Summary
Este manuscrito describe protocolos estándar para la medición de la hiperfosforilación de tau, medición de enlace de tau a los microtúbulos y la localización de tau intracelular después de tratamientos con fármacos. Estos protocolos pueden utilizarse repetidamente para la detección de drogas u otros compuestos que enlace la hiperfosforilación o microtúbulos tau.
Abstract
La proteína asociada a microtúbulos tau es una proteína neuronal que se localiza sobre todo en los axones. Generalmente tau es esencial para el funcionamiento neuronal normal porque está implicada en la estabilización y el montaje del microtubule. Además de las neuronas, tau se expresa en mama, próstata, gástrica, colorrectal y los cánceres de páncreas donde se muestra la estructura casi similar y ejerce funciones similares como el tau neuronal. La cantidad de tau y su fosforilación puede cambiar su función como estabilizador de microtúbulos y conducir al desarrollo de filamentos helicoidales apareados en trastornos neurodegenerativos diferentes, como la enfermedad de Alzheimer. Es importante determinar el estado de fosforilación de tau y sus características de unión a microtúbulos. Además, examinar la localización intracelular de tau es importante en diferentes enfermedades. Este manuscrito detalles protocolos estándar para la medición de la fosforilación de tau y de la Unión de tau a los microtúbulos en las células de cáncer colorrectal con o sin tratamiento de LiCl y curcumina. Estos tratamientos pueden utilizarse para detener el desarrollo y proliferación de células de cáncer. Localización intracelular del tau se examina mediante el uso de inmunohistoquímica y microscopía confocal durante el uso de bajas cantidades de anticuerpos. Estos ensayos pueden usarse repetidamente para la detección de compuestos que afectan la hiperfosforilación de tau o atascamiento de microtúbulos. Terapéutica de la novela utiliza para diferentes Tauopatías o relacionados con agentes anticancerígenos potencialmente pueden ser caracterizados mediante estos protocolos.
Introduction
Tau fue identificado originalmente como una proteína asociada a microtúbulos estables al calor que fue co purificada con tubulina1. Tau se expresa exclusivamente en eucariotas superiores2,de3,4. La función principal del tau es controlar microtúbulos Asamblea1,5,6. También contribuye a la polimerización de microtúbulos7, transporte axonal8, cambios en el diámetro axonal9, formación de polaridad de neuroma y neurodegeneración10. Tau también actúa como un andamio de proteínas para el control de algunas vías de señalización. Estudios de cerebro de rata sugieren que tau es específica de la neurona y que principalmente se localiza en axones11. Porque es esencial para el desarrollo neuronal y polimerización de microtúbulos tau, tau fue presumido para desempeñar un papel importante en el desarrollo axonal en el sistema nervioso central; Esta hipótesis fue posteriormente verificado por experimentos in vitro e in vivo . Además de las neuronas, tau se expresa en diversas células no neuronales, incluyendo hígado, riñón y músculo células12,13. Tau se expresa también en mama, próstata, colorrectal, gástrica y cáncer pancreático células líneas y tejidos14,15,16,17,18, 19. tau también se encuentra en myositis del cuerpo de inclusión como trenzado tubulofilaments en cuerpos de inclusión20.
Tau puede llevar varias modificaciones poste-de translación. De todas las modificaciones post-traduccionales, fosforilación es la más común. Fosforilación de tau mayor disminuye su afinidad por los microtúbulos, finalmente desestabilizar el citoesqueleto. Se han descrito sitios de fosforilación de ochenta y cinco en aislados de los tejidos del cerebro humano la enfermedad de Alzheimer la proteína tau. De estos sitios, 53% son serina, treonina 41% y sólo 6% tirosina residuos21,22,23. Fosforilación de Tau afecta a su localización, función, enlace, solubilidad y su susceptibilidad a otras modificaciones poste-de translación. También la fosforilación de tau a más de lo normal (o completamente saturado con grupos fosfato) se conoce como la hiperfosforilación que imita las características estructurales y funcionales de la enfermedad de Alzheimer24. Mantiene el buen funcionamiento de los microtúbulos axonales y asegura el funcionamiento neuronal normal bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, tau hiperfosforilada es incapaz de mantener un enlace de microtúbulos bien organizado, causando la pérdida neuronal por desmontaje de microtúbulos. Niveles normales de la fosforilación de tau se requieren para tau correcto funcionamiento, pero tau no funciona normalmente si se altera su nivel de fosforilación característico y si está hiperfosforilada25. En la enfermedad de Alzheimer y algunos otros trastornos neurodegenerativos relacionados con la edad, se convierte en hiperfosforilada y forma los filamentos helicoidales apareados y los enredos de neurofibrillary26,27. Por lo tanto, métodos para la determinación de la fosforilación de tau y Unión de los microtúbulos son importantes.
