Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller

Published: October 10, 2017 doi: 10.3791/55932

Summary

Dette manuskript beskriver standardprotokoller til måling af tau hyperphosphorylation, måle tau binding til mikrotubuli og lokalisering af intracellulære tau efter medicinsk behandling. Disse protokoller kan bruges gentagne gange til screening af stoffer eller andre stoffer, der er målrettet tau hyperphosphorylation eller mikrotubulus bindende.

Abstract

Mikrotubulus-forbundet protein tau er en neuronal protein, der lokaliserer for det meste i axoner. Generelt er tau afgørende for normale neuronal funktion, fordi det er involveret i mikrotubulus forsamling og stabilisering. Udover neuroner, er tau udtrykt i menneskelige bryst, prostata, gastrisk, kolorektal, og pancreascancer hvor det viser næsten lignende struktur og udøver tilsvarende funktioner som den neuronale tau. Mængden af tau og dens fosforylering kan ændre sin funktion som en stabilisator af mikrotubuli og føre til udviklingen af parret spiralformet filamenter i forskellige neurodegenerative lidelser, såsom Alzheimers sygdom. Bestemmelse af tilstanden fosforylering af tau og dets mikrotubulus-bindende egenskaber er vigtige. Derudover er undersøger den intracellulære lokalisering af tau vigtige i forskellige sygdomme. Dette manuskript detaljer standardprotokoller til måling af tau fosforylering og tau binding til mikrotubuli i kolorektal cancerceller med eller uden curcumin og LiCl behandling. Disse behandlinger kan bruges til at stoppe kræft celle spredning og udvikling. Intracellulære lokalisering af tau er undersøgt ved hjælp af Immunhistokemi og konfokal mikroskopi mens du bruger lavt beløb af antistoffer. Disse assays kan bruges gentagne gange til screening af stoffer, der påvirker tau hyperphosphorylation eller mikrotubulus bindende. Roman therapeutics anvendes til forskellige tauopathies eller relaterede anticancer agenter kan potentielt være karakteriseret ved hjælp af disse protokoller.

Introduction

Tau blev oprindeligt identificeret som en varme-stabil mikrotubulus-forbundet protein, der blev co renset med tubulin1. Tau er udelukkende udtrykt i højere eukaryoter2,3,4. Den vigtigste funktion af tau er at kontrollere mikrotubulus forsamling1,5,6. Det bidrager også til polymerisering af mikrotubuli7, cytoskeletale transport8, ændringer i cytoskeletale diameter9, dannelsen af neuroma polaritet, og neurodegeneration10. Tau fungerer også som et protein stillads til at styre nogle signaling veje. Rotte hjerne undersøgelser tyder på, at tau er neuron-specifik, og at det primært lokaliserer i axoner11. Fordi tau er afgørende for mikrotubulus polymerisation og neuronal udvikling, var tau hypotese for at spille en større rolle i cytoskeletale udvikling i centralnervesystemet; Denne hypotese blev senere bekræftet af in vitro- og i vivo eksperimenter. Ud over neuroner, er tau udtrykt i forskellige ikke-neuronale celler, herunder lever, nyre og muskel celler12,13. Tau udtrykkes også i menneskelig brystkræft, prostata, kolorektal, gastrisk, og kræft i bugspytkirtlen celle linjer og væv14,15,16,17,18, 19. tau er også fundet i inklusion-krop myositis som snoet tubulofilaments i inklusion organer20.

Tau kan bære flere posttranslationelle modifikationer. Af alle posttranslationelle modifikationer er fosforylering den mest almindelige. Øget tau fosforylering nedsætter sin affinitet for mikrotubuli, endelig destabiliserende cytoskeleton. Firs-fem fosforylering sites er blevet beskrevet i tau protein isoleret fra menneskelige Alzheimers sygdom hjernen væv. 53% udgør i disse steder, Serin, 41% Threonin og kun 6% tyrosin restkoncentrationer21,22,23. Tau fosforylering påvirker dens lokalisering, funktion, bindende, opløselighed og dens følsomhed over for andre posttranslationelle modifikationer. Også tau fosforylering til mere end det normale omfang (eller fuldt mættet med fosfat grupper) er kendt som hyperphosphorylation, der replikerer strukturelle og funktionelle egenskaber af Alzheimers sygdom24. Tau fastholder de cytoskeletale mikrotubuli fungerer korrekt og sikrer normale neuronal velfungerende fysiologiske betingelser. Dog undlader hyperphosphorylated tau at vedligeholde en velorganiseret mikrotubulus bindende, forårsager neuronal tab på grund af mikrotubulus demontering. Normale niveauer af tau fosforylering er nødvendige for korrekt tau funktion, men tau ikke fungerer normalt, hvis dets karakteristiske fosforylering niveau er ændret, og det er hyperphosphorylated25. I Alzheimers sygdom og nogle andre aldersrelaterede neurodegenerative sygdomme, tau bliver hyperphosphorylated og danner parret spiralformet filamenter og neurofibrillary tangles26,27. Metoder til bestemmelse af tau fosforylering og mikrotubulus bindende er derfor vigtig.

Kolorektal cancer, en aldrende-associerede kræft, er tredje mest hyppigt diagnosticeret kræft og den tredje fremtrædende død-forårsager kræft for både mænd og kvinder28. Tarmkræft er en af de vigtigste død-forårsager kræft i den vestlige verden29. Fordi både tarmkræft og Alzheimers sygdom er forbundet med aldring og begge sker primært i de udviklede lande, hvor folk nyde lignende kostvaner, kan de to sygdomme eller anden måde være korreleret. Hertil kommer, reagerer tau-positive og tau-negative kræftceller forskelligt på kemoterapeutika, fx, paclitaxel16.

Curcumin er en af de vigtigste derivater af Curcuma longa, indisk krydderi gurkemeje30. I århundreder har sydasiatiske populationer forbruges gurkemeje i deres kost på daglig basis. Curcumin er anvendt til behandling af forskellige sygdomme, herunder kolorektal cancer, Alzheimers sygdom, diabetes, cystisk fibrose, inflammatorisk tarmsygdom, gigt, hyperlipidæmi, åreforkalkning og iskæmisk hjertesygdom31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. lithium kan også dræbe kolorektal cancerceller eller forhindre deres spredning39. Lithium kan også bruges til behandling af Alzheimers sygdom40 , da det nedsætter tau sammenlægning og forhindrer dens hyperphosphorylation som observeret i en Transgene mus model41,42,43, 44.

Dette manuskript har til formål at: 1) måle den samlede tau og phospho-tau udtryk niveauer i behandlede celler; 2) Beskriv en fosfatase assay for at måle samlede tau fosforylering; 3) undersøge mikrotubulus-binding af tau; og 4) lokalisere tau af Konfokal mikroskopi i kolorektal cancer cellelinjer behandlet med curcumin eller LiCl. Resultaterne viser, at celle behandling med curcumin, som er en angiveligt god kemoterapeutiske agent for tyktarmskræft, og behandling med LiCl kan reducere udtrykket af begge samlede tau og fosforyleret tau i kolorektal cancer cellelinjer. Disse behandlinger kan også forårsage nukleare translokation af tau. Dog uventet, undlader curcumin at forbedre bindingen af tau at mikrotubuli.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af reagenser

  1. tilføje 10 µL (1 mM) phenylmethylsulfonyl fluor opløsning, 10 µL (1 x 100 x lager) af protease hæmmer cocktail løsning og 10 µL (1 x 100 x lager) af fosfatase hæmmer cocktail løsning til 1 mL af 1 x radioimmunoprecipitation (RIPA) analysebuffer til at forberede den komplette RIPA lysisbuffer.
  2. Forbered 10 x generelle tubulin buffer (PEM) buffer.
    1. Tilføj 800 mM (6.0474 g) piperazin-N-N ' - bis - 2-ethanesulfonic acid, 10 mM (95.1 mg) ethylen glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacetic syre, 10 mM (51 mg) MgCl 2 og 1,25 M (3 mL 10 m) NaOH i en 50 mL tube , bland med 15 mL destilleret vand, og opløses ved hjælp af en vortex. Tjek pH (bør 6.9). Hvis pH > 6.9, kassere bufferen og remake alot frisk.
      Bemærk: NaOH bør være under 1,25 M at sikre, at pH ikke overskridelse 6.9. Det anbefales ikke at bruge HCl til at justere pH > 6.9.
    2. Tilføj NaOH dråbevis indtil pH er 6.9. Der tilsættes destilleret vand for at gøre op til 25 mL 10 X PEM buffer. Endelig filtrere ved hjælp af en sprøjte og en 0,2 µm sprøjte filter. Opdele denne buffer i delprøver i 1,5 mL rør og opbevares ved 4 ° C.
  3. Forbered 5 x prøvebuffer med reduktionsmiddel og dye.
    1. Mix 300 µL (60 mM) af 1 M Tris-HCl (pH 6,8), 2,5 mL (25%) i 50% glycerol, 1 mL (2%) af 10% natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS) og 1,2 mL destilleret vand til at gøre op 5 mL af 5 x SDS prøvebuffer. Gemme på − 20 ° C.
      Bemærk: Fordi glycerol er tyktflydende, måling af 1,25 mL glycerol er vanskeligt. Én mL 100% glycerol vejer 1.26 g. Således vejer 1.575 g 100% glycerol (som er lig med 1,25 mL af 100% eller 2,5 mL 50% glycerol) i en 15 mL tube først; Bland godt med de andre komponenter.

2. Celle kultur-behandling med Curcumin eller LiCl behandling og undersøgelse af Protein udtryk

  1. Tilføj ~ 1 x 10 6 HCT 116 celler i 100 mm vævskultur retter der indeholder Minimum væsentlige medier (MEM) suppleret med 10% føtal kvæg serum (FBS) og 1% penicillin-streptomycin. Efter en dag med dyrkning, celler vil nå 60-70% sammenløbet.
    Bemærk: Antallet af plader nødvendig afhænger af antallet af behandlinger beskrevet nedenfor.
  2. Når celler når ~ 65% sammenløbet (tilnærmet ved hjælp af mikroskopi), fjerne MEM suppleret medium og tilføje serumfrit MEM med 5 µM, 10 µM, og 30 µM curcumin eller 25 mM, 50 mM og 100 mM LiCl. Der inkuberes ved 37 ° C i 24 timer i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO 2.
  3. 24 timer efter behandling, cellerne vaskes med 1 mL iskold fosfatbufferet saltopløsning (PBS), og skrabe celler ved hjælp af en celle skraber. Overføre de skrabede celler i 1,5 mL centrifugeres rør og centrifugeres i 4 min på 1.800 x g ved 4 ° C til indhente celle pellets.
  4. Lyse celler ved at suspendere pellets i 100 µL af komplet RIPA buffer ved 4 ° C i 20 min. mens jævnligt trykke rør. Læg instrumenterne i ultralydsbad prøverne kortvarigt.
  5. Centrifugeres celle homogeniseret i en benchtop centrifuge på 22,570 x g i 20 min. ved 4 ° C. overføre analysere andre mærket rør ved hjælp af en pipette.
  6. Måler koncentrationen af protein i at analysere af Bradford assay 45 ved hjælp af kommercielle protein-assay kits.
  7. Forbered prøver af lig proteinkoncentration (10 µg protein/13 µL prøven) af cellelysater med 4 X SDS gel-loading bufferen. Rede 4 x SDS gel-loading bufferen friske, der indeholder 400 mM dithiothreitol (DTT).
    Bemærk: På dette stadium, prøver kan opbevares i − 20 ° C hvis nødvendigt.
  8. Incubate prøver på en varme blok ved 100 ° C i 5 min. Bland prøverne ved hjælp af en vortex og vente med at køle dem for ~ 10-15 min.
  9. Samle en elektroforese system.
    1. Belastning 10 µg protein (13 µL prøve) pr. brønd på en 10% SDS-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE). Indlæse molekylvægt stigen på gel til én vognbane.
      Bemærk: Som elektroforese starter, protein stigen vil løse i protein bands af åbenbare molekylvægte, inden. Brug disse bands til at anslå Molekylær vægten af ukendt protein bands.
    2. Efter indlæsning af prøverne, positive og negative elektroderne tilsluttes af elektroforese system en strømkilde til at opretholde en konstant spænding. I første omgang, starte på 70 V i 20 min. at flytte protein prøver fra stabling gelen i den løse gel. Derefter, øge spændingen til 125 V til ca. 70-120 min. indtil prøver og protein stigen nå slutningen af gelen.
    3. Efter afslutningen af elektroforese, overføre gel til en polyvinylidene xenondifluorid (PVDF) membran ved hjælp af en våd electroblotting system. Overføre for ~ 100 min. ved 100 V. blok membran i 4% bovint serumalbumin (BSA) blokerende buffer i 90 min ved stuetemperatur ca 25 ° C.
  10. Markerer skamplet ved at skære det på siden med molekylvægt stigen. Brug en gennemsigtig plastik plade og en skarp cutter til at skære skamplet. Forberede de primære-antistof løsninger (anti-tau på 1:5, 000, anti-phospho-tau på 1:4, 000) og inkuberes skamplet i denne løsning ved 4 ° C natten.
  11. Efter natten inkubation, vasker skamplet for 7 min fire gange i fosfatbufferet saltopløsning-Tween-20 (PBST) løsning.
  12. Fremstilles de relevante sekundære-antistof (ged anti-kanin eller anti-mus IgG på 1:5, 000), og der inkuberes skamplet i denne løsning i 90 min ved stuetemperatur i ca. 25 ° C. vask i PBST fire gange, 7 min..
  13. Udvikle den skamplet, ved hjælp af en kemiluminescens kit ifølge producenten ' s anbefalinger. Dække den skamplet, ved hjælp af en gennemsigtig plast wrap. Erhverve billeder af en kemiluminescens imaging system for kemiluminescens med relevante software.

3. Fosfatase Assay

  1. behandle cellelysater (fra trin 2,5) med alkalisk fosfatase i alkalisk fosfatase buffer.
    1. For både styre og behandlede prøver, forberede 20 µL prøver indeholdende 20 µg total protein. Tilføje volumen af cellelysater, der indeholder 20 µg total protein, efterfulgt af 2 µL alkalisk fosfatase buffer og 10 µL alkalisk fosfatase. Der tilsættes destilleret vand til at gøre op 20 µL.
  2. Inkuberes prøver ved 37 ° C for 1 h. Stop reaktionen ved at tilføje ethylendiamintetra syre (EDTA) i en endelig koncentration på 50 mM, eller ved at tilføje natrium orthovanadate (Na 3 VO 4) i en endelig koncentration på 10 mM. Reaktionen kan også være stoppet af varme ved 75 ° C i 5 min.
  3. Før inkubation af prøver med fosfatase færdig, forberede prøverne af den samme fusion uden at tilføje fosfatase til sammenligning med fosfatase-behandlede prøver.
  4. Tilføj de frisk tilberedte 4 X SDS gel-loading bufferen indeholder 400 mM DTT.
  5. Ruger prøver på en varme blok ved 100 ° C i 5 min. Bland prøver ved hjælp af en vortex. Cool ved stuetemperatur for ~ 10-15 min.
  6. Samle en elektroforese system til at køre en 10% polyacrylamid gel af SDS-PAGE.
    1. Belastning 10 µg protein (13 µL prøve) pr. brønd på en 10% polyacrylamide gel. Indlæse molekylvægt stigen.
    2. Efter indlæsning af prøven, positive og negative elektroderne tilsluttes af elektroforese system en strømkilde til at opretholde en konstant spænding. I første omgang, starte på 70 V i 20 min. at flytte protein prøver fra stabling gelen i den løse gel. Derefter, øge spændingen til 125 V og køre gel for ca. 70-120 min. indtil prøver og protein stigen nå slutningen af gelen.
    3. Efter afslutningen af elektroforese, overføre gel på en PVDF membran ved hjælp af en våd electroblotting system. Overføre for ~ 100 min. ved 100 V.
    4. Markerer skamplet ved at gøre et lille skær på siden af molekylvægt stigen. Brug en gennemsigtig plastik plade og en skarp cutter til at skære skamplet.
  7. Blokere membran i 4% BSA blokerende buffer i 90 min ved stuetemperatur.
  8. Ruger skamplet i primær-antistof løsning (anti-tau på 1:5, 000) ved 4 ° C natten over. Vasker skamplet i PBST fire gange, i 7 min..
  9. Forbereder den relevante sekundære-antistof løsning (ged anti-mus IgG på 1:5, 000), og der inkuberes skamplet i 90 min ved stuetemperatur. Vask i PBST fire gange, i 7 min..
  10. Udvikle den skamplet, ved hjælp af en kemiluminescens kit ifølge producenten ' s anbefalinger. Dække skamplet inden for en gennemsigtig plast wrap. Erhverve billeder af en kemiluminescens imaging system for kemiluminescens med relevante software.

