Summary
Bu iletişim kuralı oksijen seviyesini geri dönüşümlü arabellek küçük bir hacim ve etkinlik bağımlı sinaptik plastisite batık akut Hipokampal dilimler halinde kayıt metodolojik açıdan istikrar açıklar.
Abstract
Beyin dilimleri üzerinde deneyler 1951 beri kullanımda olmuştur rağmen sorunlar alan potansiyel ya da hücre içi kayıtları yapılırken sinaptik iletimi modülasyon istikrarlı ve başarılı bir analizini ulaşma olasılığını azaltan devam etmektedir. Bu el yazması deneysel koşullar akut beyin dilimleri bakımı için ve alan eksitatör postsinaptik potansiyeller bir piyasada bulunan batma odaya kayıt için geliştirmeye yardımcı olabilir metodolojik açıları anlatır bir çıkış-carbogenation birimi ile. Çıkış-carbogenation ilaç deneyleri maliyet verimliliğini artırmak için küçük arabellek rezervuarı geri dönüşüm itimat deneylerde oksijen seviyesini dengelemek için yardımcı olur. Ayrıca, el yazması sinaptik iletimi etkinlik bağımlı sinaptik plastisite farklı carbogenation modları ve stimülasyon paradigmalar etkilerini incelemek temsilcisi deneyler sunar.
Introduction
1951 yılında, akut beyin ilk rapor dilim deneyler yapılan1vardı. 1971 yılında, sonra başarılı vitro kayıtları piriform korteks2,3 ve Hipokampal nöronlar kemiği Hipokampus4, birini septotemporal ekseni boyunca birbirine bağlanır bulma Hipokampal nöronal aktivite ilk vitro kayıtları elde5oldu. Nöronlar içinde vivo ve in vitro koşullarda nörofizyolojik veya neurostructural parametreleri benzerlik hala biraz tartışma6konusu, ama Schwartzkroin7 1975'te belirtilen Bazal vitro nöron özellikleri korunur ve bu yüksek frekanslı uyarılması (Örneğin, tetanization) afferents Hipokampal oluşumunda bir uzun süreli kolaylaştırma sinaptik potansiyelleri8indükler. Elektrofizyolojik nöronal aktivite kayıt vitro büyük ölçüde Bliss tarafından 1973 yılında keşfetmişti etkinlik bağımlı sinaptik plastisite9,10, hücresel mekanizmaları çalışmanın genişletilmiş vd. 11 ' in vivo tavşanlarla deneyleri.
Nöronal aktivite veya yollar beyin dilimleri ve özellikle akut Hipokampal dilimleri, sinyal çalışma şimdi standart bir araçtır. Ancak, şaşırtıcı, vitro deneyler standart olacak, hala hazırlık ve akut Hipokampal dilimleri bakımı için mevcut birden çok yaklaşımlarla kanıtladığı gibi henüz. Reid vd. (1988) 12 bakım akut beyin dilim dilim odaları farklı türleri ve orta, pH, sıcaklık ve oksijen düzeyi banyo seçimler için yöntembilimsel sorunlar gözden geçirdim. Bu parametreler hala vitro dilim-kayıt kurulumları özel yapım unsurları nedeniyle kayıt odası kontrol etmek zordur. Üstesinden gelmek için yardımcı bazı yöntembilimsel sorunlar ve bu yeni tip batma dilim chambers, interstisyel 3D microperfusion sistem13, Gelişmiş laminar akışı ve oksijen ile bir oda gibi açıklayabilir yayınları bulunabilir 14, bilgisayarlı sıcaklık kontrol15ile bir sistem ve bir çok odası kayıt sistemi16sağlayın. Bu odaları inşa etmek kolay olmadığı için çoğu bilim adamı piyasada bulunan dilim chambers güveniyor. Bu odaları böylece Elektrofizyoloji ve17,18,19görüntüleme Floresans birleşimi için izin bir mikroskop sistemi monte edilebilir. Bu odaları yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) sular altında beyin dilimleri tutmak beri tampon çözeltinin yüksek akış hızı muhafaza edilmesi, ilaç uygulama masrafına artan gerekmektedir. Bu amaçla, biz çıkış-carbogenation alan potansiyelleri batma dilim odasında bir nispeten küçük aCSF birim için uzun süreli kayıt için yeterli istikrar sağlayan bir geri dönüşüm perfüzyon sistemiyle dahil. Buna ek olarak, biz bu deneysel carbogenation/perfüzyon sistemi etkinlik bağımlı sinaptik plastisite10 sonucunu etkilemesi ve nasıl ökaryotik uzama faktör-2 kinaz (eEF2K) inhibisyonu sinaptik modüle özetlenebilir iletim20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanlar hayvan bakım kurulan standartları ve prosedürleri beyin bilim kurumları ve devlet anahtar laboratuvar, tıbbi Nörobiyoloji Bund'a Üniversitesi, Shanghai, Çin uygun olarak muhafaza.