Cáncer colorrectal, un cáncer asociado a envejecimiento, es que la tercera más frecuentemente diagnosticado cáncer y el tercer prominente que causan la muerte para hombres y mujeres28. El cáncer colorrectal es uno de los principales cánceres causantes de muerte en el mundo occidental29. Porque el cáncer colorrectal y la enfermedad de Alzheimer están asociados con el envejecimiento y ambos suceden principalmente en los países desarrollados donde disfrutar de los hábitos alimentarios similares, las dos enfermedades de alguna manera pueden correlacionarse. Además, las células cancerosas tau-positivas y negativas de tau responden de diferente manera a los agentes quimioterapéuticos, por ejemplo, paclitaxel16.
La curcumina es uno de los principales derivados de la longa de la cúrcuma, la especia India cúrcuma30. Durante siglos, las poblaciones del sur de Asia han consumido cúrcuma en su dieta diariamente. La curcumina se usa para tratar diferentes enfermedades, incluyendo cáncer colorrectal, la enfermedad de Alzheimer, diabetes, fibrosis quística, enfermedad inflamatoria intestinal, artritis, hiperlipidemia, aterosclerosis y cardiopatía isquémica31, 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38. litio también puede matar a las células de cáncer colorrectal o prevenir su proliferación39. Litio puede usarse para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer40 ya que disminuye la agregación de tau y previene su hiperfosforilación como se observa en un ratón transgénico modelo41,42,43, 44.
Este manuscrito tiene como objetivo: 1) medir la tau total y niveles de expresión de fosfo-tau en células tratadas; 2) describe un ensayo de fosfatasa para medir la fosforilación de tau total; 3) examinar microtubule-obligatorios de tau; y 4) localizar tau mediante microscopía confocal en líneas celulares de cáncer colorrectal tratados con curcumina o LiCl. Los resultados revelan que célula el tratamiento con curcumina, que es un agente quimioterapéutico supuestamente bueno para el cáncer de colon, y tratamiento con LiCl puede reducir la expresión de ambos tau total y fosforila tau en líneas celulares de cáncer colorrectal. Estos tratamientos también pueden causar desplazamiento nuclear de tau. Sin embargo, inesperadamente, la curcumina no mejorar la Unión de tau a los microtúbulos.
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Protocol
1. preparación de los reactivos
- añadir 10 μl de solución de fluoruro de phenylmethylsulfonyl (1 mM), 10 μl (1 x de acción x 100) de solución Cóctel de inhibidor de la proteasa y 10 μl (1 x de acción x 100) de fosfatasa solución coctel inhibidor a 1 mL de tampón de ensayo (RIPA) x radioimmunoprecipitation 1 preparar el buffer de lisis RIPA completo.
- Prepare 10 x buffer de buffer (PEM) de tubulina general.
- Add 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido, 10 mM (95,1 mg) glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacético de ácido, 10 mM (51 mg) MgCl 2 y NaOH 1.25 de M (3 mL de 10 M) en un tubo de 50 mL , mezclar con 15 mL de agua destilada y disolver mediante el uso de un vórtice. Verificar el pH (debe ser 6,9). Si pH > 6.9, deseche el búfer y rehacer un lote fresco.
Nota: El NaOH debe ser por debajo de 1,25 M para asegurar que el pH no adelantar 6.9. No se aconseja utilizar ácido clorhídrico para ajustar el pH > 6.9. - Agregar NaOH gota a gota hasta que pH 6.9. Añadir agua destilada hasta 25 mL de tampón de PEM X 10. Por último, filtrar utilizando una jeringa y un filtro de jeringa de 0,2 μm. Este buffer se dividen en alícuotas en tubos de 1,5 mL y almacenar a 4 ° C.
- Add 800 mM (6,0474 g) piperazina-N-N ' - bis - 2-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido ácido, 10 mM (95,1 mg) glicol de etileno-bis(β-aminoethyl ether)-N, N, N ', N '-tetraacético de ácido, 10 mM (51 mg) MgCl 2 y NaOH 1.25 de M (3 mL de 10 M) en un tubo de 50 mL , mezclar con 15 mL de agua destilada y disolver mediante el uso de un vórtice. Verificar el pH (debe ser 6,9). Si pH > 6.9, deseche el búfer y rehacer un lote fresco.
- Prepare 5 x tampón con agente reductor y tinte.
- Mix 300 μL (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), (25%) de 2,5 mL de glicerol 50%, 1 mL (2%) de 10% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1,2 mL de agua destilada para 5 mL de 5 x buffer de muestra de SDS. Almacenar en − 20 ° C.
Nota: Ya que el glicerol es viscoso, mide 1,25 mL glicerol es difícil. 1 mL de glicerol al 100% pesa 1,26 g. Así, pesar 1,575 g de glicerol al 100% (que equivale a 1,25 mL de 100% o 2,5 mL de glicerol al 50%) en 15 mL tubo primero; mezclar bien con los demás componentes de.
