Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2
1Systems Biotechnology Research Center, KIST Gangneung Institute of Natural Products, 2Division of Bio-Medical Science & Technology, KIST School, Korea University of Science and Technology

Summary

Эта рукопись описывает стандартные протоколы для измерения Тау hyperphosphorylation, измерения Тау привязки микротрубочек и локализация внутриклеточных Тау, после медикаментозного лечения. Эти протоколы могут использоваться многократно для скрининга наркотиков или других соединений, которые нацелены Тау hyperphosphorylation или микротрубочек привязки.

Abstract

Микротрубочки связанные белка Тау — нейронов белок, локализуется преимущественно в аксонов. Как правило Тау имеет важное значение для нормального функционирования нейронов, потому что он участвует в Ассамблее микротрубочек и стабилизации. Кроме того, нейроны Тау выражается в груди человека и предстательной железы, желудка, толстой кишки, поджелудочной железы, где он показывает почти аналогичные структуры и оказывает аналогичные функции как нейрональных Тау. Количество Тау и его фосфорилирование может изменить свою функцию как стабилизатор микротрубочек и привести к развитию парных винтовой нитей в различных нейродегенеративных расстройств, таких как болезнь Альцгеймера. Определение состояния фосфорилирование Тау и его характеристики микротрубочек привязки имеет важное значение. Кроме того изучение внутриклеточной локализации Тау имеет важное значение в различных заболеваний. Эта рукопись детали стандартные протоколы для измерения Тау фосфорилирования и Тау связывание микротрубочек в клетках рака прямой кишки с или без куркумин и LiCl лечения. Эти процедуры может использоваться для остановки распространения раковых клеток и развитию. Внутриклеточной локализации Тау проверяется с помощью иммуногистохимии и конфокальная микроскопия при использовании низкого количества антител. Эти анализы могут использоваться многократно для проверки соединений, которые влияют на hyperphosphorylation Тау или привязки микротрубочек. Роман терапии используется для различных tauopathies или потенциально связанные противоопухолевых агентов можно охарактеризовать с помощью этих протоколов.

Introduction

Тау первоначально была определена как тепло stable микротрубочек связанный белок, который был совместной очищенную с тубулин1. Тау исключительно выражается в высших эукариот2,3,4. Основная функция Тау является контроль микротрубочек Ассамблея1,5,6. Он также способствует полимеризации микротрубочек7, аксональное транспорта8, изменения в аксональное диаметр9, формирование Неврома полярности, и нейродегенеративные10. Тау также действует как белка лески для управления некоторые сигнальные пути. Исследования мозга крысы предположить что Тау нейрон конкретной и что он локализуется преимущественно в аксоны11. Потому что Тау имеет важное значение для полимеризации микротрубочек и развития нервной системы, Тау был предположить, чтобы играть важную роль в аксональное развития центральной нервной системы; Эта гипотеза была позднее подтверждена экспериментах in vitro и in vivo . В дополнение к нейронов Тау выражается в различных не нейрональных клеток, включая печень, почки и мышечные клетки12,13. Тау выражается также в груди человека, простаты, толстой кишки, желудка и рака поджелудочной железы клетки линии и тканей14,15,16,17,18, 19. Тау встречается также в миозит включение тело как витой tubulofilaments включения органов20.

Тау могут нести несколько столб-поступательные изменения. Из всех столб-поступательные изменения фосфорилирование является наиболее распространенным. Увеличение Тау фосфорилирование уменьшается его сродство для микротрубочек, наконец дестабилизации цитоскелета. Восемьдесят пять фосфорилирование сайты были описаны в белка Тау, изолированных от тканей мозга человека болезни Альцгеймера. Из этих сайтов 53% составляют Серин, треонин 41% и только 6% тирозин остатков21,22,23. Тау фосфорилирование влияет на его локализации, функции, привязки, растворимость и его восприимчивости к другой столб-поступательные изменения. Также Тау фосфорилирование более чем нормальной степени (или полностью насыщенных с фосфатными группами) известен как hyperphosphorylation, которая реплицирует структурные и функциональные характеристики болезни Альцгеймера24. Тау поддерживает надлежащее функционирование аксональное микротрубочек и обеспечивает нормальное функционирование нейронов в физиологических условиях. Однако hyperphosphorylated Тау не поддерживать привязку хорошо организованной микротрубочек, гибели нейронов вследствие микротрубочек разборки. Нормальные уровни Тау фосфорилирование необходимы для надлежащего функционирования Тау, но Тау не может нормально функционировать, если его характерные фосфорилирование уровень изменяется, и если это hyperphosphorylated25. В болезни Альцгеймера и некоторые другие связанные с возрастом нейродегенеративных расстройств Тау становится hyperphosphorylated и образует парные спиральные нити и нейрофибриллярных клубков26,27. Таким образом важное значение имеют методы определения Тау фосфорилирования и микротрубочек привязки.

Колоректальный рак, старение связанных, является третьим наиболее часто диагноз рака и третий выдающийся причиной смерти для мужчин и женщин28. Колоректальный рак является одной из главной причиной смерти рака в западном мире29. Потому что колоректального рака и болезни Альцгеймера, связанные со старением, и оба происходят главным образом в развитых странах, где люди наслаждаются аналогичные пищевые привычки, двух заболеваний могут быть каким-то образом связаны. Кроме того Тау позитивных и негативных Тау раковые клетки реагируют по-разному химиотерапевтических агентов, например, паклитаксел16.

Куркумин является одним из основных производных Куркума longa, индийские специи куркумы30. На протяжении веков Южной Азии населения потребляли куркумы в их диетпитаниях на ежедневной основе. Куркумин используется для лечения различных заболеваний, включая колоректальный рак, болезнь Альцгеймера, диабет, кистозный фиброз, воспалительные заболевания кишечника, артрит, гиперлипидемия, атеросклероз и ишемическая болезнь сердца31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. лития может также убить колоректальные раковые клетки или предотвращения их распространения39. Лития может также использоваться для лечения болезни Альцгеймера40 , как он уменьшает Тау агрегации и предотвращает его hyperphosphorylation, как отмечено в трансгенные мыши модель41,,4243, 44.

Эта рукопись направлена на: 1) измеряют всего Тау и уровни выражения фосфо Тау в очищенной ячейки; 2) описывают фосфатазы пробирного для измерения общей Тау фосфорилирования; 3) изучить микротрубочек привязки Тау; и 4) локализовать Тау, confocal микроскопии в клеточных линиях колоректального рака лечение куркумин или LiCl. Результаты показывают, что клеток лечение с куркумин, который якобы хорошего химиотерапевтического агента для рака толстой кишки, и лечение с LiCl может уменьшить выражение как общая Тау и фосфорилированных Тау в colorectal рак клеточных линий. Эти процедуры могут также вызвать ядерный транслокации Тау. Однако неожиданно, куркумин не улучшить связывание Тау микротрубочек.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка реагентов

  1. Добавить 10 мкл (1 мм) phenylmethylsulfonyl фторида раствор, 10 мкл (1 x из 100 x запасов) ингибитор протеазы коктейль решения и 10 мкл (1 x из 100 x запасов) фосфатазы ингибитор коктейль решение по 1 мл 1 x radioimmunoprecipitation проба (RIPA) буфера подготовить полный буфера lysis RIPA.
  2. Подготовка 10 x буфер буфера (PEM) общего тубулина.
    1. Добавить 800 мм (6.0474 g) пиперазина N-N ' - бис - 2-ethanesulfonic кислота, 10 мм (95,1 мг) этиленгликоль bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic кислота, MgCl 10 мм (51 мг) 2 и 1,25 М (3 мл 10 м) NaOH в 50-мл трубку , смешать с 15 мл дистиллированной воды и распустить с помощью вихря. Проверьте рН (должно быть 6.9). Если рН > 6.9, сбросить буфер и переделать много свежих.
      Примечание: NaOH должна быть ниже 1,25 М для обеспечения что рН не выброс 6,9. Не рекомендуется использовать HCl для регулировки рН > 6.9.
    2. Добавление NaOH каплям до рН 6,9. Добавьте дистиллированной воды, чтобы сделать до 25 мл 10 X PEM буфера. Наконец фильтр, с помощью шприца и 0,2 мкм фильтром шприц. Разделите этот буфер на аликвоты в 1,5 мл пробирок и хранить при 4 ° C.
  3. Подготовка 5 x буфер образца с восстанавливающего агента и краситель.
    1. Смесь 300 мкл (60 мм) 1 М трис-HCl (рН 6,8), 2,5 мл (25%), 50% глицерина, 1 мл (2%), лаурилсульфат натрия 10% (СДП) и 1,2 мл дистиллированной воды составляют 5 мл 5 x буфер образца SDS. Хранить в − 20 ° с.
      Примечание: Потому что глицерин вязкой, измерения 1,25 мл глицерина сложно. 1 мл 100% глицерина весит 1.26 g. Таким образом, весят 1.575 g 100% глицерина (что составляет 1,25 мл 100% или 2,5 мл 50% глицерина) в 15 мл трубки; хорошо перемешать с другими компонентами.

2. Клетки культуры, лечение с куркумин или LiCl лечение и обследование выражения протеина

  1. Добавить ~ 1 х 10 6 HCT 116 клеток в 100 мм культуры ткани блюд, содержащих минимум основных СМИ (MEM) с 10% плода говядину сыворотка (ФБС) и 1% пенициллин стрептомицином. После одного дня культивирования клеток достигнет 60-70% впадения.
    Примечание: Количество пластин необходимо зависит количество процедур, описанных ниже.
  2. Когда клетки достичь слияния ~ 65% (аппроксимировать с помощью микроскопии), удалите MEM дополнено средней и добавить сыворотки свободный MEM с 5 мкм, 10 мкм, 30 мкм куркумин или 25 мм, 50 мм и 100 мм LiCl. Инкубировать при 37 ° C в течение 24 часов в атмосфере увлажненные, содержащих 5% CO 2.
  3. 24 ч после лечения, вымыть клетки с 1 мл ледяной фосфат амортизированное saline (PBS) и скрип клетки, клетки скребком. Передача царапины клетки в 1,5 мл центрифуга трубы и центрифуги для 4 мин, при 1800 x g при 4 ° C для получения клеток гранулы.
  4. Лизируйте клетки, приостановив гранулы в 100 мкл полный буфер RIPA на 4 ° C в течение 20 минут во время регулярно выстукивать трубы. Sonicate образцы кратко.
  5. Центрифуга гомогенатах клеток в настольная центрифуга на 22,570 x g 20 мин на 4 ° C. передать другие обозначенные трубки с помощью пипетки supernatants.
  6. Измерения концентрации белка в supernatants Брэдфорд пробирного 45 с использованием коммерческих assay протеина наборы.
  7. Подготовка образцов равных белка концентрации (10 мкг белка/13 мкл пример) lysates клетки с 4 X SDS гель загрузки буфера. Подготовлено 4 x SDS гель загрузки буфера свежие, содержащие 400 мм Дитиотреитол (ДТТ).
    Примечание: На данном этапе образцы могут храниться в − 20 ° C в случае необходимости.
  8. Инкубировать образцы на блоке тепла при 100 ° C за 5 мин Mix образцы с помощью вихря и ждать, чтобы охладить их на ~ 10-15 мин
  9. Сборка системы электрофореза.
    1. Нагрузки 10 мкг белка (13 мкл пример) также на 10% геле полиакриламида SDS для электрофореза (SDS-PAGE). Загрузить молекулярный вес лестница на гель до одной полосы.
      Примечание: Как электрофорез начинает, белок лестница будет разрешить в белок полос очевидно молекулярным весом. Использовать эти диапазоны для оценки молекулярным весом полос неизвестный белок.
    2. После загрузки образцов, подключите положительные и отрицательные электроды электрофореза системы к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начинаются 70 V для 20 минут переместить образцы протеина от штабелируя гель в разрешая гель. Затем увеличить напряжение 125 V для примерно 70-120 мин до конца геля образцов и белка лестница.
    3. После окончания электрофореза, передачи гель винилидена мембраны фторид (PVDF), с помощью системы мокрой electroblotting. Передачи для ~ 100 мин 100 V. блок мембрану в блокирующем буфере 4% бычьим сывороточным альбумином (БСА) 90 мин при комнатной температуре около 25 ° с.
  10. Марк помаркой, резки его на стороне с молекулярным весом лестница. Используйте прозрачный пластиковый лист и резким резак для резки блот. Подготовить решения первичного антитела (анти Тау 1:5, 000; анти фосфо Тау 1:4, 000) и инкубировать пятно в этом растворе на 4 ° C на ночь и.
  11. После ночи инкубации, стирать пятно для 7 мин четыре раза в растворе фосфат амортизированное saline-Tween-20 (PBST).
  12. Подготовить соответствующие решения средних антитела (коза анти кролика или анти мыши IgG 1:5, 000), и инкубировать пятно в этом решении 90 мин при комнатной температуре около 25 ° C. мыть в PBST четыре раза, 7 мин и.
  13. Разработка пятно с помощью хемилюминесценции kit по заявлению производителя ' s рекомендации. Обложка пятно с помощью прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений, хемилюминесценция Система для хемилюминесценции с соответствующим программным обеспечением.

3. Фосфатаза Assay

  1. лечения lysates клетки (с шагом 2.5) с щелочной фосфатазы в буфере щелочной фосфатазы.
    1. Для обеих управления и обработанные образцы, подготовить 20 мкл образцы содержащие 20 мкг общего белка. Добавьте тома lysates клетки, содержащий 20 мкг общего белка, а затем 2 мкл буфера щелочной фосфатазы и 10 мкл щелочной фосфатазы. Долейте дестилированную воду составляют 20 мкл.
  2. Проинкубируйте образцы при 37 ° C, за 1 ч. остановить реакции путем добавления Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) в конечной концентрации 50 мм, или путем добавления Ортованадат натрия (Na 3 VO 4) в конечной концентрации 10 мм. Реакция также может быть прекращено путем нагрева при 75 ° C за 5 мин
  3. До окончания инкубации проб с фосфатазы, подготовить образцы такой же концентрации без добавления фосфатазы для сравнения с образцами лечение фосфатазы.
  4. Добавить свежеприготовленные 4 X SDS гель загрузки буфер, содержащий 400 мм DTT.
  5. Проинкубируйте образцы на блоке тепла при 100 ° C за 5 минут смеси образцы с помощью вихря. Прохладный при комнатной температуре на ~ 10-15 мин
  6. Собрать систему электрофореза запустив 10% гель полиакриламида SDS-PAGE.
    1. Нагрузки 10 мкг белка (13 мкл пример) на колодец на 10% polyacrylamide гель. Загрузить по лестнице молекулярным весом.
    2. После загрузки образца, подключите положительные и отрицательные электроды электрофореза системы к источнику питания для поддержания постоянного напряжения. Первоначально начинаются 70 V для 20 минут переместить образцы протеина от штабелируя гель в разрешая гель. Затем увеличить напряжение 125 V и Побегите гель для примерно 70-120 мин до конца геля образцов и белка лестница.
    3. После окончания электрофореза, передачи геля на PVDF мембрану с помощью системы мокрой electroblotting. Передачи для ~ 100 мин 100 V.
    4. Марк помаркой, сделав небольшой разрез на стороне лестницы молекулярного веса. Использовать прозрачный пластиковый лист и резким резак для резки блот.
  7. Блокировать мембрану в 4% BSA блокирующем буфере 90 мин при комнатной температуре.
  8. Инкубировать пятно в раствор (анти Тау 1:5, 000) начальной антител при температуре 4 ° C на ночь. Промойте пятно в PBST четыре раза, за 7 мин.
  9. Подготовить соответствующие решения средних антитела (мыши IgG коза анти 1:5, 000) и инкубировать помарку для 90 минут при комнатной температуре. Стирать в PBST четыре раза, за 7 мин.
  10. Разработка пятно с помощью хемилюминесценции kit по заявлению производителя ' s рекомендации. Обложка пятно в прозрачной полиэтиленовой пленкой. Получение изображений, хемилюминесценция Система для хемилюминесценции с соответствующим программным обеспечением.

4. Микротрубочки привязки Assay

  1. для привязки assay микротрубочек, повторите пункты 2.1-2.6.
  2. Подготовка 1 X (2 мл) PEM буфер из 10 X PEM буфера хранятся при температуре 4 ° C, добавив 20 мкм паклитаксел (40 мкл) и 1 мм (20 мкл) GTP. (MT) подвести микротрубочек из − морозильник 80 ° C и E. coli Тау рабочий запас от − морозильник 20 ° С.
  3. Подготовка образцов в соответствии с табл.1.
  4. Инкубации при 37 ° C для ультрацентрифуга 30 мин при 25 ° C для 60 мин на 100,000 x г.
  5. Передачи 120 мкл supernatants содержащие несвязанные Тау, чтобы очистить и помечены трубы.
  6. Добавить 120 мкл (же объем как супернатант) 5 X образец буфер гранулы, содержащие связанные Тау и тщательно перемешать. Передача решения для очистки помечены трубы и тщательно перемешать.
  7. Измерения концентрации белка (см. шаг 2.6).
    Примечание: При подготовке проб, используйте объем раствора (шаг 4.6) для подготовки супернатант и пеллет образцы.
  8. Подготовить образцы концентрацию эквивалента белка и добавить свежеприготовленные 4 x SDS гель загрузки буфер, содержащий DTT (400 мм).
    Примечание: Образцы можно хранить при − 20 ° C на этом этапе.
  9. Повторите шаги 3,5-3.10.
< td colspan =» 2">
образец имени микротрубочки необходимо главных белка необходимо PEM-GTP-PTX
1 2 мкл HCT 116-контроль (6,21 мкг/мкл) 9.66 мкл (60 мкг) 108.34 мкл
2 HCT 116-куркумин 10 мкм (4.81 мкг/мкл) 2 мкл 16.63 мкл (80 мкг) 101.37 мкл
3 HCT 116-куркумин 20 мкм (3.28 мкг/мкл) 2 мкл 30.49 мкл (100 мкг) 87.51 мкл
4 HCT 116-LiCl 25 мм (5.43 мкг/мкл) 2 мкл 18.42 мкл (100 мкг) 99.58 мкл
5 E. coli Тау 2 мкл 1 мкл Тау-352 117 мкл
6 MT только 2 мкл X 118 мкл
120 мкл

Таблица 1: Пробоподготовка для привязки микротрубочек assay.

5. Локализация и выражение Тау после лечения клетки с куркумин

  1. чистый coverslip с помощью 70% этанола и высушить его с помощью лабораторных тканей. Вставьте одну coverslip в каждой скважине плиты обозначенные 6-ну культуры ткани. Место пластину на биологической безопасности кабинета и переключиться на УФ-излучения для по крайней мере 3-х.
  2. Субкультура клетки и семян их в соответствующие скважины пластину 6-Ну 2,5 x 10 5 клеток/колодец в рекомендуемых культуры среднего.
  3. После ~ 24 h, изучить клетки с помощью инвертированного микроскопа с помощью 10 X и 40 X целей для проверки сотовой морфологических изменений. Запись фотографий, в случае необходимости.
  4. Промывать ячейки, дважды с помощью PBS. Исправить ячейки 3,7% формальдегида в инкубаторе 37 ° C в темноте.
    Примечание: Фиксация, формальдегида при комнатной температуре работает хорошо, слишком. Носите соответствующие средства индивидуальной защиты при обращении с формальдегидом.
  5. Мыть ячейки в PBS. Исправить клетки в ледяной метанола в − 20 ° C на 15 мин разрушения клеток путем инкубации их в BSA 3% и 0,1% тритон X-100 в PBS на льду на 10 мин вымыть клетки с PBS.
  6. Инкубации клеток в блокирующем буфере (BSA 3% и 0,1% Tween-20 в растворе PBS) за 1 ч при комнатной температуре.
    Примечание: Инкубационный втечение 2 ч при температуре 4 ° C работает хорошо, слишком.
  7. Подготовить раствор начальной антител (анти Тау на 1: 200) BSA 3% и 0,1% Tween-20 в PBS (например, 2 мкл антител Тау-13 в 0,4 мл буфера).
  8. Вырезать кусочки PVDF мембраны так, чтобы куски подходят правильно в каждой скважине 6-ну плиты; замочить их в воде в течение 5 минут место разреза PVDF в каждой скважине.
  9. Добавить 60 мкл раствора первичного антитела в разрез PVDF штук в каждой скважине. Место coverslips, таким образом, что клетки могут коснуться раствор начальной антител. Инкубируйте на 4 ° C в темных, влажных камеру на ночь. Стирать в PBS в четыре раза.
  10. Подготовить раствор средней антител (конъюгированных флуоресцеин 594 анти мыши IgG в 1: 400) BSA 3% и 0,1% Tween-20 в PBS.
  11. Вырезать кусочки PVDF мембрану, так что куски должным образом вписываются в каждой скважине пластину 6-Ну и замочить их в воде на 5 мин место разреза PVDF в каждой скважине.
  12. Добавить 80 мкл раствора средней антитела для каждой из частей PVDF в пластину 6-Ну. Место coverslip, таким образом, что клетки могут коснуться раствор средней антител. Инкубировать в темных, влажных камере при комнатной температуре на 2 ч. мыть с PBS в четыре раза.
  13. Установить образцы в средстве крепления с 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) и исправление coverslips на стеклянных вставках.
    1. Добавить одно падение монтажа среды с DAPI на стеклянных вставках. Удалить coverslips из каждой скважины и разместить их на стеклянных вставках, содержащий средство монтажа с DAPI. Обеспечить на поверхности каждого coverslip, содержащие окрашенных клеток затрагивает МунТинг среднего на соответствующий стеклянное скольжение.
    2. Применить Лак для ногтей все вокруг каждого coverslip уплотнение и исправить их герметичной на стеклянных вставках. При необходимости, сделать этот шаг дважды.
  14. Инкубировать на 1,5 ч при комнатной температуре в темной камере.
  15. Изучить слайды с помощью конфокального микроскопа с помощью погружения нефти на coverslip в темной комнате.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Выражение всего Тау и фосфо Тау был рассмотрен после лечения клетки с различной концентрации куркумин или LiCl (рис. 1). Лечение клеток с трех различных концентрации куркумин снизились уровни выражения Тау; фосфо Тау выражение увеличилось после лечения с низкой концентрацией куркумина однако, сократилось на лечении ячейки с более высокой концентрации куркумин. Анти фосфо Тау (Ser396) был использован для обнаружения фосфо-Тау. Снижение уровня общего Тау и фосфо Тау на лечение клеток с трех различных концентраций LiCl (рис. 1). Предыдущие исследования показали, что уровни выражения Тау различаются в рака различных видов и на различных объектах, имеющих те же типы рака. Предыдущие данные о колоректального рака показали, что в двух клеточных линий (HCT 116 и SW480) колоректального рака которые были также фосфорилированных19была выражена что Тау. Фосфо Тау уровни в клетках, обработанных с 5 мкм куркумин были выше, чем в необработанной клеток. Фосфо Тау уровни были выше, чем общая Тау в клетках, обработанных с такой же концентрации куркумин. Лечение клеток с 10 мкм куркумин снизились уровни фосфо Тау, по сравнению с необработанными клетки, но фосфо Тау выражение было еще больше, чем общая Тау выражение уровня. Лечение клеток с 30 мкм куркумин опустил фосфо Тау выражение по сравнению с фосфо Тау в необработанной клетки и общая Тау уровнях в тех же камерах лечение.

Эта рукопись создана простой протокол для оценки статуса фосфорилирование Тау пробирного фосфатазы (рис. 2). После лечения куркумин общий Тау фосфорилирование существенно не изменились и фосфорилирования в определенных аминокислотных остатков было значительным (рис. 1). В целом Тау фосфорилирование был остановлен в клетках, обработанных с LiCl по сравнению с необработанными клетки. Фосфатаза лечение образцы electrophoresed быстрее, чем необработанных образцов, проверяя, что неочищенные пробы были более hyperphosphorylated чем лечить фосфатазы образцы. Куркумин лечение клеток показали почти те же результаты, указав, что лечение колоректального рака клеточных линий не уменьшить Тау фосфорилирование, как показано на рисунке 1. Фосфатазы обработанных и необработанных образцов electrophoresed в почти том же диапазоне в образцах клеток, получавших LiCl, указывающее, что Тау фосфорилирования в этих клетках был сокращен (рис. 2). Здесь высокие концентрации куркумин обработанных образцов (20 мкм или 30 мкм) были приняты для сравнения общего статуса фосфорилирование, как низкая концентрация лечения показали выше участкам фосфорилирования выявлены антитела конкретных фосфо Тау (S396).

Кроме того в этой лаборатории, микротрубочки привязки assay клетки образцов была создана успешно используя Тау-352 как положительный контроль и только MT как отрицательный контроль (рис. 3). Куркумин и лечения LiCl микротрубочки привязку деятельности было тормозится, как продемонстрировано assay привязки микротрубочек. В этом эксперименте куркумин лечения не показывают микротрубочек привязки возможности, но ингибирует связывание аналогична в предыдущих исследованиях46,47, тогда как было эффективным для ингибирования участкам Тау фосфорилирования в более высокие концентрации. В Рисунок 110 мкм куркумин лечения привели к минимальным проявлением фосфо Тау, по сравнению с контролем, но выше выражение, чем общая Тау. Однако микротрубочки связывающая способность Тау колоректального рака после лечения куркумин, а также низкой концентрации LiCl лечения уменьшилась в образце необработанных. Участкам Тау фосфорилирование эффекты микротрубочек привязки и самостоятельной агрегации48. Тау фосфорилирования в proline богатый регион препятствует микротрубочек привязки свойства, тогда как C-терминала региона увеличили эти свойства, и в обоих регионах наряду с МТ привязки региона уменьшили свои свойства привязки, около 70% и неупорядоченных микротрубочки48. Некоторые другие факторы, а также другим участкам фосфорилирование Тау могут быть вовлечены для дестабилизации этой микротрубочек Тау колоректального рака, лечение куркумин или LiCl.

Простой протокол, используя небольшое количество первичных и вторичных антител включена локализация Тау в клеточных линиях колоректального рака после лечения куркумин (рис. 4). Результаты показали, что Тау перемещен в ядро, после лечения куркумин, похож на более ранних исследований, отчетности что ядерная Тау вывод является ключевым игроком в нейрональных защиты ДНК в нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера49 ,50.

Figure 1
Рисунок 1: Тау и фосфо Тау выражение в colorectal рак клеток после куркумин или лечения LiCl. Образцы, извлеченные из управления клетки или клетки, лечение за 24 ч с тремя различными концентрации куркумин (A) и (B) LiCl были разрешаться на 10% полиакриламидных гелях SDS-PAGE и исследован с антитела анти Тау или анти фосфо Тау. Денситометрия анализ результатов иммуноблоттинга представлены на правой панели. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: Общая фосфорилирование Тау в необработанной или дифференцированно относились образцы клетки обнаружены фосфатазы assay. Нечетные полосы показать управления ячейки экстракты, тогда как даже полосы показать фосфатазы лечения куркумин лечение или лечение LiCl образцов. Фосфатаза лечения сделал быстрее, чем необработанных образцов, содержащих фосфорилированных Тау Тау электрофоретической подвижности. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: микротрубочек привязки Тау в клетках колоректального рака, обнаруженных микротрубочек привязки assay. Управления HCT 116 клеток образцов, куркумин лечение, или образцы LiCl лечение клетки и E. coli Тау были инкубировали с микротрубочек, как подробно указано в протоколе раздела 4. Эквивалентные суммы супернатант (S) и Пелле (P) фракций были immunoblotted с антитела анти Тау. Отрицательный контроль полосы, содержащие только MT были запущены для подтверждения, что MT не содержит каких-либо связанных эндогенного Тау. Нижняя панель показывает анализ денситометрии западных помарках отдельных образцов позволяет сравнение между супернатант (несвязанных Тау) и Пелле (привязанных Тау) фракций. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Тау белка локализации рассмотрен конфокальный microscopy.
Тау локализованное периферически ядрышко колоректального рака клеток. Левой панели показывают Тау локализации обнаружены с использованием моноклональных антител анти Тау, тогда как средней панели показывают ядро, окрашивание, DAPI. Также показаны представитель примеры обработанных показаны Тау транслокации в ядре клеток. Клетки управления показал Тау главным образом вокруг и за пределами ядра, в то время как Тау в клетках обработанных локализованы также внутри ядра. Шкалы бар = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Эта рукопись учредил различные процедурные условия для обнаружения всего Тау и фосфорилированных Тау в клетках колоректального рака, обработанных с куркумин и LiCl. Чтобы оценить общее состояние фосфорилирование Тау в образцы протеина, фосфатазы пробирного был описан. Этот assay потенциально может использоваться для изучения состояния фосфорилирование любого белка.

Этот assay основана на том принципе, что фосфорилированных белка движется медленнее, чем его состояние фосфорилированных. В этом протоколе используются щелочной фосфатазы и щелочной фосфатазы буфера. После добавления компонентов пробирного lysates клетки, образцы следует инкубированы для конкретных оптимальная продолжительность при определенной температуре. После инкубации образцы должны быть вареные в буфере выборки SDS для остановки реакции. Ранее различные экспериментальные протоколы использовались для оценки привязки Тау микротрубочек. Assay микротрубочек привязки, представленные здесь легко выполнять, включая как позитивные, так и негативные элементы управления для обеспечения качества с помощью супернатант и Пелле фракций. MT-только отрицательный контроль был использован для проверки что MT не содержат каких-либо связанных эндогенного Тау. Кроме того, чисто человеческие Тау-352, микротрубочки привязки Тау был использован как позитивный элемент управления. Чтобы отделить микротрубочек привязки дроби (гранулы) от обязательной доли (супернатант) ультра скорость центрифугирования было использовано; Эта процедура может быть ограничение, потому что такие ультрацентрифуга является дорогостоящим и не широко доступны. Кроме того поскольку низкого количества образцов используется, длинные, тонкие пробирок с переходниками необходимы для использования в ротор Ультрацентрифуги. Хотя это позволяет повторно использовать такие трубы, одноразовые желательно, чтобы избежать перекрестного загрязнения. Наконец преимущество протокола Тау локализации является, что необходимы лишь небольшие количества первичных и вторичных антител. После фиксации, permeabilization и блокирование клетки приверженцем coverslips малая капля антител был сдан на небольшой кусок PVDF, который затем был помещен внутрь скважины 6-ну плиты. Coverslips были храниться таким образом, что антитела могут получить доступ к ячейкам. Используя этот протокол, можно минимизировать количество антител используемых.

Некоторые меры предосторожности следует иметь в виду для обеспечения надежных и поддающихся количественной оценке результатов. Во-первых строгих асептических методов должны использоваться для предотвращения загрязнения в клеточных культурах и выдержки клетки. Полный RIPA литического буфера должен быть подготовлен свежие. В assay фосфатазы важно варить образцы для 3 мин и начать сразу же после инкубации фосфатазы обработанных и необработанных образцов SDS-PAGE. Тау-352 следует разделить на небольшие аликвоты и хранится на льду после удаления из морозилки −20 ° C и сдала обратно в морозильник сразу же после использования. После удаления из −80 ° C, MT запасы должны храниться на льду, если повторно в течение 72 ч; в противном случае Храните их при комнатной температуре. PEM буфер должен быть подготовлен, как 10 x концентрированный раствор, потому что буфере 1 x должен быть свежеприготовленные при добавлении GTP и паклитаксел.

Тау функции регулируются степень его фосфорилирования. Тау hyperphosphorylation происходит не в нормальной взрослого мозга Тау аналогичны Тау-352, который был использован в качестве позитивного управления в assay микротрубочек привязки. Однако Тау hyperphosphorylation происходит в нейродегенеративных заболеваний. Этот протокол и последующие результаты демонстрируют, что линии клеток человека колоректального рака также нести фосфорилированных Тау аналогично тому в мозгов Альцгеймераа. Процедура с высокодозной куркумин и особенно LiCl можно свести к минимуму Тау фосфорилирования. Таким образом хорошее соотношение между нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера и колоректального рака может существовать в отношении Тау hyperphosphorylation, и куркумин или LiCl могут быть использованы для лечения колоректального рака и болезни Альцгеймера. И наконец изучая Тау фосфорилирования и Тау микротрубочек привязки существенно важное значение не только для нейродегенеративных заболеваний, но и для некоторых химиотерапевтических потому, что агенты, которые изменяют Тау микротрубочек связывания динамически изучаются как рак терапии51. Протоколы, представленные здесь поможет потенциально открытие и разработка новых лекарственных препаратов для лечения различных tauopathies и рака.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют, что они не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Это исследование было выполнено как частью проекта под названием «Развитие и индустриализации высокое значение косметического сырья из морских водорослей», финансируемого министерством океанов и рыболовства, Корея и была поддержана интрамуральных Грант (2Z04930) от института Каннын в KIST натуральных продуктов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Биохимия выпуск 128 болезнь Альцгеймера Таупатия фосфорилирование микротрубочки куркумин хлорид лития конфокальная микроскопия
Assay для фосфорилирования и привязки микротрубочек наряду с локализацией тау белка в клетках рака прямой кишки
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan,… More

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter