Summary
Dit protocol beschrijft de stabilisatie van het zuurstofgehalte in een klein volume van gerecycled buffer en methodologische aspecten van de opname van de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit in verzonken acute hippocampal plakjes.
Abstract
Hoewel experimenten op segmenten van de hersenen zijn al in gebruik sinds 1951, problemen die de kans op het bereiken van een stabiele en succesvolle analyse van synaptische transmissie modulatie verminderen bij het uitvoeren van potentiële of intracellulaire veldopnames. Dit manuscript beschrijft de methodologische aspecten die nuttig wellicht bij het verbeteren van de experimentele omstandigheden voor het onderhoud van acute hersenen segmenten en voor het vastleggen van veld excitatory postsynaptisch potentieel in een kamer verkrijgbare onderdompeling met een uitstroom-carbogenation eenheid. De uitstroom-carbogenation helpt bij het stabiliseren van het zuurstofniveau in experimenten die afhankelijk zijn van de recycling van een kleine buffer reservoir ter verbetering van de kostenefficiëntie van de drug experimenten. Daarnaast presenteert het manuscript representatieve experimenten die onderzoeken van de effecten van verschillende carbogenation wijzen en stimulatie paradigma's op de activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit van synaptische transmissie.
Introduction
In 1951 waren de eerste gerapporteerde acute hersenen segment experimenten uitgevoerd1. In 1971, na succesvolle in vitro opnames uit de3 van piriform cortex2,en de ontdekking dat hippocampal neuronen onderling dwars langs de as van de septotemporal van de hippocampus4, één van verbonden de eerste in vitro opnames van hippocampal Neuronale activiteit werd bereikt5. De gelijkenis van de neurofysiologische of neurostructural parameters van neuronen in vivo en in vitro voorwaarden zijn nog steeds het onderwerp van een debat6, maar in 1975, Schwartzkroin7 aangegeven dat de basale eigenschappen van neuronen in vitro worden gehandhaafd en dat hoogfrequente stimulatie (dat wil zeggen, tetanization) van afferents in de hippocampal formatie induceert een langdurige versoepeling van synaptic potentieel8. Elektrofysiologische opname van neuronale activiteit in vitro breidde de studie van de cellulaire mechanismen van activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit9,10, die had ontdekt in 1973 door Bliss et al. 11 in vivo experimenten met konijnen.
De studie van neuronale activiteit of signalering trajecten in plakjes van de hersenen, met name in acute hippocampal segmenten, is nu een standaard tool. Verrassend, moeten in vitro experimenten echter nog worden herleid, zoals blijkt uit de verschillende benaderingen die nog steeds bestaan voor de opstelling en het onderhoud van acute hippocampal segmenten. Reid et al. (1988) 12 herzien de methodologische uitdagingen voor het onderhoud van acute hersenen segmenten in verschillende soorten segment kamers en de keuzes van het medium, pH, temperatuur en zuurstof niveau zwemmen. Deze parameters zijn nog steeds moeilijk te controleren in de zaal van de opname als gevolg van de op maat gemaakte elementen van in vitro segment-opname opstellingen. Publicaties kunnen worden gevonden dat misschien help te overwinnen enkele van de methodologische uitdagingen en die nieuwe soorten beschreven onderdompeling segment chambers, zoals een interstitiële 3D microperfusion systeem13, een kamer met verbeterde laminaire flow en zuurstof 14, een systeem met geautomatiseerde temperatuur controle15, en een multi-kamer opname systeem16opgeven. Aangezien deze kamers zijn niet gemakkelijk op te bouwen, rekenen de meeste wetenschappers op verkrijgbare segment kamers. Deze kamers kunnen worden gemonteerd op een Microscoop systeem, waardoor de combinatie van elektrofysiologie en fluorescentie imaging17,18,19. Aangezien deze kamers houden de segmenten van de hersenen ondergedompeld in kunstmatige cerebrospinale vloeistof (aCSF), moet een hoog stroomtarief bufferoplossing worden gehandhaafd, verhoging van de kosten van de toepassing van de drug. Daartoe hebben we een recyclingsysteem perfusie met uitstroom-carbogenation waarmee voldoende stabiliteit voor de lange termijn opname van veld potentieel in een onderdompeling segment kamer met behulp van een relatief kleine aCSF volume opgenomen. Bovendien, samengevat we hoe het gebruik van deze experimentele carbogenation/perfusie-systeem de uitkomst van de Synaptische plasticiteit activiteit-afhankelijke10 beïnvloedt en hoe remming van eukaryotische rek factor-2 kinase (eEF2K) moduleert synaptic transmissie20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De dieren werden onderhouden volgens de vastgestelde normen voor de verzorging van de dieren en de procedures van de instituten van de wetenschap van de hersenen en de State sleutel laboratorium van medische neurobiologie van Fudan University, Shanghai, China.