- Mix 300 μL (60 mM) de 1 M Tris-HCl (pH 6,8), (25%) de 2,5 mL de glicerol 50%, 1 mL (2%) de 10% sodio dodecil sulfato (SDS) y 1,2 mL de agua destilada para 5 mL de 5 x buffer de muestra de SDS. Almacenar en − 20 ° C.
2. Cultura, el tratamiento con curcumina o LiCl tratamiento y examen de expresión de la proteína de la célula
- Add ~ 1 x 10 6 HCT 116 células en 100 mm platos de cultivo de tejidos que contienen el mínimo esencial los medios de comunicación (MEM) suplementado con 10% bovino fetal suero (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina. Después de un día de cultivo, las células llega a confluencia de 60-70%.
Nota: El número de placas necesitada depende del número de tratamientos que se describen a continuación. - Cuando las células alcanzan confluencia ~ 65% (aproximado usando microscopia), saque el medio MEM complementado y añadir MEM libre de suero de 5 μm, 10 μm, 30 μm curcumina o 25 mM, 50 mM y 100 mM LiCl. Incubar a 37 ° C durante 24 h en una atmósfera humidificada con 5% CO 2.
- 24 h después del tratamiento, lavar las células con solución salina 1 mL helado con tampón fosfato (PBS) y raspar las células usando un raspador celular. Transferencia de las células raspadas en 1,5 mL tubos de centrífuga y centrifugar durante 4 min a 1.800 x g a 4 ° C para obtener pellets celulares.
- Lyse las células suspendiendo las pelotillas en 100 μl de buffer RIPA completa a 4 ° C por 20 min mientras que regularmente golpean ligeramente los tubos. Someter a ultrasonidos las muestras brevemente.
- Centrifugar los homogenados celulares en una centrífuga de sobremesa a 22.570 x g por 20 min a 4 ° C. transferir el sobrenadante a otros tubos etiquetados con una pipeta de.
- Medir la concentración de proteína en los sobrenadantes mediante el ensayo de Bradford 45 usando kits comerciales de análisis de proteínas. Tampón de carga de gel SDS X
- preparar muestras de concentración de la proteína igual (10 μg proteína/13 μl de muestra) de lysates de la célula con 4. Preparado 4 x buffer de carga de gel SDS fresco que contiene 400 mM Ditiotreitol (DTT).
Nota: En esta etapa, las muestras pueden conservarse a − 20 ° C si es necesario. - Incubar las muestras en un bloque térmico a 100 ° C por 5 min mezclan las muestras usando un vórtex y esperan que se enfríe para ~ 10-15 min
- Montar un sistema de electroforesis.
- Carga 10 μg de proteína (13 μl de muestra) por pocillo en un gel de SDS-poliacrilamida de 10% para electroforesis (SDS-PAGE). La escala del peso molecular en el gel a un carril de la carga.
Nota: Como electroforesis, la escalera de la proteína se resuelve en bandas de proteínas de pesos moleculares evidentes. Utilizar estas bandas para calcular los pesos moleculares de las bandas de proteínas desconocidas. - Después de cargar las muestras, conectar los electrodos positivos y negativos del sistema de electroforesis a una fuente de energía para mantener una tensión constante. Inicialmente, comenzar a 70 V por 20 min mover las muestras de proteína del gel de apilamiento en el gel de resolución. Luego, aumentar la tensión de 125 V para aproximadamente 70-120 min hasta que las muestras y la escala de proteína lleguen al final del gel.
- Después de la terminación de la electroforesis, transferir el gel a una membrana de polivinilideno difluoruro (PVDF) utilizando un sistema de moje electroblotting. Transferencia de ~ 100 min a 100 V. bloque de la membrana en solución amortiguadora de bloqueo 4% albúmina de suero bovino (BSA) durante 90 minutos a temperatura ambiente de alrededor de 25 ° C.
- Carga 10 μg de proteína (13 μl de muestra) por pocillo en un gel de SDS-poliacrilamida de 10% para electroforesis (SDS-PAGE). La escala del peso molecular en el gel a un carril de la carga.
- Marque el blot por corte en el lado con la escala del peso molecular. Use una lámina de plástico transparente y un cuchillo afilado para cortar el blot. Preparar las soluciones de primaria-anticuerpo (anti-tau en el 1:5, 000, anti-fosfo-tau 1:4, 000) e incubar el blot en esta solución a 4 ° C durante la noche.
- Después de la incubación durante la noche, lavar la mancha de 7 min cuatro veces en solución tampón fosfato salino-Tween-20 (SAFT).
- Preparar las soluciones pertinentes de anticuerpo secundario (anti-conejo de cabra o anti-mouse IgG 1:5, 000) e incubar el blot en esta solución durante 90 minutos a temperatura ambiente de 25 ° C. lavado en SAFT cuatro veces, 7 min.
- Desarrollar la mancha blanca /negra usando un kit de quimioluminescencia según el fabricante ' recomendaciones de s. Cubrir la mancha blanca /negra usando una envoltura de plástico transparente. Adquisición de imágenes por una sistema de quimioluminiscencia con software relevante de imagen de la quimioluminescencia.
3. Ensayo de la fosfatasa
- tratar los lysates de la célula (del paso 2.5) con fosfatasa alcalina en el búfer de fosfatasa alcalina.
- Tanto controlan y tratamiento de muestras, preparar 20 μl las muestras que contienen 20 μg proteína total. Añadir el volumen de lysates de la célula que contiene 20 μg proteína total, seguido de 2 μl de tampón de fosfatasa alcalina y fosfatasa alcalina 10 μl. Añadir agua destilada a 20 μl.
- Incubar las muestras a 37 ° C por 1 h. detener la reacción agregando ácido etilendiaminotetracético (EDTA) en una concentración final de 50 m m, o mediante la adición de ortovanadato de sodio (Na 3 VO 4) a una concentración final de 10 mM. También puede detener la reacción por calentamiento a 75 ° C por 5 min
- Antes de la incubación de las muestras con fosfatasa acabados, preparar muestras de la misma concentración sin añadir fosfatasa para la comparación con las muestras tratadas con fosfatasa.
- Añadir los 4 recién preparada el tampón de carga de gel SDS X que contiene 400 mM DTT.
- Incubar las muestras en un bloque térmico a 100 ° C por 5 min mezclar las muestras utilizando un vortex. Enfriar a temperatura ambiente para ~ 10-15 minutos
- Montar un sistema de electroforesis para correr un gel de poliacrilamida al 10% por SDS-PAGE.
- Carga 10 μg proteína (13 μl de muestra) por pozo en una fibra polyacry 10%lamide gel. La escala del peso molecular de la carga.
- Después de cargar la muestra, conectar los electrodos positivos y negativos del sistema de electroforesis a una fuente de energía para mantener una tensión constante. Inicialmente, comenzar a 70 V por 20 min mover las muestras de proteína del gel de apilamiento en el gel de resolución. A continuación, aumentar la tensión de 125 V y correr el gel aproximadamente 70-120 min hasta que las muestras y la escala de proteína lleguen al final del gel.
- Después de la terminación de la electroforesis, transferir el gel a una membrana PVDF usando un sistema de moje electroblotting. Transferencia de ~ 100 min a 100 V.
- Marque la mancha haciendo un pequeño corte en el lado de la escala del peso molecular. Use una lámina de plástico transparente y un cuchillo afilado para cortar lo blot.
- Bloquear la membrana en 4% BSA solución amortiguadora de bloqueo durante 90 minutos a temperatura ambiente.
- Incubar el blot en solución de anticuerpo primario (anti-tau en el 1:5, 000) a 4 ° C durante la noche. Lave la mancha blanca /negra en SAFT cuatro veces, durante 7 min.
- Preparar la correspondiente solución de anticuerpo secundario (cabra anti-ratón IgG 1:5, 000) e incubar el blot durante 90 minutos a temperatura ambiente. Lavar en SAFT cuatro veces, durante 7 min.
- Desarrollar la mancha blanca /negra usando un kit de quimioluminescencia según el fabricante ' recomendaciones de s. Cubrir la mancha dentro de una envoltura de plástico transparente. Adquisición de imágenes por una sistema de quimioluminiscencia con software relevante de imagen de la quimioluminescencia.
4. Ensayo de unión a microtúbulos
- para el análisis de enlace de microtúbulos, repita los pasos 2.1-2.6.
- Prepare 1 X buffer (2 mL) PEM de búfer PEM X 10 almacenados a 4 ° C mediante la adición de 20 μm (40 μL) paclitaxel y 1 mM (20 μl) GTP. Tomar los microtúbulos (MT) de − congelador de 80 ° C y la acción de trabajo de e. coli tau de − 20 ° C congelador.
- Preparación de las muestras según la tabla 1.
- Incubar a 37 ° C para ultracentrífuga de 30 min a 25 ° C durante 60 min a 100.000 x g.
- Transferencia 120 μl de sobrenadante que contiene desatado tau, limpieza y etiquetado tubos.
- Añadir 120 μl (mismo volumen como sobrenadante) de 5 X buffer para el sedimento que contiene tau encuadernado de la muestra y mezcla bien. La solución para limpiar tubos etiquetados y mezcle bien.
- Medir la concentración de proteína (ver paso 2.6).
Nota: Mientras se preparan las muestras, usar el volumen de solución (paso 4.6) para la preparación de las muestras el pellet y sobrenadante. - Preparar muestras de concentración de la proteína equivalente y añadir 4 recién preparada x buffer de carga de gel SDS con TDT (400 mM).
Nota: Las muestras pueden almacenarse a − 20 ° C en este momento. - Repita los pasos del 3.5-3.10.
| nombre | de lamuestra | microtúbulos necesitada | principal proteína necesaria | PEM-GTP-PTX | ||||
| 1 | HCT 116-Control (6,21 μg/μl) | 2 μl | 9.66 μl (60 μg) | 108.34 μl | ||||
| 2 | HCT 116-curcumina 10 μM (4,81 μg/μl) | μl 2 | μl 16.63 (80 μg) | μl 101.37 | ||||
| 3 | HCT 116-curcumina 20 μM (3.28 μg/μl) | μl 2 | μl 30.49 (100 μg) | 87.51 μl | ||||
| 4 | HCT 116-LiCl 25 mM (5.43 μg/μl) | μl 2 | μl 18.42 (100 μg) | μl 99.58 | ||||
| 5 | e. coli tau | 2 μl | 1 μl Tau-352 | μl 117 | ||||
| 6 | MT sólo | 2 μl | X | μl 118 | ||||
| < td colspan = " 2" > | 120 μl | |||||||
tabla 1: preparación para el ensayo de unión a microtúbulos de muestras.
5. localización y expresión del Tau después de tratamiento de células con curcumina
- limpiar un cubreobjetos usando etanol al 70% y secar con un pañuelo de laboratorio. Coloque un cubreobjetos solo en cada pocillo de una placa de etiquetado bien 6-cultivo de tejidos. Coloque la placa en una seguridad biológica gabinete y encender una luz para por lo menos 3 h. UV
- Subcultivo las células y los de semilla en los pocillos correspondientes de la placa de 6 pozos en 2.5 x 10 5 células/pozo en medio de cultivo recomendado.
- ~ 24 h, después de examinar las células utilizando un microscopio invertido mediante 10 X y objetivos de X 40 para comprobar cambios morfológicos celulares. Grabar fotos si es necesario.
- Enjuague las células dos veces con PBS. Fijar las células en 3,7% formaldehído en una incubadora de 37 ° C en la oscuridad.
Nota: La fijación por el formaldehído en la temperatura funciona bien, también. Use equipo de protección personal cuando maneje formaldehído. - Lave las células en PBS. Fijar las células en metanol helada en − 20 ° C por 15 min permeabilizar las células por incubación en BSA 3% y 0,1% Tritón X-100 en PBS en hielo durante 10 minutos lavar las células con PBS.
- Incubar las células en solución amortiguadora de bloqueo (BSA 3% y 0,1% Tween-20 en solución de PBS) durante 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Incubación de 2 h a 4 ° C funciona bien, también. - Preparar la solución primaria-anticuerpo (anti-tau en el 1: 200) en BSA 3% y 0,1% Tween-20 en PBS (p. ej., 2 anticuerpo tau-13 μl 0,4 mL de tampón).
- Cortar pequeños pedazos de un PVDF membrana para que las piezas encajan correctamente en cada pocillo de la placa de la pozo 6; remójelos en agua por 5 min lugar el corte PVDF en cada pozo.
- Añadir 60 μL de solución de anticuerpo primario para el corte de piezas PVDF en cada pozo. Colocar el cubre-objetos que las células pueden tocar la solución de anticuerpo primario. Incubar durante una noche a 4 ° C en una cámara oscura, húmeda. Lavado en PBS cuatro veces.
- Preparar la solución de anticuerpo secundario (conjugado con fluoresceína 594 anti-ratón IgG en 1: 400) BSA 3% y 0,1% Tween-20 en PBS.
- Cortar pequeños trozos de una membrana PVDF para que las piezas de encajar correctamente en cada pocillo de la placa de 6 pozos y remojan en agua por 5 min lugar el corte PVDF en cada pozo.
- Añadir 80 μl de la solución de anticuerpo secundario para cada una de las piezas PVDF en la placa de 6 pozos. Colocar el cubreobjetos de tal que las células pueden tocar la solución de anticuerpo secundario. Incubar en una cámara oscura, húmeda a temperatura ambiente durante 2 h. lavado con PBS cuatro veces.
- Montaje de muestras en el medio de montaje con 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) y fijar el cubreobjetos en portaobjetos de cristal.
- Agregar una gota de medio de montaje con DAPI en portaobjetos de vidrio. Quite el cubreobjetos de cada bien y colocarlos en el portaobjetos de vidrio que contiene el medio de montaje con DAPI. Asegurar que la superficie de cada cubreobjetos que contiene células toca la montañamedio de Ting en la correspondiente diapositiva de cristal.
- Aplicar esmalte de uñas todo cada cubreobjetos para sellar y fijar hermético sobre el portaobjetos. Si es necesario, hacer este paso dos veces.
- Incubar durante 1,5 h a temperatura ambiente en una cámara oscura.
