Summary
このプロトコルでは、再生バッファーの量が少ないと水中急性海馬スライスにおける活性依存性シナプス可塑性を記録の方法論的側面の酸素レベルの安定化について説明します。
Abstract
脳スライスの実験は 1951 年以来使用されている、にもかかわらず、フィールドや潜在的な細胞内の録音を実行するとき、シナプス伝達の変調の安定した、成功した分析を達成するための確率を低減問題が残っています。この原稿は、急性脳スライスの維持のため、市販の水没商工会議所における興奮性シナプス後電位を記録するための実験条件の改善に役立つ可能性のある方法論的側面をについて説明します流出 carbogenation 付け。流出 carbogenation は、薬物実験のコスト効率を高めるために小さなバッファー貯留層の循環依存の実験で酸素レベルを安定させるのに役立ちます。さらに、原稿はシナプス伝達の活動依存的シナプス可塑性に及ぼす異なる carbogenation モードと刺激パラダイムを調べる代表的な実験を紹介します。
Introduction
1951 年に初めて報告した急性期脳スライス実験は実施1.梨状皮質2,3海馬ニューロンが海馬の4、1 つの septotemporal 軸に沿って横相互接続されて検出から成功体外録音後の 1971 年に、海馬神経活動の最初の in vitroの録音は達成5だった生体内および生体外での条件の下でニューロンの神経生理学的または neurostructural パラメーターの類似性はまだいくつかの討論の6件名が、1975 年に Schwartzkroin7ことが示された基底神経細胞の特性は体外で維持され、その高周波刺激 (すなわちtetanization) 海馬における求心性神経のシナプス電位8の長期的な円滑化を誘導します。記録神経活動の電気生理学的体外大幅拡大活動依存的シナプス可塑性9,10至福によって 1973 年に発見されていた細胞のメカニズムの研究ら11 生体内で実験ウサギ。
神経細胞の活動やシグナル伝達経路脳スライスで、特に急性海馬スライスの研究は今標準的なツールです。しかし、驚いたことに、体外実験があるまだ標準化される準備や急性海馬スライスのメンテナンスのために存在する複数のアプローチによっても明らかなようリードら(1988 年)12は、急性脳スライス スライス チャンバーの種類と入浴中、pH、温度、酸素のレベルの選択肢でのメンテナンスの方法論的課題を検討しました。これらのパラメーターは、まだスライス記録のセットアップの in vitroのカスタムメイドの要素のための記録室の制御が困難です。可能性があります問題の克服にいくつかの方法論的課題と説明水没スライス チェンバース、間質性の 3 D microperfusion システム13、強化された層流と酸素室などの新しいタイプの出版物を見つけることができます。14、コンピューター化された温度コントロール15システム、マルチチャンバ記録システム16を供給します。これらの部屋は簡単に構築できないので、ほとんどの科学者は市販のスライスの部屋に依存します。これらの部屋は、こうして電気生理学および蛍光イメージングの17,18,19の組み合わせを可能にする顕微鏡システムにマウントできます。以来、これらの部屋は、人工髄液 (アプライド) に沈んで脳スライスを維持、新薬承認申請の費用を増加緩衝液の流量を維持する必要があります。このため、流出 carbogenation 比較的小さいアプライド ボリュームを使用して浸漬スライス チャンバー内電位長時間記録の十分な安定性を提供するリサイクル灌流システムを組み込みました。さらに、我々 は活動依存的シナプス可塑性10の結果に影響を与えるこの実験的 carbogenation/灌流システムを使用し、どの真核伸長因子 2 キナーゼ (eEF2K) の抑制を調節するシナプスを要約伝送20。
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Protocol
動物は、動物のケアの確立された標準と脳科学研究所と状態キー研究所の医療神経生物学の復旦大学、上海、中国の手順に従って維持されました。
1. ソリューションの準備
注: は、材料の表を参照してください。
- (変更された Gey ソリューション) のスライスのバッファーを準備: 92 mM の NaCl、KCl、1.25 mM NaH2PO4、30 mM NaHCO3、2.5 mM 25 mM グルコース、20 mM HEPES、3 mM Na+-ピルビン酸、10 mM MgSO4、および 0.5 mM CaCl2。
- 7.6 carbogenation なし 1 M NaOH を使用してに pH を調整します。
- 4 ° C でバッファーを保存します。
注: 滴定濁った液体を明らかにします。浸透圧は、305 310 mOsm です。カーボゲン ・21には、5% の二酸化炭素と 95% の酸素が含まれています。 - 希釈原液重炭酸、ブドウ糖が含まれていないアプライドの x 10 の最終組成物を与えることで、アプライドの準備: 124 mM の NaCl、2.5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、2 mM MgCl2、および 1.25 mM KH2PO4。
- 重炭酸塩と 10 mM グルコースと 26 mM NaHCO3に到達するためにグルコースを追加します。
- Carbogenate NaHCO3を追加した直後にブロックされた端と穴あきシリコン チューブを通してアプライド。
- Carbogenating (pH 7.3 7.4) しながら pH を測定します。
注意: バッファー容量は、NaHCO3の量を変えることによって少し調整できます。結果 pH は温度に依存するので動作温度 (例えば、 30 ° C) で carbogenating しながら結果の pH をチェックする必要は。
2. 急性海馬スライスの準備
注: は、材料の表を参照してください。
- 急性脳スライスのインキュベーション室にスライスを保持メッシュを配置、アプライド、28-30 ° C で少なくとも 30 分22 carbogenate (4-6 L/h) とチャンバー
- 2-4 ° c. の下に手術器具をクールします。
- 寒さとバッファー (2-4 ° C)、vibratome の近くの氷/水混合物の維持をスライス carbogenated ガラス ビーカーを置きます。
- ラットやマウスの麻酔まで角膜反射が消える (30-50 s) 500 μ L を勘案し 2 L ガラス瓶または 50 mL のチューブに 12.5 μ L イソフルランを使用します。
- 説明し、マティスらの著書・論文で詳細に可視化法を用いた脳を分離します。(2011 年)23 日宗門ら(2014)24。
- 小脳の解剖と半球を分ける前に (少なくとも 2 分) の冷たいスライス バッファーに 2-4 ° C まで脳を冷やします。
- 図 1Cに示すように腹と海馬の中間部分から横スライスを取得するのに各半球の25の背側縁に沿って 70 ° の角度で背側皮質の部分を解剖するのに冷たい外科ブレードを使用します。E。
- 冷たい歯科用セメントへらで、フィルター ペーパーで簡潔に作成された表面 (1 〜 2 秒) を乾燥する部分に半球を転送します。
- 速効性の接着剤; を使用して冷たいスライス プラットフォームで新鮮なカット面をもつ 2 つの半球をマウントします。半球顔かみそりの刃 (図 1D) の尾の端を持っています。
- スライスのプラットフォームを vibratome の冷却室に置き、スライスのバッファー (2-4 ° C) とその部屋を埋めます。Carbogenate 穴あきシリコン チューブを使用しています。
- 適切な vibratome 設定を使用して 350 μ m のスライス カット (例えば、ブレード前方速度: 1.2 mm/s、ブレード振幅: 1 mm)。
- Subiculum と 2 つの注入カニューレを使用して嗅皮質から海馬を分離 (> 28 G) はさみとして。
- パスツール ピペットを使用して事前に準備された培養室のスライスを保持メッシュから泡を削除します。
- スライス スライスのプラットフォームから地層属三角骨にいくつかの透明性は、インキュベーション室のメッシュに転送します。任意の折りたたみ、ストレッチ、重複、および大きな口パスツール ピペットにアプライドとスライスを吸引によって浮動を回避します。
メモ: 全体の手順 (手順 2.5 2.14) がかかる 5-10 分。したがって、4 ° C で維持するために時間をかけて緩衝液の温度をチェックすることが重要です。 - インキュベーション室に少なくとも 1.5-2 時間 30 ° C でスライスをインキュベートし、4-6 L/h でカーボゲン ・を提供します。
注: は、インキュベーター内のバッファーを循環するが、浮遊からのスライスを防ぐカーボゲン ・流量を調整します。
3. 変更、アプライドの Carbogenation の小さな貯水池のリサイクル
- リサイクル システム (図 2B) の流出に 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。
- カーボゲン ・供給管と 3 ウェイ チューブ コネクタの中間の腕を接続し、エアフロー メーター (図 2Dと図 4C3-4 L/h) と流量を調節します。
- リサイクル システムの流入に 2 番目の 3 ウェイ チューブ コネクタを追加します。中間の腕を貯水池 (低域通過フィルターから流入管インライン ヒーター、薄いシリコン チューブ (10 cm) にアッパー アームとロアアームに直面する管に接続します。図 4C)。
- 薄いシリコン チューブにチューブ絞りを配置 (OD: 2 mm) 蠕動ポンプによって生成されたスライス チャンバーでアプライドの脈動が、最低は管に沿って位置に。
注: 流出-carbogenation (流出-炭水化物) 変更はアプライド貯水池、リサイクル率、アプライドのボリュームに carbogenation レベルの感受性を減らすと小さなアプライド貯水池内に相対的なチューブを配置 (< 50 mL。図 3)。低域通過フィルターに関する薄膜シリコン チューブで空気量削減アプライドの流れの脈動したがって、空気とほとんどチューブを満たす必要があります。
4。水没スライス チャンバー内シナプス応答の記録
注: は、材料の表を参照してください。
- あらかじめ約 28-30 ° c に (これは、気泡の録音室を防止) 水浴のアプライド解決を暖めます。
- リサイクル システム (4-5 mL/分) を開始し、少なくとも 1 時間のためのシステムを平衡にインライン ヒーターをアクティブにします。
- レンズ クリーニング ペーパーと数分 (図 4) 水没スライス チャンバーで U 字白金線に固定ナイロン メッシュの小片を presoak します。
- U 字白金線を削除します。
- リサイクル電源、レンズ クリーニング ペーパーのスライスを配置します。
- すぐにスライスの上にスライスを保持メッシュを配置し、ポンプのスイッチ、目的をくずさず、アプライドに 30 分間平衡スライス。
- アプライドとホウケイ酸塩のマイクロ ピペット (すなわち、記録電極) を記入 (先端抵抗: 1 2 MΩ いっぱいアプライドで 1/3)、ピペット ホルダーにマウントします。
- NaHCO3ソリューションにそれを置くことによって金属刺激電極の絶縁体をチェック (> 40 mM)。DC 電圧のマイナス極に、電極を接続 (1-2 V、肯定的な棒: 銀やプラチナ ワイヤ)、解剖顕微鏡の下で先端に泡の形成を観察して (> 60 倍の倍率)。
- マニピュレーター ホルダー内テスト エポキシ絶縁タングステン刺激電極を置き、スライス チャンバーでワイヤを参照。
- 室に 2 番目参照電極を追加し、記録電極 (図 4A) のパッチアンプ用アダプターの参照のソケットに接続します。
- アンプ コントロール ソフトウェアの「ゼロ ・ クランプ」ボックスをクリックし、「出力ゲイン一覧」ボックスをダブルクリックして進みます。ゲインを選択「100」の"ハイパス フィルター リスト ボックスのダブルクリック (ベッセル)」「0.1 Hz"を選択し、"ローパス フィルター リスト ボックスをダブルクリック (AC)」「3 kHz」を選択するには
- レコーディング ソフトウェアでクリックしてで「取得 |プロトコルを開きます。"エピソードの録音の開始後 10 ms を刺激アイソレータ トリガー設定が自動的に間欠的刺激と 50-100 ms の 10-20 kHz で増幅された電位のデジタル化を可能にするプロトコルを選択します。
- ラインと属地層三角骨、たとえば (図 4および図 5) に平行に刺激と記録電極を配置します。
- クリックして"取得 |プロトコルを編集"し (ポップアップ ウィンドウ) の「トリガー」タブを選択します。トリガ ・ ソースとして「トリガ ・ ソース」ボックスと「スペースバー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。集録を開始し、トリガー ボタンでポップアップ ウィンドウを注意してください「レコード」ボタンをクリックします。
- 刺激アイソレータ ソフトウェアで「電圧制御」ボックスをクリックし、、"0"を入力してください。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。「ソフトウェアを記録」ウィンドウをクリックし、スペース バーを押します。「電圧制御」ボックスの 1 mV ステップには 1 から 8、たとえば、値を入力順にしてこのサイクルを繰り返します。
- FEPSP 勾配値と刺激強度の相関、fEPSP 斜面の 40% の最大値を得るために必要な刺激の強度を決定します。「電圧制御ボックス」をクリックし、、確定値を入力します。「ダウンロード」ボタンををクリックしてします。
メモ: 刺激アイソレータは、脳組織に簡単な電圧または電流パルスを適用する使用されます。二相パルスは、フェーズごとに 100 μ 秒を持つことができます。 - レコーディング ソフトウェアで停止ボタンをクリックし、「獲得」メニューをクリックしてします。「プロトコルを編集」をクリックし、ポップアップ ウィンドウに"トリガー"タブを選択します。トリガ ・ ソースとしてトリガー ソース ボックスと「内部タイマー」を選択をクリックします。「OK」ボタンををクリックしてします。すべて 30 フィールド電位の自動記録を開始レコード ボタンをクリックしてたとえば s。30-60 分後に、"stop"ボタンをクリックします。
- 「取得」メニューをクリックし、「オープンなプロトコル、」をクリックして、シナプス可塑性の誘導が必要なプロトコルを選択し、"OK"ボタンをクリックしますします。高頻度刺激と記録を自動的にアクティブに「レコード」ボタンをクリックします。「停止」ボタンををクリックしてします。
注: シナプス可塑性に関連する調査、場合長期増強や長期ベースライン録音後の長期不況の標準誘導パラダイムの一つを適用します。図 7と図 8にシナプス伝達の変調の代表例を示します。 - レコーディング ソフトウェアでクリックして"取得 |プロトコルを開き」、ステップ 4.12 のように同じプロトコルを選択します。"OK"ボタンをクリックし、「記録」をクリックたとえば、2-4 時間フィールドの潜在的な録音を自動的に実行してください。録音を終了する"stop"ボタンをクリックします。
- 化合物を適用医薬品研究の場合直接、アプライドに貯水池恒久的な化合物の管理がある場合希望 (図 6)。
5. セットアップとヒントをクリーニング
メモ: 以下の一般的なヒントをください。
- 毎週 10% H2O2脱イオン H2o. 洗浄後 20 分以上をリサイクルしてシステムをきれい
注: エタノールはクリーニングのため推奨されません。同様に、参照線と H2O2で目的を浸すことは推奨していません。 - 対物レンズまたは 0.1 N HCl、水とチャンバ周囲の表面に沈殿した塩を削除します。
- 蒸留水または 0.1 N HCl でカーボゲン ・ バブラーを洗います。
- 10% H2O2 5 分でスライス培養室に週に一度を浸すし、脱イオン H2o ・ インキュベーション室を徹底的にリンス
- 金属刺激電極の場合各実験後脱イオン水で刺激電極先端部を洗うし、残留組織を除去し、エタノールに浸した綿球で刺激電極先端部を軽く拭きます。
- サンドペーパーで慎重な強打を先端の断熱材を削除することによって商業金属刺激電極の抵抗を減らします。
- ポリテトラフルオロ エチレン チューブとシリコン チューブを取り付け、チューブをリサイクルしながら、アプライドからカーボゲン ・の損失を減らします。
- 線材表面に塩化銀のフォームに漂白剤で数日間記録電極と参照電極の銀線を維持します。
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Representative Results
プロトコル セクションの男性 c57bl/6 マウスとラット (5-8 週間) の海馬 (図 1) の腹側と中間部分から急性海馬スライスの作製について述べる。スライサー プラットフォーム上半球の位置は、安定を保つのに役立ち、寒天やアガロースと安定化の必要性を削除します。灌流システム自体は液体の必要流量を与えるため高回転で作動、ペリスタルティック ポンプに基づいています。したがって、標準的なチューブ ポンプ内の急速な高齢化は非シリコン系チューブを使用して、乗り越え、相当な問題を作成 (ID: 1.02 mm)。流出の負圧も 2.79 mm の内部の直径を持っている 2 つの並列接続管によって作成されます。これらの 2 つのチューブは、液体 (図 4A) の吸引を許可する録音室でカニューレに接続されます。貯水池のアプライドの carbogenation 率は、小さな細孔を有する換気石やチューブを使用して達成することは困難することができます多くの時間にわたって安定でなければなりません。以来、流出 carbogenation は、小さな毛穴、カーボゲン ・流量安定した当時のままに (図 2) には依存しません。小さなアプライド貯水池と実験、流出 carbogenation は溶存酸素 (図 3) の平衡を達成するために役立ちます。また、酸素レベルが変更された流入/流出管位置、カーボゲン ・ バブル チューブと液体のリサイクル率でアクティブな毛穴の数に基づいて実験間の可変性を最小限に抑えます。
スライスは、レンズ ペーパー (図 4A) の下からいくつかの液体の交換を許可するために配置されます。スライス商工会議所は、40 X 目的が装備されている正立型顕微鏡にマウントできますが、以来よく制御 (図 4Bおよび図 5) 電極の位置がすることができます。これはさらに日常的な作業で実験の変動が減少します。
潜在的な刺激強度の時にフィールドの潜在的なサイズの依存関係は異なる刺激強度 (図 5 で fEPSPs を記録することによって決定する必要がありますフィールドの基準記録に必要な刺激の強度を決定するには).入出力特性の測定は、刺激強度は高いでスライスにいくつかのストレスを作成します。したがって、別のアプローチはちょうど fEPSP 崩壊 (図 5の黒矢印)26に肯定的な人口スパイク コンポーネントを呼び起こす刺激強度を検索します。
少なくとも 30 分安定したベースラインを記録した後薬物管理を開始できます。EEF2K 阻害剤のシナプス伝達に及ぼす影響の例を紹介します。EEF2K の阻害は、シナプス伝達 (図 6A)、p38 MAPK (図 6B)20の抑制によって減衰した効果を促進します。
活動依存的シナプス可塑性は、さまざまな刺激パラダイム10によることができます。ここでは、100 hz 刺激の連続で、1 Hz 以上 15 分で繰り返される刺激に基づいているシナプスの可塑性の代表的な実験を提案しました。シナプス伝達の変調は、図 7と図 8に描かれています。さらに、ことを示す図 7と図 8に LTP を流出 carbogenation (白い円、図 3の 24 40 分で相対的な酸素レベル) によって小さなバッファー タンクの酸素レベルの安定化に改善(灰色の円、酸素レベル 7-24 分) 貯水池-carbogenation のみの実験と比較して株式会社の誘導。我々 は低いと簡単カーボゲン ・使用に実験システムを作成するのに興味を持っていたので流出 carbogenation と貯水池 carbogenation (7-24 分) の組み合わせはテストしませんでした。ない貯水池 carbogenation アプライド貯留層における酸素のベースライン レベルを表します (まで 7 分) をリサイクルします。
図 1:、Vibratome を使用して海馬の横スライスを取得する脳半球を配置します。(A) 海馬は再建されたマウス脳モデル内に、緑色で、右の脳半球の側面図で示されます。(B) A は海馬体の腹側ビュー。(C) 吻側尾側のビューは、水平面で右半球の海馬体の腹側と中間部分のセクションを示しています。32、異なる切削角度はの背側の海馬の横スライスに必要な海馬の septotemporal 軸に沿ってさまざまな地域を持っている神経支配と機能31,の程度が異なるので例を示します。スケール バー = 3 mm (横の白い線)。(D) 写真は、vibratome のプラットフォーム上で接着ラット脳の半球を示しています。スケール バー = 6 mm。 (E) スケッチ (黒の点線) で区切られた右半球の脳スライスのプラットフォームで作成されたサーフェス上に接着する回転 (赤矢印) 皮質 (上部スキーマ) の背側縁をトリミングの角度を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 50 mL 以下アプライド貯留のための carbogenation システムの要素。カーボゲン ・ バブル デバイスとして (a) 穴あき管を使用して (A) 標準的な carbogenation システム250 μ m 径のステンレス ワイヤと複数の刺し傷によって穿孔チューブ。(B) 3 ウェイ チューブ コネクタ (B) 流出 carbogenation (内径: 2 mm) または疎水性フィルターと液体の逆流を防ぐ通気孔 (C) 単位。3 ウェイ チューブ コネクタの中間の腕が圧力計後カーボゲン ・ タンクに接続されている (ガス圧力: < 1 atm)、流量計。残りの武器は、アプライド流出管に接続されています。(D)、カーボゲン ・流量は流量計によって制御されます。28-30 ° C で、実験中にアプライド貯水池が保持されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:異なる条件下でアプライドの 40 mL の酸素レベル。貯水池 carbogenation 中に酸素レベル (研-炭水化物。) 絶えず減少アプライド リサイクル (灰色で塗りつぶされた円形、n = 3)。しかし、流出 carbogenation (流出-炭水化物。) アプライドの中にリサイクル基準レベルで平衡に達した酸素レベルの低下を低減 (白で塗りつぶされた円、n = 3)。研炭水化物のベースライン レベルを調べた。なしアプライド リサイクル。垂直方向の点線の灰色の線は、異なる carbogenation プロトコルへの切り替えを示します。(7-24 分) をリサイクル研究炭水化物と炭水化物流出の効果。LTP と LTD の誘導 (白い円、24-40 分) をリサイクル図 7と図 8に示します。データは、平均 ± SEM. として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 流出-carbogenation 水没スライス室の実験のためのコンポーネントです。(A) 水没スライス チャンバーのプレゼンテーション。海馬スライスを保持しているナイロン繊維で U 字白金線が描かれています。銀線シルバーワイヤー エンディングの領域を拡大するコイルを作成する小さなカニューレ包まれていました。刺激の参照線が流出室に置かれていたし、記録参照が主室にあった。さまざまな液体レベルで安定している、記録参照線バッファーにさらされるワイヤーの「水中」の部分だけを残して、プラスチック製のチューブで絶縁することができる潜在的な参照電極を保。(B) 明視野像は、代表的な急性海馬スライスと電極を示しています。CA1、CA3: コルニュ Ammonis 1、3;総局: 海馬歯状回;サブ: subiculum;EC: 内嗅野。(C) 回路図は、カーボゲン ・と蠕動ポンプ流量計の指示なしに、流出-carbogenation の主要なコンポーネントを強調表示します。ローパス フィルターは、アプライドの流れの脈動を減らすためにインライン ヒーターの前にだけ配置できます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: 刺激強度と電極の位置フィールドのポテンシャル形状の依存関係します。(A) 地層属三角骨 (str. pyr.) と刺激の強さから異なる距離に誘発電位が描かれているフィールドの代表的な例です。水平の黒い矢印は、フィールドの潜在的な崩壊で人口の急増の肯定的なソース コンポーネントを示します。人口の急増の肯定的なソース コンポーネントは、細胞体層 (e) に非常に近い 1 つを除いて、初期 fEPSP 上昇フェーズ テストしたすべての「ライン」電極位置の中央に約残った。人口の急増の肯定的なソースの位置 (B) の成分は刺激と記録電極のミスアラインメントによる大幅変化。Lac。: 地層 lacunosum moleculare;放射線管理: 地層結腸寄生虫;Pyr。: 地層属三角骨;録音:: 記録電極;スティミュラス。: 刺激電極。スケールバー = 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 流出-carbogenation の小さなアプライド貯留層20のリサイクルを用いた海馬シナプス伝達に及ぼす eEF2K 阻害剤の代表的な例.20 分間 1 分間隔で fEPSPs を記録した後 eEF2K 阻害剤 A-484954 はアプライド貯水池 (水平線) に直接追加しました。シナプス伝達の急激な増加は、検出 (白で塗りつぶされた円) でした。薬が適用されなかった場合、記録 (灰色で塗りつぶされた円形) の時間をかけて fEPSP 斜面が安定していた。P38 MAPK の阻害剤 (灰色の水平線) の (B) アプリケーションは、eEF2K inhibito を誘発電位の強化を防ぐ。データは、平均 ± SEM. として表示されますこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7:代表の録音活動依存した流出 carbogenation, シナプス伝達の増強 (流出-炭水化物; 白い円) と貯水池 carbogenation (研-炭水化物。; 黒丸)、小さなアプライドのリサイクル。貯水池。時間ポイント 0 で 3 倍の 100 Hz/s 列車後増強が誘導された (テト。: tetanization、高頻度刺激)。データは、平均 ± SEM. ラケットとして表示されます: グループ時間ポイントごとの統計的な比較対になっていない T 検定、一貫性のある標準偏差を仮定しません。* p < 0.05。この図の拡大版を表示するのには、ここをクリックしてください。
図 8: 活動依存的シナプス伝達刺激強度と carbogenation のうつ病の依存関係します。(A) 貯水池 carbogenation を使用して (研-炭水化物。) アプライド大ボリュームのリサイクル、最大 fEPSP 斜面の 80% で 15 分の 1 Hz の刺激はシナプス伝達 (白丸) の強いうつ病を誘発します。ただし、代表 fEPSP トレース (黒い跡) の前に、(110回分で赤いトレース) 株式会社誘導を示す後、シナプス前繊維ボレー (垂直黒矢印) が大幅に削減。これは、刺激電極の電気化学的プロセスは、会社関連のメカニズムに部分的に頼らないうつ病を引き起こす、求心性神経に害を及ぼす可能性を示す例です。FEPSP 勾配の最大値の 50% に刺激強度を減らすより低い程度にシナプス伝達のうつ病が変更せずシナプス前繊維ボレー (灰色で塗りつぶされた円形)。(B) 株式会社誘導した貯水池 carbogenation による実験で fEPSP 斜面の永続的なうつ病や小さなアプライド貯水池のリサイクルを引き起こさない (研-炭水化物。; 灰色で満たされた正方形)。(C) 流出 carbogenation 小さなアプライド貯水池のリサイクルは、株式会社の誘導の結果を向上します。挿入を提示 (黒トレース) 前に、代表 fEPSPs 前後 (110回分、赤のトレース) 株式会社誘導。代表的な fEPSPs の垂直方向のスケール バーを示す 1 mV とデータ 1、2 ヶ月前の C57/BL 6 マウスの急性海馬スライス (350 μ m) から得られたし、平均 ± SEM. かっことして表示されます 2 さんに対応している水平方向のスケール バー: グループ時間ポイントごとの統計的な比較対になっていない T 検定、一貫性のある標準偏差を仮定しません。* p < 0.05、ns: 有意ではないです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
インターフェイス スライス室より堅牢なシナプス応答25,26,27,28の展示物、水没室提供パッチ ・ クランプ記録および蛍光追加の利便性イメージング。したがって、我々 はフィールド ニューロン17,18、蛍光プローブのイメージングに簡単に拡張することができます商業水没スライス チャンバーを用いた急性海馬スライスにおける潜在的な録音のいくつかの側面を説明しました。 19。スライスの準備25以外にも多くの時間後録音室で一定カーボゲン ・ レベルのメンテナンス、障害の 1 つを表します。カーボゲン ・ レベルはアプライド貯水池の初期の飽和によって制御可能なだけなので、アプライドの酸素レベルの違いが日常の実験で簡単に得られます。したがって、酸素計お勧めトラブルシューティングをスピードアップし、少なくとも 28 mg/L に到達する条件 (例えば温度、カーボゲン ・流量、carbogenation ツール、およびアプライド リサイクル率) を調整して安定のアプライド貯留層中の酸素レベル。また、新薬承認申請のアプライド コンテナーのサイズを変更する一般的な方法は、カーボゲン ・ レベルの違いによる電位に及ぼす影響を引き起こすことができます。
リサイクル バッファー少量の流出 carbogenation の使用は、シナプス可塑性の実験の結果を向上します。改善された液体中の酸素の溶解液体の接触面積とカーボゲン ・大きな割合に基づいています。また、流出 carbogenation アプライド貯水池カーボゲン ・枯渇アプライドの供給が減少します。商品の29の原理に基づいて特別に設計されたベンチュリーによって、carbogenation の安定性をさらに改善可能性があります。
スライスの最良の準備および設定条件、それはしばしば避けられない絶縁金属刺激電極を使用する場合に誘発されることはできませんフィールド電位。多くの場合、理由は、曲げやクリーニングのため断熱材が損傷していることです。我々 は方法で示されている、シンプルなアプローチは、低電圧で気泡をチェックすることです。さらに、この手順は先端をきれいにして刺激電極のインピー ダンスを減らすために役立ちます。刺激のためガラス ピペットの使用は共通で、繊維刺激の狭いフィールドを提供することの利点。多くの場合、ガラス ピペット刺激が使用される場合、最大 fEPSP の斜面を見つけること不可能しますです。刺激強度23を調整する fEPSP 減衰期の人口の急増の肯定的なソース コンポーネントの外観を使用しています。
活動依存的シナプス可塑性の誘導に関する文書をことがあります、応用誘導プロトコルに依存して異なるシグナル伝達経路の関与は10です。しかし、方法論的視点から、高頻度刺激シナプス可塑性の成功誘導を防ぐことができる個別の成果物があります。100 Hz/1 の刺激を反復刺激電極の電気化学的反応30、(例については図 8を参照) 求心性神経損傷によるシナプス伝達のうつ病の結果分極が生じる可能性があります。電気化学プロセスを最小限に抑える、相性刺激パルス刺激力 2 V 以上のベースラインの録音用が推奨されます。
要約すると、流出 carbogenation は薬物実験のコスト効率を高め、小さいバッファーの貯留層の循環依存の実験で酸素レベルを安定させるのに役立ちます。
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Disclosures
著者らは、調査した潜在的な利益相反として解釈される可能性が商業や金融関係の不在を宣言します。
Acknowledgments
大戦実施、分析し実験を設計し、原稿を書いていた。D.X. と C.P. 図の準備を支援し、実験を行なった。この作品は、NSFC (31320103906) によって支えられたおよび結核 111 プロジェクト (B16013)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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