Summary
Ce protocole décrit la stabilisation du niveau d’oxygène dans un petit volume de tampon recyclé et aspects méthodologiques de la plasticité synaptique activité dépendante d’enregistrement dans des tranches d’hippocampe aiguës immergés.
Abstract
Même si les expériences sur des tranches de cerveau ont été utilisés depuis 1951, problèmes subsistent qui réduisent la probabilité de réaliser une analyse stable et réussie de la modulation de la transmission synaptique lors d’enregistrements intracellulaires ou potentiel sur le terrain. Ce manuscrit décrit des aspects méthodologiques qui peuvent être utiles à l’amélioration des conditions expérimentales pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë et d’enregistrement des potentiels postsynaptiques excitateurs de champ dans une chambre de disponible dans le commerce de l’immersion avec une unité de sortie-carbogenation. La sortie-carbogenation aide à stabiliser le niveau d’oxygène dans les expériences qui s’appuient sur le recyclage d’un réservoir tampon petit pour améliorer le rapport coût-efficacité des expériences de la drogue. En outre, le manuscrit présente des expériences représentatives qui examinent les effets de modes différents carbogenation et paradigmes de la stimulation sur l’activité dépendante de la plasticité synaptique de la transmission synaptique.
Introduction
En 1951, les expériences de tranche cérébrale aiguë première signalés étaient menées1. En 1971, après avoir réussi in vitro des enregistrements de piriform cortex2,3 et la découverte que les neurones de l’hippocampe sont interconnectés transversalement le long de l’axe de septotemporal de l’hippocampe4, un de la premiers enregistrements in vitro de l’activité neuronale hippocampique a atteint5. La similitude des paramètres neurophysiologiques ou neurostructural de neurones dans des conditions in vivo et in vitro sont toujours l’objet d’un débat6, mais en 1975, Schwartzkroin7 a indiqué que la basale Propriétés des neurones sont maintenues in vitro et cette stimulation haute fréquence (c.-à-d., tétanisation) des afférents à la formation hippocampique induit une facilitation de longue durée des potentiels synaptiques8. Enregistrement de l’activité neuronale électrophysiologiques in vitro considérablement élargi l’étude des mécanismes cellulaires de la plasticité synaptique activité dépendante9,10, qui avait été découvert en 1973 par Bliss et al. 11 in vivo des expériences avec les lapins.
L’étude de l’activité neuronale ou tranches de cerveau, en particulier dans des tranches d’hippocampe aiguës, les voies de signalisation est maintenant un outil standard. Cependant, étonnamment, des expériences in vitro doivent encore être normalisées, comme en témoignent les multiples approches qui existent encore pour la préparation et l’entretien des tranches d’hippocampe aiguës. Reid et al. (1988) 12 a examiné les défis méthodologiques pour l’entretien des tranches de cerveau aiguë dans différents types de chambres de tranche et les choix de niveau moyen, pH, température et oxygène de baignade. Ces paramètres sont encore difficiles à contrôler dans la chambre d’enregistrement en raison des éléments sur mesure de in vitro tranche-enregistrement des configurations. Publications peuvent être consultées qu’aide à surmonter les défis méthodologiques et qui décrive nouveaux types de chambres de tranche de submersion, comme un interstitiel microperfusion 3D système13, une chambre avec une hotte à flux laminaire et oxygène fournir un système multichambre enregistrement1614et un système de contrôle informatisé température15. Étant donné que ces chambres ne sont pas faciles à construire, la plupart des scientifiques s’appuient sur chambres tranche disponible dans le commerce. Ces chambres peuvent être montés sur un système de microscope, ce qui permet la combinaison d’électrophysiologie et de fluorescence imaging17,18,19. Étant donné que ces chambres de garder les tranches de cerveau immergés dans le liquide céphalorachidien artificiel (aCSF), un débit élevé de la solution tampon doit être maintenue, augmentant les frais de demande de drogue. À cette fin, nous avons incorporé un système de perfusion recyclage avec écoulement-carbogenation qui offre une stabilité suffisante pour l’enregistrement de longue durée des potentiels de champ dans une chambre de tranche de submersion à l’aide d’un volume relativement petit fsca. En outre, nous avons résumé comment l’utilisation de ce système expérimental carbogenation/perfusion affecte le résultat de l’activité-dépendant de la plasticité synaptique10 et comment l’inhibition de l’élongation eucaryote facteur-2 kinase (eEF2K) module synaptique transmission20.
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Protocol
Les animaux ont été maintenus selon les normes établies de protection des animaux et les procédures des instituts des sciences cérébrales et état clé laboratoire de médecine neurobiologie de Fudan University, Shanghai, Chine.
1. préparation de la solution
Remarque : Consultez la Table des matières.
- Préparer le tranchage tampon (solution de mis à jour le Gey) : 92 mM NaCl, KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 2,5 mM glucose 25 mM, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvate et 10 mM MgSO40,5 mM CaCl2.
- Ajuster le pH à 7,6 à l’aide de 1 NaOH M sans carbogenation.
- Stocker le tampon à 4 ° C.
Remarque : Le titrage clarifie le liquide trouble. L’osmolalité est 305-310 mOsm. La carbogen21 contient 5 % de dioxyde de carbone et 95 % d’oxygène. - Préparer le FSCA en diluant un 10 x solution de réserve du FSCA qui ne contient-elle pas de bicarbonate et glucose, ce qui donne une composition finale de : 124 mM NaCl, KCl 2,5 mM, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2et 1,25 mM KH2PO4.
- Ajouter le bicarbonate et le glucose pour atteindre 10 mM glucose et 26 mM NaHCO3.
- Carbogenate l’aCSF à travers un tube de silicone perforée avec une fin bloqué immédiatement après l’ajout du NaHCO3.
- Mesurer le pH tandis que carbogenating (pH 7,3 à 7,4).
Remarque : La capacité de la mémoire tampon peut être ajustée légèrement en modifiant la quantité de NaHCO3. Étant donné que le pH qui en résulte est dépendante de la température, il est nécessaire de vérifier le pH qui en résulte tout en carbogenating à la température de travail (par exemple, 30 ° C).
2. préparation de tranches d’hippocampe aiguës
Remarque : Consultez la Table des matières.
- Placez un maillage tenue de tranche dans une chambre d’incubation pour obtenir des tranches cérébrale aiguë, emplit la chambre FSCA et carbogenate (4-6 L/h) au moins 30 min22 à 28-30 ° C.
- Refroidir les instruments chirurgicaux jusqu'à 2-4 ° C.
- Placer un bécher en verre rempli de froid et carbogenated tampon (2-4 ° C), maintenu dans un mélange d’eau et de glace, près le vibratome de tranchage.
- Anesthésier des rats ou des souris jusqu'à ce que les réflexes cornéens disparaissent (30-50 s) l’isoflurane en prenant 500 µL dans un bocal de verre de 2 L ou 12,5 µL dans un tube de 50 mL.
- Isoler le cerveau à l’aide d’une méthode décrite et visualisées en détail dans les publications de Mathis et al. (2011) 23 et Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Refroidir le cerveau jusqu'à 2-4 ° C dans un tampon de tranchage glacé (pendant au moins 2 min) avant de disséquer le cervelet et séparant les hémisphères.
- Utilisez une lame chirurgicale froide pour disséquer un morceau du cortex dorsal à un angle de 70° sur le bord dorsal de chaque hémisphère25 pour obtenir des tranches transversales de la ventrale et la partie intermédiaire de l’hippocampe, comme illustré à la Figure 1C et E.
- Avec une spatule de ciment dentaire froid, transmettre un hémisphère à un morceau de papier filtre brièvement sécher la surface créée (1-2 s).
- Monter les deux hémisphères avec surfaces fraîchement coupées sur la plate-forme de tranchage glacée à l’aide de colle à action rapide ; a l’extrémité caudale du visage hémisphères la lame de rasoir (Figure 1D).
- Placez la plateforme tranchage dans la chambre de refroidissement d’un vibratome et remplir cette chambre avec le tampon de tranchage (2-4 ° C). Carbogenate à l’aide d’un tube de silicone perforé.
- Couper 350 µm tranches à l’aide de paramètres vibratome adéquat (par exemple, vitesse d’avancement lame : 1,2 mm/s, amplitude de la lame : 1 mm).
- Isoler la formation hippocampique du subiculum et le cortex entorhinal, à l’aide de deux canules d’injection (> 28 G) comme des ciseaux.
- Retirer les bulles de la maille de tranche-tenue de la chambre d’incubation préalablement préparée à l’aide d’une pipette Pasteur.
- Transférer les tranches qui ont une transparence à la pyramidale de la strate de la plate-forme de tranchage sur le maillage de la chambre d’incubation. Éviter tout pliage, étirements, qui se chevauchent et flottant en aspirant le FSCA et la tranche dans une pipette Pasteur de grande bouche.
Remarque : L’ensemble de la procédure (étape 2.5-2.14) peut prendre 5-10 min ; par conséquent, il est important de vérifier la température de la solution tampon au fil du temps à le maintenir à 4 ° C. - Incuber les tranches à 30 ° C pendant au moins 1,5 à 2 h dans la chambre d’incubation et de fournir des carbogen pour 4-6 L/h.
Remarque : Réglez la vitesse d’écoulement de la carbogen à faire circuler la mémoire tampon dans l’incubateur, mais éviter les tranches flottantes.
3. les modifications de la Carbogenation pour le FSCA recyclage de petits réservoirs
- Ajouter un connecteur 3 voies tube à la sortie du système recyclage (Figure 2B).
- Connecter le bras central du connecteur 3 voies tube avec un tube d’alimentation de carbogen et de réguler le débit avec un compteur de débit d’air (3-4 L/h, Figure 2D et Figure 4C).
- Ajouter un second connecteur de tube de 3 voies à l’entrée du système de recyclage. Connecter le bras moyen au tube face à l’appareil de chauffage en ligne, le haut du bras dans un tube mince de silicium (10 cm de longueur) et le bras inférieur dans le tube d’entrée du réservoir (filtre passe-bas ; Figure 4 ( C).
- Placer un presse-citron tube sur un tube de silicium mince (OD : 2 mm) à une position le long du tube où la pulsation de l’aCSF dans la chambre de tranche, produite par la pompe péristaltique, est à son minimum.
Remarque : L’exode-carbogenation (sortie-carb.) modification réduit la sensibilité du niveau carbogenation au volume du réservoir aCSF, le FSCA taux, de recyclage et tube relative des postes au sein de l’aCSF petits réservoirs (< 50 mL ; La figure 3). Concernant le filtre passe-bas, une certaine quantité d’air dans le tube en silicone mince réduit la pulsation de l’écoulement de l’aCSF ; ainsi, le tube doit être rempli pour la plupart à l’air.
4.Enregistrement des réponses synaptiques dans une chambre de tranche de Submersion
Remarque : Consultez la Table des matières.
- Réchauffez la solution FSCA dans un bain d’eau à environ 28-30 ° C (cela permettra d’éviter la formation de bulles dans la chambre d’enregistrement).
- Démarrer le système de recyclage (4 à 5 mL/min) et activer le chauffage inline pour équilibrer le système pendant au moins 1 h.
- Faire tremper un petit morceau de papier et une maille en nylon fixés sur un fil de platine en forme de U dans la chambre de tranche de submersion pendant quelques minutes (Figure 4) de nettoyage pour lentilles.
- Enlever le fil de platine en forme de U.
- Eteignez le recyclage et déposer une tranche sur le papier de nettoyage pour lentilles.
- Placer immédiatement le maillage tenue de tranche sur le dessus de la tranche, mettre en marche la pompe et laisser la tranche équilibrer pendant 30 min sans plongeant l’objectif dans le fsca.
- Remplir la micropipette de borosilicate (c.-à-d., l’électrode d’enregistrement) avec aCSF (Astuce de résistance : rempli de MΩ 1-2, 1/3 avec aCSF) et fixez-le dans le porte-pipette.
- Vérifier l’isolation de l’électrode de stimulation métal en le plaçant dans NaHCO3 solution (> 40 mM). Connecter l’électrode au pôle négatif d’un générateur de tension DC (1-2 V, pôle positif : fil d’argent ou de platine) et d’observer la formation de bulles à la pointe sous le microscope à dissection (> grossissement x 60).
- La référence fils dans la chambre de tranche et placer l’électrode de stimulation de tungstène d’isolation époxy testés dans le support de manipulateur.
- Ajouter une deuxième électrode de référence à la chambre et branchez-le sur la prise de référence de la tête de l’électrode d’enregistrement (Figure 4A).
- Dans le logiciel de commande d’amplificateur, cliquez sur la case « mode zéro pince » et procéder en double-cliquant sur la case « liste de gain de sortie ». Choisir un gain de « 100 », double-cliquez sur la « passe-haut filtre zone de liste (Bessel), » choisissez « 0,1 Hz », puis double-cliquez sur la « passe-bas filtre zone de liste (AC) » pour choisir « 3kHz. »
- Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le sur « Acquire | Ouvrir le protocole ». Choisissez un protocole qui dispose de paramètres permettant de stimulations épisodiques et la numérisation des potentiels amplifiés à 10-20 kHz pour 50 à 100 ms et qui déclenche automatiquement un isolateur stimulus 10 ms après le début d’un enregistrement épisodique.
- Placez la stimulation et les électrodes d’enregistrement en ligne, parallèlement à la strate pyramidale, par exemple (Figure 4B et 5).
- Cliquez sur « acquérir | Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » (dans la fenêtre pop-up). Cliquez sur la case « source de détente » et choisissez « barre d’espace » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour démarrer l’acquisition et de noter la fenêtre pop-up avec un bouton de déclenchement.
- Dans le logiciel d’isolateur stimulus, cliquez sur la case « contrôle de la tension » et inscrivez « 0 ». Cliquez sur le bouton « Télécharger ». Cliquez sur la fenêtre « logiciel d’enregistrement », puis appuyez sur la barre d’espace. Répétez ce cycle en saisissant séquentiellement des valeurs de 1 à 8, par exemple, à 1 pas de mV dans la boîte de « contrôle de la tension ».
- La force de stimulation en corrélation avec les valeurs de fEPSP-pente et déterminer l’intensité de stimulation nécessaire pour obtenir 40 % de la fEPSP-pente maximale. Cliquez sur la « boîte de contrôle de la tension » et entrez la valeur déterminée. Cliquez sur le bouton « Télécharger ».
Remarque : Un isolateur stimulus sert à appliquer la tension brève ou des impulsions de courant aux tissus du cerveau. Les impulsions biphasiques peuvent avoir 100 µs par phase. - Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur le bouton arrêter, puis le menu « Acquérir ». Cliquez sur « Modifier le protocole » et choisissez l’onglet « déclencheur » dans la fenêtre pop-up. Cliquez sur la zone source de détente et a choisi le « horloge interne » comme la source de commande. Cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton d’enregistrement qui commence l’enregistrement automatique des potentiels de champ toutes les 30 s, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » après 30 à 60 min.
- Cliquez sur le menu « Acquérir », cliquez sur « Open Protocol », choisissez le protocole désiré de l’induction de la plasticité synaptique et cliquez sur le bouton « OK ». Cliquez sur le bouton « enregistrer » pour activer automatiquement la stimulation haute fréquence et l’enregistrement. Cliquez sur le bouton « stop ».
Remarque : Dans le cas d’études relatives à la plasticité synaptique, appliquer un des paradigmes induction standard pour la potentialisation à long terme ou à long terme dépression après l’enregistrement de base prolongée. Des exemples représentatifs de la modulation résultante de la transmission synaptique sont illustrés dans la Figure 7 et Figure 8. - Dans le logiciel d’enregistrement, cliquez sur « Acquire | Ouvrir le protocole » et choisissez le même protocole comme au point 4.12. Cliquez sur le bouton « OK », puis cliquez sur « Enregistrer ». Garder d’exécuter automatiquement les enregistrements de domaine potentiels pour 2-4 h, par exemple. Cliquez sur le bouton « stop » pour terminer l’enregistrement.
- Dans le cas d’études pharmaceutiques, appliquer la pâte directement le FSCA réservoir si l’administration permanente composée est souhaitée (Figure 6).
5. nettoyage de l’installation et conseils
Remarque : Voir ci-dessous pour obtenir des conseils généraux.
- Nettoyer le système chaque semaine en recyclant 10 % H2O2 pendant pas plus de 20 min, lavé avec désionisée H2O.
Remarque : L’éthanol n’est pas recommandé pour le nettoyage. De même, il n’est pas recommandé de plonger l’objectif en H2O2et les fils de référence. - Supprimer le sel précipité sur la surface de la lentille de l’objectif ou les environs de chambre avec 0,1 N HCl et ensuite de l’eau.
- Laver le barboteur de carbogen dans l’eau distillée ou 0,1 N HCl.
- Plonger la chambre d’incubation tranche à 10 % H2O2 pendant 5 minutes une fois par semaine et puis bien rincer la chambre d’incubation avec désionisée H2O.
- Dans le cas d’électrodes de stimulation metal, rincez l’électrode stimulant avec de l’eau désionisée après chaque expérience et essuyer doucement la pointe de l’électrode de stimulation avec un tampon d’ouate imbibé de l’éthanol pour éliminer le tissu résiduel.
- Réduire la résistance des électrodes de stimulation métal commercial en enlevant l’isolation à la pointe grâce à un coup soigneusement avec papier de verre.
- Réduire la perte de carbogen de l’aCSF tout en recyclage à travers les tubes de remplacement des tubes de silicium avec des tubes de polytétrafluoroéthylène.
- Garder les fils d’argent de l’électrode de l’enregistrement et l’électrode de référence à l’eau de Javel pendant plusieurs jours à AgCl se forment à la surface de fil.
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Representative Results
Dans la section protocole, nous décrit la préparation de tranches d’hippocampe aiguës de la partie ventrale et intermédiaire de la formation hippocampique (Figure 1) de souris C57BL/6 mâles et des rats Wistar mâles (5-8 semaines). La position des hémisphères sur la plate-forme de trancheuse contribue à garder stable et supprime la nécessité de stabilisation avec la gélose ou d’agarose. Le système de perfusion lui-même est basé sur une pompe péristaltique opérée une rotation élevée pour donner le débit demandé du liquide. Ainsi, le vieillissement rapid de tubes standards au sein de la pompe créée un problème important que nous avons surmonté en utilisant des tubes de silicium (ID : 1,02 mm). La pression négative pour les sorties de fonds est également créée par deux tubes parallèle disposant de 2,79 mm de diamètre intérieur. Ces deux tubes sont raccordés à une canule dans la chambre d’enregistrement pour permettre l’aspiration du liquide (Figure 4A). Le taux de carbogenation de l’aCSF dans le réservoir doit être stable pendant plusieurs heures, ce qui peuvent être difficiles à obtenir en utilisant des pierres de ventilation ou des tubes avec petits pores. Depuis la sortie-carbogenation ne dépend pas de petits pores, la vitesse d’écoulement du carbogen au fil du temps reste stable (Figure 2). Si les expériences sont effectuées avec un réservoir de petite aCSF, l’écoulement-carbogenation contribue à l’atteinte de l’équilibre de l’oxygène dissous (Figure 3). En outre, elle réduit au minimum la variabilité de la teneur en oxygène entre les expériences basées sur une position de tube altérée entrées/sorties, le nombre de pores actives à des tubes de bulles de carbogen et le taux de recyclage liquid.
La tranche est placée sur un papier lentille afin de permettre un échange liquid dessous (Figure 4A). Étant donné que la chambre de tranche peut être montée sur un microscope vertical qui est équipé d’un objectif X 40, la position des électrodes peut être bien contrôlée (Figure 4B et 5). Cela réduit encore la variabilité des expériences dans le travail quotidien.
Pour déterminer l’intensité de la stimulation nécessaire à l’enregistrement de base du champ potentiel, que la dépendance de la taille potentielle du champ sur l’intensité de stimulation doit être déterminée en enregistrant la fEPSPs à des intensités de stimulation différents (Figure 5 ). La mesure de la caractéristique d’entrée-sortie crée une contrainte sur la tranche à des intensités de stimulation plus élevées. Ainsi, une autre approche consiste à rechercher une force de stimulation qui évoque simplement une composante démographique positive de spike dans la désintégration fEPSP (flèches noires sur la Figure 5)26.
Après l’enregistrement d’une base stable pendant au moins 30 min, la FDA peut commencer. Ici, nous avons présenté un exemple des effets d’un inhibiteur de l’eEF2K sur la transmission synaptique. L’inhibition de l’eEF2K favorise la transmission synaptique (Figure 6A), un effet qui a été atténuée par l’inhibition de p38 MAPK (Figure 6B)20.
Activité-dépendant de la plasticité synaptique peut être induite par une variété de stimulation paradigmes10. Ici, nous avons présenté des expériences représentatives de la plasticité synaptique qui reposent sur un enchaînement continu de stimuli à 100Hz et des stimulations répétées à 1 Hz pendant 15 min. La modulation résultante de la transmission synaptique a été représentée dans la Figure 7 et Figure 8. En outre, il est affiché dans la Figure 7 et Figure 8 que la stabilisation de la teneur en oxygène de réservoirs petit tampon par l’écoulement-carbogenation (cercles blancs, teneur en oxygène relative à 24-40 min à la Figure 3) a amélioré la LTP et induction LTD par rapport aux expériences avec réservoir-carbogenation seulement (cercles gris, niveau d’oxygène à 7-24 min). Nous n’ai pas tester la combinaison de sortie-carbogenation et réservoir-carbogenation (7-24 min) parce que nous étions intéressés par la création d’un système expérimental avec carbogen plus bas et plus simple utilisation. Le réservoir-carbogenation avec no recyclage (jusqu'à 7 min) représente le niveau de base de l’oxygène dans le réservoir du fsca.
Figure 1 : Positionnement les hémisphères du cerveau pour obtenir des tranches transversales de l’hippocampe en utilisant un vibratome. (A) la formation hippocampique est indiquée dans une vue latérale de l’hémisphère droit, en vert, dans un modèle de cerveau de souris reconstituées. (B) une vue ventrale de la formation de l’hippocampe. (C) la vue rostral-à-caudale montre une section de la partie ventrale et intermédiaire de la formation hippocampique pour l’hémisphère droit dans le plan horizontal. Étant donné que différentes régions le long de l’axe de septotemporal de l’hippocampe ont différents degrés de l’innervation et la fonction31,32, un angle de coupe différente est requise pour les tranches transversales de l’hippocampe dorsal, pour par exemple. Echelle = 3 mm (lignes blanches horizontales). (D) la photo montre les hémisphères d’un cerveau de rat collé sur une plate-forme vibratome. Echelle = 6 mm. (E) le croquis représente l’angle pour tailler le bord dorsal du cortex (schéma supérieur) de l’hémisphère droit séparé (pointillé noir) et la rotation (flèche rouge) pour coller le cerveau sur la surface créée sur la plate-forme de tranchage. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Éléments du système carbogenation pour le FSCA réservoirs inférieurs à 50 mL. (A) norme carbogenation systèmes utilisant (a) tubes perforés comme un dispositif de bulle carbogen ; un tube a été perforé par des ponctions multiples avec un fil d’acier inoxydable 250 µm de diamètre. (B) écoulement-carbogenation de (b) un connecteur 3 voies tube (diamètre intérieur : 2 mm) ou de l’unité (C), un évent qui empêche le reflux de liquide avec un filtre hydrophobe.Le bras central du connecteur 3 voies tube est raccordé à un réservoir de carbogen après un manomètre (pression du gaz : < 1 atm) et d’un débitmètre. Les armes restantes sont connectés dans le tube de sortie du fsca. (D), le carbogen débit est contrôlé par débitmètres. Au cours des expériences, les réservoirs de l’aCSF sont maintenus à 28-30 ° C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Le niveau d’oxygène dans 40 mL de FSCA à différentes conditions. Le niveau d’oxygène dans le réservoir-carbogenation (res.-carb.) et recyclage FSCA a diminué constamment (cercles remplis de gris, n = 3). Cependant, l’écoulement-carbogenation (sortie-carb.) au cours de l’aCSF recyclage réduit la baisse du niveau d’oxygène, qui atteint un équilibre aux niveaux de référence (cercles blancs cercles, n = 3). Niveaux de référence ont été mesurées avec res.-carb. sans FSCA recyclage. Les verticales en pointillés gris indiquent le passage à carbogenation différents protocoles. Les effets du res.-carb avec recyclage (7-24 min) et sortie-carb. avec le recyclage (cercles blancs, 24-40 min) sur l’induction de LTP et LTD sont illustrés dans la Figure 7 et Figure 8. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Éléments de sortie-carbogenation pour des expériences dans une chambre de tranche de submersion. (A) présentation de la chambre de tranche de submersion. Le fil de platine en forme de U avec les fibres de nylon tenant une tranche hippocampe est représenté. Les fils d’argent ont été enroulés autour d’une petite canule, créant une bobine pour augmenter la zone de la fin du fil d’argent. Le fil de référence de la stimulation a été introduite dans la chambre de sortie, et la référence de l’enregistrement était dans la chambre principale. Pour conserver l’électrode de référence potentiel que stable à différents niveaux de liquides, le fil de référence d’enregistrement peut être isolé par un tube en plastique, laissant seulement la partie « sous-marin » du fil exposé dans la mémoire tampon. (B), le lumineux-zone image montre une tranche hippocampe aiguë représentative et les électrodes. CA1, CA3 : Cornu Ammonis 1, 3 ; DG : gyrus denté ; sup : subiculum ; EC : aire entorhinale. (C), le schéma met en évidence les principales composantes de l’écoulement-carbogenation, sans indication de débitmètres pour le carbogen et la pompe péristaltique. Un filtre passe-bas peut être placé juste en face de l’appareil de chauffage inline pour réduire la pulsation de l’écoulement de l’aCSF. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Dépendance de forme potentielle de champ sur l’intensité de la stimulation et la position des électrodes. (A) des exemples représentatifs du champ potentiels, évoqués à différentes distances des forces de strate pyramidale (Str. pyr.) et la stimulation sont représentés. Les flèches noires horizontales indiquent le composant source positive de l’épi de la population dans la désintégration potentielle de champ. Le composant source positive de l’épi de la population est restée environ au milieu des positions « in-line » électrode fEPSP-hausse initiale phase du tout testé, sauf celui très proche de la couche de corps cellulaire (e). Composante (B), la position de la source positive de l’épi de la population varie beaucoup en raison de l’alignement des électrodes de stimulation et d’enregistrement. Bac. : strate lacunosum moleculare ; Rad. : stratum radiatum ; Pyr. : strate pyramidale ; Rec. : enregistrement électrode ; STIM. : électrode de stimulation. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Un exemple représentatif des effets d’un inhibiteur de l’eEF2K sur la transmission synaptique hippocampique utilisant l’écoulement-carbogenation, avec le recyclage d’un réservoir de petite FSCA20 . Après l’enregistrement de fEPSPs à 1 min d’intervalle pendant 20 min, inhibiteur de l’eEF2K A-484954 a été ajouté directement dans le FSCA (ligne horizontale). Une augmentation rapide de la transmission synaptique est détectables (cercles de cercles blancs). Si le médicament n’a pas été appliqué, la pente fEPSP restées stable au moment de l’enregistrement (cercles remplis de gris). (B) Application de l’inhibiteur de la p38 MAPK (ligne horizontale grise) a empêché l’eEF2K inhibito-induite par le renforcement des potentiels de champ. Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Enregistrements de représentant de potentialisation de l’activité dépendante de la transmission synaptique à l’aide de sortie-carbogenation (sortie-carb. ; cercles blancs) et réservoir-carbogenation (res.-carb. ; cercles noirs), avec le recyclage d’une petite FSCA réservoir. La potentialisation a été induite après temps point 0 par trois fois les 100 trains Hz/s (Tet. : tétanisation, stimulation haute fréquence). Les données sont présentées comme la moyenne ± SEM. support : comparaison statistique des groupes de chaque point dans le temps ; T célibataires-essai, ne pas en supposant écart cohérente. * p < 0,05.S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 8 : Dépendance de la dépression d’activité dépendante de la transmission synaptique à force de stimulation et de carbogenation. (A) à l’aide de réservoir-carbogenation (res.-carb.) avec le recyclage d’un volume de grand aCSF, une stimulation de 1 Hz pendant 15 min à 80 % de la fEPSP-pente maximale évoquée par une forte dépression de la transmission synaptique (cercles blancs). Toutefois, le représentant fEPSP trace avant (trace noire) et après induction LTD (trace rouge au 110ème min) indiquent, la volée de la fibre présynaptique (flèche noire verticale) est fortement réduite. Il s’agit d’un exemple qui indique que des processus électrochimiques à l’électrode de stimulation pourraient nuire les afférences, provoquant une dépression qui ne s’appuie pas partiellement sur les mécanismes axés sur le LTD. Réduction de la puissance de stimulation à 50 % de la valeur maximale de pente fEPSP induit une dépression de la transmission synaptique à un degré moindre, mais sans changer la fibre présynaptique volley (cercles remplis de gris). (B) induction LTD ne provoque pas une dépression durable des fEPSP-pentes dans les expériences avec le réservoir-carbogenation et le recyclage d’un réservoir de petite FSCA (res.-carb. ; places remplis de gris). (C) l’écoulement-carbogenation avec le recyclage d’un réservoir de petite FSCA amélioré le résultat de l’induction LTD. Les inserts présent représentant fEPSPs avant (traces noires) et après (110ème min, rouge traces) induction LTD. Pour le représentant fEPSPs, les barres d’échelle verticale indiquent 1 mV et les barres d’échelle horizontale correspond à 2 m les données ont été extraites des tranches d’hippocampe aiguës (350 µm) de 1 à 2 mois souris C57/BL 6 et sont présentées comme la moyenne ± SEM. supports : comparaison statistique des groupes de chaque point dans le temps ; T célibataires-essai, ne pas en supposant écart cohérente. * p < 0,05, ns : non significatif. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Bien que les chambres tranche interface pièce plus robuste réponses synaptiques25,26,27,28, chambres de submersion assurent un confort supplémentaire pour l’enregistrement patch-clamp et fluorescence d’imagerie. Ainsi, nous avons décrit plusieurs aspects d’enregistrements possibles sur le terrain dans des tranches d’hippocampe aiguës en utilisant une chambre de tranche de submersion commerciale qui peut facilement être étendue à l’imagerie de fluorescence des sondes dans les neurones17,18, 19. Outre la préparation de tranche25, le maintien d’un niveau constant de carbogen dans la chambre après de nombreuses heures d’enregistrement représente un des obstacles. Puisque le niveau de carbogen est uniquement contrôlable par la saturation initiale du réservoir aCSF, différences dans le niveau d’oxygène dans le FSCA sont facilement obtenus dans les expériences quotidiennes. Ainsi, un compteur d’oxygène est recommandé afin d’accélérer le diagnostic et pour ajuster les conditions (par exemple, la température, débit carbogen, carbogenation outils et taux de recyclage aCSF) pour atteindre au moins 28 mg/L oxygène dans le réservoir de l’aCSF au testing niveaux. En outre, la pratique courante de changer la taille du conteneur FSCA pour la demande de drogue peut induire des effets sur les potentiels de champ en raison des différences dans leurs niveaux de carbogen.
L’utilisation de la sortie-carbogenation d’un petit volume de tampon recyclage amélioré le résultat des expériences la plasticité synaptique. Amélioration de dissolution de l’oxygène dans le liquide est basée sur le plus grand rapport entre la surface de contact du liquide et carbogen. En outre, l’écoulement-carbogenation réduit l’approvisionnement de l’aCSF carbogen appauvris dans le réservoir du fsca. La stabilité de le carbogenation pourrait être encore améliorée par un venturi spécialement basé sur le principe des produits commerciaux29.
Même avec la meilleur préparation de tranches et des conditions d’installation, il est souvent inévitable que les potentiels de champ ne peut pas être induits lorsqu’on utilise des électrodes de stimulation métallique isolé. Souvent, la raison est que l’isolation a été endommagée en raison de la flexion ou de nettoyage. Comme nous l’avons indiqué dans les méthodes, une approche simple consiste à contrôler la formation de bulles en basse tension DC. En outre, cette étape permet de nettoyer le bout et de réduire l’impédance de l’électrode de stimulation. L’utilisation des pipettes en verre pour la stimulation est fréquente et a l’avantage d’offrir un champ plus étroit de la stimulation de la fibre. Souvent, il n’est pas possible de trouver une pente maximale de fEPSP lorsque la stimulation de pipette de verre est utilisée. L’apparence du composant source positive de l’épi de la population dans la phase de décroissance fEPSP pourrait alors servir à régler la force de stimulation23.
Mai publication concernant l’induction de l’activité-dépendant de la plasticité synaptique et l’implication des différentes voies de signalisation dépendants du protocole d’induction appliquée sont disponibles10. Cependant, du point de vue méthodologique, la stimulation haute fréquence peut causer des artefacts distincts qui pourraient empêcher l’induction réussie de la plasticité synaptique. Un 100 Hz/1 s une stimulation répétée peut entraîner la polarisation des électrodes de stimulation ou réactions électrochimiques30, ce qui entraîne la dépression de la transmission synaptique due aux dommages causés aux afférences (voir la Figure 8 pour obtenir un exemple). Pour minimiser les processus électrochimiques, l’utilisation d’impulsions de stimulation biphasique et d’une puissance de stimulation ne dépassant pas les 2 V pour des enregistrements de base sont recommandés.
En résumé, sortie-carbogenation aide à stabiliser le niveau d’oxygène dans les expériences qui s’appuient sur le recyclage d’un réservoir tampon petit, améliorer le rapport coût-efficacité des expériences de la drogue.
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Disclosures
Les auteurs déclarent que la recherche a été effectuée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprété comme un conflit d’intérêts potentiel.
Acknowledgments
W.W. menée, analysé et les expériences et a écrit le manuscrit. D.X. et C.P. a aidé à la préparation de la figure et mené les expériences. Ce travail a été soutenu par la FSNC (31320103906) et 111 (B16013) à C.T.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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