1. çözüm hazırlık
Not: tablo malzemelerinbakın.
- Dilimleme arabellek (değiştirilmiş Gey'nın çözüm) hazırlamak: 92 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 30 mM NaHCO3, 25 mM glikoz, 20 mM HEPES, 3 mM Na+-pyruvate, 10 mM MgSO4ve 0,5 mM CaCl2.
- PH 7,6 1 M NaOH carbogenation olmadan kullanarak için ayarlayın.
- Arabellek 4 ° C'de depolayın
Not: Titrasyon bulutlu sıvı açıklar. Osmolalite 305-310 mOsm var. Carbogen%21 5 karbon dioksit ve % 95 oksijen içerir. - ACSF son bir bileşimi vererek 10 x does değil içermek bikarbonat ve glukoz, aCSF hisse senedi çözüm sulandrarak hazırlamak: 124 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 2.5 mM CaCl2, 2 mM MgCl2ve 1,25 mM KH2PO4.
- Bikarbonat ve 10 mM glikoz ve 26 mM NaHCO3ulaşmak için şekeri ekleyin.
- Carbogenate hemen NaHCO3ekledikten sonra Engellenen bir son ile delikli silikon tüp yoluyla aCSF.
- Carbogenating (pH 7.3 7.4) iken pH ölçmek.
Not: Arabelleği kapasitesi biraz NaHCO3miktarını değiştirerek ayarlanabilir. Elde edilen pH sıcaklık bağımlı olduğundan, carbogenating, çalışma sıcaklığında (Örneğin, 30 ° C) sırasında elde edilen pH kontrol etmek gereklidir.
2. akut Hipokampal dilimleri hazırlanması
Not: tablo malzemelerinbakın.
- Akut beyin dilimleri için bir kuluçka odası içine bir dilim tutma kafes koyun, aCSF ve carbogenate (4-6 L/h) en az 30 dk22 28-30 ° C'de odası dolgu
- 2-4 ° c aşağı cerrahi aletler serin
- Soğuk ve vibratome yakınındaki bir buz/su karışımı saklanır arabellek (2-4 ° C), Dilimleme carbogenated dolu bir cam kabı yerleştirin.
- Fareler ya da fareler kadar kornea refleksleri (30-50 ler) ortadan anestezi 2 L cam sürahi veya 50 mL tüp içine 12.5 µL 500 µL alarak isoflurane kullanarak.
- Bir yöntemle açıklanan ve ayrıntılı Mathis vd. yayınları olarak görüntülenmiştir beyin izole (2011) 23 ve Yuanxiang vd. (2014) 24.
- 2-4 ° C aşağı beyin ve beyincik anatomi ve hemisferlerin ayıran önce buz gibi bir Dilimleme arabellek (için en az 2 dk) ne yapıyorsun?
- Şekil 1' deC gösterildiği gibi bir parça enine dilimleri ventral ve Hipokampus, ara parçası almak için her yarım küre25 dorsal kenarı boyunca 70 ° açıyla dorsal korteksin incelemek için soğuk bir cerrahi bıçak kullanın ve E.
- Bir soğuk diş çimento spatula ile bir filtre kısa bir süre (1-2 s) oluşturulan yüzey kuru kağıt parçası bir Yarımküre aktarın.
- Taze kesilmiş yüzeyler ile iki hemisferlerin hızlı yapıştırıcı tutkal kullanarak buz gibi Dilimleme platformda mount; hemisferlerin yüz tıraş bıçağı (şekil 1D) Kaudal sonu var.
- Dilimleme platformu bir vibratome soğutma odasına koyun ve o odası ile dilimleme tampon (2-4 ° C) doldurun. Delikli silikon tüp kullanarak Carbogenate.
- Yeterli vibratome ayarları kullanarak 350 µm dilimler kesip (Örneğin, bıçak ileri hız: 1.2 mm/s, bıçak genlik: 1 mm).
- Hipokampal oluşumu subiculum ve iki enjeksiyonu Kanüller kullanılarak entorhinal cortices izole (> 28 G) olarak makas.
- Baloncuklar Pasteur pipet kullanarak önceden hazırlanmış kuluçka odası dilim tutma kafes kaldırın.
