Summary
Denne protokollen beskriver stabilisering av oksygennivået i en liten mengde resirkulert buffer og metodologiske aspekter ved opptak aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet i neddykket akutt hippocampus skiver.
Abstract
Selv om eksperimenter på hjernen stykker har vært i bruk siden 1951, fortsatt problemer som reduserer sannsynligheten for å oppnå en stabil og vellykket analyse av synaptic overføring modulering når potensielle eller intracellulær andre. Dette manuskriptet beskriver metodiske aspekter som kan være nyttig i å forbedre eksperimentelle forhold for vedlikehold av akutt hjernen skiver og opptak feltet eksitatoriske postsynaptic potensialer i en kommersielt tilgjengelig neddykking kammer med en strøm-carbogenation enhet. Strøm-carbogenation bidrar til å stabilisere oksygennivået eksperimenter som bruker resirkulering av en liten buffer reservoaret for å forbedre kostnadseffektiviteten av stoffet eksperimenter. I tillegg presenterer manuskriptet representant eksperimenter undersøke effekten av ulike carbogenation moduser og stimulering paradigmer på aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet av synaptic overføring.
Introduction
I 1951 ble første rapporterte akutte hjernen stykke eksperimenter utført1. I 1971, etter vellykket i vitro opptak fra piriform cortex2,3 og funnet at hippocampus neurons er sammenvevd tvers langs septotemporal akse hippocampus4, en av de første i vitro opptak av hippocampus neuronal aktivitet var oppnådd5. Likheten av parameterne nevrofysiologiske eller neurostructural av neurons under i vivo og i vitro forhold er fortsatt gjenstand for noen debatt6, men i 1975, Schwartzkroin7 indikerte at de basale egenskaper av neurons opprettholdes i vitro og den høyfrekvente stimulering (dvs. tetanization) afferente i hippocampus formasjonen induserer en langvarig tilrettelegging av synaptic potensialer8. Elektrofysiologiske opptak av neuronal aktivitet i vitro kraftig utvidet studiet av cellulære mekanismer for aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet9,10, som hadde blitt oppdaget i 1973 av Bliss et al. 11 i vivo eksperimenter med kaniner.
Studiet av neuronal aktivitet eller signalnettverk trasé i hjernen skiver, og særlig i akutt hippocampus skiver, er nå et standardverktøy. Men overraskende, har i vitro eksperimenter ennå å bli standardisert, som dokumentert av flere tilnærminger som fortsatt eksisterer og vedlikehold av akutt hippocampus skiver. Reid et al. (1988) 12 gjennomgått metodiske utfordringer for vedlikehold av akutt hjernen sektorer i ulike typer skive kamre og valg av bading medium, pH, temperatur og oksygen nivå. Disse parametrene er fortsatt vanskelig å kontrollere i innspillingen kammer på grunn av skreddersydde elementer av i vitro skive-opptak oppsett. Publikasjoner kan bli funnet som kan bidra til å overvinne noen metodiske utfordringer og som beskriver nye typer neddykking skive chambers, som en interstitiell 3D microperfusion system13, et kammer med forbedret laminær strømning og oksygen Angi14, et system med datastyrt temperatur kontroll15og en multi kammer innspilling system16. Siden disse rommene ikke er lett å bygge, stole de fleste forskere på kommersielt tilgjengelig skive kamre. Disse rommene kan monteres på et mikroskop system, slik at for kombinasjonen av electrophysiology og fluorescens imaging17,18,19. Siden disse rommene holde hjernen skiver neddykket i kunstig cerebrospinalvæske (aCSF), må en høy flow rate i buffer løsning opprettholdes, øke bekostning av medikament programmet. Dette har vi innarbeidet en resirkulering perfusjon system med strøm-carbogenation som gir tilstrekkelig stabilitet for langsiktig opptak av feltet potensialer i en neddykking skive kammer med et relativt lite aCSF volum. I tillegg oppsummert vi hvordan bruk av eksperimentell carbogenation/perfusjon systemet påvirker resultatet av aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet10 og hvordan hemming av eukaryote forlengelse faktor-2 kinase (eEF2K) modulerer synaptic overføring20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyrene ble opprettholdt i samsvar med etablerte standarder for dyr omsorg og prosedyrer institutter for hjernen vitenskap og State nøkkel laboratorium av medisinsk nevrobiologi av Fudan University, Shanghai, Kina.
1. løsning forberedelse
Merk: Se tabell av materialer.
- Forberede kutting bufferen (endret Gey løsning): 92 mM NaCl, 2,5 KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glukose, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvate, 10 mM MgSO4og 0,5 mM CaCl2.
- Justere pH til 7,6 med 1 M NaOH uten carbogenation.
- Lagre bufferen på 4 ° C.
Merk: Serine tydeliggjør skyet væske. Osmolality er 305-310 mOsm. Carbogen21 inneholder 5% karbondioksid og 95% oksygen. - Forberede aCSF fortynne en 10 x lager løsning av aCSF som ikke inneholder bikarbonat og glukose, gir et siste sammensetning: 124 mM NaCl, 2,5 KCl, 2,5 CaCl2, 2 mM MgCl2og 1,25 mM KH2PO4.
- Legg bikarbonat og glukose nå 10 mM glukose og 26 mM NaHCO3.
- Carbogenate aCSF gjennom et perforert silikon rør med en blokkert end umiddelbart etter NaHCO3.
- Måle pH mens carbogenating (pH 7.3-7.4).
Merk: Bufferen kapasiteten kan justeres litt ved å endre mengden NaHCO3. Siden den resulterende pH er temperaturen-avhengige, er det nødvendig å kontrollere resulterende pH mens carbogenating ved fungerer temperatur (f.eks 30 ° C).
2. forberedelse av akutt hippocampus skiver
Merk: Se tabell av materialer.
- Plasser et stykke holder nett i en inkubasjon kammer for akutt hjernen skiver, fylle kammeret med aCSF og carbogenate (4-6 L/h) for minst 30 min22 på 28-30 ° C.
- Avkjøle de kirurgiske instrumentene til 2-4 ° C.
- Sett et glass beaker fylt med kaldt og carbogenated kutting buffer (2-4 ° C), vedlikeholdes i en is/vann-blanding, i nærheten av vibratome.
- Bedøve rotter eller mus til hornhinnen reflekser forsvinner (30-50 s) med isoflurane ved å ta 500 µL i en 2 L glasskanne eller 12.5 µL i en 50 mL tube.
- Isolere hjernen med en metode beskrevet og visualisert i detalj i publikasjoner av Mathis et al. (2011) 23 og Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Kjøl ned hjernen til 2-4 ° C i en iskaldt slicing buffer (i minst 2 minutter) før dissekere lillehjernen og skille halvkuler.
- Bruk en kald kirurgisk blad for å analysere et stykke dorsal cortex i 70° vinkel langs dorsal hver halvkule25 få tverrgående skiver fra ventrale og mellomliggende del av hippocampus, som vist i figur 1C og E.
- Med en kald dental sement slikkepott, overføre en halvkule til filter papir kort tørke opprettet overflaten (1-2 s).
- Monter de to halvdelene med fersk kuttet overflater på iskaldt slicing plattformen ved hjelp av hurtigvirkende selvklebende lim; har caudal slutten av halvkuler ansiktet barberblad (figur 1D).
- Plasser kutting plattformen i kjøling kammeret av en vibratome og fylle på at kammer med kutting bufferen (2-4 ° C). Carbogenate med en perforert silikon rør.
- Skiver 350 µm med tilstrekkelig vibratome innstillinger (f.eks blad forover: 1,2 mm/s, blad amplituden: 1 mm).
- Isolere hippocampus dannelsen av subiculum og entorhinal halvdelene bruker to injeksjon cannulas (> 28 G) som saks.
- Fjern bobler fra skive-holder mesh av tidligere forberedt inkubasjon kammer med en Pasteur pipette.
- Overføre skiver som har noen gjennomsiktighet på stratum pyramidale fra slicing plattformen på nettet av inkubasjon chamber. Unngå alle folding, stretching, overlappende og flytende av aspirating aCSF og skive inn en stor munn Pasteur pipette.
Merk: Hele prosedyren (trinn 2.5-2.14) kan ta 5-10 min; Derfor er det viktig å sjekke temperaturen i buffer løsning over tid for å opprettholde den på 4 ° C. - Inkuber skiver på 30 ° C i minst 1,5-2 h i inkubasjon kammeret og gir carbogen på 4-6 L/h.
Merk: Justere flyt for carbogen å sirkulere bufferen i inkubator, men hindre skiver fra flytende.
3. endringer av Carbogenation for aCSF gjenvinning av små reservoarer
- Legge til en 3-veis tube kobling strøm av resirkulering systemet (figur 2B).
- Koble midten armen av 3-veis tube kontakten med en carbogen levering tube og regulere flyt med en luftstrøm meter (3-4 L/h, figur 2D og Figur 4C).
- Legge til en ny 3-veis tube kobling tilsig av resirkulering. Koble midten armen til røret mot inline ovnen, overarmen slik tynn silikon (10 cm lengde) og den nederste arm til tilsig røret fra reservoaret (low pass-filteret; Figur 4 C).
- Plasser en tube squeezer på en tynn silikon tube (OD: 2 mm) et sted langs røret der pulsering av aCSF i skive kammeret, generert av peristaltiske pumpen, er minst sitt.
Merk: Strøm-carbogenation (strøm-carb.) endringen reduserer følsomheten til hvilket carbogenation volumet av aCSF reservoaret, aCSF gjenvinning fall og relativ tube posisjoner innen små aCSF reservoarer (< 50 mL; Figur 3). Om low pass-filteret reduserer en viss mengde luft i tynn silikon røret pulsering av aCSF; Dermed skal røret fylles med luft.
4.Innspillingen Synaptic svar i en neddykking skive kammer
Merk: Se tabell av materialer.
- Forvarm aCSF løsningen i et vannbad til ca 28-30 ° C (Dette forhindrer boble dannes i innspillingen chamber).
- Starte resirkulering systemet (4-5 mL/min) og aktivere innebygd ovnen for å equilibrate systemet for minst 1 time.
- Presoak et lite stykke linsen papir og en nylon maske løst på en U-formet platina wire neddykking skive kammeret i noen minutter (Figur 4).
- Fjerne U-formet platina ledningen.
- Slå av resirkulering og Plasser et stykke på linsen renser.
- Umiddelbart plassere skive-holder mesh på sektoren, slå på pumpen, og la skive equilibrate i 30 min uten dipping målet i aCSF.
- Fyll borosilicate brønnene (dvs. opptak elektroden) med aCSF (tips motstand: 1-2 MΩ, fylt 1/3 med aCSF) og montere den inn i pipette holderen.
- Når isolering av metall stimulering elektroden ved å plassere den i NaHCO3 løsning (> 40 mM). Koble elektroden til den negative Polen på en DC spenning generator (1-2 V, positive Polen: sølv eller platinum wire), og observere dannelsen av bobler på spissen under disseksjon mikroskop (> 60 x forstørrelse).
- Plasser testet epoxy-isolert wolfram stimulering elektrode i manipulator holderen og referansen ledninger i skive kammeret.
- Legge til en andre referanse elektrode til kammeret, og koble den til referanse-kontakten på headstage på opptak elektroden (Figur 4A).
- Klikk boksen "null klemme-modus" i forsterker Kontrollprogramvaren, og gå videre ved å dobbeltklikke boksen "output få listen". Velg en gevinst på "100" Dobbeltklikk "høye pass filterlisten (Bessel)," Velg "0,1 Hz", og dobbeltklikk "low-pass filterlisten (AC)" for å velge "3 kHz."
- I innspillingen programvare, klikker du på "Hent | Åpne protokollen." Velg en protokoll som har innstillinger slik at for episodisk stimulations og digitalisering av forsterket potensial på 10-20 kHz for 50-100 ms og som utløser automatisk en stimulans isolator 10 ms etter starten av en episodisk opptak.
- Plass stimulering og opptak elektrodene i linjen og parallelt med den stratum pyramidale, for eksempel (Figur 4B og figur 5).
- Klikk "erverve | Rediger protokoll", og velg kategorien"trigger"(i popup-vinduet). Klikk på "utløse kilde" boksen og velg "space bar" som utløser kilde. Klikk på "OK"-knappen. Klikk "record" for å starte oppkjøpet og Merk popup-vinduet med en utløser knapp.
- Klikk boksen "spenning kontroll" i stimulans isolator programvaren, og angi "0." Klikk på "Last ned"-knappen. Klikk på "opptak programvare" vinduet og trykker på mellomromstasten. Gjenta denne syklusen av sekvensielt inn verdier fra 1 til 8, for eksempel 1 mV skritt i boksen "spenning kontroll".
- Relatere stimulering styrke med fEPSP-slope-verdier, og bestemme stimulering styrken kreves for å få 40% av fEPSP-skråningen maksimalt. Klikk "spenning kontrollboksen" og angi bestemmes verdien. Klikk på "Last ned"-knappen.
Merk: En stimulans isolator brukes til å bruke korte spenning eller nåværende pulser på hjernevev. Bifasisk pulser kan ha 100 µs per fase. - I innspillingen programvare, klikker du stopp-knappen og deretter på "Hent"-menyen. Klikk på "Rediger protokoll" og velg "utløser"-fanen i popup-vinduet. Klikk utløser kilde-boksen og velge "tidtaker" som utløser kilde. Klikk på "OK"-knappen. Klikk på opptaksknappen som starter automatisk opptak av feltet potensialer hver 30 s, for eksempel. Klikk på "stop" knappen etter 30-60 minutter.
- Klikk på "Kjøpe"-menyen, klikk på "Åpne Protocol" Velg ønsket induksjon protokollen for synaptiske plastisitet, og klikk "OK"-knappen. Klikk "record" for å automatisk aktivere høyfrekvente stimulering og opptak. Klikk på "stop" knappen.
Merk: Ved studier knyttet til synaptiske plastisitet, bruke en av standard induksjon paradigmene for langsiktig potensiering eller langsiktig depresjon etter langvarig planlagte opptak. Eksemplene resulterende modulering av synaptic overføring er avbildet i figur 7 og Figur 8. - Innspillingen programvare, klikk "Hent | Åpne protokollen"og velg den samme protokollen som i trinn 4,12. Klikk "OK" og deretter "record". Holde automatisk kjøre feltet potensielle opptak 2-4 h, for eksempel. Klikk på "stop"-knappen for å avslutte opptaket.
- Ved farmasøytiske studier, bruke sammensatte direkte til aCSF reservoaret hvis permanent sammensatte administrasjonen ønsket (figur 6).
5. rengjøring oppsett og tips
Merk: Se nedenfor for generelle tips.
- Rense systemet ukentlig ved gjenvinning 10% H2O2 for mer enn 20 min, etterfulgt av vask med deionisert H2O.
Merk: Etanol anbefales ikke for rengjøring. Det er likeledes ikke anbefalt å fordype referanse ledningene og målet i H2O2. - Fjerne utfelt salt på overflaten av linsen eller kammer omgivelser med 0,1 N HCl og vann.
- Vask carbogen bubbler i destillert vann eller 0,1 N HCl.
- Fordype skive inkubasjon kammeret i 10% H2O2 for 5 min en gang i uken og deretter grundig skylling inkubasjon kammeret med deionisert H2O.
- Ved metall stimulering elektroder, skyll stimulerende elektrode spissen med deionisert vann etter hvert eksperiment og tørk forsiktig av den stimulerende elektrode spissen med en bomull ball fuktet med etanol å fjerne gjenværende vev.
- Redusere holdbarheten av kommersielle metall stimulering elektroder ved å fjerne isolasjon på spissen gjennom en forsiktig sveip med sandpapir.
- Redusere tapet av carbogen fra aCSF mens resirkulering gjennom rørene ved å erstatte silisium rør med polytetrafluoroethylene rør.
- Holde sølvtråder opptak elektrode og referanse elektrode i blekemiddel i flere dager til skjemaet AgCl wire overflaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I delen protokollen beskrev vi utarbeidelse av akutt hippocampus skiver fra ventrale og mellomliggende del av hippocampus dannelse (figur 1) mannlige C57BL/6 mus og Wistar hannrotter (5-8 uker). Plasseringen av halvkulene på slicer plattformen hjelper for å holde dem stabile og fjerner behovet for stabilisering agar eller agarose. Selve perfusjon systemet er basert på en peristaltiske pumpen drives på høy rotasjon å gi nødvendig flow rate av væsken. Således, rask aldring av standard rør i pumpen skapt et betydelig problem som vi overvant ved hjelp av ikke-silisium rør (ID: 1.02 mm). Den negative trykket for strøm er også laget av to parallelle-tilkoblet rør som har en diameter på 2.79 mm. Disse to rør er koblet til en kanyle i innspillingen kammer å tillate aspirasjon av væske (Figur 4A). Carbogenation antall aCSF i reservoaret må være stabile over mange timer, som kan være vanskelig å oppnå med ventilasjon steiner eller rør med små porer. Siden strøm-carbogenation ikke stole på små porer, carbogen flow rate over tid er fortsatt stabil (figur 2). Hvis forsøkene er utført med en liten aCSF reservoaret, bidrar strøm-carbogenation til å oppnå en likevekt av oppløst oksygen (Figur 3). I tillegg reduserer variasjon av oksygennivået mellom forsøkene basert på et endret tilsig/utløp posisjon, antall aktive porene på carbogen boble rør og flytende resirkulering satsen.
Stykket er plassert på linsen papir å tillate noen flytende utveksling nedenfra (Figur 4A). Siden skive kammeret kan monteres på en oppreist mikroskop som er utstyrt med en 40 X målsetting, kan plasseringen av elektrodene være godt kontrollert (Figur 4B og figur 5). Dette reduserer ytterligere variasjon av eksperimenter i daglige arbeid.
Å bestemme stimulering styrken kreves for planlagte opptak av feltet potensial, avhengighet av potensielle feltstørrelsen ved stimulering styrken må avgjøres ved fEPSPs på ulike stimulering styrke (figur 5 ). Måling av inndata-utdata karakteristisk skaper noen stress på stykket på høyere stimulering styrke. Således, en annen tilnærming er å søke etter en stimulering styrke som bare fremkaller en positiv befolkningen spike komponent i fEPSP-decay (svart piler i figur 5)26.
Etter innspillingen en stabil baseline for minst 30 min, kan drug administrasjonen begynne. Her presentert vi et eksempel på effektene av en eEF2K hemmer på synaptic overføring. Hemming av eEF2K fremmer synaptic overføring (figur 6en), en effekt som ble oppveid av hemming av p38 MAPK (figur 6B)20.
Aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet kan bli overtalt av en rekke stimulering paradigmer10. Her presentert vi representant eksperimenter av synaptiske plastisitet som er basert på en kontinuerlig sekvens av stimuli på 100 Hz og gjentatte stimulations ved 1 Hz over 15 min. Resulterende modulering av synaptic overføringen har blitt avbildet i figur 7 og Figur 8. Dessuten, er det vist i figur 7 og Figur 8 at stabilisering av oksygennivået liten buffer reservoarer av strøm-carbogenation (hvite sirkler, relativ oksygennivået 24-40 minutter i Figur 3) forbedret the LTP og LTD induksjon i forhold til eksperimenter med reservoaret-carbogenation bare (grå sirkler, oksygennivå 7-24 minutter). Vi teste ikke kombinasjonen av strøm-carbogenation og reservoaret-carbogenation (7-24 min) fordi vi var interessert i å skape en eksperimentell system med lavere og enklere carbogen bruk. Reservoaret-carbogenation uten resirkulering (opptil 7 min) representerer grunnlinjen nivå av oksygen i aCSF reservoaret.
Figur 1: Plassering hjernen halvkuler for å få tverrgående skiver av hippocampus ved hjelp av en vibratome. (A) hippocampus dannelsen angis i en lateral visning av den høyre hjernehalvdelen, i grønt, innenfor en rekonstruert mus hjernen modell. (B) en opprydning av hippocampus formasjonen. (C) rostral til caudal visningen viser en del av et ventrale mellomliggende delen av hippocampus formasjonen for den høyre hjernehalvdelen på det horisontale planet. Siden regioner langs septotemporal akse hippocampus har forskjellig gir og funksjon31,kreves32, en annen cutting vinkel for tverrgående skiver av dorsal hippocampus, for eksempel. Skala bar = 3 mm (horisontale hvite linjer). (D) bildet viser halvkulene av rotte hjernen limt på en vibratome plattform. Skala bar = 6 mm. (E) skissen viser vinkelen for trimming rygg kanten av cortex (øvre skjematisk) atskilt høyre halvkule (prikket svart linje) og rotasjon (rød pil) lime hjernen på opprettet overflaten på slicing plattformen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Elementer av det carbogenation systemet for aCSF reservoarer under 50 mL. (A) Standard carbogenation systemer med (a) perforerte rørene som en carbogen boble enhet. et rør ble perforert ved flere punkteringer med en 250 µm-diameter rustfritt stål wire. (B) strøm-carbogenation med (b) en 3-veis tube-kontakt (indre diameter: 2 mm) eller (C) en ventil som hindrer flytende tilbake flyt med en hydrofobe filter.Midtre armen av 3-veis tube kontakten er koblet til en carbogen tank etter en manometer (gass Press: < 1 atm) og en flyt meter. Gjenværende armene er koblet innen aCSF utløp røret. (D) i carbogen strømningshastighet styres av Strømningsmålere. Under forsøkene, er aCSF reservoarene holdt på 28-30 ° C. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Oksygen i 40 mL av aCSF på ulike forhold. Oksygennivået under reservoaret-carbogenation (res.-carb.) og aCSF gjenvinning redusert stadig (grå-fylte sirkler, n = 3). Imidlertid strøm-carbogenation (strøm-carb.) under aCSF gjenvinning redusert dråpe oksygennivået, som nådde likevekt på baseline nivåer (hvit-fylte sirkler, n = 3). Baseline nivåer ble målt med disponible-carb. uten aCSF resirkulering. Den vertikale stiplede grå linjer angir bryteren til forskjellige carbogenation protokoller. Effekten av res.-carb resirkulering (7-24 min) og strøm-carb. resirkulering (hvite sirkler, 24-40 min) på induksjon av LTP og LTD er avbildet i figur 7 og Figur 8. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Komponenter i ut-carbogenation for eksperimenter i en neddykking skive kammer. (A) presentasjon av neddykking skive kammeret. U-formet platina ledningen med nylon fibrene holder en hippocampus skive er avbildet. Sølv ledningene var pakket rundt en liten kanyle, lage en coil for å øke området av sølv wire slutt. Stimulering referanse ledningen ble plassert i utløp chamber, og opptak referansen var i main chamber. Å holde referanse elektroden potensielle stabilt på ulike flytende nivåer, innspillingen referanse ledningen kan være isolert av et plastrør, forlater bare "undervannskamera" delen av ledningen utsatt for bufferen. (B) lyse-feltet bildet viser en representant akutt hippocampus skive og elektrodene. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: dentate gyrus; sub: subiculum; EC: entorhinal cortex. (C) skjematiske høydepunkter de viktigste komponentene i ut-carbogenation, uten en indikasjon på Strømningsmålere for carbogen og peristaltiske pumpen. En low pass-filteret kan plasseres rett foran inline ovnen å redusere pulsering av aCSF. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Avhengighet av feltet potensielle figuren ved stimulering styrke og plasseringen av elektrodene. (A) Representative eksempler på feltet potensialene, utløste i ulik avstand fra stratum pyramidale (str. pyr.) og stimulering styrkene er avbildet. De vannrette svart pilene indikerer positiv komponenten av befolkningen topp i feltet potensielle forfall. Positiv komponenten av befolkningen innsamlingslageret forble omtrent i midten av de første fEPSP-stige fase hele testet "in-line" elektrode stillingene, foruten den nær celle kroppen laget (e). (B) plasseringen av positiv kilden del av befolkningen innsamlingslageret varierte sterkt på grunn av opp feiljusteringer i stimulering og opptak elektrodene. Lac.: stratum lacunosum moleculare; Rad.: stratum radiatum; Pyr.: stratum pyramidale; Poster: opptak elektrode; Stim.: stimulering elektroden. Skala bar = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Representativt eksempel på effektene av en eEF2K hemmer på hippocampus synaptic overføring ved hjelp av strøm-carbogenation, med resirkulering av en liten aCSF reservoaret20 . Etter innspillingen fEPSPs på 1 minutt intervaller for 20 min, lagt den eEF2K inhibitor A-484954 direkte til aCSF reservoaret (vannrette linjen). En rask økning av synaptic overføringen var synlig (fylt med hvite sirkler). Hvis stoffet ikke ble brukt, stabilt fEPSP-skråningen over for innspillingen (grå-fylte sirkler). (B) bruk av den p38 MAPK inhibitor (grå vannrett linje) forhindret eEF2K inhibito-indusert styrking av feltet potensialer. Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Representant opptak aktivitet-avhengige potensiering synaptic overføring ved hjelp av strøm-carbogenation (strøm-carb., hvite sirkler) og reservoaret-carbogenation (res.-carb.; svart sirkler), med resirkulering av en liten aCSF reservoaret. Potensiering ble indusert etter tidspunkt 0 av tre ganger 100 Hz/s tog (Tet.: tetanization, høyfrekvent stimulering). Dataene presenteres som gjennomsnittlig ± SEM. braketten: statistisk sammenligning av grupper pr. tidspunkt; kortet T-test, antar ikke konsekvent standardavvik. * p < 0,05.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Avhengighet av aktivitet-avhengige depresjon synaptic overføring ved stimulering styrke og carbogenation. (A) bruke reservoaret-carbogenation (res.-carb.) med resirkulering av et stort aCSF volum, en 1 Hz stimulering i 15 min på 80% av maksimal fEPSP-skråningen utløste en sterk depresjon synaptic overføring (hvite sirkler). Men ble som representant fEPSP spor før (svart trace) og etter (rød spor på 110th min) LTD induksjon angi, presynaptic fiber volley (loddrett svart pil) sterkt redusert. Dette er et eksempel som viser at elektrokjemiske prosesser på stimulering elektroden kan skade afferente, forårsaker en depresjon som ikke avhenger delvis LTD-relaterte mekanismer. Redusere stimulering styrken til 50% av fEPSP-skråningen maksimal indusert en nedgangstiden av synaptic overføring til en lavere grad, men uten å endre presynaptic fiber volley (grå-fylte sirkler). (B) LTD induksjon ikke fremkalle en varig depresjon av fEPSP-bakken i eksperimenter med reservoaret-carbogenation og resirkulering av en liten aCSF reservoaret (res.-carb.; fylt med grå firkanter). (C) strøm-carbogenation med resirkulering av en liten aCSF reservoaret bedre utfallet av LTD induksjon. Skivene presentere representant fEPSPs før (svart spor) og etter (110th min, røde spor) LTD induksjon. For den representant fEPSPs, loddrette skalaen barer angi 1 mV og vannrette skala barer tilsvarer 2 ms. data Hentet fra akutt hippocampus skiver (350 µm) 1 til 2 måneder gamle C57/BL 6 mus og presentert som den gjennomsnittlig ± SEM. hakeparenteser : statistisk sammenligning av grupper pr. tidspunkt; kortet T-test, antar ikke konsekvent standardavvik. * p < 0,05, ns: ikke betydning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om grensesnittet skive kamre utstilling mer robust synaptic svar25,26,27,28, gir neddykking chambers ekstra praktisk for patch-klemme opptak og fluorescens bildebehandling. Derfor har vi beskrevet flere aspekter av potensielle feltopptak i akutt hippocampus skiver med en kommersiell neddykking skive kammer som kan enkelt utvides til avbilding av fluorescens sonder neurons17,18, 19. Foruten de skive forberedelse25representerer vedlikehold av et konstant carbogen nivå i innspillingen kammeret etter mange timer en av hindringer. Siden carbogen er bare kontrolleres av første metning av aCSF reservoaret, hentes lett forskjeller i oksygennivået i aCSF daglige eksperimenter. Dermed en oksygen måler er anbefalt å fremskynde feilsøking og justere betingelsene (f.eks temperatur, carbogen gjennomstrømning, carbogenation verktøy og aCSF resirkuleringsrate) for å nå minst 28 mg/L oksygen i aCSF reservoaret på stabil nivåer. I tillegg kan til vanlig praksis å endre størrelsen på aCSF beholder for medikament programmet indusere effekter på feltet potensialer skyldes forskjeller i carbogen nivåer.
Bruk av strøm-carbogenation av en liten resirkulering buffer forbedret utfallet av synaptiske plastisitet eksperimenter. Forbedret oppløsning oksygen i væsken er basert på større forholdet mellom kontakt av væsken og carbogen. I tillegg reduserer ut-carbogenation tilførsel av carbogen-utarmet aCSF i aCSF reservoaret. Stabilitet i carbogenation kan være ytterligere forbedret med en spesialdesignet venturi basert på kommersielle produkter29.
Selv med den beste stykke forberedelse og definere betingelser er det ofte uunngåelig at feltet potensialer ikke kan bli indusert når isolerte metall stimulering elektrodene brukes. Årsaken er ofte at isolasjon er skadet på grunn av bøying eller rengjøring. Som vi har vist i metoder, er en enkel tilnærming å sjekke boble dannelsen på lav DC spenning. I tillegg hjelper dette trinnet å rengjøre spissen og redusere impedans på stimulering elektroden. Bruk av glass Pipetter for stimulering er vanlig og har fordelen av å gi et smalere felt av fiber stimulering. Ofte, er det ikke mulig å finne en maksimal fEPSP skråning når glass pipette stimulering. Utseendet av positiv komponenten av befolkningen spiker i fEPSP-decay fase kan deretter brukes til å justere stimulering styrke23.
Involvering av ulike signalveier avhengig av protokollen anvendt induksjon er tilgjengelig10kan publikasjonen om induksjon av aktivitet-avhengige synaptiske plastisitet. Men fra metodologiske synspunkt, kan høyfrekvent stimulering forårsake forskjellige gjenstander som kan hindre vellykket induksjon av synaptiske plastisitet. En gjentatt 100 Hz/1 s stimulering føre polarisering av stimulering elektrodene eller elektrokjemiske reaksjoner30, noe som resulterer i depresjonen i synaptic overføring skyldes skader på afferente (se Figur 8 for et eksempel). For å minimere de elektrokjemiske prosessene, anbefales bruk av bifasisk stimulering pulser og en stimulering makt ikke mer enn 2 V for planlagte innspillinger.
I sammendraget bidrar strøm-carbogenation til å stabilisere oksygennivået eksperimenter som bruker resirkulering av en liten buffer reservoaret, forbedre kostnadseffektiviteten av stoffet eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at forskningen ble utført i fravær av noen kommersielle eller økonomiske relasjoner som kan tolkes som en potensiell interessekonflikt.
Acknowledgments
Ww gjennomført, analysert, og designet eksperimenter og skrev manuskriptet. D.X. og C.P. assistert figur forberedelse og gjennomført eksperimenter. Dette arbeidet ble støttet av NSFC (31320103906) og 111 Project (B16013) TB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
