Summary
Denne protokol beskriver stabilisering af iltindholdet i en lille mængde genanvendt buffer og metodologiske aspekter af optagelse aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet i undersøiske akut hippocampus skiver.
Abstract
Selv om eksperimenter på hjerne skiver har været i brug siden 1951, fortsat problemer at reducerer sandsynligheden for at opnå en stabil og succesfuld analyse af synaptisk transmission graduering, når du udfører felt potentielle eller intracellulære optagelser. Dette manuskript beskriver metodologiske aspekter, der kan være nyttige i at forbedre eksperimentelle betingelser for opretholdelsen af akut hjernen skiver og optagelse feltet excitatoriske postsynaptiske potentialer i et kommercielt tilgængelige submersion kammer med en udstrømning-carbogenation enhed. Udstrømning-carbogenation hjælper med at stabilisere iltindholdet i eksperimenter, der er baseret på genbrug af en lille buffer reservoir til at forbedre omkostningseffektiviteten for drug eksperimenter. Derudover præsenterer håndskriftet repræsentative eksperimenter, at undersøger virkningerne af forskellige carbogenation tilstande og stimulation paradigmer på aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet af synaptisk transmission.
Introduction
I 1951 blev først rapporteret akut hjernen skive eksperimenter gennemført1. I 1971, efter vellykket in vitro- optagelser fra piriform cortex2,3 og den opdagelse, at hippocampus neuroner hænger paa tvaers langs septotemporal aksen af hippocampus4, en af de første in vitro- optagelser af hippocampus neuronal aktivitet var opnået5. Ligheden mellem de neurofysiologiske eller neurostructural parametre af neuroner in vivo og in vitro- betingelser er stadig genstand for nogle debat6, men i 1975, Schwartzkroin7 oplyste, at de basale egenskaber af neuroner vedligeholdes i vitro og at højfrekvente stimulation (dvs. tetanization) af afferenter i hippocampus dannelse inducerer en langvarig lettelse af synaptiske potentialer8. Elektrofysiologiske optagelse af neuronal aktivitet in vitro- stærkt udvidet studiet af de cellulære mekanismer i aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet9,10, som var blevet opdaget i 1973 af lyksalighed et al. 11 i in vivo forsøg med kaniner.
Studiet af neuronal aktivitet eller signalering veje i hjernen skiver, og især i akut hippocampus skiver, er nu en standard værktøj. Men overraskende, in vitro- eksperimenter har endnu ikke standardiseres, som det fremgår af de flere tilgange, der stadig findes for forberedelse og vedligeholdelse af akut hippocampus skiver. Reid et al. (1988) 12 gennemgik de metodologiske udfordringer for vedligeholdelse af akut hjernen skiver i forskellige typer af skive kamre og valg af badning medium, pH, temperatur og ilt niveau. Disse parametre er stadig svære at styre optagelse her på grund af de skræddersyede elementer af in vitro- skive-optagelse opsætninger. Publikationer kan findes at kunne bidrage til at overvinde nogle af de metodologiske udfordringer og at beskrive nye typer af submersion skive chambers, en interstitiel 3D microperfusion system13, et kammer med forbedret laminar flow og ilt levere14, et system med edb temperatur kontrol15og en multi kammer optagelse system16. Da disse kamre ikke er let at bygge, de fleste forskere er afhængige af kommercielt tilgængelige skive kamre. Disse kamre kan monteres på et mikroskop system, således at kombination af Elektrofysiologi og fluorescens imaging17,18,19. Da disse kamre holde hjernen skiver neddykket i kunstige cerebrospinalvæske (aCSF), skal en høj gennemstrømning stødpudeopløsning vedligeholdes, øge bekostning af drug application. Til dette formål har vi indarbejdet et genvindingssystem perfusion med udstrømning-carbogenation, der giver tilstrækkelig stabilitet for feltet potentialer i en submersion skive afdeling ved hjælp af en forholdsvis lille aCSF volumen langsigtet optagelsen. Hertil kommer, sammenfattet vi hvordan brugen af dette eksperimentelle carbogenation/perfusion system påvirker resultatet af aktiviteten-afhængige synaptisk plasticitet10 og hvordan hæmning af eukaryote brudforlængelse faktor-2 kinase (eEF2K) modulerer synaptic transmission20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene blev opretholdt i overensstemmelse med de fastlagte standarder for dyrs pleje og procedurer for institutter af hjernen videnskab og staten nøglen laboratorium for medicinsk neurobiologi af Fudan University, Shanghai, Kina.
1. løsning forberedelse
Bemærk: Se tabel af materialer.
- Forberede den udskæring buffer (modificeret Gey løsning): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvat, 10 mM MgSO4og 0,5 mM CaCl2.
- PH-værdien til 7,6 ved hjælp af 1 M NaOH uden carbogenation.
- Gemme buffer ved 4 ° C.
Bemærk: Titreringen præciserer den uklar væske. Osmolalitet er 305-310 mOsm. Carbogen21 indeholder 5% kuldioxid og 95% ilt. - Forberede en aCSF ved at fortynde 10 x stamopløsning af aCSF, der ikke indeholder bikarbonat og glukose, giver en endelige sammensætning: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2og 1,25 mM KH2PO4.
- Tilføje bikarbonat og glucose at nå 10 mM glukose og 26 mM NaHCO3.
- Carbogenate aCSF gennem et perforeret silicium rør med en spærret udgangen umiddelbart efter tilføjer NaHCO3.
- Måle pH mens carbogenating (pH 7.3-7.4).
Bemærk: Buffer kapaciteten kan justeres let ved at ændre mængden af NaHCO3. Da den resulterende pH er temperatur afhængige, er det nødvendigt at kontrollere den resulterende pH mens carbogenating på arbejdstemperatur (f.eks. 30 ° C).
2. forberedelse af akut hippocampus skiver
Bemærk: Se tabel af materialer.
- Læg en skive-bedrift mesh i en inkubation afdeling for akut hjernen skiver, fylde salen med aCSF og carbogenate (4-6 L/h) i mindst 30 min.22 på 28-30 ° C.
- Cool de kirurgiske instrumenter ned til 2-4 ° C.
- Placere et glas bægerglas fyldt med koldt og carbogenated udskæring buffer 2-4 ° C, opretholdt i en is/vand-blanding, nær vibratome.
- Bedøver rotter eller mus indtil de hornhinde reflekser forsvinder (30-50 s) ved hjælp af isofluran ved at tage 500 µL til en 2 L glaskrukke eller 12,5 µL i en 50 mL tube.
- Isolere hjernen ved hjælp af en metode beskrevet og visualiseret i detaljer i publikationerne fra Mathis et al. (2011) 23 og Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Nedkøler hjernen ned til 2-4 ° C i en iskold udskæring buffer (i mindst 2 min.) før dissekere lillehjernen og adskille halvkugler.
- Brug en kold kirurgiske kniv til at dissekere et stykke af den dorsale cortex i en 70° vinkel langs den dorsale kanten af hver halvkugle25 at få tværgående udsnit fra ventrale og den mellemliggende del af hippocampus, som vist i figur 1C og E.
- Med en kold dental cement spatel, overføre en halvkugle til et stykke filtrerpapir kort tørre den oprettede overflade (1-2 s).
- Montere de to hjernehalvdele med frisk skåret overflader på den iskolde udskæring platform ved hjælp af hurtigt virkende klæbende lim; har den caudale slutningen af hjernehalvdele ansigt barberblad (fig. 1D).
- Placere den udskæring platform ind i køle kammeret af en vibratome og fyld kammeret med udskæring bufferen (2-4 ° C). Carbogenate ved hjælp af en perforeret silicium tube.
- Skær 350 µm skiver ved hjælp af passende vibratome indstillinger (f.eks., klingen fremad hastighed: 1,2 mm/s, blade amplitude: 1 mm).
- Isolere hippocampus dannelse fra subiculum og entorhinal cortex ved hjælp af to injektion cannulas (> 28 G) som saks.
- Fjerne boblerne fra Skive-bedrift mesh for tidligere forberedt inkubation afdeling ved hjælp af Pasteurs pipette.
- Overføre de udsnit, der har nogle gennemsigtighed på stratum pyramidale fra udskæring platformen på mesh inkubation kammer. Undgå enhver folde, stretching, overlappende og flydende ved sugning aCSF og skive i en stor mund Pasteur pipette.
Bemærk: Hele proceduren (trin 2,5-2.14) kan tage 5-10 min. Derfor er det vigtigt at tjekke temperaturen stødpudeopløsning over tid til at vedligeholde det ved 4 ° C. - Inkuber skiver ved 30 ° C i mindst 1,5-2 h inkubation her og give carbogen på 4-6 L/h.
Bemærk: Justere flow af carbogen til at cirkulere buffer i rugemaskinen, men forhindre skiver fra flydende.
3. ændringer af Carbogenation for aCSF genbrug af små reservoirer
- Tilføje en 3-vejs rør stik til udstrømningen af genbrugssystem (figur 2B).
- Forbinde den midterste arm af 3-vejs tube-stikket med et carbogen forsyning rør og regulere flowet med en luftmængde måleren (3-4 L/h, figur 2D og figur 4C).
- Tilføje en anden 3-vejs rør stik til indstrømning af den genbrugssystem. Forbinde den midterste arm til røret mod indbygget varmelegeme, overarm til en tynd silicium tube (10 cm længde) og den nederste arm indstrømning røret fra reservoir (low-pass filter. Figur 4 C).
- Placer en tube squeezer på en tynd silicium tube (OD: 2 mm) på en position langs røret hvor pulsering af aCSF i Skive afdeling, genereret af den peristaltiske pumpe, er på sit minimum.
Bemærk: Udstrømning-carbogenation (udstrømning-carb.) ændring reducerer følsomheden af carbogenation niveauet til omfanget af aCSF reservoir, aCSF genanvendelsesprocent, og relative tube positioner inden for små aCSF reservoirer (< 50 mL; Figur 3). Med hensyn til low-pass filter reducerer en vis mængde af luft i tynde silicium tube pulsering af aCSF strømmen; således skal røret være fyldt det meste med luft.
4.Optagelse Synaptic svar i en Submersion skive afdeling
Bemærk: Se tabel af materialer.
- Pre varm aCSF løsning i et vandbad til ca. 28-30 ° C (dette vil forhindre boble dannelse i optagelse kammer).
- Start genbrugssystem (4-5 mL/min) og aktivere indbygget varmelegeme for at reagensglasset systemet i mindst 1 time.
- Presoak et lille stykke af linse rengøring papir og en nylon mesh fast på en U-formet platin wire i submersion skive afdeling for et par minutter (figur 4).
- Fjerne den U-formede platin wire.
- Tænd for genanvendelse og placere en skive på linsen rengøring papir.
- Umiddelbart placerer skive-bedrift mesh på toppen af udsnittet, Tænd pumpen, og lad skive Blandingen henstår i 30 min. uden dypper mål i aCSF.
- Fyld borosilicate mikropipette (dvs. optagelse elektrode) med aCSF (tip modstand: 1-2 MΩ, fyldt 1/3 med aCSF) og montere det i pipette indehaveren.
- Kontroller isolering af metal stimulation elektrode ved at placere det i NaHCO3 løsning (> 40 mM). Tilslut elektroden til den negative pol på en DC spænding generator (1-2 V, positive pol: sølv eller platin tråd), og observere dannelsen af boblerne i spidsen under en dissektion mikroskop (> 60 x forstørrelse).
- Placer testet epoxy-isolerede stimulation Wolframelektroden i manipulator indehaveren og henvisningen ledninger i Skive afdeling.
- Tilføje en anden referenceelektrode til kammeret og Tilslut det til reference-stik af headstage af optagelse elektrode (figur 4A).
- I forstærker kontrol software, skal du klikke på boksen "nul klemme mode" og fortsætte ved at dobbeltklikke på feltet "output gain liste". Vælg en gevinst af "100", skal du dobbeltklikke på "high pass filter liste boks (Bessel)," vælge "0,1 Hz", og dobbeltklik på "low pass filter liste boks (AC)" for at vælge "3 kHz."
- I optagelse software, skal du klikke på den på "erhverve | Åbn protokollen." Vælg en protokol, der har indstillinger giver mulighed for episodisk stimulering og digitalisering af forstærkede potentialer på 10-20 kHz for 50-100 ms og der udløser automatisk en stimulus isolator 10 ms efter starten af en episodisk optagelse.
- Placer stimulation og optagelse elektroder i linje og parallel til stratum pyramidale, for eksempel (fig. 4B og figur 5).
- Klik på "erhverve | Redigere protokol"og vælg fanen"trigger"(i pop-up-vinduet). Klik på "udløse kilde" boks og valgte "mellemrumstasten" som udløser kilde. Klik på knappen "OK". Klik på "record"-knappen for at starte erhvervelse og Bemærk den pop op-vindue med en udløser knap.
- Klik på kontrolboksen "spænding" i stimulus isolator software, og indtast "0." Klik på knappen "download". Klik på vinduet "optagelse software" og tryk på mellemrumstasten. Gentag denne cyklus af sekventielt indtaste værdier fra 1 til 8, for eksempel på 1 mV skridt i kontrolboksen "spænding".
- Korrelere stimulation styrke med fEPSP-slope værdier og bestemme stimulation styrken skal få 40% af fEPSP-skråning maksimalt. Klik på "spænding kontrolboks" og Indtast værdien bestemmes. Klik på knappen "download".
Bemærk: En stimulus isolator bruges til at anvende korte spænding eller aktuelle impulser til hjernevæv. Bifasisk pulser kan have 100 µs pr. fase. - I optagelse software, skal du klikke på stop-knappen og derefter menuen "Erhverve". Klik på "Rediger protokol" og vælg "trigger"-fanen i pop-up-vinduet. Klik på triggeren kilde boks og valgte "internt koblingsur" som udløser kilde. Klik på knappen "OK". Klik på optage-knappen, der starter automatisk registrering af feltet potentialer hver 30 s, f.eks. Klik på knappen "stop" efter 30-60 min.
- Klik på menuen "Erhverve", klik på "Open Protocol," skal du vælge den ønskede induktion protokol af synaptisk plasticitet, og klik på knappen "OK". Klik på knappen "Optag" for at aktivere automatisk højfrekvente stimulation og optagelse. Klik på knappen "stop".
Bemærk: I tilfælde af undersøgelser vedrørende synaptisk plasticitet, anvende en af standard induktion paradigmerne for langsigtede potensering eller langvarig depression efter langvarig baseline optagelse. Repræsentative eksempler på den resulterende graduering af synaptisk transmission er afbildet i figur 7 og figur 8. - I optagelse software, skal du klikke på "erhverve | Åbne protokol"og vælge den samme protokol som i trin 4.12. Klik på "OK"-knappen og derefter klikke på "record." Holde automatisk kører feltet potentielle optagelser for 2-4 h, f.eks. Klik på knappen "stop" for at afslutte optagelsen.
- I tilfælde af farmaceutiske undersøgelser, anvende sammensat direkte til aCSF reservoir hvis permanent sammensatte administration er ønsket (figur 6).
5. rengøring af Setup og tips
Bemærk: Se nedenfor for generelle tips.
- Rense systemet ugentligt ved genanvendelse 10% H2O2 til ikke mere end 20 min, efterfulgt af vask med deioniseret vand H2O.
Bemærk: Ethanol er ikke anbefalet til rengøring. Det er ligeledes ikke anbefales at fordybe reference ledninger og mål i H2O2. - Fjerne udfældede salt på overfladen af formålet objektivet eller kammer omgivelser med 0,1 N HCl og derefter vand.
- Vask carbogen Bobleflasken i destilleret vand eller 0,1 N HCl.
- Fordyb slice inkuberingen kammer i 10% H2O2 til 5 min en gang om ugen og derefter grundigt skylles inkubation kammer med deioniseret vand H2O.
- I tilfælde af metal stimulation elektroder, skyl den stimulerende elektrode tip med deioniseret vand efter hvert forsøg og tør forsigtigt stimulere elektroden spidsen med et stykke vat vædet med ethanol til at fjerne resterende væv.
- Mindske modstanden i kommercielle metal stimulation elektroder ved at fjerne isoleringen på spidsen gennem en omhyggelig knalde med sandpapir.
- Reducere tabet af carbogen fra aCSF mens genbrug gennem rørene ved at erstatte silicium rør med polytetrafluorethylen rør.
- Holde sølv ledninger af optagelse elektrode og referenceelektrode i blegemiddel i flere dage at danne AgCl på wire overflade.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I afsnittet protokollen beskrev vi forberedelse af akut hippocampus skiver fra den ventrale og mellemliggende del af hippocampus dannelse (figur 1) af mandlige C57BL/6 mus og mandlige Wistar rotter (5-8 uger). Placeringen af hjernehalvdele på pålægsmaskine platform hjælper til at holde dem stabile og fjerner behovet for stabilisering med agar eller agarosegelelektroforese. Selve perfusion-systemet er baseret på en peristaltisk pumpe drives på høj rotation til at give den krævede strømningshastighed af væsken. Således, den hurtige aldring af standard rør inden for pumpen skabt et betydeligt problem, at vi overvandt ved hjælp af ikke-silicium rør (ID: 1.02 mm). Undertryk for udstrømningen er også lavet af to parallelle-tilsluttet rør, der har en indre diameter på 2,79 mm. Disse to rør er forbundet til en kanyle i optagelse salen til at gøre det muligt aspiration af væske (figur 4A). Carbogenation satsen for aCSF i beholderen skal være stabil over mange timer, som kan være vanskeligt at opnå ved hjælp af ventilation sten eller rør med lille porer. Da udstrømning-carbogenation ikke stole på små porer, carbogen strømningshastigheden over tid forbliver stabil (figur 2). Hvis forsøgene er udført med en lille aCSF reservoir, udstrømning-carbogenation hjælper med at opnå en ligevægt af opløst ilt (figur 3). Desuden minimerer det variabilitet af iltindholdet mellem de eksperimenter, der er baseret på en ændret tilstrømning/udstrømning tube placering, antallet af aktive porer på carbogen boble rør og flydende genbrugsprocenten.
Skive er placeret på objektivet papir at tillade nogle flydende exchange nedefra (figur 4A). Da skive afdeling kan monteres på et opretstående mikroskop, der er udstyret med en 40 X mål, kan elektroderne befinde velkontrollerede (fig. 4B og figur 5). Dette reducerer yderligere variation af forsøg i det daglige arbejde.
Til at bestemme den stimulation styrke kræves til baseline optagelse af feltet potentielle, afhængighed af den potentielle Feltstørrelse stimulation styrke skal bestemmes ved at optage fEPSPs på forskellige stimulation styrker (figur 5 ). Måling af input-output karakteristisk skaber nogle stress på skive på højere stimulation styrker. Således, en anden metode er at søge efter en stimulation styrke, der bare fremkalder en positiv befolkning spike komponent i fEPSP-henfald (sorte pile i figur 5)26.
Efter optagelse en stabil basislinje i mindst 30 min., kan drug administration begynde. Her fremlagde vi et eksempel på en eEF2K-hæmmer indvirkning på synaptisk transmission. Hæmning af eEF2K fremmer synaptisk transmission (fig. 6A), en effekt, der var svækket af hæmning af p38 MAPK (fig. 6B)20.
Aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet kan være fremkaldt af en bred vifte af stimulation paradigmer10. Her, præsenterede vi repræsentant eksperimenter af synaptisk plasticitet, der er baseret på en kontinuerlig sekvens af stimuli på 100 Hz og gentagne stimulering ved 1 Hz over 15 min. Den resulterende graduering af synaptisk transmission har været afbildet i figur 7 og figur 8. Desuden, er det vist i figur 7 og figur 8 , stabilisering af ilt-niveau af lille buffer reservoirer af udstrømning-carbogenation (hvide cirkler, relative ilt niveau på 24-40 min i figur 3) forbedret LTP og LTD induktion i forhold til eksperimenter med reservoir-carbogenation kun (grå cirkler, ilt niveau 7-24 min.). Vi har ikke teste kombination af udstrømning-carbogenation og reservoir-carbogenation (7-24 min), fordi vi var interesserede i at skabe en eksperimentel system med lavere og enklere carbogen brug. Reservoir-carbogenation uden genanvendelse (op til 7 min.) udgør basisniveauet af ilt i aCSF reservoir.
Figur 1: Positionering hjernen halvkugle for at opnå tværgående skiver af hippocampus ved hjælp af en vibratome. (A) den hippocampus dannelse er indiceret i en lateral udsigt over den højre hjernehalvdel, i grøn, inden for en rekonstrueret mus hjerne model. (B) en ventrale visning af hippocampus dannelse. (C) den rostralt til caudale visning viser en del af den ventrale og mellemliggende del af hippocampus dannelse for den rigtige halvkugle på det vandrette plan. Da forskellige regioner langs septotemporal aksen af hippocampus har forskellige grader af innervation og funktion31,er32, en anden opskæring vinkel påkrævet for tværgående skiver af den dorsale hippocampus, for eksempel. Skalalinjen = 3 mm (vandrette hvide streger). (D) foto viser hjernehalvdele af en rotte hjerne limet på en vibratome platform. Skalalinjen = 6 mm. (E) skitsen skildrer vinkel til trimning dorsale kanten af cortex (øvre skema) adskilt højre hjernehalvdel (stiplede sorte linie) og rotation (rød pil) til at lime hjernen på den oprettede overflade på den udskæring platform. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Elementer i carbogenation systemet til aCSF reservoirer under 50 mL. (A) Standard carbogenation systemer ved hjælp af (a) perforerede rør som carbogen boble enhed; en tube var perforeret af flere punkteringer med en 250 µm diameter rustfrit stål wire. (B) udstrømning-carbogenation ved (b) en 3-vejs tube connector (indvendig diameter: 2 mm) eller (C) en udluftningsanordning enhed, der forhindrer tilbage væskestrømmen med en hydrofobe filter.Den midterste arm af 3-vejs slange stik er tilsluttet et carbogen tank efter et manometer (gas pres: < 1 atm) og en flowmåler. De resterende arme hænger i aCSF udstrømning røret. (D) carbogen strømningshastighed reguleres af flowmålere. Under forsøgene holdes aCSF reservoirer på 28-30 ° C. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Iltindhold i 40 mL af aCSF på forskellige betingelser. Iltindholdet i reservoir-carbogenation (res.-carb.) og aCSF genbrug faldt konstant (grå-fyldt cirkler, n = 3). Dog udstrømning-carbogenation (udstrømning-carb.) under aCSF genbrug reduceret drop af den ilt, der nået ligevægt på baseline niveauer (hvid-fyldt cirkler, n = 3). Baseline niveauer blev målt med res.-carb. uden aCSF genbrug. De lodrette stiplede grå streger angiver parameteren til forskellige carbogenation protokoller. Virkningerne af res.-carb med genanvendelse (7-24 min) og udstrømning-carb. med genanvendelse (hvide cirkler, 24-40 min) på induktion af LTP og LTD er afbildet i figur 7 og figur 8. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Komponenter af udstrømning-carbogenation for eksperimenter i en submersion skive afdeling. (A) præsentation af submersion skive afdeling. Den U-formede platin wire med nylon fibre holding en hippocampus skive er afbildet. Sølv ledninger var svøbt omkring en lille kanyle, at skabe en spole for at øge området af sølv wire slutter. Stimulation reference wire blev placeret i udstrømning kammer, og referencen optagelse var i det vigtigste kammer. At holde referenceelektrode potentielle stabil på forskellige flydende niveauer, optagelse reference wire kan være isoleret med et plastik rør, forlader kun de "undersøiske" del af wiren udsat til bufferen. (B) lysfelt billedet viser et repræsentativt akut hippocampus skive og elektroderne. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; GD: dentate gyrus; sub: subiculum; EF: entorhinal cortex. (C) skematiske fremhæver de vigtigste komponenter i udstrømning-carbogenation, uden angivelse af flow meter for carbogen og den peristaltiske pumpe. Et low-pass filter kan placeres lige foran inline varmeren at reducere pulsering aCSF flow. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Afhængighed af feltet potentielle form efter stimulation styrke og placering af elektroderne. (A) repræsentative eksempler på feltet potentialer, fremkaldt på forskellige afstande fra stratum pyramidale (str. pyr.) og stimulation styrker er afbildet. Vandret sort pilene angiver Kildekomponenten positive af befolkningen spike i feltet potentiel forfald. Kildekomponenten positive af befolkningen spike forblev ca i midten af indledende fEPSP-rise fase på alle testet "in-line" elektrode positioner, undtagen den ene meget tæt på cellen kroppen layer (e). (B) placering af den positive kilde bestanddel af befolkningen spike varieret betydeligt på grund af forskydning af stimulation og optagelse elektroderne. Lac.: stratum lacunosum moleculare; Rad.: stratum radiatum; Pyr.: stratum pyramidale; REC.: optagelse elektrode; STIM.: stimulation elektrode. Skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Repræsentativt eksempel på virkningerne af en eEF2K-hæmmer på Hippocampus synaptisk transmission ved hjælp af udstrømning-carbogenation, med genbrug af en lille aCSF reservoir20 . Efter optagelse fEPSPs 1 min. mellemrum i 20 min., var eEF2K hæmmer A-484954 tilsættes direkte til aCSF reservoir (vandret streg). En hurtig stigning af synaptisk transmission var påviselige (hvid-fyldt cirkler). Hvis stoffet ikke blev anvendt, forblev fEPSP-skråning stabil over tid af optagelse (grå-fyldt cirkler). (B) anvendelse af p38 MAPK inhibitor (grå vandret streg) forhindrede eEF2K inhibito-induceret forbedring af feltet potentialer. Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Repræsentant optagelser af aktivitet-afhængige potensering af synaptisk transmission ved hjælp af udstrømning-carbogenation (udstrømning-carb.; hvide cirkler) og reservoir-carbogenation (res.-carb.; sorte cirkler), med genbrug af en lille aCSF reservoir. Potensering blev induceret efter tidspunkt 0 af tre gange 100 Hz/s-tog (Tet.: tetanization, høj frekvens stimulation). Dataene præsenteres som den gennemsnit ± SEM. beslag: statistisk sammenligning af grupper pr. tidspunkt; uparret T-test, ikke forudsat konsekvent standardafvigelse. * p < 0,05.Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Afhængighed af aktivitet-afhængige depression af synaptisk transmission ved stimulation styrke og carbogenation. (A) ved hjælp af reservoir-carbogenation (res.-carb.) med genbrug af en stor aCSF volumen, 1 Hz stimulation for 15 min. ved 80% af maksimal fEPSP-skråning fremkaldte en stærk depression af synaptisk transmission (hvide cirkler). Men som den repræsentative fEPSP spor før (sort trace) og efter (røde spor på 110th min) LTD induktion angiver, præsynaptiske fiber volley (lodret sort pil) blev stærkt reduceret. Dette er et eksempel, der viser, at elektrokemiske processer på stimulation elektrode kan skade afferenter, forårsager en depression, der ikke er afhængig delvist LTD-relaterede mekanismer. At reducere stimulation styrke til 50% af maksimumsbeløbet, fEPSP-skråning induceret en depression af synaptisk transmission til en lavere grad, men uden at ændre den præsynaptiske fiber volley (grå-fyldt cirkler). (B) LTD induktion ikke fremkalde en varig depression af fEPSP-løjperne i eksperimenter med reservoir-carbogenation og genbrug af en lille aCSF reservoir (res.-carb., grå-fyldte pladser). (C) udstrømning-carbogenation med genanvendelse af en lille aCSF reservoir forbedret resultatet af LTD induktion. Indsætter præsentere repræsentative fEPSPs før (sort spor) og efter (110th min, røde spor) LTD induktion. For de repræsentative fEPSPs, angiver de lodrette skala 1 mV, og de vandrette skala barer svarer til 2 ms. dataene blev indhentet fra akut hippocampus skiver (350 µm) af 1 til 2 måneder gamle C57/BL 6 mus og præsenteres som den gennemsnit ± SEM. parentes : statistisk sammenligning af grupper pr. tidspunkt; uparret T-test, ikke forudsat konsekvent standardafvigelse. * p < 0,05, ns: ikke-væsentlig. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selvom interface skive kamre udviser mere robust synaptic svar25,26,27,28, levere neddykning kamre ekstra bekvemmelighed for patch-clamp optagelse og fluorescens Imaging. Dermed, vi har beskrevet flere aspekter af feltet potentielle optagelser i akut hippocampus skiver ved hjælp af en kommerciel submersion skive kammer, der kan nemt udvides til billeddannelse af fluorescens sonder i neuroner17,18, 19. Udover skive forberedelse25repræsenterer opretholdelse af et konstant carbogen i optagelse salen efter mange timer en af forhindringerne. Da carbogen er kun kan styres af den oprindelige mætning af aCSF reservoir, er forskelle i ilt-niveau i aCSF let fremstillet i daglige eksperimenter. Således, en ilt meter er anbefalet at fremskynde fejlfinding og tilpasse betingelserne (f.eks. temperatur, carbogen strømningshastighed, carbogenation værktøjer og aCSF genbrugsprocenten) for at nå mindst 28 mg/L ilt i aCSF reservoir på stabil niveauer. Derudover kan det almindelig praksis at ændre størrelsen på aCSF container for drug application fremkalde virkninger på feltet potentialer på grund af forskelle i deres carbogen.
Brugen af udstrømning-carbogenation af en lille genanvendelse buffer volumen forbedret resultatet af synaptisk plasticitet eksperimenter. Forbedret opløsning af ilt i væsken er baseret på større forholdet mellem kontaktområdet på væsken og carbogen. Desuden reducerer udstrømning-carbogenation levering af den carbogen-forarmet aCSF i aCSF-reservoiret. Stabiliteten i carbogenation kan forbedres yderligere ved en specielt designet venturi baseret på princippet om kommercielle produkter29.
Selv med de bedste slice forberedelse og opsætning betingelser er det ofte uundgåelige, at feltet potentialer ikke kan induceres, når der anvendes elektroder af isoleret metal stimulation. Årsagen er ofte, at isoleringen er blevet beskadiget på grund af bøjning eller rengøring. Som vi har nævnt i metoderne, er en enkel metode at kontrollere boble-dannelse på lav DC-spænding. Derudover hjælper dette trin til at rense spidsen og reducere impedans af stimulation elektrode. Brugen af glas pipetter til stimulation er fælles og har fordelen at give et smallere felt af fiber stimulation. Ofte, er det ikke muligt at finde en maksimal fEPSP hældning, når glas pipette stimulation er brugt. Udseendet af Kildekomponenten positive af befolkningen spike i fasen for fEPSP-henfald kan derefter bruges til at justere stimulation styrke23.
Kan publikation om induktion af aktivitet-afhængige synaptisk plasticitet og inddragelse af forskellige signaling veje afhængig af den anvendte induktion protokol er tilgængelig10. Men fra et metodologisk synspunkt højfrekvens stimulation kan forårsage forskellige artefakter, der kan forhindre vellykket induktion af synaptisk plasticitet. En gentagen 100 Hz/1 s stimulation kan forårsage polarisering af stimulation elektroder eller elektrokemiske reaktioner30, resulterer i depression af synaptisk transmission grund til skade på afferenter (Se figur 8 for et eksempel). For at minimere de elektrokemiske processer, anbefales brug af bifasisk stimulation pulser og en stimulation magt ikke mere end 2 V til baseline optagelser.
I Resumé, udstrømning-carbogenation hjælper med at stabilisere iltindholdet i eksperimenter, der er baseret på genbrug af en lille buffer reservoir, forbedre omkostningseffektiviteten af narkotika eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at forskningen blev gennemført i mangel af nogen kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.
Acknowledgments
WW gennemført, analyseres, og designet af eksperimenter og skrev manuskriptet. D.X. og C.P. bistået i figur forberedelse og udført eksperimenter. Dette arbejde blev støttet af NSFC (31320103906) og 111 projekt (B16013) til T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