- Kuluçka odası mesh katman pyramidale Dilimleme platformdan bazı şeffaflık sahip dilimleri aktarın. Herhangi bir katlama, germe, örtüşen ve aCSF ve dilim büyük ağız Pasteur pipet alıyorum tarafından yüzen kaçının.
Not: Tüm prosedürü (Adım 2.5-2.14) 5-10dk sürebilir; Bu nedenle, arabellek çözüm sıcaklığı 4 ° C'de korumak için zaman içinde kontrol etmek önemlidir - Dilimleri en az 1.5-2 h kuluçka odasında için 30 ° C'de kuluçkaya ve 4-6 L/s carbogen sağlar.
Not: kuluçka makinesi arabellekte dolaşımda ancak yüzen üzerinden dilimleri engellemek için carbogen akış hızı ayarlayın.
3. değişiklikler aCSF için Carbogenation geri dönüşüm, küçük rezervuarlar
- Bir 3-yönlü tüp bağlayıcı geri dönüşüm sistemi (Şekil 2B) çıkış için ekleyin.
- 3'lü boru bağlantılarının orta kol carbogen tedarik tüp ile bağlayın ve akış hızı ile bir hava akımı metre (3-4 L/h, Şekil 2D ve şekil 4C) düzenleyen.
- İkinci bir 3-yönlü tüp bağlayıcı geri dönüşüm sistemi girişi ekleyin. Satır içi Kalorifer, ince silikon tüp (10 cm uzunluk) için üst kol ve alt kol giriş akımı tüp rezervuar (alçak geçiren Filtre; karşı karşıya tüp orta kol bağlanmak Şekil 4 C).
- Bir tüp sıkacağı bir ince silikon tüp yerleştirin (OD: 2 mm) tüp boyunca bir pozisyonda Peristaltik pompa tarafından oluşturulan dilim odasında aCSF nabız, en azından nerede.
Not: Çıkış-carbogenation (çıkış-carb.) değiştirme oranı, geri dönüşüm aCSF aCSF göl hacmi carbogenation seviyeye duyarlılığını azaltır ve göreli tüp konumlandırır küçük aCSF rezervuarlar içinde (< 50 mL; Şekil 3). Alçak geçiren filtre ile ilgili nabız aCSF akımı ince silikon tüp havada belli bir miktar azaltır; Böylece, tüp çoğunlukla hava ile dolu olması gerekir.
4.Sinaptik yanıt bir batma dilim odasında kayıt
Not: tablo malzemelerinbakın.
- Yaklaşık 28-30 ° c (bu-ecek önlemek kayıt odası kabarcık oluşumu) bir su banyosunda aCSF çözüm önceden ısıtmak.
- Geri dönüşüm sistemi (4-5 mL/dk) başlatmak ve sistem en az 1 h için equilibrate için satır içi Kalorifer etkinleştirin.
- Lens kağıt ve bir U şeklinde Platin tel batma dilim odasında bir kaç dakikalığına (şekil 4) sabit bir naylon mesh Temizleme küçük bir parça presoak.
- U şekilli Platin tel kaldırın.
- Geri dönüşüm kapalı geçiş ve bir dilim kağıt temizlik objektif yerleştirin.
- Hemen üstünde tepe-in dilim dilim-holding kafes yerleştirin, pompa geçiş ve amacı aCSF daldırma olmadan için 30 dk equilibrate dilim izin.
- Borosilikat micropipette (Yani, kayıt elektrot) aCSF ile doldurmak (İpucu direnç: 1-2 MΩ, 1/3 ile aCSF dolu) ve pipet yuvasına bağlayın.
- NaHCO3 çözüm yerleştirerek metal stimülasyon elektrot yalıtım kontrol (> 40 mM). Elektrot bir DC gerilim jeneratör eksi kutbuna bağlayın (1-2 V, pozitif Kutbu: gümüş veya Platin tel) ve kabarcıklar diseksiyon mikroskop altında ucundaki oluşumu gözlemlemek (> 60 x büyütme).
- Test epoksi izolasyonlu tungsten stimülasyon elektrot yer manipülatör tutucu ve başvuru dilim odasında teller.
- İkinci bir referans elektrot odasına eklemek ve kayıt elektrodu (şekil 4A) headstage başvuru prizine takýn.
- Amplifikatör kontrol yazılımı "sıfır kelepçe modu" kutusunu tıklatıp "çıkış elde listesi" kutusunu çift tıklatarak devam edin. Bir kazanç seçin "100", "yüksek geçiş filtresi liste kutusunu (Bessel)," çift tıklatın "0.1 Hz" seçin ve "düşük geçiş filtresi liste kutusunu (AC)" "3 kHz." seçmek için çift tıklatın
- Kayıt yazılımı tıklatın üzerinde "edinme | İletişim kuralı açın." Epizodik elektrodlar ve 50-100 ms için 10-20 kHz güçlendirilmiş potansiyelleri dijitalleştirme ve bunun için otomatik olarak izin ayarlarına sahip bir protokol bir uyarıcı izolatör 10 ms epizodik bir kayıt başladıktan sonra Tetikleyicileri seç.
- Çizgi ve stratum pyramidale (şekil 4B ve şekil 5) örneğin paralel stimülasyon ve kayıt elektrotları yeri.
- Tıklatın "elde etmek | İletişim Kuralı Düzenle"ve"tetik"sekmesinde (açılır pencere) seçin. Seçti "space bar" ve "tetikleyici kaynağı" kutusu üzerinde tetikleyici kaynağı olarak'ı tıklatın. "Tamam" düğmesini tıklatın. Satın başlatmak ve açılır pencerenin bir tetikleyici düğme ile not için "kayıt" düğmesini tıklatın.
- Uyarıcı izolatör yazılım "gerilim kontrolü" kutusuna tıklayın ve "0" girin "Yükle" düğmesini tıklatın. Tıkırtı üstünde "kayıt yazılımı" pencere ve boşluk çubuğuna basın. Sırayla değerleri 1'den 8'e, örneğin, 1 mV adımlar "gerilim kontrolü" kutusuna girerek bu döngüsünü tekrarlayın.
- Stimülasyon gücü fEPSP-eğim değerleri ile ilişkilendirmek ve fEPSP-eğim % 40'ını en fazla almak için gerekli stimülasyon gücü belirlemek. "Voltaj kontrol kutusu" tıklatın ve kararlı değeri girin. "Yükle" düğmesini tıklatın.
Not: Bir uyarıcı izolatör kısa gerilim veya geçerli bakliyat beyin dokusu ile uygulamak için kullanılır. Bifazik bakliyat faz başına 100 µs olabilir. - Kayıt yazılımı Durdur düğmesini ve ardından "Ele geçirme" menüsünü tıklayın. "Düzenleme protokol" tıklayın ve açılan pencerede "tetik" sekmesini seçin. Tetikleyici kaynak kutusu ve seçilmek "iç süreölçer" tetikleyici kaynağı olarak'ı tıklatın. "Tamam" düğmesini tıklatın. Her 30 alan potansiyelleri otomatik kayıt başlar kayıt düğmesini tıklatın s, örneğin. 30-60 dakika sonra "dur" düğmesini tıklatın.
- "Elde" menüsünde tıklatın, "Açık protokol üzerinde" sinaptik plastisite istenen indüksiyon protokolü seçin ve "Tamam" düğmesini tıklatın. Yüksek frekanslı stimülasyon ve kayıt otomatik olarak etkinleştirmek için "kayıt" düğmesini tıklatın. "Kes" düğmesini tıklatın.
Not: sinaptik plastisite ile ilgili çalışmaları durumunda, uzun vadeli kullanılmasının muhtemelen veya uzun süreli temel kaydettikten sonra uzun süreli depresyon için standart indüksiyon paradigmalar birini uygulayın. Sinaptik iletimi elde edilen modülasyon temsilcisi örnekleri Şekil 7 ve şekil 8tasvir edilmektedir. - Kayıt yazılımı tıklatın "edinme | İletişim kuralı açın"ve adım 4.12 olduğu gibi aynı iletişim kuralını seçin. "Tamam" düğmesini tıklatıp ardından "kaydı." Otomatik olarak alan potansiyel kayıtları için 2-4 h, örneğin koşmaya devam et. Kaydı sonlandırmak için "stop" düğmesine tıklayın.
- İlaç çalışmaları durumunda, bileşik uygulamak doğrudan aCSF için kalıcı bileşik yönetim ise rezervuar istenen (şekil 6).
5. Kurulum ve İpuçları Temizleme
Not: aşağıda genel ipuçları için bkz:.
- Temiz belgili tanımlık sistem haftalık % 10 H2O2 için en fazla 20 dk deiyonize H2ile O. yıkama tarafından takip, geri dönüştürerek
Not: Etanol temizlik için önerilmez. Bu aynı şekilde başvuru teller ve objektif H2O2sokmak için tavsiye edilmez. - Objektif lens veya odası çevresi ile 0.1 N HCl ve sonra su yüzeyinde zarlarını tuz kaldırın.
