Summary
Este protocolo describe la estabilización del nivel de oxígeno en un pequeño volumen de tampón reciclado y aspectos metodológicos de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la grabación en rebanadas hippocampal agudas sumergidas.
Abstract
Aunque los experimentos en rebanadas de cerebro han estado en uso desde 1951, siguen existiendo problemas que reducen la probabilidad de lograr un análisis acertado y estable de la modulación de la transmisión sináptica al realizar grabaciones intracelulares o potenciales del campo. Este manuscrito describe aspectos metodológicos que pueden ser útiles en la mejora de las condiciones experimentales para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas y para la grabación de potenciales postsinápticos excitatorios de campo en una cámara de inmersión disponibles en el mercado con una unidad de salida carbogenation. La carbogenation de la salida ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en los experimentos que se basan en el reciclaje de un depósito tampón pequeño para mejorar la rentabilidad de experimentos con drogas. Además, el manuscrito presenta experimentos representativos que examinan los efectos de la carbogenation diferentes modos y paradigmas de estimulación de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de la transmisión sináptica.
Introduction
En 1951, los experimentos de rebanada cerebral aguda registrados primero fueron realizados1. En 1971, después de éxito en vitro las grabaciones de la corteza piriforme2,3 y el descubrimiento que las neuronas hippocampal están interconectadas transversalmente en el eje septotemporal del hipocampo4, uno de los primeras grabaciones en vitro de la actividad neuronal hippocampal fue alcanzado5. La similitud de los parámetros neurofisiológicos o neurostructural de las neuronas bajo condiciones en vivo y en vitro son todavía objeto de un debate6, pero en 1975, Schwartzkroin7 indica que la basal propiedades de las neuronas se mantienen en vitro y esa estimulación de alta frecuencia (es decir, tetanization) de aferentes en la formación hipocampal induce una facilitación de larga duración de los potenciales sinápticos8. Electrofisiológica de la actividad neuronal en vitro ampliado en gran medida el estudio de los mecanismos celulares de la plasticidad sináptica dependiente de actividad9,10, que había sido descubierto en 1973 por Bliss et al. 11 en vivo experimentos con conejos.
El estudio de la actividad neuronal o la señalización de vías en rebanadas de cerebro y especialmente en rebanadas hippocampal agudas, es ahora una herramienta estándar. Sin embargo, sorprendentemente, en vitro experimentos han estar estandarizados, como lo demuestran los múltiples enfoques que existen para la preparación y mantenimiento de rebanadas hippocampal agudas. Reid et al. (1988) 12 repasa los desafíos metodológicos para el mantenimiento de rebanadas cerebrales agudas en diferentes tipos de cámaras de la rebanada y las opciones de baño nivel medio, pH, temperatura y oxígeno. Estos parámetros son todavía difíciles de controlar en la cámara de grabación debido a los elementos por encargo en vitro rebanada-grabación configuraciones. Pueden encontrar publicaciones que podría ayudar a superar algunos de los retos metodológicos y describen nuevos tipos de cámaras de rebanada de inmersión, como un sistema intersticial microperfusion 3D del13, una cámara con mejor flujo laminar y oxígeno de la fuente14, un sistema con control de temperatura computarizado15y un sistema de grabación multi cámara16. Ya que estas cámaras no son fáciles de construir, mayoría de los científicos se basan en cámaras de corte disponibles en el mercado. Estas cámaras pueden montarse en un sistema de microscopio, permitiendo la combinación de electrofisiología y de fluorescencia de imagen17,18,19. Puesto que estas cámaras guardar las rebanadas de cerebro sumergidas en líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF), un alto flujo de la solución tampón debe mantenerse, aumentar el gasto de uso de la droga. Para ello, hemos incorporado un sistema de perfusión reciclaje con carbogenation de salida que proporciona la estabilidad suficiente para la grabación a largo plazo de los potenciales de campo en una cámara de corte de inmersión usando un volumen relativamente pequeño de la aCSF. Además, resumimos cómo el uso de este sistema experimental carbogenation/perfusión afecta el resultado de la plasticidad sináptica dependiente de actividad10 y cómo la inhibición de la cinasa del factor 2 de elongación eucariotas (eEF2K) modula sináptica transmisión20.
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Protocol
Los animales fueron mantenidos según las normas de cuidado de los animales y los procedimientos de los institutos de ciencia del cerebro y el estado clave de laboratorio médico Neurobiología de la Universidad de Fudan, Shanghai, China.
1. preparación de la solución
Nota: Consulte la tabla de materiales.
- Preparar el buffer de corte (solución de Gey modificado): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1.25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM de glucosa, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-piruvato, 10 mM MgSO4y 0,5 mM de CaCl2.
- Ajustar el pH a 7,6 con 1 M NaOH sin carbogenation.
- Almacenar el buffer a 4 ° C.
Nota: La valoración clarifica el líquido nublado. La osmolalidad es 305-310 mOsm. El carbogen21 contiene 5% de dióxido de carbono y el 95% de oxígeno. - Preparar la aCSF diluyendo un 10 x solución de aCSF que no contienen bicarbonato y glucosa, dando una composición final: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM de MgCl2y 1,25 mM KH2PO4.
- Añadir bicarbonato y glucosa para llegar a 10 mM glucosa y 26 mM NaHCO3.
- Carbogenate la aCSF a través de un tubo de silicona perforada con un extremo bloqueado inmediatamente después de agregar el NaHCO3.
- Medir el pH mientras que carbogenating (pH 7.3-7.4).
Nota: La capacidad tampón puede ajustarse ligeramente alterando la cantidad de NaHCO3. Puesto que el pH resultante depende de la temperatura, es necesario comprobar el pH resultante mientras carbogenating en la temperatura de trabajo (por ejemplo, 30 ° C).
2. preparación de rebanadas Hippocampal agudas
Nota: Consulte la tabla de materiales.
- Coloque una malla de retención de rebanada en una cámara de incubación para rebanadas de cerebro agudo, llene la cámara con la aCSF y carbogenate (4-6 L/h) para por lo menos 30 min22 a 28-30 ° C.
- Enfriar los instrumentos quirúrgicos hasta 2-4 ° C.
- Coloque un vaso de vidrio llenado de agua fría y carbogenated corte tampón (2-4 ° C), en una mezcla de hielo y agua, cerca el vibratome.
- Anestesiar las ratas o los ratones hasta que desaparezcan de los reflejos corneales (30-50 s) utilizando isoflurano teniendo 500 μL en un frasco de vidrio de 2 L o 12.5 μL en un tubo de 50 mL.
- Aislar el cerebro usando un método descrito y visualizar en detalle en las publicaciones de Mathis et al. (2011) 23 y Yuanxiang et al. (2014) 24.
- Enfriar el cerebro hasta 2-4 ° C en un búfer de corte helado (para al menos 2 minutos) antes de cerebelo de disección y separación de los hemisferios.
- Utilice una hoja quirúrgica fría para diseccionar un pedazo de la corteza dorsal en un ángulo de 70° en el borde dorsal de cada hemisferio25 para obtener rodajas transversales de la ventral y la parte intermedia del hipocampo, como se muestra en la figura 1C y E.
- Con una espátula de cemento dental frío, transferencia de un hemisferio a un pedazo de papel de filtro para secar brevemente la superficie creada (s 1-2).
- Monte los dos hemisferios con superficies recién cortadas sobre la plataforma helada de corte con pegamento adhesivo de acción rápida; tienen el extremo caudal de la cara de hemisferios la hoja de afeitar (figura 1D).
- Coloque la plataforma de corte en la cámara de refrigeración de un vibratome y llenar esa cámara con el tampón de corte (2-4 ° C). Carbogenate utilizando un tubo de silicona perforada.
- Cortar rodajas de μm 350 vibratome adecuados parámetros (por ejemplo, velocidad de avance hoja: 1,2 mm/s, amplitud de la lámina: 1 mm).
- Aislar la formación hipocampal del subiculum y las cortezas entorrinal mediante dos cánulas de inyección (> 28 G) como tijeras.
- Quite las burbujas de la malla de retención de rebanada de la cámara de incubación previamente preparados, utilizando una pipeta Pasteur.
- La transferencia de los sectores que tienen cierta transparencia en el pyramidale del estrato de la plataforma de corte de la malla de la cámara de incubación. Evitar cualquier plegable, estiramiento, superposición y flotante por aCSF y la rebanada de aspiración con una pipeta Pasteur de boca grande.
Nota: Todo el procedimiento (paso 2.5-2.14) puede tomar 5-10 min; por lo tanto, es importante comprobar la temperatura de la solución tampón en el tiempo para mantener a 4 ° C. - Incubar las rebanadas a 30 ° C al menos 1.5-2 h en la sala de incubación y proporcionar carbogen en 4-6 L/h.
Nota: Ajuste el caudal de carbogen circular el búfer en la incubadora, pero evitar que las rodajas flotando.
3. las modificaciones de la Carbogenation de la aCSF reciclaje de pequeños embalses
- Agregar un conector de 3 vías tubo a la salida del sistema de reciclaje (figura 2B).
- Conectar el brazo medio del conector de 3 vías tubo con un tubo de suministro de carbogen y regular el caudal con un medidor de flujo de aire (3-4 L/h,D , figura 2y figura 4C).
- Agregar un segundo conector de 3 vías tubo a la entrada del sistema de reciclaje. Conectar el brazo medio al tubo hacia el calentador en línea, el brazo a un tubo de silicona delgada (10 cm de longitud) y el brazo inferior del tubo de entrada de la reserva (filtro de paso bajo; Figura 4 C).
- Coloque un exprimidor de tubo en un tubo de silicona delgada (OD: 2 mm) en una posición a lo largo del tubo donde la pulsación de la aCSF en la cámara de corte, generada por la bomba peristáltica, está en su mínimo.
Nota: El carbogenation de salida (salida-carb.) modificación reduce la sensibilidad del nivel carbogenation para el volumen del embalse del aCSF, la aCSF tasa de reciclaje y tubo relativa posiciones dentro aCSF pequeños embalses (< 50 mL; Figura 3). Sobre el filtro de paso bajo, una cierta cantidad de aire en el tubo de silicona fino reduce la pulsación de la corriente de la aCSF; así, el tubo debe llenarse con aire.
4.Grabación de las respuestas sinápticas en una cámara de corte de inmersión
Nota: Consulte la tabla de materiales.
- Precaliente la aCSF solución en un baño de agua a unos 28-30 ° C (Esto evitará la formación de burbujas en la cámara de grabación).
- Iniciar el sistema de reciclaje (4-5 mL/min) y activar el calentador en línea para equilibrar el sistema durante al menos 1 h.
- Remojo un pedazo pequeño de papel y una malla de nylon fijado en un alambre de platino en forma de U en la cámara de corte sumersión durante unos minutos (figura 4) de limpieza de lentes.
- Quite el alambre de platino en forma de U.
- Apague el reciclaje y coloque una rebanada en el papel de limpieza de lentes.
- Inmediatamente Coloque la malla de retención de rebanada encima de la rebanada, encender la bomba y dejar el segmento equilibre durante 30 min sin el objetivo de inmersión en la aCSF.
- La micropipeta de borosilicato (es decir, el electrodo de la grabación) se llenan de aCSF (punta de resistencia: 1-2 MΩ, llena 1/3 con aCSF) y montar en el soporte de pipeta.
- Compruebe el aislante del electrodo de estimulación metal colocando en la solución de NaHCO3 (> 40 mM). Conecte el electrodo al polo negativo de un generador de voltaje de DC (1-2 V, polo positivo: alambre de plata o platino) y observar la formación de burbujas en la punta de un microscopio de disección (> 60 aumentos).
- Coloque el electrodo de estimulación probado tungsteno aislamiento de epoxi manipulador y la referencia de los cables en la cámara del sector.
- Añada un segundo electrodo de referencia a la cámara y conéctela a la toma de referencia de la headstage del electrodo de la grabación (figura 4A).
- En el software de control de amplificador, haga clic en la casilla de "modo cero abrazadera" y continuar haciendo doble clic en la casilla "output gain lista". Elegir una ganancia de "100", haga doble clic en el "paso alto filtro cuadro de lista (Bessel)," elegir "0.1 Hz" y haga doble clic en el "paso bajo filtro cuadro de lista (AC)" para elegir "3 kHz."
- En el software de grabación, haga clic en el sobre "adquisición | Abrir protocolo." Elegir un protocolo que tiene posiciones permitiendo estímulos episódicos y la digitalización de potenciales amplificados en 10-20 kHz para 50-100 ms y desencadena automáticamente un aislador de estímulo 10 ms después del comienzo de una grabación episódica.
- Coloque la estimulación y electrodos de registro en línea y paralelo al pyramidale del estrato, por ejemplo (figura 4B y figura 5).
- Haga clic en "adquirir | Editar el protocolo"y elija la ficha"gatillo"(en la ventana emergente). Haga clic en la caja de "fuente del disparador" y elegir "barra espaciadora" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón "grabar" para iniciar la compra y observe la ventana emergente con un botón de disparo.
- En el estímulo aislador software, haga clic en la casilla de "control de la tensión" y escriba "0". Haga clic en el botón "Descargar". Haga clic en la ventana "software de grabación" y presiona la barra espaciadora. Repita este ciclo introduciendo secuencialmente los valores de 1 a 8, por ejemplo, en pasos de 1 mV en la caja de "control de la tensión".
- La fuerza del estímulo se correlacionan con valores de pendiente fEPSP y determinar la fuerza de la estimulación necesaria para obtener el 40% de la fEPSP-pendiente máxima. Haga clic en la "caja de control de voltaje" e introduzca el valor determinado. Haga clic en el botón "Descargar".
Nota: Un aislador de estímulo se utiliza para aplicar tensión breve o pulsos de corriente para el tejido cerebral. Los pulsos bifásicos pueden tener 100 μs por fase. - En el software de grabación, haga clic en el botón stop y luego en el menú de "Adquirir". Haga clic en protocolo de"Editar" y seleccione la ficha "gatillo" en la ventana emergente. Haga clic en la caja de la fuente de disparo y eligió el "temporizador interno" como la fuente del disparador. Haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de grabación que se inicia la grabación automática de los potenciales de campo cada 30 s, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" después de 30-60 min.
- Haga clic en el menú de "Adquirir", haga clic en "Protocolo abierto", elija el protocolo de inducción deseado de plasticidad sináptica y haga clic en el botón "OK". Haga clic en el botón de "grabar" para activar automáticamente la alta frecuencia estimulación y registro. Haga clic en el botón "stop".
Nota: En caso de estudios de plasticidad sináptica, aplicar uno de los paradigmas de inducción estándar para potenciación a largo plazo o depresión a largo plazo después de la grabación inicial prolongada. Ejemplos representativos de la modulación resultante de la transmisión sináptica se representan en la figura 7 y figura 8. - En el software de grabación, haga clic en "adquirir | Abra el protocolo"y seleccione el mismo protocolo como en el paso 4.12. Haga clic en el botón "Aceptar" y haga clic en "registro". Mantenga el funcionamiento automáticamente las grabaciones del campo potencial para 2-4 h, por ejemplo. Haga clic en el botón "stop" para finalizar la grabación.
- En el caso de estudios farmacéuticos, aplique el compuesto directamente a la aCSF depósito si es permanente administración compuesta deseado (figura 6).
5. limpieza de la instalación y consejos
Nota: Ver abajo para consejos generales.
- Limpiar el sistema semanal de reciclaje 10% H2O2 para no más de 20 min, seguido de lavado con desionizada H2O.
Nota: Etanol no se recomienda para la limpieza. Asimismo se recomienda no sumergir los cables de referencia y objetivo en H2O2. - Retire la sal precipitada en la superficie de la lente del objetivo o alrededores de cámara con 0.1 N HCl y agua.
- Lave el borboteador carbogen en agua destilada o 0.1 N HCl.
- Sumergir la cámara de incubación de la rebanada en el 10% H2O2 durante 5 minutos una vez por semana y luego enjuague bien la cámara de incubación con desionizada H2O.
- En caso de electrodos de estimulación metal, enjuague la punta del electrodo estimulante con agua desionizada después de cada experimento y suavemente Limpie la punta del electrodo estimulante con una bola de algodón empapada con etanol para eliminar tejido residual.
- Reducir la resistencia de los electrodos de estimulación metal comercial eliminando el aislamiento en el extremo a través de un golpe cuidado con papel de lija.
- Reducir la pérdida de carbogen de la aCSF reciclaje a través de los tubos mediante la sustitución de los tubos de silicona con tubos de politetrafluoretileno.
- Mantenga los cables de plata de la grabación de electrodo y electrodo de referencia en lejía durante varios días para formar AgCl en la superficie del alambre.
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Representative Results
En la sección de protocolo, nos describe la preparación de aguda rebanadas hippocampal de la parte intermedia y ventral de la formación hipocámpica (figura 1) de ratones C57BL/6 machos y ratas Wistar macho (5-8 semanas). La posición de los hemisferios en la plataforma de la máquina de cortar ayuda a mantener estable y elimina la necesidad de estabilización con agar o agarosa. El sistema de perfusión se basa en una bomba peristáltica en alta rotación para dar el necesario caudal de líquido. Así, el rápido envejecimiento de los tubos estándar dentro de la bomba crea un problema substancial que superamos mediante el uso de tubos del silicio no (ID: 1,02 mm). También se crea la presión negativa de la salida por los dos tubos conectados en paralelo que tienen un diámetro interno de 2,79 mm. Estos dos tubos se conectan a una cánula en la cámara de grabación para permitir la aspiración del líquido (figura 4A). La tasa de carbogenation de la aCSF en el depósito debe ser estable durante muchas horas, que pueden ser difíciles de lograr utilizando piedras de ventilación o tubos con poros pequeños. Desde la salida carbogenation no se basa en pequeños poros, carbogen caudal más tiempo permanece estable (figura 2). Si los experimentos se llevan a cabo con un depósito pequeño aCSF, salida-carbogenation ayuda a lograr un equilibrio del oxígeno disuelto (figura 3). Además, minimiza la variabilidad del nivel de oxígeno entre los experimentos basados en una posición alterada la entrada/salida de tubo, el número de poros activos en los tubos de burbuja de carbogen y la tasa de reciclaje de líquido.
La rodaja se coloca en el papel de la lente para permitir un intercambio líquido desde abajo (figura 4A). Puesto que la cámara de corte puede ser montada en un microscopio vertical equipada con un objetivo 40 X, la posición de los electrodos puede ser bien controlado (B ,figura 4y figura 5). Esto reduce aún más la variabilidad de las experiencias en el trabajo día a día.
Para determinar la fuerza de la estimulación necesaria para la grabación de referencia de campo potencial, que la dependencia del tamaño de campo potencial en la fuerza del estímulo se determinará mediante el registro de la fEPSPs a intensidades de estimulación diferentes (figura 5 ). La medición de la característica de entrada-salida crea cierta tensión en el segmento a mayores intensidades de estimulación. Así, otro enfoque es buscar una fuerza de estímulo que evoca a un componente de pico positivo de la población en el fEPSP-decaimiento (flechas negras en la figura 5)26.
Después de registrar una línea base estable para por lo menos 30 minutos, puede comenzar la administración de drogas. Aquí, presentamos un ejemplo de los efectos de un inhibidor eEF2K sobre la transmisión sináptica. Inhibición de la eEF2K promueve la transmisión sináptica (figura 6A), un efecto que se atenúa por la inhibición de p38 MAPK (figura 6B)20.
Plasticidad sináptica dependiente de actividad puede ser inducida por una variedad de paradigmas de estimulación10. Aquí, presentamos experimentos representativos de plasticidad sináptica que se basan en una secuencia continua de estímulos a 100 Hz y en repetidos estímulos a 1 Hz durante 15 minutos. La modulación resultante de la transmisión sináptica ha sido representada en la figura 7 y figura 8. Además, se muestra en la figura 7 y figura 8 que la estabilización del nivel de oxígeno de embalses de pequeño buffer de salida-carbogenation (círculos de color blanco, nivel de oxígeno relativa a 24-40 min en la figura 3) mejoró el LTP y la inducción LTD en comparación con experimentos con depósito-carbogenation solamente (círculos grises, nivel de oxígeno en el minuto 7-24). No probamos la combinación de salida carbogenation y depósito-carbogenation (7-24 min) porque estábamos interesados en la creación de un sistema experimental usando carbogen menor y más simple. El embalse de carbogenation no reciclado (hasta 7 min) representa el nivel basal de oxígeno en el embalse de la aCSF.
Figura 1: Posicionamiento de los hemisferios del cerebro para obtener rebanadas transversales del hipocampo con un vibratome. (A) la formación hipocampal está indicado en una vista lateral del hemisferio derecho, en verde, dentro de un modelo de cerebro de ratón reconstruido. (B) una vista ventral de la formación hipocámpica. (C) la opinión de rostral a caudal muestra una sección de la parte ventral e intermedia de la formación del hipocampo del hemisferio derecho en el plano horizontal. Puesto que las diferentes regiones a lo largo del eje septotemporal del hipocampo tienen diferentes grados de inervación y función31,32, un ángulo de corte diferentes es necesaria para rebanadas transversales del hipocampo dorsal, para ejemplo. Barra de escala = 3 mm (líneas blancas horizontales). (D) la foto muestra los hemisferios de un cerebro de rata pegadas en una plataforma de vibratome. Barra de escala = 6 mm. (E) el bosquejo representa el ángulo para recortar el borde dorsal de la corteza (esquema superior) del hemisferio derecho separado (línea negra punteada) y rotación (flecha roja) para pegar el cerebro en la superficie creado en la plataforma de corte. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Elementos del sistema carbogenation para la aCSF embalses por debajo de 50 mL. Sistemas de carbogenation estándar (A) utilizando (a) tubos perforados como un dispositivo de burbuja de carbogen; un tubo fue perforado por múltiples punciones con un alambre de acero inoxidable de 250 μm de diámetro. (B) salida-carbogenation (b) un conector de 3 vías tubo (diámetro interior: 2 mm) o unidad (C) una ventilación que evita el reflujo de líquido con un filtro hidrofóbico.El brazo central del conector de 3 vías tubo está conectado a un tanque de carbogen después de un manómetro (presión de gas: < 1 atm) y un medidor de flujo. Los brazos restantes están conectados dentro del tubo de salida de la aCSF. (D) el carbogen caudal se controla mediante medidores de flujo. Durante los experimentos, los embalses de la aCSF se mantienen a 28-30 ° C. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Los niveles de oxígeno en 40 mL de aCSF en condiciones diferentes. El nivel de oxígeno en el embalse de carbogenation (res.-carb.) y aCSF reciclaje disminuyó constantemente (círculos llenos de grises, números = 3). Sin embargo, el carbogenation de salida (salida-carb.) durante la aCSF reciclaje reduce la caída del nivel de oxígeno, que alcanzó el equilibrio en los niveles iniciales (círculos llenos de blanco, números = 3). Se midieron niveles basales con res-carb. sin reciclaje del aCSF. Las líneas grises punteadas verticales indican el interruptor a carbogenation diferentes protocolos. Los efectos de la res. carbohidratos con reciclaje (7-24 min) y de la salida-carb. con el reciclaje (círculos blancos, 24-40 min) en la inducción de LTP y LTD se representan en la figura 7 y figura 8. Los datos se presentan como la media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Componentes de la salida carbogenation para experimentos en una cámara de corte sumersión. (A) presentación de la cámara de corte sumersión. El alambre de platino en forma de U con las fibras de nylon sosteniendo una rebanada hippocampal se representa. Los alambres de plata fueron envueltas alrededor de una pequeña cánula, creando una bobina para aumentar el área de la terminación del alambre de plata. El cable de referencia de estimulación fue colocado en la cámara de salida, y la referencia de la grabación fue en la cámara principal. Mantener el electrodo de referencia de potencial que estable a diferentes niveles de líquidos, el cable de referencia de la grabación se puede aislar por un tubo de plástico, dejando sólo la parte "submarina" del alambre expuesto en el búfer. (B) el campo brillante imagen muestra un representante sector hippocampal agudo y los electrodos. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: giro dentado; Sub: subiculum; CE: corteza del entorhinal. (C) el esquema Resumen de los principales componentes de la salida-carbogenation, sin indicación de los metros de flujo para el carbogen y la bomba peristáltica. Un filtro de paso bajo puede colocarse justo en frente del calentador en línea para reducir la pulsación del flujo aCSF. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 : Dependencia de la forma de potenciales de campo a fuerza de estímulo y la posición de los electrodos. (A) ejemplos representativos del campo de potenciales, evocados a distancias diferentes de las fortalezas del pyramidale (Str. pyr.) y estimulación del estrato son representados. Las flechas negras horizontales indican el componente positivo de la fuente de la espiga de la población en el decaimiento de potencial de campo. El componente positivo de la fuente de la espiga de la población seguía siendo aproximadamente en la mitad de las posiciones de fEPSP-subida inicial fase en absoluto probado electrodo "en línea", excepto uno muy cerca de la capa del cuerpo de la célula (e). Componente (B) la posición de la fuente positiva de la espiga de la población varió grandemente debido al desalineamiento de los electrodos de estimulación y registro. LAC.: estrato lacunosum moleculare; Reportes: estrato radiatum; Pyr.: pyramidale del estrato; Grabación: grabación de electrodo; Stim.: electrodo de estimulación. Barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Ejemplo de los efectos de un inhibidor eEF2K en transmisión sináptica hipocampal usando el carbogenation de salida, con el reciclaje de un depósito pequeño aCSF de20 . Después de grabar fEPSPs en intervalos de 1 min por 20 min, el inhibidor eEF2K A-484954 fue agregado directamente al depósito de aCSF (línea horizontal). Un rápido incremento de la transmisión sináptica era detectables (círculos llenos de blanco). Si la droga no se aplicó, la cuesta de fEPSP permanecido estable durante el tiempo de la grabación (círculos llenos de gris). (B) aplicación del inhibidor p38 MAPK (línea horizontal gris) impidió la eEF2K inhibito-inducida mejora de potenciales de campo. Los datos se presentan como la media ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Grabaciones de representante de potenciación dependiente de actividad de la transmisión sináptica con salida carbogenation (salida-carb.; círculos blancos) y Embalse de carbogenation (res.-carb.; los círculos negros), con el reciclaje de un pequeño aCSF Embalse de. La potenciación fue inducida después de tiempo punto 0 por tres veces 100 trenes Hz/s (TTE.: tetanization, estimulación de alta frecuencia). Los datos se presentan como la media ± SEM. soporte: comparación estadística de los grupos por cada punto de tiempo; T-test, no suponiendo constante desviación de estándar. * p < 0.05.Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Dependencia de depresión dependiente de actividad de la transmisión sináptica a fuerza de estímulo y carbogenation. (A) mediante depósito carbogenation (res.-carb.) con el reciclado de un volumen grande de la aCSF, un estímulo de 1 Hz durante 15 min a 80% de fEPSP-pendiente máxima evoca una fuerte depresión de la transmisión sináptica (círculos blancos). Sin embargo, como el representante fEPSP rastros antes (trazo negro) y después de indicar la inducción LTD (trazo rojo en la 110th min), la volea de fibra presináptica (flecha negra vertical) fue reducida. Este es un ejemplo que indica que procesos electroquímicos en el electrodo de estimulación podrían dañar los aferentes, provocando una depresión que no se basa parcialmente en los mecanismos relacionados con la LTD. Reducir la fuerza de la estimulación hasta el 50% de la máxima pendiente de la fEPSP inducida por una depresión de la transmisión sináptica en un grado inferior, pero sin cambiar la fibra presináptica volley (círculos llenos de gris). Inducción LTD (B) no evocan una depresión duradera de pistas de fEPSP en los experimentos con el embalse de carbogenation y el reciclaje de un reservorio pequeño aCSF (res.-carb., plazas llenas de gris). (C) el carbogenation de salida con el reciclaje de un embalse pequeño aCSF mejoró el resultado de la inducción LTD. Los rellenos presentan representante fEPSPs antes (rastros de negro) y después (110th min, rojo rastros) LTD inducción. Para el representante de fEPSPs, las barras de la escala vertical indican 1 mV y las barras de escala horizontal corresponden a 2 ms. los datos fueron obtenidos de rebanadas hippocampal agudas (350 μm) de ratones C57/BL 6 1 a 2 meses de edad y se presentan como la media ± SEM. soportes : comparación estadística de los grupos por cada punto de tiempo; T-test, no suponiendo constante desviación de estándar. * p < 0,05, ns: no significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Aunque cámaras de rebanada de interfaz exhiben más sólidas respuestas sinápticas25,26,27,28, cámaras de inmersión proporcionan comodidad adicional para la grabación de la abrazadera del remiendo y de la fluorescencia proyección de imagen. Así, hemos descrito algunos aspectos de posibles grabaciones de campo en rebanadas hippocampal agudas usando una cámara de corte de inmersión comercial que puede extenderse fácilmente a la proyección de imagen de puntas de prueba de fluorescencia de neuronas17,18, 19. Además el sector preparación25, el mantenimiento de un nivel de carbogen constante en la cámara de grabación después de muchas horas representa uno de los obstáculos. Puesto que el nivel de carbogen sólo es controlable por la saturación inicial del embalse aCSF, diferencias en el nivel de oxígeno en la aCSF son fácilmente obtenidas en experimentos día a día. Por lo tanto, se recomienda un medidor de oxígeno para acelerar la solución de problemas y ajustar las condiciones (por ejemplo, temperatura, caudal de carbogen, carbogenation herramientas y tasa de reciclaje aCSF) para llegar a por lo menos 28 mg/L oxígeno en el embalse de la aCSF en estable niveles. Además, la práctica común para cambiar el tamaño del recipiente de la aCSF para uso de la droga puede inducir efectos sobre los potenciales de campo debido a las diferencias en sus niveles de carbogen.
El uso de la carbogenation de la salida de un pequeño volumen de buffer reciclaje mejoró los resultados de los experimentos de plasticidad sináptica. Mejor disolución del oxígeno en el líquido se basa en la relación mayor entre el área de contacto del líquido y carbogen. Además, el carbogenation de salida reduce el suministro de la aCSF carbogen-agotado en el depósito de la aCSF. La estabilidad de la carbogenation puede ser mejorada por un venturi especialmente diseñado basado en el principio de productos comerciales29.
Incluso con la mejor preparación de rebanada y las condiciones de instalación, a menudo es inevitable que los potenciales de campo no inducida por cuando se utilizan electrodos de estimulación metal aislado. A menudo, la razón es que el aislamiento ha sido dañado debido a la flexión o la limpieza. Como hemos indicado en los métodos, es un enfoque simple comprobar la formación de burbujas en baja tensión. Además, este paso ayuda a limpiar la punta y para reducir la impedancia del electrodo de estimulación. El uso de pipetas de vidrio para la estimulación es común y tiene la ventaja de proporcionar un campo más estrecho de la estimulación de la fibra. A menudo, no es posible encontrar una pendiente máxima de la fEPSP cuando se utiliza la estimulación de pipeta de vidrio. La aparición del componente positivo de la fuente de la espiga de la población en la fase de decaimiento fEPSP podría utilizarse entonces para ajustar la fuerza de estímulo23.
Publicación con respecto a la inducción de la plasticidad sináptica dependiente de actividad de mayo y la participación de diferentes vías de señalización depende el protocolo de inducción aplicada están disponibles10. Sin embargo, desde el punto de vista metodológico, la estimulación de alta frecuencia puede causar distintos artefactos que podrían impedir la inducción exitosa de la plasticidad sináptica. Un repetido 100 Hz/1 s de estimulación puede causar polarización de los electrodos de estimulación o reacciones electroquímicas30, dando por resultado la depresión de la transmisión sináptica debido a daño a los aferentes (vea la figura 8 para ver un ejemplo). Para minimizar los procesos electroquímicos, se recomienda el uso de pulsos de estimulación bifásica y una potencia de estimulación no más de 2 V para las grabaciones de la línea de base.
En Resumen, la salida-carbogenation ayuda a estabilizar el nivel de oxígeno en los experimentos que se basan en el reciclaje de un depósito tampón pequeño, mejorar la rentabilidad de experimentos con drogas.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de cualquier relación comercial o financiera que pueda interpretarse como un potencial conflicto de interés.
Acknowledgments
W.W. realizó, analizados y había diseñado los experimentos y escribió el manuscrito. D.X. y C.P. ayudó en la preparación de la figura y llevado a cabo los experimentos. Este trabajo fue apoyado por NSFC (31320103906) y 111 (B16013) en T.B.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
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