4. Mikrotubulus-bindende Assay

  1. For mikrotubulus bindende assay, Gentag trin 2.1-2.6.
  2. Forbered 1 X (2 mL) PEM buffer fra 10 X PEM buffer opbevares ved 4 ° C ved at tilføje 20 µM (40 µL) paclitaxel og 1 mM (20 µL) GTP. Tage en mikrotubulus (MT) bestand fra − 80 ° C fryser og E. coli tau arbejder lager fra − 20 ° C fryser.
  3. Forberede prøverne efter tabel 1.
  4. Der inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Ultracentrifuge ved 25 ° C i 60 min på 100.000 x g.
  5. Overføre 120 µL supernatanter indeholdende ubundet tau, at rengøre og mærket rør.
  6. Tilføje 120 µL (samme volumen som supernatanten) 5 X prøve den pellet, der indeholder bundet tau-buffer og blandes grundigt. Overføre løsning til at rense mærket rør og blandes grundigt.
  7. Måler proteinkoncentration (Se trin 2.6).
    Bemærk: Samtidig med at forberede prøverne, bruge rumfang af opløsning (trin 4.6) for at forberede både pellet og supernatanten prøver.
  8. Forberede prøverne af tilsvarende proteinkoncentration og tilføje frisklavede 4 x SDS gel-loading bufferen indeholder DTT (400 mM).
    Bemærk: Prøver kan opbevares i − 20 ° C på dette stadium.
  9. Gentag trin 3.5-3.10.
< td colspan = " 2">
prøve navn mikrotubulus behov Main Protein behov for PEM-GTP-PTX
1 HCT 116-kontrol (6.21 μg/μl) 2 µl 9.66 μl (60 μg) 108.34 μl
2 HCT 116-Curcumin 10 μM (4,81 μg/μl) 2 µl 16.63 μl (80 μg) 101.37 μl
3 HCT 116-Curcumin 20 μM (3,28 μg/μl) 2 µl 30.49 μl (100 μg) 87.51 μl
4 HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl) 2 µl 18.42 μl (100 μg) 99.58 μl
5 E. coli tau 2 µl 1 μl Tau-352 117 μl
6 MT kun 2 µl X 118 μl
120 μl

tabel 1: prøve forberedelse til mikrotubulus-bindende assay.

5. lokalisering og udtryk af Tau efter behandling af celler med Curcumin

  1. rense en coverslip med 70% ethanol og tørre det ved hjælp af et laboratorium væv. Indsæt en enkelt coverslip i hver brønd af et mærket 6-godt vævskultur plade. Pladen anbringes på en biologisk sikkerhed kabinet og tænde et lys for mindst 3 h. UV
  2. Subkultur cellerne og seed dem i de relevante pladens huller 6-godt på 2,5 x 10 5 celler/brønd i anbefalede næringssubstratet.
  3. ~ 24 h, undersøge celler ved hjælp af en omvendt mikroskop ved hjælp af både 10 X og 40 X mål for at tjekke for cellulære morfologiske ændringer. Optage billeder, hvis det er nødvendigt.
  4. Skylles cellerne to gange med PBS. Fix celler i 3,7% formaldehyd i et 37 ° C inkubator i mørke.
    Bemærk: Fiksering af formaldehyd ved stuetemperatur virker godt, også. Bære passende personlige værnemidler, når du håndterer formaldehyd.
  5. Vaske cellerne i PBS. Fix celler i iskold methanol på − 20 ° C i 15 min. Permeabilize cellerne ved at inkubere dem i 3% BSA og 0,1% Triton X-100 i PBS i isbad i 10 min. Cellerne vaskes med PBS.
  6. Ruger celler i blokerende buffer (3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS løsning) i 1 time ved stuetemperatur.
    Bemærk: Inkubation i 2 timer ved 4 ° C virker godt, også.
  7. Forbereder den primære-antistof (anti-tau på 1:200) løsning i 3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS (fx, 2 µL tau-13 antistof i 0,4 mL buffer).
  8. Skåret små stykker af en PVDF membran så at brikkerne passer ordentligt inden for hver brønd af 6-godt pladen; sættetid dem i vand i 5 min. sted cut PVDF i hver brønd.
  9. Tilføje 60 µL af primære antistof løsning at sænke PVDF stykker i hver brønd. Placere coverslips sådan, at cellerne kan røre den primære-antistof løsning. Der inkuberes ved 4 ° C i et mørkt, fugtigt kammer natten over. Vask i PBS fire gange.
  10. Forbereder den sekundære-antistof løsning (fluorescein-konjugeret 594 anti-mus IgG på 1: 400) i 3% BSA og 0,1% Tween-20 i PBS.
  11. Skåret små stykker af en membran, PVDF, således at brikkerne passer ordentligt inden for hver brønd af 6-godt plade, og sættetid dem i vand i 5 min. sted cut PVDF i hver brønd.
  12. Tilføje 80 µL af opløsningen sekundære-antistof til hvert af PVDF stykkerne i 6-godt plade. Placere coverslip sådan, at cellerne kan røre den sekundære-antistof løsning. Inkuber i et mørkt, fugtigt kammer ved rumtemperatur til 2 h. vask med PBS fire gange.
  13. Mount prøver i montering medium med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) og lave coverslips på glas dias.
    1. Tilføj en dråbe af montering medium med DAPI på glas dias. Fjerne coverslips fra hver brønd og placere dem på glas dias med montering medium med DAPI. Sørg for at overfladen af hver coverslip, der indeholder farvede celler berører mounTinget medium på den tilsvarende glas dias.
    2. Anvend neglelak rundt hver coverslip til at forsegle og løse dem lufttæt på glas dias. Hvis det er nødvendigt, gøre dette trin to gange.
  14. Incubate i 1,5 timer ved stuetemperatur i en mørk afdeling.
  15. Undersøge de forskellige dias ved hjælp af en Konfokal mikroskop ved hjælp af immersionsolie på coverslip i et mørkt rum.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Udtryk for total tau og phospho-tau blev undersøgt efter behandling af celler med forskellige koncentrationer af curcumin eller LiCl (figur 1). Behandling af celler med de tre forskellige koncentrationer af curcumin faldt tau udtryk niveauer; dog phospho-tau udtryk steg på behandling med lav koncentration af curcumin men faldt efter behandling af celler med højere curcumin koncentrationer. Anti-phospho-tau (Ser396) blev brugt til påvisning af phospho-tau. Niveauer af både samlede tau og phospho-tau faldt efter behandling af celler med de tre forskellige koncentrationer af LiCl (figur 1). Tidligere forskning havde vist, at tau udtryk niveauerne varierer i forskellige kræft typer og på forskellige steder af typerne samme kræft. Tidligere data på kolorektal cancer viste, at tau blev udtrykt i to cellelinjer (HCT 116 og SW480) af kolorektal cancer, var også fosforyleres19. Phospho-tau niveauer i cellerne behandlet med 5 µM curcumin var højere end dem i ubehandlet celler. Phospho-tau niveauer blev højere end samlede tau i celler behandles med den samme koncentration af curcumin. Behandling af celler med 10 µM curcumin faldt phospho-tau niveauer sammenlignet med ubehandlet celler men phospho-tau udtryk var stadig mere end samlede tau udtryk niveauer. Behandling af celler med 30 µM curcumin sænket phospho-tau udtryk sammenlignet med phospho-tau i ubehandlet celler og samlede tau niveauer i de samme behandlede celler.

Dette manuskript etableret en let protokol for at vurdere tau fosforylering status af en fosfatase assay (figur 2). Efter curcumin behandling, samlede tau fosforylering ændre ikke væsentligt og fosforylering på specifikke aminosyrerester var signifikant (figur 1). Samlede blev tau fosforylering stoppet i celler behandles med LiCl sammenlignet med ubehandlet celler. Fosfatase-behandlede prøver electrophoresed hurtigere end ubehandlet prøver, kontrollere, at ubehandlet prøver var mere hyperphosphorylated end fosfatase-behandlede prøver. Curcumin-behandlede celler viste næsten de samme resultater, som angiver, at behandling af kolorektal cancer cellelinjer ikke reducere tau fosforylering, som vist i figur 1. Både fosfatase-behandlet og ubehandlet prøver electrophoresed på næsten de samme hold i prøver af celler behandles med LiCl, der angiver at tau fosforylering i disse celler blev reduceret (figur 2). Her, blev høje koncentrationer (20 µM eller 30 µM) af curcumin-behandlede prøver taget at sammenligne samlede fosforylering status, som lav koncentration behandling viste højere lokationsspecifikke fosforylering afsløret af specifikke phospho-tau (S396) antistof.

I denne øvelse, blev mikrotubulus bindende analysen af celle prøver desuden konstateret, med held bruge tau-352 som positiv kontrol og kun MT som en negativ kontrol (figur 3). For både curcumin og LiCl behandling, var mikrotubulus-bindende aktivitet hæmmede, som det fremgår af mikrotubulus bindende assay. I dette eksperiment udviste curcumin behandling ikke mikrotubulus bindende evner men hæmmede bindende lig den i tidligere undersøgelser46,47, der henviser til, at det var effektivt til at hæmme lokationsspecifikke tau fosforylering på højere koncentration. I figur 1resulterede 10 µM curcumin behandling i minimale udtryk for phospho-tau sammenlignet med kontrol, men højere udtryk end samlede tau. Men mikrotubulus-bindende kapacitet af kolorektal cancer tau efter curcumin behandling samt lav koncentration af LiCl behandling blev faldt i den ubehandlede prøve. Lokationsspecifikke tau fosforylering effekter mikrotubulus bindende og selvstændig sammenlægning48. Tau fosforylering på prolin-rige region hæmmet mikrotubulus-bindende egenskaber, mens C-terminalen regionen steg disse egenskaber, og begge regioner sammen med MT-bindende region mindsket sin bindende egenskaber af omkring 70% og uordnede den Mikrotubuli48. Nogle andre faktorer samt andre Webstedsspecifikke fosforylering af tau kan være involveret i denne mikrotubulus destabilisering af kolorektal cancer tau behandlet med curcumin eller LiCl.

En enkel protokol ved hjælp af små mængder af primære og sekundære antistoffer aktiveret lokalisering af tau i kolorektal cancer cellelinjer efter curcumin behandling (figur 4). Resultaterne viste at tau havde omplantes til kernen efter curcumin behandling, et resultat svarende til tidligere undersøgelser rapportering at nukleare tau er en nøglespiller i neuronal DNA beskyttelse i neurodegenerative sygdomme som Alzheimers sygdom49 ,50.

Figure 1
Figur 1: Tau og phospho-tau udtryk i kolorektal cancerceller efter curcumin eller LiCl behandling. Prøverne ekstraheres fra kontrol celler eller celler behandles i 24 timer med tre forskellige koncentrationer af (A) curcumin og (B) LiCl blev løst på 10% polyacrylamidgeler af SDS-PAGE og aftestede med anti-tau eller anti-phospho-tau antistof. Densitometri analyser af vestlige skamplet resultaterne præsenteres på højre panel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: overordnede fosforylering af tau i ubehandlet eller varierende behandlet celle prøver opdaget af fosfatase assay. Ulige baner vise kontrol celle ekstrakter, der henviser til, at selv baner vise fosfatase behandling af curcumin-behandlet eller LiCl-behandlet prøver. Fosfatase behandling gjort tau elektroforese mobilitet hurtigere end ubehandlet prøver, som indeholdt fosforyleres tau. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: mikrotubulus binding af tau i kolorektal cancerceller opdaget af mikrotubulus-bindende assay. HCT 116 celle kontrolprøver, curcumin-behandlet, eller LiCl-behandlet celle prøver og E. coli tau blev inkuberet med mikrotubuli som beskrevet i protokollen afsnit 4. Tilsvarende mængder af supernatanten (S) og pellet (P) fraktioner var immunoblotted med en anti-tau antistof. Negativ kontrol baner der indeholder kun MT blev kørt til at bekræfte, at MT ikke indeholdt nogen bundne endogene tau. Nederste panel viser densitometri analyser af Western blots af individuelle prøver muliggør sammenligning mellem supernatanten (ubundet tau) og pellet (bundet tau) fraktioner. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Tau protein lokalisering undersøgt af Konfokal microscopy.
Tau lokaliseret perifert til nucleolus i kolorektal cancerceller. Venstre paneler viser tau lokalisering påvises ved hjælp af anti-tau monoklonalt antistof, der henviser til midterste paneler viser kernen farvning af DAPI. Repræsentative eksempler på behandlede celler viser tau omplantning i kernen er også vist. Kontrol celler viste tau hovedsageligt rundt og kerner, hvorimod tau i behandlede celler lokaliseret også inde i atomkerner. Skalalinjen = 20 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskript etableret forskellige proceduremæssige forhold til påvisning af total tau og fosforyleret tau i kolorektal cancerceller behandles med curcumin og LiCl. For at vurdere den samlede fosforylering status af tau i protein prøver, blev en fosfatase assay beskrevet. Denne analyse kan potentielt bruges til at undersøge fosforylering status af et protein.

Denne analyse er baseret på princippet om, at fosforyleret protein bevæger sig langsommere end sin ikke-fosforyleret tilstand. Alkalisk fosfatase og alkalisk fosfatase buffer anvendes i denne protokol. Efter tilføjer assay komponenter til cellelysater, bør være inkuberet prøver en bestemt optimal varighed ved en bestemt temperatur. Efter inkubationen skal prøver koges i SDS prøvebuffer at stoppe reaktionen. Tidligere, kan forskellige eksperimentelle protokoller har været brugt til at vurdere bindingen af tau at mikrotubuli. Mikrotubulus-bindende analysen præsenteres her er let at udføre, mens herunder både positive og negative kontroller for at sørge for kvalitetssikring ved hjælp af supernatanten og pellet fraktioner. MT-kun negative kontrol blev brugt til at kontrollere, at MT ikke indeholder nogen bundne endogene tau. I tilføjelse, rene menneskelige tau-352, blev en mikrotubulus-bindende tau brugt som den positive kontrol. For at adskille mikrotubulus-bindende brøkdel (pellet) fra ikke-bindende del (supernatanten) ultra-speed centrifugering blev brugt; denne procedure kan være en begrænsning, fordi sådan en ultracentrifuge er dyrt og ikke almindeligt tilgængelig. Desuden, fordi små mængder af prøver er brugt, lang, er tyndt centrifuge rør med adaptere nødvendige til brug i ultracentrifuge rotor. Selvom det er muligt at genbruge sådanne rør, er engangsbrug tilrådeligt at undgå krydskontaminering. Endelig er en fordel af tau-lokalisering protokol, at kun små mængder af primære og sekundære antistoffer er nødvendige. Efter fiksering, permeabilization og blokering af celler tilhænger til coverslips, var en lille dråbe af antistof deponeres på et lille stykke af PVDF, som blev derefter placeret inde wells af en 6-godt plade. Coverslips blev holdt så antistoffet kunne få adgang til cellerne. Ved hjælp af denne protokol, kan blive minimeret mængden af antistoffer bruges.

Visse forholdsregler bør holdes for øje at sikre pålidelige og målbare resultater. For det første, strenge aseptisk teknik skal bruges til at undgå forurening i cellekulturer og celle ekstrakter. Den komplette RIPA lysisbuffer bør være forberedt friske. I analysen fosfatase er det vigtigt at koge prøver i 3 min og starte SDS-PAGE umiddelbart efter inkubation af fosfatase-behandlet og ubehandlet prøver. Tau-352 bør opdeles i små prøver og opbevares på is efter fjernelse fra −20 ° C fryser og deponeret tilbage i fryseren straks efter brug. Efter fjernelse fra −80 ° C, MT skal bestande holdes på is hvis genbruges inden for 72 h; ellers, holde dem ved stuetemperatur. PEM buffer bør udarbejdes som en 10 x koncentreret løsning fordi 1 x buffer skal være frisklavet når GTP og paclitaxel er tilføjet.

Tau funktioner er reguleret af omfanget af dens fosforylering. Tau hyperphosphorylation opstår ikke i normale voksne hjerne tau svarende til tau-352, som blev anvendt som positiv kontrol i mikrotubulus-bindende assay. Men tau hyperphosphorylation forekommer i neurodegenerative sygdomme. Denne protokol og efterfølgende resultater viser, at menneskelige kolorektal cancer cellelinjer også bære fosforyleres tau ligeledes at der i Alzheimers sygdom hjerner. Behandling med højdosis curcumin og især LiCl kan minimere tau fosforylering. Således, en god korrelation mellem neurodegenerative sygdomme såsom Alzheimers sygdom, og tyktarmskræft kan findes med hensyn til tau hyperphosphorylation, og curcumin eller LiCl kan bruges til behandling af tarmkræft og Alzheimers sygdom. Endelig er studerer tau fosforylering og tau mikrotubulus bindende væsentligt ikke kun relevant for neurodegenerative sygdomme men også for nogle kemoterapeutika fordi agenter, der ændrer tau mikrotubulus bindingen studeres dynamisk som kræft Therapeutics51. Protokollerne præsenteres her vil potentielt hjælpe opdagelse og udvikling af nye terapeutiske midler til behandling af forskellige tauopathies og kræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne forskning blev udført som en del af projektet med titlen "Udvikling og industrialisering af høj værdi kosmetiske råvarer fra marine mikroalger", finansieret af ministeriet af oceaner og fiskeri, Korea og blev støttet af en murene tilskud (2Z04930) fra KIST Gangneung Institute of Natural Products.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
HCT 116 cell ATCC CCL-247
MEM (EBSS) Hyclone SH30024.01
Fetal Bovine Serum (FBS) ThermoFisher (Gibco) 16000044 Store at -20 °C
penicillin-streptomycin Hyclone SV30010
Trypsin-EDTA solution WelGene LS 015-01
100 mm dish Corning 430161
6 well plate Corning Coster 3516
Anti-Tau 13 antibody abcam ab19030
Dithiothreitol (DTT) Roche 10 708 984 001 Storage Temperature 2–8 °C
Microlitre Centrifuges Hettich Zentrifugen MIKRO 200 R
Paclitaxel Sigma-Aldrich T1912 Storage Temperature 2–8 °C
Curcumin Sigma-Aldrich (Fluka) 78246 Storage Temperature 2–8 °C
Microtubules (MT) Cytoskeleton MT001 Store at 4 °C (desiccated)
Mounting Medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 Store at 4 °C in the dark
Sodium hydroxide Sigma 72068
Magnesium Chloride Sigma-Aldrich M2670
GTP Sigma-Aldrich G8877 Store at -20 °C
DPBS WelGene LB 001-02
Sonic Dismembrator Fisher Scientific Model 500
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-100 XP
PIPES Sigma P1851
Bovine serum Albumin (BSA) Sigma A7906
Molecular Imager Bio-Rad ChemiDoc XRS+ Store at 4 °C
Protein assay dye reagent Bio-Rad 500-0006
α-tubulin (11H10) Rabbit mAb Cell signalling 2125
GAPDH (14C10) Rabbit mAb Cell signalling 2118
Anti-Tau (phospho S396) antibody abcam ab109390
EGTA Sigma E3889 Store at room temperature
FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase Thermo Scientific EF0651 Store at -20 °C
PMSF Sigma P7626 Store at room temperature
Phosphatase Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5870 Store at 4 °C
Protease Inhibitor Cocktail Cell Signalling 5871 Store at 4 °C
RIPA Buffer Sigma R 0278 Storage Temperature 2–8 °C
Tau-352 human Sigma T 9950 Store at -20 °C
Triton X-100  Sigma-Aldrich X - 100 Store at around 25 °C
PVDF membrane Bio-Rad 162-0177
Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody ThermoFisher A-11005 Store at 4 °C in the dark
Confocal Microscopy Leica Microsystem Leica TCS SP5
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Affymetrix 75819
Protein Assay Bio-Rad 500-0006 Store at 4 °C