- Examinar las diapositivas utilizando un microscopio confocal utilizando aceite de inmersión sobre el cubreobjetos en un cuarto oscuro.
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Representative Results
Expresión de tau total y fosfo-tau fue examinado después de tratar las células con diferentes concentraciones de curcumina o LiCl (figura 1). Tratamiento de células con las tres concentraciones diferentes de la curcumina disminuye los niveles de expresión de tau; expresión de fosfo-tau aumentó sobre el tratamiento con baja concentración de curcumina pero disminuyó al tratar las células con concentraciones más altas de la curcumina. Anti-fosfo-tau (Ser396) fue utilizado para la detección de fosfo-tau. Disminución de los niveles de tau total y fosfo-tau sobre el tratamiento de las células con las tres diferentes concentraciones de LiCl (figura 1). Investigaciones anteriores habían mostrado que los niveles de expresión de tau varían en tipos de cáncer diferentes y en diferentes sitios de los mismos tipos de cáncer. Los datos anteriores sobre cáncer colorrectal mostraron que tau se expresó en dos líneas celulares (HCT 116 y SW480) del cáncer colorrectal que fueron también fosforilada19. Niveles de fosfo-tau en células tratadas con 5 μm curcumina eran superiores a los de las células no tratadas. Niveles de fosfo-tau fueron superiores a tau total en células tratadas con la misma concentración de curcumina. Tratamiento de células con 10 μm curcumina disminución de los niveles de la fosfo-tau en comparación con las células no tratadas pero la expresión de fosfo-tau era niveles de expresión de tau total todavía más. Tratamiento de células con expresión de fosfo-tau de curcumina redujo de μm 30 había comparado con fosfo-tau en células no tratadas y tau total niveles en las mismas células tratadas.
Este manuscrito establece un protocolo fácil de evaluar el estado de fosforilación de tau por un ensayo de fosfatasa (figura 2). Después del tratamiento de la curcumina, la fosforilación de tau total no cambió significativamente y fosforilación en residuos de aminoácidos específicos fue significativa (figura 1). En general se detuvo fosforilación del tau en células tratadas con LiCl en comparación con las células no tratadas. Muestras tratadas con fosfatasa al más rápido que las muestras no tratadas, verificar que las muestras sin tratar fueron hiperfosforilada más que las muestras tratadas con fosfatasa. Células tratadas con curcumina demostraron casi los mismos resultados, lo que indica que el tratamiento de líneas celulares de cáncer colorrectal no redujo la fosforilación tau como se muestra en la figura 1. Fosfatasa-tratados y sin tratadas las muestras en casi la misma gama en muestras de células tratadas con LiCl, indicando que la fosforilación tau en estas células era reducido (figura 2). Aquí, altas concentraciones (20 μm o 30 μm) de las muestras tratadas con curcumina llevaron a comparar el estado general de fosforilación, como baja concentración mayor tratamiento demostrada la fosforilación específica revelada por anticuerpos específicos fosfo-tau (S396).
Por otra parte, en esta práctica, el ensayo de unión de microtúbulos de muestras de células se estableció con éxito utilizando tau-352 como control positivo y sólo MT como un control negativo (figura 3). Tanto para la curcumina como tratamiento de LiCl, microtubule-obligatorios actividad fue inhibida, según lo demostrado por el análisis de enlace de microtúbulos. En este experimento, la curcumina tratamiento no mostró microtúbulos vinculante capacidad, pero inhibe el atascamiento similar a la de anteriores estudios46,47, mientras que fue eficaz inhibir la fosforilación de tau específica en concentración más alta. En la figura 1, 10 μm curcumina tratamiento dio lugar a mínima expresión de fosfo-tau en comparación con el control pero la mayor expresión de tau total. Sin embargo, capacidad de microtubule-obligatorios de tau de cáncer colorectal después del tratamiento de la curcumina, así como baja concentración de LiCl tratamiento disminuyó en la muestra no tratada. Fosforilación de tau específica los efectos vinculantes y la agregación de microtúbulos48. Fosforilación de tau en la región rica en prolina impedido microtubule-obligatorios propiedades mientras que la región c-terminal aumentado estas propiedades, y ambas regiones junto con la región de unión a MT disminuye sus propiedades de enlace de alrededor del 70% y trastornos del microtúbulos48. Pudo implicar otros factores así como otros específicos del sitio fosforilación de tau para esta desestabilización microtúbulos tau cáncer colorrectal tratados con curcumina o LiCl.
Un protocolo sencillo utilizando pequeñas cantidades de anticuerpos primarios y secundarios permitió localización de tau en líneas celulares de cáncer colorrectal tras tratamiento de curcumina (figura 4). Resultados mostraron que el tau había desplazado hacia el núcleo después del tratamiento de la curcumina, un hallazgo similar a estudios anteriores informes tau nuclear es un jugador clave en la protección neuronal de ADN en enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer49 ,50.
Figura 1: expresión de Tau y fosfo-tau en células de cáncer colorrectal después de la curcumina o tratamiento LiCl. Las muestras extraídas de las células del control o células tratadas por 24 h con tres diferentes concentraciones de curcumina (A) y (B) LiCl fueron resueltas en geles de poliacrilamida de 10% por SDS-PAGE y sondeadas con anticuerpos anti-tau o anti-fosfo-tau. Análisis de densitometría de los resultados de Western blot se presentan en el panel derecho. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: General fosforilación de tau en no tratados o tratados diferencialmente muestras celulares detectadas por el ensayo de la fosfatasa. Carriles impares Mostrar control celular extractos, mientras que calles incluso muestran fosfatasa tratamiento muestras tratados con curcumina o tratados con LiCl. Tratamiento de fosfatasa hace la movilidad electroforética de tau más rápida que las muestras no tratadas, que contuvo tau fosforilada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Unión de microtúbulos tau en células de cáncer colorrectal detectada mediante los análisis de microtubule-obligatorios. Muestras de células de HCT 116 control, tratados con curcumina, o muestras de células tratadas con LiCl y tau de e. coli se incubaron con los microtúbulos como se detalla en el protocolo de la sección 4. Cantidades equivalentes de sobrenadante (S) y fracciones de pellet (P) fueron immunoblotted con un anticuerpo anti-tau. Carriles de control negativo que contiene solamente MT fueron funcionados para confirmar que los MT no contenían ningún límite tau endógena. Panel inferior muestra análisis de densitometría de manchas blancas /negras occidentales de muestras individuales que permite la comparación entre el sobrenadante (TH) y pellets (tau encuadernado) fracciones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Localización de la proteína de Tau por mic confocalroscopy.
Tau localizado periféricamente al nucleolo en las células de cáncer colorrectal. Paneles de la izquierda muestran localización tau detectada mediante el anticuerpo monoclonal de anti-tau Considerando que medio paneles muestran núcleo tinción por DAPI. También se muestran ejemplos representativos de células tratadas con desplazamiento de tau en el núcleo. Las células del control demostraron tau principalmente alrededor y fuera de los núcleos, mientras que tau en células tratadas también localizada dentro de los núcleos. Barra de escala = 20 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este manuscrito establece diferentes condiciones procedimentales para la detección de tau total y fosforila tau en células de cáncer colorrectal tratados con curcumina y LiCl. Para evaluar el estado global de la fosforilación de tau en las muestras de proteína, un ensayo de fosfatasa fue descrito. Este ensayo se puede potencialmente utilizar para examinar el estado de fosforilación de alguna proteína.
Este ensayo se basa en el principio de que fosforila la proteína se mueve más lento que su estado no fosforilado. Fosfatasa alcalina y fosfatasa alcalina tampón se utilizan en el presente Protocolo. Después de agregar los componentes del ensayo a los lysates de la célula, las muestras deben ser incubadas para una duración óptima específica a una temperatura específica. Después de la incubación, las muestras se deben hervir en el tampón de muestra de SDS para detener la reacción. Previamente, diferentes protocolos experimentales pueden han utilizado para evaluar la Unión de tau a los microtúbulos. El ensayo de microtubule-obligatorios presentado aquí es fácil de realizar al mismo tiempo incluyendo controles positivos y negativos para proporcionar aseguramiento de la calidad utilizando fracciones sobrenadante y pellet. Sólo MT control negativo se utilizó para verificar que el MT no contiene ningún límite tau endógena. Además, tau humana pura-352, un tau microtubule-obligatorios se utilizó como control positivo. Se utilizó separar la fracción de microtubule-obligatorios (pellets) de la centrifugación de ultra velocidad (sobrenadante) de la fracción no vinculante; Este procedimiento puede ser una limitación porque tal una ultracentrífuga es costosa y no ampliamente disponible. Además, debido a cantidades pequeñas de muestras se utilizan, larga, tubos de centrífuga fina con adaptadores se necesitan para el uso en el rotor de la ultracentrífuga. Aunque es posible volver a utilizar esos tubos, de un solo uso es recomendable para evitar la contaminación cruzada. Finalmente, una ventaja del protocolo tau-localización es que se requieren sólo pequeñas cantidades de anticuerpos primarios y secundarios. Después de la fijación permeabilización y bloqueo de la adherente de células a cubreobjetos, una pequeña gota de anticuerpo fue depositada en un pequeño trozo de PVDF, que se coloca dentro de los pozos de una placa de 6 pozos. El cubreobjetos se mantuvieron que el anticuerpo podría acceder a las células. Mediante este protocolo, puede minimizarse la cantidad de anticuerpos que se usan.
Algunas precauciones deben tenerse en cuenta para asegurar resultados confiables y cuantificables. En primer lugar, deben utilizarse técnicas asépticas estrictas para evitar la contaminación en los cultivos celulares y los extractos de célula. El tampón de lisis completado de RIPA debe estar preparado fresco. En el ensayo de fosfatasa, es importante hervir las muestras por 3 min y SDS-PAGE de inicio inmediatamente después de la incubación de las muestras sin tratar y tratados con fosfatasa. Tau-352 debe ser dividido en pequeñas partes alícuotas y mantenido en hielo después de la eliminación del congelador del ° C −20 y depositado en el congelador inmediatamente después de su uso. Después del retiro de la −80 ° C, TA las acciones deben conservarse en hielo si reutilizar dentro de las 72 h; de lo contrario, mantenerlos a temperatura ambiente. El búfer PEM debe ser preparado como un x 10 solución concentrada porque el tampón 1 x debe hacerse recién cuando se agregan GTP y paclitaxel.
Funciones de Tau están reguladas por la amplitud de su fosforilación. Hiperfosforilación de Tau no ocurre en tau normal cerebro adulto similar al tau-352, que fue utilizado como control positivo en el ensayo de microtubule-obligatorios. Sin embargo, la hiperfosforilación de tau ocurre en enfermedades neurodegenerativas. Este protocolo y resultados subsecuentes demuestran que líneas celulares de cáncer colorrectal humano también llevan la tau fosforilada de manera similar a en el cerebro de la enfermedad de Alzheimer. Tratamiento con altas dosis de curcumina y especialmente LiCl puede minimizar la fosforilación del tau. Así, una buena correlación entre enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer y el cáncer colorrectal puede existir en lo que respecta a la hiperfosforilación de tau, y la curcumina o LiCl se puede utilizar para tratar el cáncer colorrectal y la enfermedad de Alzheimer. Por último, estudiar la fosforilación de tau y tau microtubule vinculante es significativamente relevante no sólo para las enfermedades neurodegenerativas y también para algunos quimioterápicos porque dinámicamente se estudian agentes que modifican la Unión de microtúbulos tau como cáncer terapéutica de51. Los protocolos presentados aquí potencialmente ayudará el descubrimiento y desarrollo de nuevos agentes terapéuticos para tratar cánceres y diferentes tauopatías.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue realizada como parte del proyecto titulado 'Desarrollo y la industrialización de materia prima cosméticos de microalgas marinas de alto valor', financiado por el Ministerio de océanos y pesquerías, Corea y fue apoyado por una subvención de intramuros (2Z04930) KIST Gangneung Instituto de productos naturales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HCT 116 cell | ATCC | CCL-247 | |
| MEM (EBSS) | Hyclone | SH30024.01 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher (Gibco) | 16000044 | Store at -20 °C |
| penicillin-streptomycin | Hyclone | SV30010 | |
| Trypsin-EDTA solution | WelGene | LS 015-01 | |
| 100 mm dish | Corning | 430161 | |
| 6 well plate | Corning | Coster 3516 | |
| Anti-Tau 13 antibody | abcam | ab19030 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Roche | 10 708 984 001 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microlitre Centrifuges | Hettich Zentrifugen | MIKRO 200 R | |
| Paclitaxel | Sigma-Aldrich | T1912 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Curcumin | Sigma-Aldrich (Fluka) | 78246 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Microtubules (MT) | Cytoskeleton | MT001 | Store at 4 °C (desiccated) |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | Store at 4 °C in the dark |
| Sodium hydroxide | Sigma | 72068 | |
| Magnesium Chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | Store at -20 °C |
| DPBS | WelGene | LB 001-02 | |
| Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | Model 500 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-100 XP | |
| PIPES | Sigma | P1851 | |
| Bovine serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906 | |
| Molecular Imager | Bio-Rad | ChemiDoc XRS+ | Store at 4 °C |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad | 500-0006 | |
| α-tubulin (11H10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2125 | |
| GAPDH (14C10) Rabbit mAb | Cell signalling | 2118 | |
| Anti-Tau (phospho S396) antibody | abcam | ab109390 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | Store at room temperature |
| FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase | Thermo Scientific | EF0651 | Store at -20 °C |
| PMSF | Sigma | P7626 | Store at room temperature |
| Phosphatase Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5870 | Store at 4 °C |
| Protease Inhibitor Cocktail | Cell Signalling | 5871 | Store at 4 °C |
| RIPA Buffer | Sigma | R 0278 | Storage Temperature 2–8 °C |
| Tau-352 human | Sigma | T 9950 | Store at -20 °C |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X - 100 | Store at around 25 °C |
| PVDF membrane | Bio-Rad | 162-0177 | |
| Goat anti-mouse IgG Secondary Antibody | ThermoFisher | A-11005 | Store at 4 °C in the dark |
| Confocal Microscopy | Leica Microsystem | Leica TCS SP5 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 75819 | |
| Protein Assay | Bio-Rad | 500-0006 | Store at 4 °C |
References
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