Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem

Published: January 1, 2018 doi: 10.3791/55936

Summary

Det här protokollet beskriver stabiliseringen av syrehalten i en liten volym av återvunnet buffert och metodologiska aspekter av inspelning aktivitet-beroende synaptisk plasticitet i nedsänkt akut Hippocampus skivor.

Abstract

Även om experiment på hjärnan skivor har varit i bruk sedan 1951, kvarstår problem som minskar sannolikheten för att uppnå en stabil och framgångsrik analys av synaptisk transmission modulering när du utför potentiella eller intracellulära fältinspelningar. Detta manuskript beskriver metodologiska aspekter som kan vara till hjälp att förbättra experimentella förhållandena för underhåll av akut hjärnskada skivor och för att registrera fält excitatoriska postsynaptiska potentialer i en kommersiellt tillgänglig nedsänkning kammare med ett utflöde-carbogenation enhet. Den utflöde-carbogenation hjälper till att stabilisera syrenivån i experiment som förlitar sig på återvinning av en liten buffert reservoar att förbättra kostnadseffektiviteten av drogen experiment. Dessutom presenterar manuskriptet representativa experiment att undersöka effekterna av olika carbogenation lägen och stimulering paradigm på aktivitet-beroende synaptisk plasticitet av synaptisk transmission.

Introduction

1951 var första rapporterade akuta hjärnan slice experimenten bedrivs1. 1971, efter framgångsrika in vitro- inspelningar från piriform cortex2,3 och upptäckten att Hippocampus nervceller är sammankopplade tvären längs septotemporal axeln av hippocampus4, en av de första in vitro -inspelningar av hippocampus neuronal aktivitet var uppnådda5. Likheten mellan de neurofysiologiska eller neurostructural parametrarna av nervceller i vivo och in vitro- villkor är fortfarande föremål för någon debatt6, men 1975, Schwartzkroin7 indikerade att den basala egenskaper av nervceller underhålls i vitro och att högfrekvent stimulering (dvs. tetanization) av afferenter i hippocampus bildandet inducerar en långvarig underlättande av synaptic potentialer8. Elektrofysiologiska inspelning av neuronal aktivitet in vitro- kraftigt expanderat studiet av de cellulära mekanismerna av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet9,10, som hade upptäckts i 1973 av Bliss o.a. 11 i i vivo experimenterar med kaniner.

Studien av neuronal aktivitet eller signalering vägar i hjärnan skivor, och särskilt i akuta Hippocampus skivor, är nu ett standardverktyg. Överraskande, har in vitro- försök dock ännu skall standardiseras, vilket framgår av de flera metoder som fortfarande finns för förberedelser och upprätthållande av akut Hippocampus skivor. Reid et al. (1988) 12 recenserade de metodologiska utmaningarna för underhåll av akut hjärnskada skivor i olika typer av slice chambers och val av badningen medium, pH, temperatur och syre nivå. Dessa parametrar är fortfarande svåra att kontrollera i inspelning kammaren på grund av de måttbeställda delarna av in vitro- slice-inspelning uppställningar. Publikationer kan hittas att kanske hjälp att övervinna några av de metodologiska utmaningarna och som beskriver nya typer av nedsänkning slice chambers, såsom en interstitiell 3D microperfusion system13, en kammare med förbättrad laminärt flöde och syre leverera14, ett system med datoriserad temperatur kontroll15och en multi chamber inspelning system16. Eftersom dessa kamrar inte är lätt att bygga, de flesta forskare förlitar sig på kommersiellt tillgängliga slice chambers. Dessa kammare kan monteras på en Mikroskop system, vilket möjliggör kombinationen av elektrofysiologi och fluorescens imaging17,18,19. Eftersom dessa kamrar hålla hjärnan skivor nedsänkt i konstgjorda cerebrospinalvätska (aCSF), behöver en hög flödeshastighet av buffertlösningen underhållas, ökar på bekostnad av drogen ansökan. Därför har vi bildat ett återvinningssystem perfusion med utflöde-carbogenation som ger tillräcklig stabilitet för långsiktiga inspelning av fältet potentialer i en nedsänkning slice kammare med en relativt liten aCSF volym. Dessutom sammanfattat vi hur användningen av detta experimentella carbogenation/perfusion system påverkar resultatet av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet10 och hur hämning av eukaryota elongation factor-2 tyrosinkinashämmare (eEF2K) modulerar synaptic överföring20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Djuren var underhålls i enlighet med de etablerade normerna för djurens vård och förfaranden för institut av Brain Science and State nyckel laboratorium av medicinska neurobiologi av Fudan University, Shanghai, Kina.

1. lösningen förberedelse

Obs: Se tabell material.

  1. Förbereda skivning bufferten (modifierad Geys lösning): 92 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glukos, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvat, 10 mM MgSO4och 0,5 mM CaCl2.
  2. Justera pH till 7,6 med 1 M NaOH utan carbogenation.
  3. Lagra bufferten vid 4 ° C.
    Obs: Titreringen klargör grumlig vätska. Osmolalitet är 305-310 mOsm. Den carbogen21 innehåller 5% koldioxid och 95% syre.
  4. Förbereda aCSF genom att späda ut en 10 x stamlösning av aCSF som inte innehåller bikarbonat och glukos, ger en slutlig sammansättning: 124 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2och 1,25 mM KH2PO4.
  5. Tillsätt bikarbonat och glukos att nå 10 mM glukos och 26 mM NaHCO3.
  6. Carbogenate aCSF genom en perforerad silicon slang med en blockerad slut omedelbart efter tillägger den NaHCO3.
  7. Mäta pH-värdet medan carbogenating (pH 7,3-7,4).
    Obs: Buffertkapacitet kan justeras något genom att ändra mängden NaHCO3. Eftersom den resulterande pH är temperaturberoende, är det nödvändigt att kontrollera den resulterande pH medan carbogenating på arbetstemperatur (t.ex. 30 ° C).

2. beredning av akut Hippocampus skivor

Obs: Se tabell material.

  1. Placera en slice-anläggning mesh i en inkubation kammare för akut hjärnskada skivor, fylla kammaren med aCSF och carbogenate (4-6 L/h) för minst 30 min22 vid 28-30 ° C.
  2. Cool de kirurgiska instrument ner till 2-4 ° C.
  3. Plats en glasbägare fylld med kallt och carbogenated skivning buffert (2-4 ° C), underhålls i en blandning av is och vatten, nära vibratome.
  4. Söva råttor eller möss tills korneal reflexer försvinner (30-50 s) med isofluran genom att ta 500 µL till en 2 L glasburk eller 12,5 µL till en 50 mL tub.
  5. Isolera hjärnan med hjälp av en metod beskrivs och visualiseras i detalj i publikationerna av Mathis o.a. (2011) 23 och Yuanxiang o.a. (2014) 24.
  6. Cool hjärnan ner till 2-4 ° C i en iskall skivning buffert (för minst 2 min) innan dissekera lillhjärnan och separera halvkloten.
  7. Använda ett kallt kirurgiska blad för att dissekera en pjäs av dorsala cortex 70° vinkel längs den dorsala kanten av varje halvklotet25 att få tvärgående skivor från ventrala och den mellanliggande delen av hippocampus, som visas i figur 1C och E.
  8. Med en kall dentala cement spatel, överföra ett halvklot till en bit av filterpapper kort torka skapade ytan (1-2 s).
  9. Montera de två hjärnhalvorna med nyklippt ytor på iskall skivning plattformen använder snabbverkande klister; har det kaudala slutet av hjärnhalvorna ansiktet rakbladet (figur 1D).
  10. Skivning plattformen in kyla kammare av en vibratome och fyll det kammaren med skivning bufferten (2-4 ° C). Carbogenate använda en perforerad silikon tub.
  11. Skär 350 µm skivor med adekvat vibratome inställningar (t.ex. hastighet som är framåt i bladet: 1,2 mm/s, blade amplitud: 1 mm).
  12. Isolera Hippocampus bildandet från subiculum och de entorhinal cortices använder två injektion kanyler (> 28 G) som sax.
  13. Ta bort bubblorna från slice-anläggning maskorna tidigare beredda inkubation kammaren med en Pasteur-pipett.
  14. Överföra de segment som har lite insyn på de stratum pyramidale från skivning plattformen på maskorna inkubation kammaren. Undvika eventuella vikning, stretching, överlappande och flytande genom att aspirera aCSF och skiva i en stor-mun Pasteur-pipett.
    Obs: Hela förfarandet (steg 2.5-2.14) kan ta 5-10 min. Därför är det viktigt att kontrollera temperaturen av buffertlösningen över tid att behålla den vid 4 ° C.
  15. Inkubera skivor vid 30 ° C i minst 1,5-2 h i inkubation kammaren och ger carbogen på 4-6 L/h.
    Obs: Justera flödet klassar av carbogen att cirkulera bufferten i inkubatorn, men hindra skivor från flytande.

3. ändringar av Carbogenation för aCSF återvinning av små cisterner

  1. Lägga till en 3-vägs tube koppling till utflödet av återvinningssystemet (figur 2B).
  2. Anslut den mellersta arm av 3-vägs tube kontakten med en carbogen utbudet röret och reglera flödet med ett luftflöde meter (3-4 L/h, figur 2D och figur 4C).
  3. Lägga till en 3-vägs tube koppling till inflödet av återvinningssystemet. Anslut den mellersta arm till röret inför inline värmaren, överarmen till en tunn silikon tub (10 cm längd) och det lägre beväpnar till inloppsröret från reservoaren (lågpassfilter; Figur 4 ( C).
  4. Placera en tube squeezer på en tunn silikon tub (OD: 2 mm) på en ställning längs röret där pulsering av aCSF i slice kammaren, genereras av den peristaltiska pumpen, är på sin minsta.
    Obs: Den utflöde-carbogenation (utflöde-förg.) förändringen minskar känsligheten i carbogenation nivån för volymen av reservoaren aCSF, den aCSF återvinningsgrad, och relativa tube positioner inom små aCSF reservoarer (< 50 mL; (Se figur 3). Angående lågpassfiltret minskar en viss mängd luft i tunna kisel röret pulsering av aCSF flödet; Således bör röret fyllas mestadels med luft.

4.Inspelning Synaptic svaren i en nedsänkning Slice kammare

Obs: Se tabell material.

  1. Pre varma aCSF lösningen i ett vattenbad till ca 28-30 ° C (detta kommer att hindra bubbla bildandet i inspelning kammaren).
  2. Starta systemet (4-5 mL/min) och aktivera inline värmaren för att temperera systemet för minst 1 h.
  3. Presoak en liten bit av lins rengöring papper och en nylon mesh fast på en U-formad platina tråd i nedsänkning slice kammaren för några minuter (figur 4).
  4. Ta bort den U-formade platina tråden.
  5. Stäng av återvinning och placera en bit på den lins rengöring papper.
  6. Placera omedelbart slice-anläggning mesh ovanpå slice, slå på pumpen och låt slice jämvikta i 30 min utan doppa målet i aCSF.
  7. Fyll den Borsilikat-mikropipett (dvs inspelning elektroden) med aCSF (spets motstånd: 1-2 MΩ, fylld 1/3 med aCSF) och montera den i pipett hållaren.
  8. Kontrollera isoleringen av metall stimulering elektroden genom att placera det i NaHCO3 lösning (> 40 mM). Anslut elektroden till minuspolen på en DC spänning generator (1-2 V, positiv pol: silver eller platina tråd), och observera bildandet av bubblor på spetsen i dissektion Mikroskop (> 60 x förstoring).
  9. Placera den testade epoxi-isolerade stimulering volframelektrod i hållaren manipulator och hänvisningen ledningar i slice kammaren.
  10. Lägga till en andra referenselektrod till kammaren och Anslut den till referens uttaget av headstage av inspelning elektroden (figur 4A).
  11. I förstärkaren kontroll mjukvaran, klicka på rutan ”noll clamp-läge” och Fortsätt genom att dubbelklicka på rutan ”utgång få lista”. Välja en vinst på ”100” dubbelklicka ”högpass filterlistrutan (Bessel)”, välja ”0.1 Hz” och dubbelklicka på ”lågpass filterlistrutan (AC)” för att välja ”3 kHz”.
  12. I inspelningsprogrammet, klicka på den på ”förvärva | Öppna protokoll ”. Välj ett protokoll som har inställningarna tillåter för episodisk stimuli och digitaliseringen av förstärkta potential på 10-20 kHz för 50-100 ms och som automatiskt utlöser en stimulus isolator 10 ms efter starten av en episodisk inspelning.
  13. Placera stimulering och inspelning elektroder i linjen och parallell till den stratum pyramidale, till exempel (figur 4B och figur 5).
  14. Klicka på ”skaffa | Redigera protokollet ”och välja fliken” trigger ”(i popup-fönstret). Klicka på rutan ”trigger källa” och valde 'mellanslagstangenten' som trigger källa. Klicka på knappen ”OK”. Klicka på knappen ”record” för att starta förvärvet och observera popup-fönstret med en trigger knappen.
  15. I stimulans isolator programvaran, klicka på rutan ”spänningskontroll” och ange ”0”. Klicka på knappen ”Hämta”. Klicka på fönstret ”inspelning programvara” och tryck på mellanslagstangenten. Upprepa denna cykel av sekventiellt Ange värden från 1 till 8, till exempel på 1 mV steg i rutan ”spänningskontroll”.
  16. Korrelera stimulering styrkan med fEPSP-backen värden och avgöra stimulering styrka krävs för att få 40% av fEPSP-backen maximal. Klicka på rutan ”spänning kontroll” och ange det fastställda värdet. Klicka på knappen ”Hämta”.
    Obs: En stimulus isolator används för att tillämpa kort spänning eller strömpulser på hjärnvävnad. Bifasisk pulserna kan ha 100 µs per fas.
  17. I inspelningsprogrammet, klickar du på stoppknappen och sedan på ”Hämta”-menyn. Klicka på ”Redigera Protocol” och välja fliken ”trigger” i popup-fönstret. Klicka på utlösare rutan källa och valde ”interna timern” som trigger källa. Klicka på knappen ”OK”. Klicka på knappen Spela in som startar automatisk inspelning av fältet potential varje 30 s, till exempel. Klicka på knappen ”Stopp” efter 30-60 min.
  18. Klicka på ”skaffa”-menyn, klicka på ”öppna protokoll”, Välj önskad induktion protokollet av synaptisk plasticitet och klicka ”OK” knappen. Klicka på ”record” för att automatiskt aktivera högfrekvent stimulering och inspelning. Klicka på knappen ”Stopp”.
    Obs: Vid studier som avser synaptisk plasticitet, gäller en av standard induktion paradigm för långsiktig potentiering eller långvarig depression efter långvarig baslinjen inspelningen. Representativt exempel på den resulterande moduleringen av synaptisk överföring avbildas i figur 7 och figur 8.
  19. I inspelningsprogrammet, klicka på ”skaffa | Öppna protokoll ”och välja samma protokoll som i steg 4.12. Klicka på knappen ”OK” och klicka sedan på ”record”. Hålla körs automatiskt fältet potentiella inspelningarna för 2-4 h, till exempel. Klicka på knappen ”stopp” för att avsluta inspelningen.
  20. Vid farmaceutiska studier, gäller föreningen direkt till aCSF reservoar om permanent sammansatta administration är önskas (figur 6).

5. rengöring av inställningar och tips

Obs: Se nedan för allmänna tips.

  1. Rengöra systemet varje vecka genom återvinning 10% H2O2 för mer än 20 min, följt av tvättning med avjoniserat H2O.
    Obs: Etanol rekommenderas inte för rengöring. Det är jämväl inte rekommenderat att fördjupa den referens ledningar och mål i H2O2.
  2. Ta bort utfällda salt på ytan av objektiv eller kammare omgivningar med 0,1 N HCl och sedan vatten.
  3. Tvätta carbogen bubbelflaskan i destillerat vatten eller 0,1 N HCl.
  4. Fördjupa slice inkubation kammaren i 10% H2O2 under 5 minuter en gång i veckan och sedan skölj inkubation kammaren med avjoniserat H2O.
  5. Vid metall stimulering elektroder, spola stimulerande elektrod spetsen med avjoniserat vatten efter varje experiment och torka försiktigt stimulerande elektrod spetsen med en bomullstuss indränkt med etanol att avlägsna kvarvarande vävnad.
  6. Minska motståndet av kommersiella metall stimulering elektroder genom att ta bort isoleringen på spetsen genom en försiktig känga med sandpapper.
  7. Minska förlust av carbogen från aCSF samtidigt återvinning genom rören genom att ersätta kisel rören med polytetrafluoreten rör.
  8. Håll silvertrådar inspelning elektrod och referenselektrod i blekmedel i flera dagar att bilda Granulatfyllda på tråd ytan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I avsnittet protokoll beskrivit vi förberedelserna av akut Hippocampus skivor från den ventrala och mellanliggande delen av hippocampus bildandet (figur 1) manliga C57BL/6 möss och manliga Wistar råttor (5-8 veckor). Placeringen av hjärnhalvorna på utsnittet plattformen hjälper till att hålla dem stabila och tar bort behovet av stabilisering med agar eller agaros. Själva perfusion systemet bygger på en Peristaltisk pump som drivs på hög rotation att ge önskat flöde av vätska. Således, den snabba åldrandet standardrör inom pumpen skapade ett betydande problem som vi besegrade med hjälp av icke-kisel rör (ID: 1,02 mm). Det negativa trycket för utflödet är också skapad av två parallella-anslutna rör som har en innerdiameter på 2,79 mm. Dessa två rör är anslutna till en kanyl i inspelning kammaren för aspiration av vätskan (figur 4A). Andelen carbogenation av aCSF i behållaren måste vara stabil över många timmar, vilket kan vara svårt att uppnå med ventilation stenar eller rör med små porer. Eftersom den utflöde-carbogenation inte förlitar sig på små porer, det carbogen flödet över tid är stabil (figur 2). Om experimenten utförs med en liten aCSF reservoar, den utflöde-carbogenation bidrar till att uppnå en jämvikt mellan den upplöst syrgas (figur 3). Dessutom minimerar variationen i syrehalten mellan experimenten baserat på en förändrad inflöde/utflöde tube, antalet aktiva porer på carbogen bubbla rören och flytande återvinningsgraden.

Segmentet placeras på linsen papper att tillåta vissa flytande byta underifrån (figur 4A). Eftersom slice kammaren kan monteras på ett upprätt Mikroskop som är utrustat med ett 40 X-objektiv, kan elektroderna vara väl kontrollerade (figur 4B och figur 5). Detta minskar ytterligare variabilityen av experiment i det dagliga arbetet.

Att bestämma den stimulering styrka som krävs för baslinjen inspelning av fältet potential, beroendet av potentiella fältstorleken vid stimulering styrkan måste fastställas genom inspelning av fEPSPs vid olika stimulering styrkor (figur 5 ). Mätning av input-output kännetecken skapar vissa stress på skiva på högre stimulering styrkor. Således är ett annat tillvägagångssätt att söka efter en stimulering styrka som bara väcker en positiv befolkningen spike komponent i den fEPSP-förfalla (svarta pilar i figur 5)26.

Efter inspelningen en stabil baslinje för minst 30 min, kan Läkemedelslära börja. Här presenterade vi ett exempel på effekterna av en eEF2K-hämmare på synaptisk transmission. Hämning av eEF2K främjar synaptisk transmission (figur 6A), en effekt som var försvagat av hämning av p38 MAPK (figur 6B)20.

Aktivitet-beroende synaptisk plasticitet kan induceras av en mängd stimulering paradigm10. Här presenteras vi representativa experiment av synaptisk plasticitet som är baserade på en kontinuerlig sekvens av stimuli vid 100 Hz och upprepad stimuli vid 1 Hz över 15 min. Den resulterande moduleringen av synaptisk överföring har porträtterats i figur 7 och figur 8. Dessutom, visas det i figur 7 och figur 8 att stabiliseringen av syrehalten liten buffert reservoarer av den utflöde-carbogenation (vita cirklar, relativa syrehalten på 24-40 min i figur 3) förbättrades LTP och LTD induktion i jämförelse med experiment med reservoar-carbogenation endast (grå cirklar, syrehalten vid 7-24 min). Vi testa inte kombinationen av utflöde-carbogenation och reservoar-carbogenation (7-24 min) eftersom vi var intresserade av att skapa ett experimentella system med lägre och enklare carbogen användning. Den reservoar-carbogenation utan återvinning (upp till 7 min) representerar basnivån för syre i reservoaren aCSF.

Figure 1
Figur 1: Positionering i hjärnhalvorna Erhåll tvärgående skivor av hippocampus med hjälp av en vibratome. (A), Hippocampus bildandet indikeras i en lateral bild av höger hjärnhalva, i grönt, inom en rekonstruerad musmodell för hjärnan. (B) en ventral vy av hippocampus bildandet. (C), vyn rostralt-till-kaudala visar ett avsnitt av den ventrala och mellanliggande delen av hippocampus bildandet för höger hjärnhalva på horisontalplanet. Eftersom olika regioner längs septotemporal axel hippocampus har olika grader av innervation och funktion31,krävs32, en annan skärvinkel för tvärgående skivor av dorsala hippocampus, för exempel. Skalstapeln = 3 mm (vågräta vita linjer). (D) bilden visar halvklot av en råtthjärna limmade på en vibratome plattform. Skalstapeln = 6 mm. (E) skissen skildrar vinkeln för trimning dorsala kanten av cortex (övre schema) av den separerade högra hjärnhalvan (streckad svart linje) och rotation (röd pil) att limma hjärnan på skapade ytan på skivning plattformen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Delar av carbogenation systemet för aCSF reservoarer under 50 mL. (A) Standard carbogenation system med (a) perforerade rör som en carbogen bubbla enhet; ett rör var perforerad av flera punkteringar med en 250 µm diameter rostfritt stål wire. (B) utflöde-carbogenation av (b) en 3-vägs tube koppling (innerdiameter: 2 mm) eller (C), en ventil som förhindrar flytande tillbaka flöde med hydrofobiska filter.Den mellersta arm av 3-vägs tube kontakten är ansluten till en carbogen tank efter en manometer (gas trycket: < 1 atm) och en flödesmätare. Återstående armarna är anslutna inom aCSF utflöde röret. (D), carbogen flödet styrs av flödesmätare. Under experimenten hålls aCSF behållarna vid 28-30 ° C. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Syrehalten i 40 mL aCSF på olika villkor. Syrehalten under den reservoar-carbogenation (res.-förg.) och aCSF återvinning minskade ständigt (grå-fyllda cirklar, n = 3). Dock den utflöde-carbogenation (utflöde-förg.) under aCSF återvinning minskade släpp av syrehalten, som nådde jämvikt på utgångsnivåerna (vit-fyllda cirklar, n = 3). Utgångsnivåerna mättes med res.-carb. utan aCSF återvinning. De vertikala prickiga grå linjerna anger växeln att olika carbogenation protokoll. Effekterna av res.-carb med återvinning (7-24 min) och utflöde-carb. med återvinning (vita cirklar, 24-40 min) på induktion av LTP och LTD avbildas i figur 7 och figur 8. Data presenteras som den medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Komponenter av utflöde-carbogenation för experiment i en nedsänkning slice kammare. (A) Presentation av nedsänkning slice kammaren. Den U-formade platina tråden med nylon fibrer håller en Hippocampus slice avbildas. Silvertrådar var virad runt en liten kanyl, skapa en spole för att öka området av ändelsen silvertråd. Stimulering referens tråden placerades i utflödet kammaren, och referensen inspelning var i huvudsakliga kammaren. Att hålla referenselektroden potentiella stabil på olika flytande nivåer, inspelning referens tråd kan isoleras genom ett plaströr, lämnar bara den ”underwater” delen av kabeln utsätts för bufferten. (B) ljus-fältet bild visar en representativ akut Hippocampus slice och elektroderna. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; GD: dentate gyrus; sub: subiculum; EG: entorhinal cortex. (C) schematiskt belyser de viktigaste komponenterna i den utflöde-carbogenation, utan angivande av flödesmätare för carbogen och den peristaltiska pumpen. Ett lågpassfilter kan placeras precis framför inline värmaren att minska pulsering av aCSF flödet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Beroendet av fältet potentiella form på stimulering styrka och ställning elektroderna. (A) representativa exempel på fältet potentialer, framkallat på olika avstånd från stratum pyramidale (str. pyr.) och stimulering styrkor är avbildade. Horisontella svarta pilarna visar positiva källkomponenten av den befolkning spike i fältet potentiell förfalla. Den positiva källkomponenten av befolkningen spike förblev ungefär på mitten av ursprungliga fEPSP-ökningen fas på alla testade ”in-line” elektrod positioner, utom den mycket nära cellkroppen lagret (e). (B), positionen för den positiva källan komponent i befolkningen spike varierade kraftigt på grund av feljusteringen av stimulering och inspelning elektroderna. Lac.: stratum lacunosum moleculare; Rad.: stratum radiatum; Pyr.: stratum pyramidale; ReK: inspelning elektrod; Stim.: stimulering elektrod. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Representativa exempel på effekterna av en eEF2K-hämmare på Hippocampus synaptisk transmission med det utflöde-carbogenation, med återvinning av en liten aCSF reservoar20 . Efter inspelningen fEPSPs 1 min mellanrum i 20 min, lades den eEF2K-hämmaren A-484954 direkt till reservoaren aCSF (horisontell linje). En snabb ökning av synaptisk överföring var detekterbar (vita cirklar). Om läkemedlet inte tillämpades, förblev fEPSP-backen stabil över tiden av inspelningen (grå-fyllda cirklar). (B) tillämpning av den p38 MAPK-hämmaren (grå vågrät linje) förhindras eEF2K inhibito-inducerad förbättrande av fältet potentialer. Data presenteras som den medelvärde ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Representant inspelningar av aktivitet-beroende potentiering av synaptisk transmission med utflöde-carbogenation (utflöde-carb.; vita cirklar) och reservoar-carbogenation (res.-carb.; svarta ringar), med återvinning av en liten aCSF reservoaren. Potentiering förmåddes efter tid punkt 0 tre gånger 100 Hz/s tåg (Tet.: tetanization, högfrekvent stimulering). Data presenteras som den medelvärde ± SEM. fäste: statistisk jämförelse mellan grupper per tidpunkt; oparat T-test, inte antar konsekvent standardavvikelse. * p < 0,05.Klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8 : Beroendet av aktivitet-beroende depression av synaptisk transmission på stimulering styrka och carbogenation. (A) använda reservoar-carbogenation (res.-förg.) med återvinning av en stor aCSF volym, en 1 Hz stimulering för 15 min på 80% av maximal fEPSP-backen frammanas en stark depression av synaptisk transmission (vita cirklar). Dock var som den representativa fEPSP spår innan (svart trace) och efter (röda spår påth 110 min) LTD induktion visar, den presynaptiska fiber volley (vertikal svart pil) kraftigt reducerad. Detta är ett exempel som visar att elektrokemiska processer vid stimulering elektroden kan skada den afferenter, orsakar en depression som inte bygger delvis på LTD-relaterade mekanismer. Att minska styrkan stimulering till 50% av den fEPSP-backe maximalt inducerade en depression av synaptisk transmission i lägre grad, men utan att ändra den presynaptiska fibern volley (grå-fyllda cirklar). (B) LTD induktion inte framkalla en varaktig depression fEPSP-pister i experiment med den reservoar-carbogenation och återvinning av en liten aCSF reservoar (res.-carb.; grå-fyllda fyrkanter). (C) den utflöde-carbogenation med återvinning av en liten aCSF reservoar förbättrades resultatet av LTD induktion. Skären presentera representativa fEPSPs innan (svarta spår) och efter (110: e min, röda spår) LTD induktion. För den representativa fEPSPs, vertikala skalan staplarna visar 1 mV och de horisontella skala staplarna motsvarar 2 ms. data erhölls från akut Hippocampus skivor (350 µm) av 1 till 2 månader gammal C57/BL 6 möss och presenteras som den medelvärde ± SEM. parentes : statistiska jämförelser av grupper per tidpunkt; oparat T-test, inte antar konsekvent standardavvikelse. * p < 0,05, ns: icke-signifikant. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Även om gränssnittet slice chambers uppvisar mer robust synaptic Svaren25,26,27,28, ger nedsänkning chambers ytterligare bekvämlighet för patch-clamp inspelning och fluorescens Imaging. Således har vi beskrivit flera aspekter av potentiella fältinspelningar i akut Hippocampus skivor med hjälp av en kommersiell nedsänkning slice kammare som kan enkelt förlängas till avbildning av fluorescens sonder i nervceller17,18, 19. Förutom de slice beredning25representerar att bibehålla en konstant carbogen i inspelning kammaren efter många timmar ett av hindren. Eftersom carbogen bara är kontrollerbar av reservoaren aCSF inledande mättnad, är skillnader i syrehalten i aCSF lätt erhållas i dagliga experiment. En syre mätare rekommenderas således, att påskynda felsökning och justera villkoren (t.ex. temperatur, carbogen flöde, carbogenation verktyg och aCSF återvinningsgraden) för att nå minst 28 mg/L syre i reservoaren aCSF på stabil nivåer. Dessutom kan den gemensamma praxisen att ändra storlek på behållaren aCSF för läkemedel ansökan medföra effekter på fältet potential på grund av skillnader i deras carbogen.

Användningen av den utflöde-carbogenation av en liten volym för återvinning buffert förbättrades resultatet av synaptisk plasticitet experimenten. Förbättrad upplösning av syre i vätskan är baserad på större förhållandet mellan vätskan kontaktyta och carbogen. Dessutom minskar det utflöde-carbogenation leverans av den carbogen-utarmat aCSF i reservoaren aCSF. Stabiliteten i carbogenation kan ytterligare förbättras genom en särskilt utformad venturi baserat på principen om kommersiella produkter29.

Även med den bästa skiva förberedelser och setup villkor är det ofta oundvikligt att fältet potentialer inte kan induceras när isolerade metall stimulering elektroder används. Anledningen är ofta att isoleringen har skadats på grund av bockning eller rengöring. Som vi har nämnt i metoderna, är ett enkelt sätt att kontrollera bubbla bildandet vid låg DC-spänning. Dessutom detta steg hjälper till att rengöra spetsen och minska impedansen hos den stimulering elektroden. Användning av glas pipetter för stimulering är vanligt och har fördelen av att ge ett smalare fält av fiber stimulering. Ofta, är det inte möjligt att hitta en maximal fEPSP lutning när glas pipett stimulering används. Utseendet på positiva källkomponenten av befolkningen spike i den fEPSP-förfall fasen kan sedan användas för att justera den stimulering styrka23.

Kan publikation angående induktion av aktivitet-beroende synaptisk plasticitet och medverkan av olika signalvägar som är beroende av protokollet tillämpad induktion är tillgänglig10. Dock från metodologisk synvinkel, kan högfrekvent stimulering orsaka olika artefakter som kan förhindra lyckad induktion av synaptisk plasticitet. En upprepad 100 Hz/1 s stimulering kan orsaka polarisering av stimulering elektroder eller elektrokemiska reaktioner30, vilket resulterar i depression av synaptisk transmission på grund för att skada på den afferenter (se figur 8 för ett exempel). För att minimera de elektrokemiska processerna, rekommenderas användning av biphasic stimulering pulser och en stimulering makt inte mer än 2 V för baslinjen inspelningar.

Sammanfattningsvis, utflöde-carbogenation hjälper till att stabilisera syrenivån i experiment som förlitar sig på återvinning av en liten buffert reservoar, förbättra kostnadseffektiviteten av drogen experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att forskningen genomfördes i avsaknad av några kommersiella eller finansiella relationer som kunde tolkas som en potentiell intressekonflikt.

Acknowledgments

WW genomfördes, analyseras, och utformade experiment och skrev manuskriptet. D.X. och C.P. biträtt i figur förberedelse och genomfört experimenten. Detta arbete stöds av NSFC (31320103906) och 111 Project (B16013) att T.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents required
NaCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10019318
KCl Sinopharm Chemical Reagent, China 10016318
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 10017618
MgCl2·6H2O Sinopharm Chemical Reagent, China 10012818
CaCl2 Sinopharm Chemical Reagent, China 10005861
NaHCO3 Sinopharm Chemical Reagent, China 10018960
Glucose Sinopharm Chemical Reagent, China 10010518
NaH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20040718
HEPES Sigma H3375
Sodium pyruvate Sigma A4043
MgSO4 Sinopharm Chemical Reagent, China 20025118
NaOH Sinopharm Chemical Reagent, China 10019718
Tools and materials for dissection
Decapitators Harvard apparatus 55-0012 for rat decapitation
Bandage Scissors SCHREIBER 12-4227 for mouse decapitation
double-edge blade Flying Eagle, China 74-C
IRIS Scissors RWD, China S12003-09
Bone Rongeurs RWD, China S22002-14
Spoon Hammacher  HSN 152-13
dental cement spatula Hammacher  HSN 016-15
dental double end excavator Blacksmith Surgical, USA BS-415-017
Vibrating Microtome Leica, Germany VT1200S
surgical blade  RWD, China S31023-02
surgical holder RWD, China S32007-14
Electrophysiology equipment and materials
Vertical Pipette Puller Narishige, Japan PC-10
Vibration isolation table Meirits, Japan ADZ-A0806
submerged type recording chamber Warner Instruments RC-26GLP
4 Axis Micromanipulator Sutter, USA MP-285, MP-225
Platinum Wire World Precision Instruments PTP406
Amplifier Molecular Devices, USA Multiclamp 700B
Data Acquisition System Molecular Devices, USA Digidata 1440A
Anaysis software Molecular Devices, USA Clampex 10.2
Fluorescence Microscope Nikon, Japan FN1
LED light source Lumen Dynamics Group, Canada X-cite 120LED
micropipettes Harvard apparatus GC150TF extracelluar recording
borosilicate micropipettes Sutter, USA BF150-86 patch clamp
tungsten electrode A-M Systems, USA 575500
peristaltic pump Longer, China BT00-300T
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0309 1x inflow, ID: 1.02 mm
tubes for peristaltic pump ISMATEC, Wertheim, Germany SC0319 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm
CCD camera PCO, Germany pco.edge sCMOS
lens cleaning paper Kodak
50 mL conical centrifuge tube Thermo scientific 339652
Prechamber Warner Instruments BSC-PC
Inline heater Warner Instruments SF-28
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
  2. McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
  3. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
  4. Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
  5. Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
  6. Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
  7. Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
  8. Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
  9. Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
  10. Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
  11. Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
  12. Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
  13. Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
  14. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
  15. Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
  16. Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
  17. Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
  18. Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
  19. Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
  20. Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
  21. Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
  22. Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
  23. Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
  24. Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
  25. Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
  26. Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
  27. Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
  28. Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
  29. Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
  30. Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
  31. Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
  32. Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).

Tags

Neurovetenskap fråga 131 hippocampus eEF2 kinase proteinsyntes lärande minne synaptisk plasticitet syre
Inspelning synaptisk plasticitet i akut Hippocampus skivor underhålls i en små volymer återvinning - Perfusion- och nedsänkning-typ kammaresystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weng, W., Li, D., Peng, C.,More

Weng, W., Li, D., Peng, C., Behnisch, T. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. J. Vis. Exp. (131), e55936, doi:10.3791/55936 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter