga till nylagad 4 x SDS gel-lastning buffert innehållande DTT (400 mM).
Obs: Prover kan förvaras vid − 20 ° C i detta skede. - Upprepa steg 3.5-3.10.
| prov | namn | mikrotubuli behövs | Main Protein behövs | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | HCT 116-kontroll (6.21 μg/μl) | 2 μl | 9.66 μl (60 μg) | 108.34 μl | ||||
| 2 | HCT 116-Curcumin 10 μM (4.81 μg/μl) | 2 μl | 16.63 μl (80 μg) | 101.37 μl | ||||
| 3 | HCT 116-Curcumin 20 μM (3.28 μg/μl) | 2 μl | 30.49 μl (100 μg) | 87.51 μl | ||||
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl) | 2 μl | 18.42 μl (100 μg) | 99.58 μl | ||||
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl Tau-352 | 117 μl | ||||
| 6 | MT endast | 2 μl | X | 118 μl | ||||
| < td colspan = ” 2 ”> | 120 μl varje | |||||||
tabell 1: provberedning för mikrotubuli-bindande assay.
5. lokalisering och uttryck av Tau efter behandling av celler med Curcumin
- Rengör ett täckglas som använder 70% etanol och torka den med en laboratorium vävnad. Infoga ett enda täckglas i varje brunn märkt 6-väl-vävnadskultur platta. Placera plattan på en biologisk säkerhet skåp och slå på en UV-ljus för minst 3 h.
- Subkultur cellerna och utsäde dem i relevanta brunnar av 6-väl plattan på 2,5 x 10 5 celler per brunn i rekommenderade odlingsmedium.
- Efter ~ 24 h, undersöka de celler med ett inverterat Mikroskop genom att använda både 10 X och 40 X mål för att kontrollera cellulära morfologiska förändringar. Spela in bilder om det behövs.
- Skölj cellerna två gånger med PBS. Fixa cellerna i 3,7% formaldehyd i en 37 ° C inkubator i mörkret.
Obs: Fixering av formaldehyd vid rumstemperatur fungerar bra, alltför. Använd lämplig personlig skyddsutrustning vid hantering av formaldehyd. - Tvätta cellerna i PBS. Fixa celler i iskall metanol på − 20 ° C i 15 min. Permeabilize cellerna genom inkubering i 3% BSA och 0,1% Triton x-100 i PBS på is för 10 min. Tvätta cellerna med PBS.
- Inkubera cellerna i blockerande buffert (3% BSA och 0,1% Tween-20 i PBS lösning) för 1 h i rumstemperatur.
Obs: Inkubation för 2 h vid 4 ° C fungerar bra, alltför. - Förbereda primär-antikropp (anti tau på 1: 200) lösningen i 3% BSA och 0,1% Tween-20 i PBS (t.ex., 2 µL tau-13 antikropp i 0,4 mL buffert).
- Skär små bitar av en PVDF membranet så att bitarna passar ordentligt inom varje brunn 6-väl plåten; Blötlägg dem i vatten i 5 min. plats skära PVDF i varje brunn.
- Lägga till 60 µL primär antikropp lösning till cut PVDF bitar i varje brunn. Placera coverslips så att cellerna kan röra primär-antikropp lösningen. Inkubera över natten vid 4 ° C i en mörk, fuktig kammare. Tvätta i PBS fyra gånger.
- Förbereda sekundär-antikropp lösningen (fluorescein-konjugerad 594 antimus IgG på 1: 400) i 3% BSA och 0,1% Tween-20 i PBS.
- Skär små bitar av PVDF membran så att bitarna passar ordentligt inom varje brunn av 6-väl plattan och blötlägg dem i vatten i 5 min. plats skära PVDF i varje brunn.
- Lägga till 80 µL av sekundär-antikropp lösningen till varje PVDF bitarna i 6-väl plattan. Placera täckglaset så att cellerna kan röra den sekundära-antikropp-lösningen. Inkubera i en mörk, fuktig kammare vid rumstemperatur under 2 h. Tvätta med PBS fyra gånger.
- Montera prover på montering medellång med 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) och korrigera coverslips på glasskivor.
- Lägg en droppe av monteringsmedium med DAPI på glasskivor. Ta bort coverslips från varje brunn och placera dem på de glasskivor som innehåller monteringsmedium med DAPI. Se till att ytan av varje täckglas som innehåller färgade celler berör i fjällenterande medium på den motsvarande glasskiva.
- Använd nagellack runt varje täckglas att försegla och fixa dem lufttätt i glas-bilderna. Om det behövs, göra detta steg två gånger.
- Inkubera i 1,5 h i rumstemperatur i en mörk kammare.
- Granska bilderna med confocal Mikroskop med nedsänkning olja på täckglaset i ett mörkt rum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttryck för totalt tau och phospho-tau undersöktes efter behandling av cellerna med olika koncentrationer av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med de tre olika koncentrationerna av curcumin minskade nivåer av tau uttryck; phospho-tau expression ökade vid behandling med låg koncentration av curcumin men minskade vid behandling av celler med högre curcumin koncentration. Anti-phospho-tau (Ser396) användes för detektion av phospho-tau. Nivåerna av både totalt tau och phospho-tau minskade vid behandling av cellerna med de tre olika koncentrationerna av LiCl (figur 1). Tidigare forskning hade visat att tau uttrycksnivåerna varierar i olika cancertyper och på olika platser i de samma typerna av cancer. Tidigare data på kolorektal cancer visade att tau uttrycktes i två cellinjer (HCT 116 och SW480) för kolorektal cancer som var också fosforyleras19. Phospho-tau nivåer i celler behandlas med 5 µM curcumin var högre än de i obehandlad celler. Phospho-tau nivåerna var högre än totalt tau i celler behandlas med samma koncentration av curcumin. Behandling av celler med 10 µM curcumin minskade phospho-tau nivåer jämfört med obehandlade celler men phospho-tau uttryck var fortfarande mer än totalt tau uttryck nivåer. Behandling av celler med 30 µM curcumin sänkte phospho-tau uttryck jämfört med phospho-tau i obehandlad celler och totalt tau nivåer i samma behandlade celler.
Detta manuskript etablerat ett enkelt protokoll för bedömning av fosforylering av tau av ett fosfatas assay (figur 2). Efter curcumin behandling, övergripande tau fosforylering förändrades inte betydligt och fosforylering på specifika aminosyra resthalter var signifikant (figur 1). Totalt stoppades tau fosforylering i celler behandlas med LiCl jämfört med obehandlade celler. Fosfatas-behandlade prover electrophoresed snabbare än obehandlade prover, verifiera att obehandlad prover var mer hyperphosphorylated än fosfatas-behandlade prover. Curcumin-behandlade celler visade nästan samma resultat, som anger att behandling av kolorektal cancer cellinjer inte minska tau fosforylering som visas i figur 1. Prover för både fosfatas-behandlade och obehandlade electrophoresed på nästan samma utbud i prover av celler behandlas med LiCl, vilket indikerar att tau fosforylering i dessa celler var minskat (figur 2). Höga koncentrationer (20 µM eller 30 µM) av curcumin-behandlade prover togs här, att jämföra övergripande phosphorylation status, som låg koncentration behandling visade högre platsspecifika fosforylering avslöjades av specifika phospho-tau (S396) antikropp.
Dessutom i denna lab inrättades mikrotubuli bindande analysen av cellprover framgångsrikt med tau-352 som positiv kontroll och endast MT som en negativ kontroll (figur 3). För både curcumin och LiCl behandling hämmades mikrotubulära-bindande verksamhet, vilket framgår av mikrotubuli bindande analysen. I detta experiment visade curcumin behandling inte mikrotubulära bindande kapacitet men hämmade bindningen liknar det i tidigare studier46,47, medan det var effektivt att hämma platsspecifika tau fosforylering på högre koncentration. I figur 1resulterade 10 µM curcumin i minimala uttryck för phospho-tau jämfört med kontroll men högre uttryck än totalt tau. Mikrotubuli-bindande kapacitet för kolorektal cancer tau efter curcumin behandling samt låg koncentration av LiCl behandling var minskade dock i obehandlade provet. Platsspecifika tau fosforylering effekter mikrotubulära bindande och själv aggregering48. Tau fosforylering på proline-rika region hindras mikrotubulära-bindande egenskaper medan C-terminal regionen ökade dessa egenskaper, och båda regionerna tillsammans med MT-bindande region minskat dess bindande egenskaper med ca 70% och störda i mikrotubuli48. Några andra faktorer samt andra platsspecifika fosforylering av tau kan vara inblandade för denna mikrotubulära destabilisering av kolorektal cancer tau behandlas med curcumin eller LiCl.
Ett enkelt protokoll som använder små mängder av primära och sekundära antikroppar aktiverat lokalisering av tau i kolorektal cancer cellinjer efter curcumin behandling (figur 4). Resultaten visade att tau hade flyttad till kärnan efter behandling med curcumin, ett konstaterande som liknar tidigare studier rapportering den nukleära tau är en nyckelspelare i nervcellernas DNA-skydd i neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom49 ,50.
Figur 1: Tau och phospho-tau uttryck i kolorektal cancerceller efter curcumin eller LiCl behandling. Prover ur kontroll celler eller celler som behandlas för 24 h med tre olika koncentrationer av (A) curcumin och (B) LiCl var löst på 10% polyakrylamidgeler med SDS-PAGE och utforskad med anti tau eller anti-phospho-tau antikropp. Densitometry analyser av Western blot resultaten presenteras på den högra panelen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: övergripande fosforylering av tau i obehandlad eller differentially behandlas cellprover som upptäcks av fosfatas analysens. Udda körfält Visa kontroll cell extrakt, medan även körfält visar fosfatas behandling av curcumin-behandlade eller LiCl-behandlade prover. Fosfatas behandling gjorde tau elektroforesiska mobiliteten snabbare än obehandlade prover, som innehöll fosforyleras tau. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: mikrotubuli bindningen av tau i kolorektal cancerceller upptäckts av mikrotubuli-bindande analysens. HCT 116 cell kontrollprover, curcumin-behandlade, eller LiCl-behandlade cellprover och E. coli tau inkuberades med mikrotubuli som beskrivs i avsnitt 4-protokollet. Motsvarande belopp av supernatanten (S) och pellet (P) bråk var immunoblotted med en anti tau antikropp. Negativ kontroll var som innehåller endast MT cykelbanor för att bekräfta att MT inte innehöll någon bunden endogena tau. Nedre panelen visar densitometry analyser av Western blotting av enskilda prover möjliggör jämförelse mellan supernatanten (obundna tau) och pellet (bundna tau) fraktioner. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Tau protein lokalisering prövas av confocal microscopy.
Tau lokaliserad perifert till nucleolus i kolorektal cancerceller. Vänstra paneler visar tau lokalisering identifieras med den anti tau monoklonala antikroppen mellersta paneler visar nucleus färgning av DAPI. Representativa exempel på behandlade cellerna visar tau flyttning in i cellkärnan visas också. Kontroll celler visade tau främst runt och utanför atomkärnor, medan tau i behandlade cellerna lokaliserade även inuti atomkärnor. Skalstapeln = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta manuskript etablerade olika processuella förutsättningarna för att upptäcka totalt tau och fosforyleras tau i kolorektal cancerceller behandlas med curcumin och LiCl. För att bedöma övergripande phosphorylation status för tau i protein prover, beskrevs ett fosfatas assay. Denna analys kan användas för att undersöka phosphorylation status för något protein.
Denna analys bygger på principen att fosforyleras protein rörelser långsammare än dess icke-fosforyleras tillstånd. Alkaliskt fosfatas och alkaliskt fosfatas buffert används i detta protokoll. Efter att analysen komponenterna till den cell lysates, bör prover inkuberas för en viss optimal varaktighet vid en viss temperatur. Efter inkubation, bör prover kokas i SDS prov bufferten att stoppa reaktionen. Olika experimentella protokoll kan tidigare ha använts att bedöma bindningen av tau till mikrotubuli. Mikrotubuli-bindande analysen presenteras här är lätt att utföra medan inklusive både positiva och negativa kontroller för att tillhandahålla kvalitetssäkring med hjälp av supernatanten och pellet fraktioner. MT-bara negativ kontroll användes för att kontrollera att MT inte innehåller någon bunden endogena tau. Dessutom rent mänskliga tau-352, användes en mikrotubulära-bindande tau som positiv kontroll. För att skilja det mikrotubulära-bindande bråket (pellets) från den icke-bindande bråkdel (supernatanten) ultrasnabba centrifugeringen användes; Detta förfarande kan vara en begränsning eftersom sådan en ultracentrifugen är dyra och inte allmänt tillgängliga. Dessutom, eftersom små mängder av prover är begagnade, lång, behövs tunn centrifugrör med adaptrar för användning i ultracentrifugen rotorn. Om det är möjligt att åter använda sådana tuber, är engångsbruk tillrådligt att undvika korskontaminering. Slutligen, en fördel med tau-lokalisering protokollet är att endast små mängder av primära och sekundära antikroppar behövs. Efter fixering, permeabilisering och blockering av den celler anhängare till coverslips, var en liten droppe av antikroppar deponeras på en liten bit av PVDF, som var då placerad inuti brunnarna 6-bra platta. Coverslips hölls så att antikroppen kunde komma åt cellerna. Med hjälp av detta protokoll, kan mängden antikroppar används minimeras.
Vissa försiktighetsåtgärder bör hållas i åtanke att säkerställa tillförlitliga och kvantifierbara resultat. För det första, strikt aseptisk teknik bör användas för att undvika kontaminering i cellodlingar och cell extrakt. Den kompletta RIPA lyseringsbuffert bör vara beredda färska. I fosfatas analysen är det viktigt att koka proverna för 3 min och börja SDS-PAGE omedelbart efter inkubation av fosfatas-behandlade och obehandlade prover. Tau-352 bör vara uppdelad i små portioner och förvaras på is efter borttagning från −20 ° C frysen och deponeras tillbaka in i frysen omedelbart efter användning. Efter uttagning ur den −80 ° C, MT bör bestånd hållas på is om återanvänds inom 72 h; Annars, förvara dem i rumstemperatur. PEM bufferten bör beredas enligt en 10 x koncentrerad lösning eftersom 1 x bufferten måste vara nybakade när GTP och paklitaxel läggs.
Tau funktioner regleras av omfattningen av dess fosforylering. Tau hyperphosphorylation uppstår inte i normala vuxna hjärnan tau liknar tau-352, som användes som positiv kontroll i mikrotubuli-bindande analysen. Hyperphosphorylation tau sker dock vid neurodegenerativa sjukdomar. Detta protokoll och efterföljande resultat visar att mänskliga kolorektal cancer cellinjer också bära fosforyleras tau likaså att det i Alzheimers sjukdom hjärnor. Behandling med hög dos curcumin och särskilt LiCl kan minimera tau fosforylering. Således en god korrelation mellan neurodegenerativa sjukdomar, som Alzheimers sjukdom och kolorektal cancer kan finnas när det gäller hyperphosphorylation tau och curcumin eller LiCl kan användas för att behandla både kolorektal cancer och Alzheimers sjukdom. Slutligen är studerar tau fosforylering och tau mikrotubulära bindande betydligt relevant inte bara för neurodegenerativa sjukdomar men också för vissa kemoterapeutika eftersom agenter som ändrar tau mikrotubulära bindande studeras dynamiskt som cancer Therapeutics51. De protokoll som presenteras här hjälper potentiellt upptäckten och utvecklingen av nya terapeutiska medel att behandla olika tauopathies och cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning utfördes som en del av projektet med titeln 'Utveckling och industrialisering av högt värde kosmetiska råvaror från Marina mikroalger' finansieras av departement av hav och fiske, Korea och stöddes av en intramural grant (2Z04930) från KIST Gangneung Institutet för naturliga produkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