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 1858-1862 (1975).
  2. Cambiazo, V., Gonzalez, M., Maccioni, R. B. DMAP-85: a tau-like protein from Drosophila melanogaster larvae. J Neurochem. 64, 1288-1297 (1995).
  3. Goedert, M., et al. PTL-1, a microtubule-associated protein with tau-like repeats from the nematode Caenorhabditis elegans. J Cell Sci. 109 (Pt 11), 2661-2672 (1996).
  4. Goedert, M., Spillantini, M. G., Jakes, R., Rutherford, D., Crowther, R. A. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer's disease. Neuron. 3, 519-526 (1989).
  5. Cleveland, D. W., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. Purification of tau, a microtubule-associated protein that induces assembly of microtubules from purified tubulin. J Mol Biol. 116, 207-225 (1977).
  6. Fellous, A., Francon, J., Lennon, A. M., Nunez, J. Microtubule assembly in vitro. Purification of assembly-promoting factors. Eur J Biochem. 78, 167-174 (1977).
  7. Witman, G. B., Cleveland, D. W., Weingarten, M. D., Kirschner, M. W. Tubulin requires tau for growth onto microtubule initiating sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 73, 4070-4074 (1976).
  8. Dixit, R., Ross, J. L., Goldman, Y. E., Holzbaur, E. L. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau. Science. 319, 1086-1089 (2008).
  9. Harada, A., et al. Altered microtubule organization in small-calibre axons of mice lacking tau protein. Nature. 369, 488-491 (1994).
  10. Caceres, A., Kosik, K. S. Inhibition of neurite polarity by tau antisense oligonucleotides in primary cerebellar neurons. Nature. 343, 461-463 (1990).
  11. Binder, L. I., Frankfurter, A., Rebhun, L. I. The distribution of tau in the mammalian central nervous system. J Cell Biol. 101, 1371-1378 (1985).
  12. Gu, Y. J., Oyama, F., Ihara, Y. tau is widely expressed in rat tissues. J Neurochem. 67, 1235-1244 (1996).
  13. Kenner, L., et al. Expression of three- and four-repeat tau isoforms in mouse liver. Hepatology. 20, 1086-1089 (1994).
  14. Souter, S., Lee, G. Microtubule-associated protein tau in human prostate cancer cells: isoforms, phosphorylation, and interactions. J Cell Biochem. 108, 555-564 (2009).
  15. Sangrajrang, S., et al. Estramustine resistance correlates with tau over-expression in human prostatic carcinoma cells. Int J Cancer. 77, 626-631 (1998).
  16. Rouzier, R., et al. Microtubule-associated protein tau: a marker of paclitaxel sensitivity in breast cancer. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 8315-8320 (2005).
  17. Mimori, K., et al. Reduced tau expression in gastric cancer can identify candidates for successful paclitaxel treatment. Brit J Cancer. 94, 1894-1897 (2006).
  18. Jimeno, A., et al. Development of two novel benzoylphenylurea sulfur analogues and evidence that the microtubule-associated protein tau is predictive of their activity in pancreatic cancer. Mol Cancer Ther. 6, 1509-1516 (2007).
  19. Huda, M. N., Kim, D. H., Erdene-Ochir, E., Kim, Y. S., Pan, C. H. Expression, phosphorylation, localization, and microtubule binding of tau in colorectal cell lines. Appl Biol Chem. 59, 807-812 (2016).
  20. Askanas, V., Engel, W. K., Bilak, M., Alvarez, R. B., Selkoe, D. J. Twisted tubulofilaments of inclusion body myositis muscle resemble paired helical filaments of Alzheimer brain and contain hyperphosphorylated tau. The American journal of pathology. 144, 177-187 (1994).
  21. Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33, 95-130 (2000).
  22. Hanger, D. P., Anderton, B. H., Noble, W. Tau phosphorylation: the therapeutic challenge for neurodegenerative disease. Trends Mol Med. 15, 112-119 (2009).
  23. Sergeant, N., et al. Biochemistry of Tau in Alzheimer's disease and related neurological disorders. Expert Rev Proteomics. 5, 207-224 (2008).
  24. Fath, T., Eidenmuller, J., Brandt, R. Tau-mediated cytotoxicity in a pseudohyperphosphorylation model of Alzheimer's disease. J Neurosci. 22, 9733-9741 (2002).
  25. Kolarova, M., Garcia-Sierra, F., Bartos, A., Ricny, J., Ripova, D. Structure and pathology of tau protein in Alzheimer disease. Int J Alzheimers Dis. 2012, 731526 (2012).
  26. Kosik, K. S., Joachim, C. L., Selkoe, D. J. Microtubule-associated protein tau (tau) is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4044-4048 (1986).
  27. Wood, J. G., Mirra, S. S., Pollock, N. J., Binder, L. I. Neurofibrillary tangles of Alzheimer disease share antigenic determinants with the axonal microtubule-associated protein tau (tau). Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 4040-4043 (1986).
  28. American Cancer Society. Colorectal Cancer Facts, Figures 2011-2013. , Available from: http://www.cancer.org/acs/groups/content/@epidemiologysurveilance/documents/document/acspc-028312.pdf (2016).
  29. Jemal, A., et al. Cancer statistics, 2003. CA Cancer J Clin. 53, 5-26 (2003).
  30. Patel, V. B., Misra, S., Patel, B. B., Majumdar, A. P. Colorectal cancer: chemopreventive role of curcumin and resveratrol. Nutr Cancer. 62, 958-967 (2010).
  31. Lim, G. P., et al. The curry spice curcumin reduces oxidative damage and amyloid pathology in an Alzheimer transgenic mouse. J Neurosci. 21, 8370-8377 (2001).
  32. Venkatesan, N. Curcumin attenuation of acute adriamycin myocardial toxicity in rats. Br J Pharmacol. 124, 425-427 (1998).
  33. Srinivasan, M. Effect of curcumin on blood sugar as seen in a diabetic subject. Indian J Med Sci. 26, 269-270 (1972).
  34. Deodhar, S. D., Sethi, R., Srimal, R. C. Preliminary study on antirheumatic activity of curcumin (diferuloyl methane). Indian J Med Res. 71, 632-634 (1980).
  35. Rao, C. V., Rivenson, A., Simi, B., Reddy, B. S. Chemoprevention of colon carcinogenesis by dietary curcumin, a naturally occurring plant phenolic compound. Cancer Res. 55, 259-266 (1995).
  36. Araujo, C. C., Leon, L. L. Biological activities of Curcuma longa L. Mem Inst Oswaldo Cruz. 96, 723-728 (2001).
  37. Lim, T. G., et al. Curcumin suppresses proliferation of colon cancer cells by targeting CDK2. Cancer Prev Res (Phila). 7, 466-474 (2014).
  38. Ringman, J. M., Frautschy, S. A., Cole, G. M., Masterman, D. L., Cummings, J. L. A potential role of the curry spice curcumin in Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2, 131-136 (2005).
  39. Li, H., et al. Lithium chloride suppresses colorectal cancer cell survival and proliferation through ROS/GSK-3beta/NF-kappaB signaling pathway. Oxid Med Cell Longev. , 241864 (2014).
  40. Forlenza, O. V., De-Paula, V. J., Diniz, B. S. Neuroprotective effects of lithium: implications for the treatment of Alzheimer's disease and related neurodegenerative disorders. ACS Chem Neurosci. 5, 443-450 (2014).
  41. Noble, W., et al. Inhibition of glycogen synthase kinase-3 by lithium correlates with reduced tauopathy and degeneration in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 6990-6995 (2005).
  42. Perez, M., Hernandez, F., Lim, F., Diaz-Nido, J., Avila, J. Chronic lithium treatment decreases mutant tau protein aggregation in a transgenic mouse model. J Alzheimers Dis. 5, 301-308 (2003).
  43. Engel, T., Goni-Oliver, P., Lucas, J. J., Avila, J., Hernandez, F. Chronic lithium administration to FTDP-17 tau and GSK-3beta overexpressing mice prevents tau hyperphosphorylation and neurofibrillary tangle formation, but pre-formed neurofibrillary tangles do not revert. J Neurochem. 99, 1445-1455 (2006).
  44. Caccamo, A., Oddo, S., Tran, L. X., LaFerla, F. M. Lithium reduces tau phosphorylation but not A beta or working memory deficits in a transgenic model with both plaques and tangles. Am J Pathol. 170, 1669-1675 (2007).
  45. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
  46. Gupta, K. K., Bharne, S. S., Rathinasamy, K., Naik, N. R., Panda, D. Dietary antioxidant curcumin inhibits microtubule assembly through tubulin binding. FEBS J. 273, 5320-5332 (2006).
  47. Lee, J. W., Park, S., Kim, S. Y., Um, S. H., Moon, E. Y. Curcumin hampers the antitumor effect of vinblastine via the inhibition of microtubule dynamics and mitochondrial membrane potential in HeLa cervical cancer cells. Phytomedicine. 23, 705-713 (2016).
  48. Liu, F., et al. Site-specific effects of tau phosphorylation on its microtubule assembly activity and self-aggregation. Eur J Neurosci. 26, 3429-3436 (2007).
  49. Sultan, A., et al. Nuclear tau, a key player in neuronal DNA protection. J Biol Chem. 286, 4566-4575 (2011).
  50. Bukar Maina, M., Al-Hilaly, Y. K., Serpell, L. C. Nuclear Tau and Its Potential Role in Alzheimer's Disease. Biomolecules. 6, 9 (2016).
  51. Dumontet, C., Jordan, M. A. Microtubule-binding agents: a dynamic field of cancer therapeutics. Nat Rev Drug Discov. 9, 790-803 (2010).

Tags

Biokemi spørgsmålet 128 Alzheimers sygdom tauopathy fosforylering mikrotubuli curcumin lithium chlorid konfokalmikroskopi
Assay for fosforylering og mikrotubulus bindende sammen med lokalisering af Tau Protein i kolorektal cancerceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan,More

Huda, M. N., Erdene-Ochir, E., Pan, C. H. Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells. J. Vis. Exp. (128), e55932, doi:10.3791/55932 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter