Summary
Dette manuskriptet beskriver standardprotokoller for å måle tau hyperphosphorylation, måle tau bindende piskehale som henger, og lokalisering av intracellulær tau etter medikamentelle behandlinger. Disse protokollene kan brukes gjentatte ganger for screening narkotika eller andre forbindelser som mål tau hyperphosphorylation eller microtubule-binding.
Abstract
Microtubule-assosiert protein tau er en neuronal protein som regionaliserer hovedsakelig i axons. Generelt er tau viktig for normal neuronal fungerer fordi det er involvert i microtubule montering og stabilisering. Foruten neurons, er tau uttrykt i menneskelig bryst og prostata, mage, colorectal, pancreatic kreft hvor det viser nesten liknende struktur og har lignende funksjoner som neuronal tau. Hvor mye tau og dens fosforylering kan endre dens funksjon som en stabilisator piskehale som henger, og føre til utvikling av sammenkoblede spiralformede filamenter i forskjellige nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom. Det er viktig å bestemme fosforylering staten tau og egenskapene microtubule-binding. I tillegg er undersøke den intracellulære lokaliseringen av tau viktig i ulike sykdommer. Dette manuskriptet detaljer standard protokoller for å måle tau fosforylering og tau binding til piskehale som henger i tykktarmskreft celler med eller uten curcumin og LiCl behandling. Disse behandlinger kan brukes å stoppe kreft celle spredning og utvikling. Intracellulær lokalisering av tau er undersøkt ved hjelp av immunohistochemistry og AC confocal mikroskopi mens du bruker små mengder av antistoffer. Disse analyser kan brukes gjentatte ganger for screening forbindelser som påvirker tau hyperphosphorylation eller microtubule binding. Romanen therapeutics brukes til ulike tauopathies eller relaterte anticancer agenter kan potensielt være preget bruker disse protokollene.
Introduction
Tau ble opprinnelig identifisert som en varme-stabil microtubule-assosiert protein som var co renset med tubulin1. Tau uttrykkes utelukkende i høyere eukaryoter2,3,4. Hovedfunksjonen til tau er å kontrollere microtubule montering1,5,6. Det bidrar også til av piskehale som henger7, axonal transport8, endringer i axonal diameter9, dannelsen av neuroma polaritet og neurodegeneration10. Tau fungerer også som en protein stillaset å kontrollere noen signalveier. Rotte hjernen studier tyder på at tau Nevron-spesifikke og at det først og fremst regionaliserer i axons11. Tau er avgjørende for microtubule polymerisasjon og neuronal utvikling, var tau hypotesen for å spille en viktig rolle i axonal utvikling i det sentrale nervesystemet; denne hypotesen ble senere bekreftet av eksperimenter i vitro og vivo . I tillegg til neurons, er tau uttrykt i forskjellige ikke-neuronal celler, inkludert lever, nyre og muskel celler12,13. Tau er også uttrykt i menneskelig bryst og prostata, colorectal, mage, bukspyttkjertelkreft cellen linjer og vev14,15,16,17,18, 19. tau er også funnet i inkludering kroppen myositt som vridd tubulofilaments i inkludering organer20.
Tau kan bære flere post-translasjonell modifikasjoner. Av alle post-translasjonell modifikasjoner er fosforylering den vanligste. Økt tau fosforylering reduserer sin affinitet for piskehale som henger, endelig destabiliserende cytoskeleton. Åttifem fosforylering nettsteder har blitt beskrevet i tau protein isolert fra menneskelige Alzheimers sykdom hjernen vev. Disse områdene utgjør 53% serine, 41% threonin, og bare 6% tyrosin rester21,22,23. Tau fosforylering påvirker beliggenheten, funksjon, binding, løselighet og sin mottakelighet for andre post-translasjonell endringer. Også tau fosforylering mer enn vanlig omfanget (eller mettede med fosfat grupper) som kalles hyperphosphorylation som reproduserer strukturelle og funksjonelle egenskaper av Alzheimers24. Tau opprettholder riktig funksjon av axonal piskehale som henger og sikrer normal neuronal fungerer under fysiologiske forhold. Imidlertid mislykkes hyperphosphorylated tau å opprettholde en velorganisert microtubule binding, forårsaker neuronal tap på grunn av microtubule demontering. Normale nivåer av tau fosforylering er nødvendig for riktig tau fungerer, men tau mislykkes å fungere normalt hvis karakteristiske fosforylering nivået endres og det er hyperphosphorylated25. Alzheimers sykdom og noen andre aldersrelaterte nevrodegenerative lidelser, tau blir hyperphosphorylated og danner par spiralformede filamenter og neurofibrillary ledninger26,27. Dermed er metoder for å bestemme tau fosforylering og microtubule binding viktig.
Tykktarmskreft, en aldrende-assosiert kreft, er tredje mest diagnostisert i tredje fremtredende død-forårsaker kreft for både menn og kvinner28. Colorectal cancer er en av de viktigste død som forårsaker kreft i den vestlige verden29. Fordi både kolorektal kreft og Alzheimers sykdom er forbundet med aldring og begge skjer hovedsakelig i de utviklede landene der folk nyte lignende kostvaner, kan de to sykdommene liksom være korrelert. I tillegg reagere tau-positive og tau-negative kreftceller forskjellig på chemotherapeutic agenter, f.eks, paklitaxel16.
Curcumin er en av de viktigste derivater av Curcuma longaindisk krydder gurkemeie30. I århundrer har sørasiatiske bestander fortært gurkemeie i kosten på daglig basis. Curcumin brukes til å behandle ulike sykdommer, inkludert tykktarmskreft, Alzheimers sykdom, diabetes, cystic fibrosis, inflammatorisk tarmsykdom, leddgikt, hyperlipidemi, åreforkalkning og iskemisk hjertesykdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan også drepe tykktarmskreft celler eller hindre deres spredning39. Litium kan også brukes for behandling av Alzheimers40 som det reduserer tau aggregering og hindrer sin hyperphosphorylation som observert i en transgene mus modell41,42,43, 44.
Dette manuskriptet har som mål å: 1) måle totale tau og phospho-tau uttrykk nivåer i behandlet celler. 2) Beskriv en fosfatase analysen for å måle samlede tau fosforylering; 3) undersøke microtubule-binding av tau; og 4) lokalisere tau av AC confocal mikroskopi i tykktarmskreft cellelinjer behandlet med curcumin eller LiCl. Resultatene viser at cellen behandling med curcumin, som er en angivelig bra chemotherapeutic agent for tykktarmskreft, og behandling med LiCl kan redusere uttrykk for både totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft linjer. Disse behandlinger kan også forårsake kjernefysiske translokasjon av tau. Imidlertid uventet mislykkes curcumin å forbedre binding av tau til piskehale som henger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. forberedelse av reagenser
- legge 10 µL av (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor løsning, 10 µL (1 x fra 100 x lager) protease hemmer cocktail løsning og 10 µL (1 x fra 100 x lager) av fosfatase hemmer cocktail løsning 1 mL 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer å forberede komplett RIPA lyseringsbuffer.
- Forberede 10 x generelle tubulin buffer (PEM) buffer.
- Add 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic syre, 10 mM (51 mg) MgCl 2 og 1,25 M (3 mL 10 M) NaOH i en 50-mL tube , bland med 15 mL destillert vann og løses ved hjelp av en spiral. Sjekk pH (skal være 6,9). Hvis pH > 6,9 forkaste buffer og gjøre mye frisk.
Merk: NaOH skal være under 1,25 M slik at pH ikke overshoot 6,9. Det anbefales ikke å bruke HCl for å justere pH > 6.9. - Legg til NaOH dropwise til pH er 6,9. Legge til destillert vann for å lage opptil 25 mL 10 X PEM-bufferen. Til slutt, filtrere ved hjelp av en sprøyte og filtere 0,2 µm sprøyten. Del denne bufferen i dele i 1,5 mL rør og lagre på 4 ° C.
- Add 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) etylenglykol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic syre, 10 mM (51 mg) MgCl 2 og 1,25 M (3 mL 10 M) NaOH i en 50-mL tube , bland med 15 mL destillert vann og løses ved hjelp av en spiral. Sjekk pH (skal være 6,9). Hvis pH > 6,9 forkaste buffer og gjøre mye frisk.
- Forberede 5 x prøve buffer med reduksjonsmiddel og fargestoff.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 2,5 mL (25%) av 50% glyserol, 1 mL (2%) av 10% natrium dodecyl sulfate (SDS) og 1.2 mL destillert vann utgjør 5 mL av 5 x SDS eksempel buffer. Lagre på − 20 ° C.
Merk: Glyserol er tyktflytende, måle 1,25 mL glyserol er vanskelig. En mL av 100% glyserol veier 1,26 g. Dermed veie 1.575 g 100% glyserol (som tilsvarer 1,25 mL av 100% eller 2,5 mL av 50% glyserol) i en 15 mL tube først. Bland godt med andre komponenter.
- Mix 300 µL (60 mM) 1 M Tris-HCl (pH 6.8), 2,5 mL (25%) av 50% glyserol, 1 mL (2%) av 10% natrium dodecyl sulfate (SDS) og 1.2 mL destillert vann utgjør 5 mL av 5 x SDS eksempel buffer. Lagre på − 20 ° C.
2. Kultur, behandling med Curcumin eller LiCl behandling og undersøkelse av Protein uttrykk
- Legg ~ 1 x 10 6 HCT 116 celler i 100 mm vev-kultur retter som inneholder Minimum Essential Media (MEM) med 10% fosterets storfe serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Etter en dag med dyrking, celler vil nå 60-70% samløpet.
Merk: Antall plater som trengs er avhengig av hvor mange behandlinger som beskrives under. - Når celler når ~ 65% samløpet (erstattet med mikroskopi), fjerne MEM supplert mediet og legge serum-free MEM med 5 µM, 10 µM, 30 µM curcumin eller 25 mM, 50 mM og 100 mM LiCl. Inkuber ved 37 ° C i 24 timer i en fuktet atmosfære som inneholder 5% CO 2.
- 24 h etter behandling, vask cellene med 1 mL iskald fosfat-bufret saltvann (PBS), og skrape celler ved hjelp av en celle skraper. Overføre skrapte cellene i 1,5 mL sentrifuge rør og sentrifuge for 4 min 1800 x g på 4 ° C å få celle pellets.
- Lyse cellene ved å stenge pellets i 100 µL av komplett RIPA buffer ved 4 ° C for 20 min mens regelmessig peke rørene. Sonicate prøvene kort.
- Sentrifuge celle homogenates i en Borstemmaskin centrifuge 22,570 x g for 20 min på 4 ° C. overføre supernatants til andre merket rør med en pipette.
- Måle protein konsentrasjonen i supernatants ved Bradford analysen 45 bruke kommersielle protein-analysen kits.
- Forberede prøver av lik protein konsentrasjon (10 µg protein/13 µL utvalget) av cellen lysates med 4 X SDS gel-lasting buffer. Forberedt 4 x SDS gel-lasting buffer frisk med 400 mM dithiothreitol (DTT).
Merk: På dette stadiet-prøver, kan lagres på − 20 ° C om nødvendig. - Incubate prøver på varme blokk ved 100 ° C i 5 min. blanding prøvene ved hjelp av en vortex og vente å avkjøle dem ~ 10-15 min.
- Sette en geleelektroforese system.
- Last 10 µg protein (13 µL utvalget) per brønn på en 10% SDS-polyakrylamid gel for geleelektroforese (SDS-side). Laste molekylvekt stigen på gel til ett kjørefelt.
Merk: Når geleelektroforese starter, løser protein stigen i protein band av tilsynelatende molekylvekt. Bruk disse bandene til å beregne molekylvekt av ukjent protein bandene. - Etter lasting prøvene, koble de positive og negative elektrodene av geleelektroforese til strøm til å opprettholde et konstant spenning. Først begynne på 70 V for 20 min å flytte protein prøvene fra stabling gel til løse gel. Deretter øke spenningen til 125 V for ca 70-120 min til prøver og protein stige når slutten av gel.
- Etter gjennomføringen av geleelektroforese, overføre gel til en polyvinylidene difluoride (PVDF) membran med en våt electroblotting system. Overføre for ~ 100 min 100 V. blokk membranen i 4% bovin serum albumin (BSA) blokkerer buffer for 90 min ved romtemperatur rundt 25 ° C.
- Last 10 µg protein (13 µL utvalget) per brønn på en 10% SDS-polyakrylamid gel for geleelektroforese (SDS-side). Laste molekylvekt stigen på gel til ett kjørefelt.
- Merke blot ved å klippe det på siden med molekylvekt stigen. Bruke gjennomsiktig plast ark og skarp kniv for å kutte blot. Forberede den primære-antistoff løsninger (anti-tau på 1:5, 000, anti-phospho-tau på 1:4, 000) og ruge blot i denne løsningen på 4 ° C over natten.
- Overnatting inkubasjon vaskes blot i 7 min fire ganger i fosfat-bufret saltholdig-Tween-20 (PBST) løsning.
- Forberede de relevante sekundære-antistoff løsningene (geit anti-kanin eller anti-musen IgG 1:5, 000) og ruge blot i denne løsningen for 90 min ved romtemperatur rundt 25 ° C. vask i PBST fire ganger, 7 min.
- Utvikle blot bruke en chemiluminescence kit ifølge produsenten ' s anbefalinger. Dekk blot bruke en gjennomsiktig plast brytes. Hente bilder av en chemiluminescence tenkelig system for chemiluminescence relevant programvare.
3. Fosfatase analysen
- Behandle celle lysates (fra trinn 2.5) med alkalisk fosfatase i alkalisk fosfatase bufferen.
- For begge kontrollere og behandlet prøver, forberede 20 µL eksempler som inneholder 20 µg totale protein. Legg volumet av celle lysates som inneholder 20 µg totale protein, etterfulgt av 2 µL alkalisk fosfatase buffer og 10 µL alkalisk fosfatase. Legge destillert vann utgjør 20 µL.
- Ruge prøvene på 37 ° C for 1 h. stoppe reaksjonen ved å legge ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) på en siste konsentrasjon av 50 mM eller legge til natrium orthovanadate (Na 3 VO 4) i en siste konsentrasjon av 10 mM. Reaksjonen kanne likeledes være stanset ved 75 ° C i 5 min.
- Før inkubasjon av prøver med fosfatase er ferdig, forbereder prøver den samme konsentrasjon uten å legge fosfatase for sammenligning med fosfatase-behandlet prøver.
- Legg til nylagde 4 X SDS gel-lasting buffer med 400 mM DTT.
- Ruge prøvene på varme blokk ved 100 ° C i 5 min. blanding prøvene med en vortex. Kul ved romtemperatur for ~ 10-15 min.
- Montere et geleelektroforese system for å kjøre en 10% polyakrylamid gel av SDS side.
- Last 10 µg protein (13 µL utvalget) per brønn på en 10% polyacrylamide gel. Laste molekylvekt stigen.
- Etter lasting prøven, koble de positive og negative elektrodene av geleelektroforese til strøm til å opprettholde et konstant spenning. Først begynne på 70 V for 20 min å flytte protein prøvene fra stabling gel til løse gel. Deretter øke spenningen til 125 V og kjøre gel for ca 70-120 min til prøver og protein stige når slutten av gel.
- Etter gjennomføringen av geleelektroforese, overføre gel på en PVDF membran med en våt electroblotting system. Overføre for ~ 100 min 100 V.
- Merke blot ved å gjøre et lite kutt på side molekylvekt stigen. Bruke gjennomsiktig plast ark og skarp kniv for å kutte blot.
- Blokkere membranen i 4% BSA blokkerer buffer for 90 min ved romtemperatur.
- Ruge blot i primær-antistoff løsning (anti-tau på 1:5, 000) på 4 ° C over natten. Vask blot i PBST fire ganger, i 7 min.
- Forberede den relevante sekundære-antistoff løsningen (geit anti-mus IgG på 1:5, 000) og ruge blot i 90 min ved romtemperatur. Vask i PBST fire ganger, i 7 min.
- Utvikle blot bruke en chemiluminescence kit ifølge produsenten ' s anbefalinger. Dekk blot i en gjennomsiktig plast brytes. Hente bilder av en chemiluminescence tenkelig system for chemiluminescence relevant programvare.
4. Microtubule-bindende analysen
- For microtubule bindende analysen, Gjenta trinn 2.1-2.6.
- Forberede 1 X (2 mL) PEM buffer fra 10 X PEM-bufferen lagret på 4 ° C ved å legge til 20 µM (40 µL) paklitaxel og 1 mM (20 µL) GTP. Ta av microtubule (MT) lager fra − 80 ° C fryser og E. coli tau arbeider lageret fra − 20 ° C fryseren.
- Forberede eksempler per tabell 1.
- Ruge på 37 ° C for 30 min. Ultracentrifuge ved 25 ° C for 60 min 100.000 x g.
- Overføre 120 µL av supernatants som inneholder ubundet tau, til å rengjøre og merket rør.
- Legge til 120 µL (samme volum som nedbryting) 5 X prøve buffer pellet som inneholder bundne tau og bland godt. Overføre løsningen å feilfri merket rør og bland godt.
- Måle protein konsentrasjonen (se trinn 2.6).
Merk: Mens forbereder prøver, bruke volumet av stoppløsningen (trinn 4.6) for å forberede både pellets og nedbryting. - Forberede prøver av tilsvarende protein konsentrasjon og legge ferskt tilberedte 4 x SDS gel-lasting buffer med DTT (400 mM).
Merk: Utvalg kan lagres på − 20 ° C på dette stadiet. - Gjenta trinn 3.5-3.10.
| eksempel | navn | Microtubule nødvendig | Main Protein trengs | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | HCT 116-kontroll (6.21 μg/μl) | 2 μl | 9.66 μl (60 μg) | 108.34 μl | ||||
| 2 | HCT 116-Curcumin 10 μM (4.81 μg/μl) | 2 μl | 16.63 μl (80 μg) | 101.37 μl | ||||
| 3 | HCT 116-Curcumin 20 μM (3,28 μg/μl) | 2 μl | 30.49 μl (100 μg) | 87.51 μl | ||||
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5,43 μg/μl) | 2 μl | 18.42 μl (100 μg) | 99.58 μl | ||||
| 5 | E. coli tau | 2 μl | 1 μl tau-352 | 117 μl | ||||
| 6 | MT bare | 2 μl | X | 118 μl | ||||
| < td colspan = " 2"> | 120 μl hver | |||||||
tabell 1: prøve forberedelse til microtubule-bindende analysen.
5. lokalisering og uttrykk i Tau etter behandling av celler med Curcumin
- ren en dekkglassvæske med 70% etanol og tørr med et laboratorium vev. Sette inn en enkelt dekkglassvæske i hver brønn av en merket 6-og vev-kultur plate. Plasser platen på en biologiske sikkerhetskabinett skap og slå på et UV lys for minst 3 h.
- Subkultur cellene og frø dem til relevante brønnene av 6-vel plate på 2.5 x 10 5 celler/godt i anbefalte kultur medium.
- Etter ~ 24 h, undersøke cellene med en invertert mikroskopet ved hjelp 10 X og 40 X mål kontroll av mobilnettet morfologiske endringer. Tar bilder om nødvendig.
- Skyll cellene to ganger med PBS. Fastsette cellene i 3,7% formaldehyd i en 37 ° C inkubator i mørket.
Merk: Fiksering av formaldehyd ved romtemperatur fungerer bra, også. Bruke riktig personlig verneutstyr når du håndterer formaldehyd. - Vask cellene i PBS. Fastsette celler i iskalde metanol i − 20 ° C i 15 min. Permeabilize cellene av rugende dem 3% BSA og 0,1% Triton X-100 i PBS på is 10 min. vaske cellene med PBS.
- Ruge cellene i blokkering buffer (3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS løsning) 1t ved romtemperatur.
Merk: Inkubasjonstiden for 2t 4 ° c fungerer bra, også. - Forberede primær-antistoff (anti-tau på 1:200) løsningen i 3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS (f.eks, 2 µL tau-13 antistoff 0,4 mL buffer).
- Små biter av en PVDF membran slik at brikkene passer ordentlig i hver brønn av 6-vel plate; suge dem i vann i 5 min. sted kuttet PVDF i hver brønn.
- Legg til 60 µL av primære antistoff løsning kuttet PVDF brikker i hver brønn. Plass coverslips slik at cellene kan røre primær-antistoff løsningen. Ruge på 4 ° C i en mørk, fuktig kammer over natten. Vask i PBS fire ganger.
- Forberede sekundær-antistoff løsningen (fluorescein-konjugerte 594 anti-mus IgG på 1:400) i 3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS.
- Kuttet i små biter av en PVDF membran slik at brikkene passer ordentlig i hver brønn av 6-vel plate, og suge dem i vann i 5 min. sted kuttet PVDF i hver brønn.
- Legge til 80 µL av sekundær-antistoff løsningen hver PVDF stykker i 6-vel plate. Plass dekkglassvæske slik at cellene kan røre sekundær-antistoff løsningen. Inkuber i en mørk, fuktig kammer ved romtemperatur for 2 h. vask med PBS fire ganger.
- Mount prøver i montering medium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og fastsette coverslips på glass lysbilder.
- Legg en dråpe montering mediet med DAPI på glass lysbilder. Fjerne coverslips fra hver brønn og plassere dem på glass lysbilder som inneholder montering mediet med DAPI. Sørg for at overflaten av hver dekkglassvæske som inneholder farget celler berører fjellting medium på den tilsvarende objektglass.
- Bruk neglelakk rundt hver dekkglassvæske å forsegle og fikse dem lufttett på glass lysbilder. Eventuelt gjøre dette trinnet to ganger.
- Incubate for 1,5 t i romtemperatur i en mørk kammer.
- Undersøke lysbildene ved hjelp AC confocal mikroskop av neddyppingsolje på dekkglassvæske i et mørkt rom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uttrykk for total tau og phospho-tau ble undersøkt etter behandling av celler med ulike konsentrasjoner av curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling av celler med tre forskjellige konsentrasjonen av curcumin redusert tau uttrykk nivåer; men phospho-tau uttrykk økt på behandling med lav konsentrasjon av curcumin, men redusert ved behandling av celler med høyere curcumin konsentrasjoner. Anti-phospho-tau (Ser396) ble brukt for påvisning av phospho-tau. Både totale tau og phospho-tau redusert ved behandling av celler med tre forskjellige konsentrasjonen av LiCl (figur 1). Tidligere forskning hadde vist at tau uttrykk nivåene variere i forskjellige kreftformene og på ulike steder av samme kreft. Tidligere data på tykktarmskreft viste at tau ble uttrykt i to cellelinjer (HCT 116 og SW480) av kolorektal kreft som var også fosforylert19. Phospho-tau nivåer i cellene behandlet med 5 µM curcumin var høyere enn i ubehandlet celler. Phospho-tau nivåer var høyere enn totalt tau i cellene behandlet med samme konsentrasjonen av curcumin. Behandling av celler med 10 µM curcumin redusert phospho-tau nivå sammenlignet med ubehandlet celler men phospho-tau uttrykk var fortsatt mer enn totalt tau uttrykk nivåer. Behandling av celler med 30 µM curcumin senket phospho-tau uttrykk sammenlignet med phospho-tau i ubehandlet celler og totale tau nivåer i samme behandlet cellene.
Dette manuskriptet etablert en enkel protokoll for vurdere fosforylering status tau ved en fosfatase analysen (figur 2). Etter curcumin behandling, generelle tau fosforylering endret ikke betydelig og fosforylering på bestemte aminosyre rester var betydelig (figur 1). Samlet ble tau fosforylering stoppet i cellene behandlet med LiCl mot ubehandlet celler. Fosfatase-behandlet prøver electrophoresed raskere enn ubehandlet prøver, bekrefter at ubehandlet prøvene var mer hyperphosphorylated enn fosfatase-behandlet prøver. Curcumin-behandlet celler viste nesten de samme resultatene, indikerer at behandling av colorectal kreftcelle linjer ikke redusere tau fosforylering som vist i figur 1. Både fosfatase behandlet og ubehandlet prøver electrophoresed på nesten samme område i prøver av cellene behandles med LiCl, som indikerer at tau fosforylering i disse cellene ble redusert (figur 2). Her, ble høye konsentrasjoner (20 µM eller 30 µM) av curcumin-behandlet prøver tatt sammenligne samlet fosforylering status, som lav konsentrasjon behandling viste høyere områdespesifikke fosforylering avslørt av bestemte phospho-tau (S396) antistoff.
Videre i dette laboratoriet etablert microtubule bindende analysen av cellen prøver vellykket med tau-352 som positive kontroll og bare MT som en negativ kontroll (Figur 3). For både curcumin og LiCl behandling, var microtubule-binding aktivitet hemmet, som demonstrert av microtubule bindende analysen. I dette eksperimentet viser curcumin behandling ikke microtubule bindende evner men hemmet bindingen lik som i tidligere studier46,-47, mens det var effektivt å hemme områdespesifikke tau fosforylering på høyere konsentrasjon. I figur 1resulterte 10 µM curcumin behandlingen i minimal uttrykk for phospho-tau sammenlignet med kontrollen, men høyere uttrykk enn totalt tau. Men ble microtubule-innbindingen behandlingskapasitet av tykktarmskreft tau etter curcumin behandling og lav konsentrasjon av LiCl behandling redusert i ubehandlet utvalget. Områdespesifikke tau fosforylering effekter microtubule og selv aggregering og48. Tau fosforylering på proline-rik region hindret microtubule-bindingsegenskapene mens C-terminalen regionen økt disse egenskapene, og begge regioner med MT-bindende område mindre bindende egenskaper ved ca 70% og uordnede den piskehale som henger48. Noen andre faktorer som andre webområdemålrettede fosforylering av tau kan være involvert for denne microtubule destabilisering av tykktarmskreft tau behandlet med curcumin eller LiCl.
En enkel protokoll med små mengder av primære og sekundære antistoffer aktivert lokalisering av tau i tykktarmskreft linjer etter curcumin behandling (Figur 4). Resultatene viste at tau hadde translocated til kjernen etter curcumin behandling, et funn som ligner tidligere studier rapporterer at kjernefysisk tau er en sentral aktør i neuronal DNA beskyttelse i nevrodegenerative sykdommer som Alzheimers sykdom49 ,50.
Figur 1: Tau og phospho-tau uttrykk i tykktarmskreft celler etter curcumin eller LiCl behandling. Eksempler Hentet fra kontroll celler eller celler som behandles for 24 timer med tre ulike konsentrasjoner av (A) curcumin og (B) LiCl ble løst på 10% polyakrylamid gels SDS-side og analysert med anti-tau eller anti-phospho-tau antistoff. Densitometry analyser av Western blot resultatene presenteres på det høyre panelet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: samlet fosforylering av tau i ubehandlet eller behandles ulikt celle prøver oppdaget av fosfatase analysen. Ulike baner Vis kontroll celle ekstrakter, mens selv baner Vis fosfatase behandling av curcumin-behandlet eller LiCl-behandlet. Fosfatase behandling gjorde tau electrophoretic mobilitet raskere enn ubehandlet prøver, som inneholdt fosforylert tau. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Microtubule binding av tau i tykktarmskreft celler oppdaget av microtubule-bindende analysen. Kontroll HCT 116 celle prøver, curcumin behandlet, eller LiCl-behandlet celle prøver og E. coli tau ble inkubert med piskehale som henger som beskrevet i Seksjon 4-protokollen. Tilsvarende mengder av nedbryting (S) og pellets (P) fraksjoner var immunoblotted med et anti-tau antistoff. Negativ kontroll baner som inneholder bare MT ble drevet til å bekrefte at MT ikke inneholder noen bundet endogene tau. Nedre panel viser densitometry analyser av vestlige blots av personlige prøver muliggjør sammenlikning nedbryting (ubundet tau) og pellets (bundet tau) fraksjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Tau protein lokalisering undersøkt av AC confocal microscopy.
Tau lokalisert perifert til kjerne i tykktarmskreft celler. Venstre panel viser tau lokalisering oppdaget bruker anti-tau monoklonalt antistoff mens middels paneler Vis kjernen farging av DAPI. Representative eksempler på behandlet celler viser tau translokasjon i kjernen vises også. Kontroll celler viste tau hovedsakelig rundt og utenfor kjerner, mens tau i behandlet celler lokalisert også inne kjerner. Skala bar = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette manuskriptet etablert forskjellige fremgangsmåter for betingelser for å oppdage totale tau og fosforylert tau i tykktarmskreft celler behandlet med curcumin og LiCl. For å vurdere samlet fosforylering status for tau i protein prøver, ble en fosfatase analysen beskrevet. Denne analysen kan brukes til å undersøke statusen fosforylering noen protein.
Denne analysen er basert på prinsippet om at fosforylert protein trekk tregere enn tilstanden ikke-fosforylert. Alkalisk fosfatase og alkalisk fosfatase bufferen brukes i denne protokollen. Etter tilføyer analysen komponentene til celle lysates, bør prøver være ruges for en bestemt optimal varighet på en bestemt temperatur. Etter inkubasjon skal prøver kokes i SDS eksempel bufferen stoppe reaksjonen. Tidligere kan annerledes eksperimentell protokollene ha blitt brukt til å vurdere binding av tau til piskehale som henger. Microtubule-bindende analysen presenteres her er enkel å utføre mens blant både positive og negative kontroller for å gi kvalitet sikkerhet bruker nedbryting og pellets fraksjoner. MT-bare negative kontrollen ble brukt til å bekrefte at MT ikke inneholder noen bundet endogene tau. I tillegg rent menneskelige tau-352, ble en microtubule-binding tau brukt som positive kontrollen. For å skille brøken microtubule-binding (pellet) fra uforpliktende brøkdel (supernatant) ultrahastighet sentrifugering ble brukt; denne fremgangsmåten kan skyldes en begrensning slik en ultracentrifuge er dyrt og ikke allment tilgjengelig. I tillegg fordi små mengder av prøver er brukt, lang, er tynn sentrifuge rør med adaptere nødvendig for bruk i ultracentrifuge rotoren. Om det er mulig å bruke slike rør, anbefales bruke én for å unngå kryss-kontaminering. Til slutt, en fordel av tau-lokalisering-protokollen er at bare små mengder av primære og sekundære antistoffer er nødvendig. Etter fiksering, permeabilization og blokkering av celler tilhenger til coverslips, var en liten dråpe antistoff avsatt på et lite stykke PVDF, som ble så plassert i brønnene av en 6-vel plate. Coverslips ble holdt slik at antistoffer kan få tilgang til cellene. Bruker denne protokollen, kan mengden av antistoffer brukes minimeres.
Forholdsregler bør holdes i bakhodet å sikre pålitelig og målbare resultater. Først strenge aseptiske teknikker bør brukes til å unngå forurensning i cellekulturer og celle ekstrakter. Komplett RIPA lyseringsbuffer bør være forberedt frisk. Fosfatase analysen er det viktig å koke prøvene for 3 min og starte SDS side umiddelbart etter inkubasjon fosfatase behandlet og ubehandlet. Tau-352 bør være delt inn i små dele og holdt på is etter fjerning fra −20 ° C fryseren og satt tilbake i fryseren straks etter bruk. Etter fjerning fra den −80 ° C, MT bør aksjer holdes på is hvis på nytt innen 72 timer; ellers, holde dem ved romtemperatur. PEM bufferen bør være forberedt som 10 x konsentrert løsning fordi 1 x bufferen må være nystekte når GTP og paklitaxel.
Tau funksjoner er regulert av omfanget av sin fosforylering. Tau hyperphosphorylation forekommer ikke i normal voksen hjerne tau ligner på tau-352, som ble brukt som positive kontroll i microtubule-bindende analysen. Men skjer tau hyperphosphorylation i nevrodegenerative sykdommer. Denne protokollen og påfølgende resultatene viser at menneskelige tykktarmskreft cellelinjer også bære fosforylert tau slik som i Alzheimers sykdom hjernen. Behandling med høy dose curcumin og spesielt LiCl kan redusere tau fosforylering. Derfor en god sammenheng mellom nevrodegenerative sykdommer, som Alzheimers sykdom og endetarmskreft kan finnes i forhold til tau hyperphosphorylation, og curcumin eller LiCl kan brukes til å behandle både kolorektal kreft og Alzheimers sykdom. Endelig, studerer tau fosforylering og tau microtubule binding er betydelig relevant ikke bare for nevrodegenerative sykdommer men også for noen chemotherapeutics fordi agenter som endrer tau microtubule binding er dynamisk studerte som kreft Therapeutics51. Protokollene presenteres her vil potensielt hjelpe oppdagelsen og utvikling av nye terapeutiske agenter til å behandle ulike tauopathies og kreft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noe å avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble utført som del av prosjektet med tittelen "Utvikling og industrialisering av høy verdi kosmetisk råvarer fra marine mikroalger", finansiert av departementet av hav og fiskeri, Korea og ble støttet av en intramural stipend (2Z04930) fra KIST Gangneung Institutt for naturlige produkter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
- Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
- Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
- Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
- Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
- Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
- Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
- Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
- Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
- Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
- Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
- Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
- Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
- Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
- Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
- Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
- Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
- Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
- Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
- Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
- Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
- Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
- Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
- Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
- Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
- Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
- American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
- Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
- Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
- Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
- Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
- Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
- Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
- Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
- Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
- Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
- Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
- Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
- Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
- Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
- Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
- Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
- Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
- Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
- Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
- Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
- Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
- Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).