1. oplossing voorbereiding
Opmerking: Zie de tabel van materialen.
- Bereiden de segmenteringshulplijnen buffer (gemodificeerde Gey de oplossing): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glucose, 20 mM HEPES, 3 mM nb+-pyruvaat, 10 mM MgSO4en 0,5 mM CaCl2.
- Breng de pH op 7.6 met behulp van de 1 M NaOH zonder carbogenation.
- Winkel de buffer bij 4 ° C.
Opmerking: De titratie verduidelijkt de vloeistof troebel. De osmolaliteit is 305-310 mOsm. De carbogen21 bevat 5% koolstofdioxide en 95% zuurstof. - De aCSF bereid door verdunning van een 10 x stockoplossing van aCSF die geen bevat bicarbonaat en glucose, geven een uiteindelijke samenstelling van: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2en 1.25 mM KH2PO4.
- Bicarbonaat en glucose tot 10 mM glucose en 26 mM NaHCO3toevoegen.
- Carbogenate de aCSF door een geperforeerde silicon buis met een geblokkeerde einde onmiddellijk na het toevoegen van de NaHCO-3.
- Wordt de pH terwijl carbogenating (pH 7,3-7.4).
Opmerking: De buffercapaciteit kan enigszins aangepast worden door een wijziging van het bedrag van NaHCO3. Aangezien de resulterende pH afhankelijk van de temperatuur is, is het noodzakelijk om te controleren de resulterende pH terwijl carbogenating bij de bedrijfstemperatuur (bijvoorbeeld 30 ° C).
2. voorbereiding van Acute Hippocampal segmenten
Opmerking: Zie de tabel van materialen.
- Plaats een segment-bedrijf maaswijdte in een incubatie kamer voor acute hersenen segmenten, de kamer vullen met aCSF en carbogenate (4-6 L/h) voor ten minste 30 min22 bij 28-30 ° C.
- Koel de chirurgische instrumenten tot 2-4 ° C.
- Plaats een glas bekerglas gevuld met koude en carbogenated snijden buffer (2-4 ° C), gehandhaafd in een mengsel van ijs water, in de buurt van de vibratome.
- Anesthetize van ratten of muizen totdat het hoornvlies reflexen verdwijnen (30-50 s) met behulp van Isofluraan door 500 µL rekening met een 2 L glazen pot of 12,5 µL in een tube van 50 mL.
- Isoleren van de hersenen met behulp van een methode beschreven en gevisualiseerd in detail in de publicaties van Mathis et al. (2011) 23 en Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Koel de hersenen tot 2-4 ° C in een ijskoude segmenteringshulplijnen buffer (gedurende ten minste 2 minuten) voordat de ontrafeling van het cerebellum en scheiden van de hemisferen.
- Een koude chirurgische mes gebruiken voor het ontleden van een stuk van de dorsale cortex onder een hoek van 70° langs de dorsale rand van elk halfrond25 om transversale segmenten van de ventrale en het tussenliggende deel van de hippocampus, zoals weergegeven in Figuur 1C en E.
- Met een koude tandheelkundige cement spatel, door een halfrond te overbrengen in een stuk filtreerpapier kort drogen de gemaakte oppervlak (1-2 s).
- Monteer de twee hemisferen met vers geslepen oppervlakken op het ijskoude segmenteringshulplijnen platform met behulp van snelwerkende lijm lijm; hebben het caudal einde van de hemisferen gezicht het scheermesje (Figuur 1D).
- Schakel de segmenteringshulplijnen platform in de koeling kamer van een vibratome en vul die kamer met de segmenteringshulplijnen buffer (2-4 ° C). Carbogenate met behulp van een geperforeerde silicium-buis.
- Knippen van 350 µm segmenten met behulp van adequate vibratome instellingen (bijvoorbeeld de voorwaartse snelheid lemmet: 1.2 mm/s, blade amplitude: 1 mm).
- Isoleren van de hippocampal formatie uit de subiculum en de cortices van de Entorinale met behulp van twee cannulas van de injectie (> 28 G) als schaar.
- Verwijder de belletjes uit de maaswijdte van de segment-bedrijf van de kamer van de eerder bereid incubatie met behulp van een precisiepipet Pasteur.
- Overdracht van de segmenten die sommige transparantie op de stratum pyramidale uit de segmenteringshulplijnen platform op de maaswijdte van de incubatie-zaal hebben. Vermijd elke vouwing, stretching, overlappende en zweven door zuigen aCSF en het segment in een grote-mond Pasteur pipet.
Opmerking: De hele procedure (stap 2.5-2.14) kan duren 5-10 min; Daarom is het belangrijk om te controleren van de temperatuur van de bufferoplossing na verloop van tijd te handhaven bij 4 ° C. - Incubeer de segmenten bij 30 ° C gedurende ten minste 1,5-2 uur in de zaal van de incubatie en bieden carbogen bij 4-6 L/h.
Opmerking: Pas het debiet van de carbogen naar de buffer in de incubator circuleren, maar voorkomen dat de plakjes drijvende.
3. wijzigingen van de Carbogenation voor de aCSF Recycling van kleine Reservoirs
- Een 3-weg buis connector toevoegt aan de uitstroom van de recyclingsysteem (Figuur 2B).
- Sluit de middelste arm van de verbindingslijn van de 3-wegs buis met een carbogen levering buis en het debiet te regelen met een luchtstroom meter (3-4 L/h, Figuur 2D en Figuur 4C).
- Een tweede 3-weg buis connector toevoegt aan de instroom van de recyclingsysteem. De middelste arm verbinden met de buis die de inline-kachel, de bovenarm aan een dunne silicium-buis (10 cm lengte) en de onderarm kijkend naar de buis van de instroom uit het reservoir (low-pass filter; Figuur 4 C).
- Plaats een buis squeezer op een dunne silicium-buis (OD: 2 mm) op een positie langs de buis waar de pulsatie van de aCSF in de zaal van het segment, gegenereerd door de peristaltische pomp, minimaal zijn is.
Opmerking: De uitstroom-carbogenation (uitstroom-carb.) wijziging vermindert de gevoeligheid van het niveau van de carbogenation aan het volume van het aCSF reservoir, het recyclingspercentage, aCSF en relatieve buis posities binnen kleine aCSF stuwmeren (< 50 mL; Figuur 3). Met betrekking tot de low-pass filter vermindert een bepaalde hoeveelheid lucht in de dunne silicium-buis de pulsatie van de stroom van de aCSF; de buis moet dus meestal met lucht worden gevuld.
4.Synaptic reacties opnemen in een onderdompeling segment kamer
Opmerking: Zie de tabel van materialen.
- Vooraf warm de oplossing van de aCSF in een waterbad tot ongeveer 28-30 ° C (Hiermee voorkomt u dat bubble vorming in de zaal van de opname).
- Start de recyclingsysteem (4-5 mL/min) en activeren van de inline kachel om equilibreer het systeem gedurende ten minste 1 uur.
- Presoak een klein stukje van lens reiniging van papier en een nylon mesh gefixeerd op een U-vormige platina-draad in de onderdompeling segment kamer voor een paar minuten (Figuur 4).
- Verwijder de U-vormige platina-draad.
- Schakel de recycling en plaatsen van een segment op de lens schoonmaken van papier.
- Onmiddellijk plaats de segment-bedrijf Maas op de top van het segment, schakelen op de pomp, en laat het segment equilibreer gedurende 30 min zonder dompelen de doelstelling in de aCSF.
- Vul de borosilicaat micropipet (dat wil zeggen, de opname-elektrode) met aCSF (weerstand tip: 1-2 MΩ, 1/3 met aCSF gevuld) en monteren in de pipet houder.
- Controleren van de isolatie van de elektrode metalen stimulatie door deze te plaatsen in NaHCO3 oplossing (> 40 mM). De elektrode verbinden met de minpool van een DC spanning generator (1-2 V, positieve pool: zilver of platina-draad), en observeren van de vorming van luchtbellen aan het uiteinde onder een Microscoop dissectie (> 60 x vergroting).
- Plaats van de geteste epoxy-geïsoleerde wolfraam stimulatie elektrode in de manipulator houder en de verwijzing draden in de zaal van het segment.
- Toevoegen van een tweede referentie-elektrode aan de zaal en sluit deze aan op de aansluiting van de verwijzing van de headstage van de opname-elektrode (Figuur 4A).
- In de software van de controle van de versterker, klik op het vak "nul klem mode" en gaan door te dubbelklikken op het vak "uitvoer gain lijst". Kies een winst van "100", dubbelklikt u op de "high-pass filter keuzelijst (Bessel)," Kies "0,1 Hz" en dubbelklik op de "low-pass filter keuzelijst (AC)" om te kiezen "3 kHz."
- In de opname-software, klikt u op het op "ophaal | Open Protocol." Kies een protocol dat heeft instellingen waardoor episodische stimulaties en de digitalisering van het versterkte potentieel bij 10-20 kHz voor 50-100 ms en dat automatisch wordt gegenereerd een stimulans isolator 10 ms na de start van een episodische opname.
- Plaats de stimulatie en de opname elektroden in lijn en evenwijdig aan de stratum pyramidale, bijvoorbeeld (Figuur 4B en Figuur 5).
- Klik op "verwerven | Edit Protocol"en kies het tabblad"trigger"(in het pop-upvenster). Klik op het vak "trigger bron" en kiezen "space bar" als de trigger bron. Klik op de knop "OK". Klik op de "record" knop om te beginnen de verwerving en het pop-upvenster met een trigger knop Opmerking.
- In de stimulus isolator software, klik op het vak "spanningsregeling" en vul "0." Klik op de "download" knop. Klik op het venster "opnamesoftware" en druk op de SPATIEBALK. Herhaal deze cyclus door het opeenvolgend waarden van 1 tot en met 8, bijvoorbeeld invoeren op 1 mV stappen in het vak "spanningsregeling".
- De kracht van de stimulatie te correleren met de waarden van de fEPSP-helling en bepalen de kracht van de stimulatie nodig om 40% van de fEPSP-helling maximaal. Klik op de "spanning control box" en voer de vastgestelde waarde. Klik op de "download" knop.
Opmerking: Een stimulans isolator wordt gebruikt om het korte spanning of huidige pulsen toepassen op hersenweefsel. De tweefase pulsen kunnen hebben 100 µs per fase. - In de opname-software, klikt u op de stopknop en vervolgens het menu "Verwerven". Klik op "Bewerken Protocol" en kies de "trigger"-tab in het pop-upvenster. Klik op het vak Bron de trigger en koos de "interne timer" als de trigger bron. Klik op de knop "OK". Klik op de opnameknop die de automatische opname van veld potentieel start elke 30 s, bijvoorbeeld. Klik op de toets "stop" na 30-60 min.
- Klik in het menu "Verwerven", klik op "Open Protocol," Kies het gewenste inductie-protocol van de Synaptische plasticiteit en klik op de knop "OK". Klik op de "record" knop om de hoogfrequente stimulatie en de opname automatisch te activeren. Klik op de "stop" knop.
Opmerking: In geval van studies met betrekking tot de Synaptische plasticiteit, van toepassing zijn een van de standaard inductie paradigma's voor de lange termijn potentiëringsverschijnselen of op lange termijn depressie na langdurige basislijn opname. Representatieve voorbeelden van de resulterende modulatie van de synaptische transmissie zijn afgebeeld in Figuur 7 en Figuur 8. - In de opname-software, klikt u op "ophaal | Open Protocol"en kies hetzelfde protocol zoals in stap 4.12. Klik op de "OK" knop en klik vervolgens op "record". Houd het automatisch uitvoeren van de potentiële veldopnames voor 2-4 h, bijvoorbeeld. Klik op de "stop" knop om de opname te beëindigen.
- In het geval van farmaceutische studies, het toepassen van de compound rechtstreeks naar het aCSF reservoir als permanente samengestelde administratie is gewenst (Figuur 6).
5. het reinigen van de Setup en Hints
Opmerking: Zie hieronder voor algemene tips.
- Wekelijks reinigen van het systeem door recycling van 10% H2O2 voor niet meer dan 20 minuten, gevolgd door wassen met gedeïoniseerd H2O.
Opmerking: Ethanol wordt niet aangeraden voor het reinigen. Het wordt ook niet aanbevolen om te dompelen de doelstelling in H2O2en verwijzing draden. - Verwijder geprecipiteerde zout op het oppervlak van het objectief of kamer omgeving met 0,1 N HCl en dan water.
- Wassen van de carbogen waskolf in gedestilleerd water of 0,1 N HCl.
- Dompel het segment incubatie kamer in 10% H2O2 voor 5 min een keer per week en dan spoel de incubatie kamer met gedeïoniseerd H2O.
- Bij metalen stimulatie de elektroden, de stimulerende elektrode tip met gedeïoniseerd water afspoelen na elk experiment en veeg voorzichtig de stimulerende elektrode-tip met een katoenen bal gedrenkt met ethanol te verwijderen van de resterende weefsel.
- Verminder de weerstand van commerciële metalen stimulatie elektroden door het verwijderen van de isolatie op het puntje door middel van een voorzichtig vegen met schuurpapier.
- Het verlies van carbogen van de aCSF verminderen terwijl recycling via de buizen door vervanging van de silicium-buizen met polytetrafluorethyleen buizen.
- Houd de zilveren draden van de opname elektrode en referentie-elektrode bleekmiddel voor meerdere dagen te vormen AgCl op het oppervlak van de draad.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In de sectie protocol beschreven we de voorbereiding van acute hippocampal segmenten uit het ventrale en tussenliggende deel van de hippocampal formatie (Figuur 1) van mannelijke C57BL/6 muizen en mannelijke Wistar ratten (5-8 weken). De positie van de hemisferen op de slicer platform helpt hen om stabiel te houden en elimineert de noodzaak van stabilisatie met agar of agarose. De perfusie-systeem zelf is gebaseerd op een peristaltische pomp geopereerd hoge rotatie te geven van het gewenste debiet van de vloeistof. Dus, de snelle veroudering van standaard buizen binnen de pomp een wezenlijk probleem dat wij overwonnen met behulp van siliciumvrij buizen gemaakt (ID: 1,02 mm). De negatieve druk voor de uitstroom is ook gemaakt door twee parallel aangesloten buizen die een binnendiameter van 2.79 mm hebben. Deze twee buizen zijn verbonden met een canule in de zaal van de opname te maken voor het streven van de vloeistof (Figuur 4A). Het tarief van de carbogenation van de aCSF in het reservoir moet stabiel gedurende vele uren, die kunnen moeilijk zijn te bereiken via ventilatie stenen of buizen met kleine poriën. Sinds de uitstroom-carbogenation niet afhankelijk zijn van kleine poriën, het carbogen debiet over tijd blijft stabiel (Figuur 2). Als de experimenten zijn uitgevoerd met een reservoir voor kleine aCSF, helpt de uitstroom-carbogenation bij het bereiken van een evenwicht van de opgeloste zuurstof (Figuur 3). Daarnaast minimaliseert het de variabiliteit van het zuurstofniveau tussen de experimenten op basis van een gewijzigde instroom/uitstroom buis positie, het aantal actieve poriën op de carbogen bubble buizen, en de vloeibare recyclingpercentage.
Het segment wordt geplaatst op lens papier dat sommige vloeibare uitwisseling onder (Figuur 4A). Aangezien de segment-zaal kan gemonteerd worden op een rechtop Microscoop die is uitgerust met een 40 X doelstelling, kunnen de positie van de elektroden goed gecontroleerde (Figuur 4B en Figuur 5). Verder vermindert dit de variabiliteit van de experimenten in dagelijkse werkzaamheden.
Om de kracht van de stimulatie nodig is voor de opname van de basislijn van veld potentiële, dat de afhankelijkheid van de mogelijke veldlengte op de sterkte van de stimulatie moet worden bepaald door het opnemen van de fEPSPs op de stimulatie van de verschillende sterktes (Figuur 5 ). De meting van de input-output-karakteristiek maakt sommige stress op het segment op de sterke punten hoger stimulatie. Een andere benadering is dus om te zoeken naar een stimulatie kracht die net een positieve bevolking spike component in de fEPSP-verval (zwarte pijlen in Figuur 5)-26 oproept.
Na het opnemen van een stabiele basis voor minstens 30 min, kan drug administration beginnen. Hier voorgesteld hebben we een voorbeeld van de gevolgen van een eEF2K-remmer voor synaptische transmissie. Remming van de eEF2K bevordert synaptische transmissie (Figuur 6A), een effect dat was verzwakt door de remming van p38 MAPK (Figuur 6B)20.
Activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit, kan worden opgewekt door een verscheidenheid van stimulatie paradigma's10. Hier, wij ingediend representatieve experimenten van synaptische plasticiteit, die zijn gebaseerd op een doorlopende reeks van stimuli bij 100 Hz en herhaalde stimulaties 1 Hz meer dan 15 min. De resulterende modulatie van de synaptische transmissie is afgebeeld in Figuur 7 en Figuur 8. Bovendien, wordt het weergegeven in Figuur 7 en Figuur 8 dat de stabilisatie van het zuurstofgehalte van kleine buffer reservoirs door de uitstroom-carbogenation (witte cirkels, relatieve zuurstofniveau op 24-40 min in Figuur 3) verbeterd de LTP en LTD inductie in vergelijking met experimenten met reservoir-carbogenation alleen (grijze cirkels, zuurstofniveau op 7-24 min). We testen de combinatie van uitstroom-carbogenation en reservoir-carbogenation (7-24 min) niet omdat we geïnteresseerd waren in het creëren van een experimenteel systeem met lagere en eenvoudigere carbogen gebruik. Het reservoir-carbogenation zonder het niveau van de basislijn van zuurstof in het reservoir aCSF recycling (tot 7 min.) vertegenwoordigt.
Figuur 1: Positionering van de hemisferen van de hersenen om te verkrijgen van transversale segmenten van de hippocampus met behulp van een vibratome. (A) de hippocampal formatie wordt aangegeven in een laterale weergave van de rechter hersenhelft, in het groen, binnen een gereconstrueerde muismodel van de hersenen. (B) een ventrale weergave van de hippocampal formatie. (C) de rostraal-naar-caudal weergave toont een deel van het ventrale en tussenliggende deel van de hippocampal formatie voor de rechter hersenhelft in het horizontale vlak. Aangezien verschillende regio's langs de as van de septotemporal van de hippocampus verschillende graden van innervatie arm en functie31,hebben is32, een verschillende snijden hoek vereist is voor transversale segmenten van de dorsale hippocampus, in het volgende voorbeeld. Schaal bar = 3 mm (horizontale witte lijnen). (D) de foto toont de hemisferen van de hersenen van een rat gelijmd op een vibratome platform. Schaal bar = 6 mm. (E) de schets toont de hoek voor het trimmen van de dorsale rand van de cortex (bovenste schema) van de gescheiden rechter hersenhelft (zwarte stippellijn) en de rotatie (rode pijl) naar de hersenen op het gemaakte oppervlak op het snijden platform lijm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Elementen van het carbogenation-systeem voor aCSF reservoirs lager dan 50 mL. (A) standaard carbogenation systemen met behulp van (een) geperforeerde buizen als een carbogen bubble apparaat; een buis was geperforeerd door meerdere lekke banden met een 250 µm-diameter roestvrij staaldraad. (B) uitstroom-carbogenation door (b) een 3-weg buis-connector (inwendige diameter: 2 mm) of (C) een vent eenheid waardoor vloeibare terug stroom met een hydrofobe filter.De middelste arm van de 3-wegs buis verbindingslijn is verbonden met een carbogen tank na een manometer (gas druk: < 1 atm) en een debietmeter. De resterende takken zijn verbonden binnen de aCSF uitstroom buis. (D) de carbogen debiet wordt geregeld door Debiet-flowmeters. Tijdens de experimenten, worden de stuwmeren van aCSF bewaard bij 28-30 ° C. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Het zuurstofniveau in 40 mL aCSF tegen verschillende voorwaarden. Het zuurstofgehalte tijdens het reservoir-carbogenation (res.-carb.) en aCSF recycling daalde voortdurend (grijs gevulde cirkels, n = 3). Echter, de uitstroom-carbogenation (uitstroom-carb.) tijdens aCSF recycling verminderd de daling van het zuurstofniveau, dat evenwicht op basislijn niveaus bereikt (witte gevulde cirkels, n = 3). Basislijn niveaus werden gemeten met res.-carb. zonder aCSF recycling. De verticale gestippelde grijze lijnen geven aan de overgang naar verschillende carbogenation protocollen. De effecten van res.-carb recycling (7-24 min) en uitstroom-carb. recycling (witte cirkels, 24-40 min) op de inductie van LTP en LTD zijn afgebeeld in Figuur 7 en Figuur 8. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Onderdelen van uitstroom-carbogenation voor experimenten in een onderdompeling segment kamer. (A) presentatie van de onderdompeling segment kamer. De U-vormige platina-draad met de nylon vezels houden een hippocampal segment wordt afgebeeld. De zilveren draden waren gewikkeld rond een kleine canule, maken een spoel te verhogen van het gebied van het zilver draad einde. De stimulatie referentie draad werd geplaatst in de uitstroom kamer, en de referentie van de opname in de belangrijkste zaal was. Te houden de referentie-elektrode potentiële dat stabiel op verschillende vloeibare niveaus, de opname referentie draad kan worden geïsoleerd door een kunststof buis, waardoor alleen het "onderwater" deel van de draad blootgesteld aan de buffer. (B) het helder-veld afbeelding toont een representatieve acute hippocampal segment en de elektroden. Ca1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: getand gyrus; sub: subiculum; EC: Entorinale cortex. (C) het schema belicht de belangrijkste onderdelen van de uitstroom-carbogenation, zonder vermelding van Debiet-flowmeters voor de carbogen en de peristaltische pomp. Een low-pass filter kan enkel voor de inline-kachel om de pulsatie van de stroom van de aCSF worden geplaatst. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5 : Afhankelijkheid van de potentiële vorm veld van de kracht van de stimulatie en de positie van de elektroden. (A) representatieve voorbeelden van veld potentiëlen, opgeroepen op verschillende afstanden van de stratum pyramidale (str. pyr.), en stimulatie sterktes worden afgebeeld. De horizontale zwarte pijlen geven aan de positieve bron component van de piek van de bevolking in het veld potentiële verval. De positieve bron component van de piek van de bevolking bleef ongeveer in het midden van de eerste fEPSP-rise fase helemaal getest "in-line" elektrode posities, behalve die vlakbij de cel lichaam laag (e). (B) de positie van de positieve bron component van de bevolking Prikker varieerde sterk als gevolg van de afwijking van de stimulatie en opname elektroden. Lac.: stratum lacunosum moleculare; Rad.: stratum radiatum; Pyr.: stratum pyramidale; Rec: opname elektrode; STIM.: stimulatie elektrode. Schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Representatief voorbeeld van de gevolgen van een eEF2K-remmer voor hippocampal synaptische transmissie de uitstroom-carbogenation, met de recycling van een kleine aCSF reservoir20 . Na het opnemen van fEPSPs gedurende 20 minuten tussenpozen 1 min, was de eEF2K-remmer A-484954 direct aan het aCSF reservoir (horizontale lijn) toevoegen. Een snelle stijging van de synaptische transmissie was aantoonbaar (witte gevulde cirkels). Als de drug niet werd toegepast, bleef de fEPSP-helling stabiel in de tijd van de opname (grijs gevulde cirkels). (B) toepassing van de p38 MAPK remmer (grijze horizontale lijn) voorkomen de eEF2K inhibito-geïnduceerde verbetering van veld potentieel. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7: Vertegenwoordiger opnames van activiteit-afhankelijke potentiëring van synaptische transmissie met uitstroom-carbogenation (uitstroom-carb; witte cirkels) en reservoir-carbogenation (res.-carb; zwarte cirkels), met de recycling van een kleine aCSF reservoir. De potentiëring was geïnduceerd na tijd punt 0 door drie keer 100 Hz/s treinen (Tet.: tetanization, hoogfrequente stimulatie). De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. Bracket: statistische vergelijking van groepen per tijdstip; ongepaarde T-test, niet uitgaande van consistente standaarddeviatie. * p < 0.05.Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Afhankelijkheid van activiteit-afhankelijke depressie van synaptische transmissie van de kracht van de stimulatie en carbogenation. (A) met behulp van reservoir-carbogenation (res.-carb.) met de recyclage van een grote aCSF volume, een stimulatie van 1 Hz gedurende 15 minuten op 80% van de maximale fEPSP-helling opgeroepen een sterke neerwaartse druk op de synaptische transmissie (witte cirkels). Echter, zoals de representatieve fEPSP voordat (zwarte sporen sporen) en na (rode sporen op de 110th min) LTD inductie aangeven, de presynaptische vezel volley (verticale zwarte pijl) was sterk verminderd. Dit is een voorbeeld dat aangeeft dat elektrochemische processen op de stimulatie elektrode schadelijk is voor de afferents, waardoor een depressie die niet afhankelijk gedeeltelijk LTD-gerelateerde mechanismen. Vermindering van de sterkte van de stimulatie tot 50% van het maximumbedrag van de fEPSP-helling veroorzaakte een depressie van synaptische transmissie aan een lagere graad, maar zonder de presynaptische vezel volley (grijs gevulde cirkels). (B) LTD inductie deed niet oproepen een duurzame neerwaartse druk op de fEPSP-hellingen in de experimenten met het reservoir-carbogenation en de recycling van een kleine aCSF reservoir (res.-carb; grijs gevulde vierkantjes). (C) de uitstroom-carbogenation met de recycling van een kleine aCSF reservoir verbeterd de uitkomst van de LTD inductie. De inserts presenteren representatieve fEPSPs vóór (zwarte sporen) en na (110th min, rode sporen) LTD inductie. Voor de representatieve fEPSPs, de verticale schaal staven geven 1 mV, en de bars van de horizontale schaal komen overeen met 2 ms. de gegevens werden verkregen uit acute hippocampal segmenten (350 µm) van 1 tot 2 maand oud C57/BL 6 muizen en worden gepresenteerd als de gemiddelde ± SEM. haken : statistische vergelijking van groepen per tijdstip; ongepaarde T-test, niet uitgaande van consistente standaarddeviatie. * p < 0,05, ns: niet-significant. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de interface segment chambers vertonen meer robuuste synaptic reacties25,26,27,28, bieden onderdompeling kamers extra gemak voor patch-clamp opname en fluorescentie Imaging. Zo hebben we verschillende aspecten van veldopnames potentiële in acute hippocampal plakjes met behulp van een commerciële onderdompeling segment kamer die gemakkelijk kan worden uitgebreid tot de beeldvorming van fluorescentie sondes in neuronen17,18, beschreven 19. Naast het segment voorbereiding25vertegenwoordigt de handhaving van een constante carbogen in de zaal van de opname na vele uren één van de obstakels. Aangezien de carbogen niveau alleen controleerbaar door de eerste verzadiging van het aCSF reservoir is, verschillen in het zuurstofniveau in de aCSF zijn gemakkelijk te verkrijgen in dagelijkse experimenten. Dus, een zuurstofmeter wordt aanbevolen om de probleemoplossing te versnellen en aan te passen de voorwaarden (bijvoorbeeld temperatuur, carbogen, debiet, carbogenation tools en aCSF recyclingpercentage) om het bereiken van ten minste 28 mg/liter zuurstof in het reservoir van de aCSF op stal niveaus. Bovendien, kan het gebruikelijk om te veranderen van de grootte van de container van de aCSF voor de toepassing van de drug veroorzaken effecten op veld potentieel als gevolg van verschillen in hun carbogen.
Het gebruik van de uitstroom-carbogenation van een kleine recycling buffervolume verbeterd de uitkomst van de Synaptische plasticiteit experimenten. Verbeterde ontbinding van zuurstof in de vloeistof is gebaseerd op de grotere verhouding tussen de contactpunten van de vloeistof en carbogen. Bovendien, vermindert de uitstroom-carbogenation de levering van de carbogen-verarmd aCSF in het aCSF reservoir. De stabiliteit van de carbogenation kan verder worden verbeterd door een speciaal ontworpen venturi gebaseerd op het beginsel van commerciële producten29.
Zelfs met de beste segment voorbereiding en setup voorwaarden is het vaak onvermijdelijk dat veld potentieel kunnen niet worden opgewekt als geïsoleerde metalen stimulatie elektroden worden gebruikt. De reden is vaak dat de isolatie is beschadigd als gevolg van buigen of reinigen van schijven. Zoals we hebben in de methoden, is een eenvoudige benadering het controleren van de vorming van de zeepbel op de DC-laagspanning. Bovendien, helpt deze stap om de tip schoon te maken en om de impedantie van de stimulatie-elektrode. Het gebruik van glas pipetten voor stimulatie is gemeenschappelijk en heeft het voordeel dat een smaller terrein van stimulatie van de vezels. Vaak is het niet mogelijk om te vinden van een maximale fEPSP helling wanneer glazen pipet stimulatie wordt gebruikt. De verschijning van het positieve bronapparaat van de bevolking-Prikker in de fase van de fEPSP-verval kan vervolgens worden gebruikt om aan te passen de stimulatie sterkte23.
Mei publicatie over de inductie van activiteit-afhankelijke synaptische plasticiteit en de betrokkenheid van verschillende signaalroutes afhankelijk van het toegepaste inductie-protocol zijn beschikbaar10. Echter, uit het methodologisch oogpunt, de hoogfrequente stimulatie kan verschillende artefacten die de succesvolle inductie van synaptische plasticiteit kunnen voorkomen. Een herhaalde 100 Hz/1 s stimulatie kan leiden tot polarisatie van de stimulatie elektroden of elektrochemische reacties30, resulterend in de depressie van synaptische transmissie verschuldigd aan schade aan de afferents (Zie Figuur 8 voor een voorbeeld). U wilt de elektrochemische processen minimaliseren, het gebruik van tweefase stimulatie pulsen en een vermogen van de stimulatie niet meer dan 2 V voor basislijnregistratie worden aanbevolen.
Kortom helpt uitstroom-carbogenation om te stabiliseren van het zuurstofniveau in experimenten die afhankelijk zijn van de recycling van een kleine buffer reservoir, verbetering van de kostenefficiëntie van de drug experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat het onderzoek werd uitgevoerd in de afwezigheid van eventuele commerciële of financiële relaties kan worden opgevat als een mogelijke belangenconflicten.
Acknowledgments
W.W. uitgevoerd, geanalyseerd, en de experimenten ontworpen en schreef het manuscript. D.X. en C.P. bijgestaan in figuur voorbereiding en de experimenten. Dit werk werd gesteund door NSFC (31320103906) en T.B.-111 Project (B16013)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