- Distile su veya 0,1 N HCl carbogen bubbler yıkayın.
- Haftada bir kez 5 min için % 10 H2O2 dilim kuluçka odasında bırakın ve sonra iyice durulayın kuluçka odası deiyonize H2O.
- Metal stimülasyon elektrotlar, durumunda her deneyden sonra uyarıcı elektrot uç deiyonize suyla durulayın ve hafifçe kalan dokuyu etanol ile ıslatılmış bir pamuk ile uyarıcı elektrot uç silin.
- Direnç ticari metal stimülasyon elektrot uç zımpara ile dikkatli bir kuvvetli darbe ile yalıtım kaldırarak azaltın.
- Carbogen kaybı aCSF borular politetrafloroetilen tüpleri ile silikon tüpler değiştirerek geri dönüşüm sırasında azaltın.
- Kayıt elektrot ve referans elektrot gümüş tel tel yüzey üzerine form AgCl birkaç gün için çamaşır suyu içinde tutun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokol bölümünde açıkladığımız akut Hipokampal dilim Hipokampal oluşumu (şekil 1) tahliyeleri ve orta kısmından erkek C57BL/6 fareler ve erkek Wistar rats (5-8 hafta) hazırlanması. Dilimleyici platformda hemisferlerin konumunu onları istikrarlı tutmaya yardımcı olur ve stabilization ile agar veya özel ihtiyaçlarını kaldırır. Perfüzyon sistemi yüksek rotasyon gerekli debi sıvı vermek için işletilen bir Peristaltik pompa üzerinde temel alır. Böylece, pompa içinde standart borular hızlı yaşlanma sigara silikon tüpler kullanarak üstesinden geldik önemli bir sorun oluşturdu (ID: 1.02 mm). Çıkış için negatif basınç da 2,79 mm iç bir çapa sahip iki paralel bağlı tüp tarafından oluşturulur. Bu iki tüp kanül (şekil 4A) sıvı aspirasyon için izin vermek için kayıt odasında bağlanır. Havalandırma taş ya da tüpler ile küçük gözenekleri kullanarak elde etmek zor olabilir birçok saat Reservoir aCSF carbogenation oranı istikrarlı olması gerekir. Bu yana çıkış carbogenation küçük gözenekler, carbogen akış hızı (Şekil 2) zaman kalır kararlı üzerinden dayanmaz. Küçük aCSF su deposu ile deneyler yaptı, çıkış carbogenation çözünmüş oksijen (şekil 3) bir denge elde etmek için yardımcı olur. Buna ek olarak, oksijen seviyesini bir değişmiş giriş/çıkış tüp pozisyon, etkin gözenekleri carbogen kabarcık tüpler ve sıvı geri dönüşüm oranı sayısını temel alan deneyler arasında değişkenlik en aza indirir.
Dilimi (şekil 4A) aşağıdan Bazı sıvı değişimine izin ver için objektif kağıt üzerinde yer alıyor. Dilim odası 40 X amacı ile donatılmış bir dik mikroskobu monte edilebilir, elektrotlar konumunu iyi kontrollü (şekil 4B ve şekil 5) olabilir. Bu gün için günlük çalışma deneylerde değişkenliği azaltılmış olur.
Temel kayıt alanının alan potansiyel boyutu stimülasyon gücü üzerine bağımlılık fEPSPs farklı stimülasyon güçlü (şekil 5 de kaydederek belirlenmelidir potansiyel için gerekli stimülasyon güç belirlemek için ). Giriş-çıkış karakteristik ölçümü daha yüksek stimülasyon güçlü dilimle bazı stres oluşturur. Böylece, başka bir yaklaşım sadece fEPSP-çürüme ( şekil 5siyah okları)26olumlu nüfus spike bileşeninde çağrıştıran bir stimülasyon güç için arama yapmaktır.
En az 30 dk için kararlı bir temel kaydettikten sonra ilaç idaresi başlayabilirsiniz. Burada, biz örnek olarak sinaptik iletimi bir eEF2K inhibitörü etkileri sundu. EEF2K inhibisyonu sinaptik iletimi (şekil 6A), p38 MAPK (şekil 6B)20inhibisyonu zayıflatılmış bir etkisi teşvik.
Etkinlik-bağımlı sinaptik plastisite stimülasyon paradigmalar10çeşitli tarafından indüklenen. Burada, temel alan temsilcisi deneyler, sinaptik plastisite uyaranlara 100 Hz'de sürekli bir dizi ve 1 Hz değerinde 15 dk tekrarlanan elektrodlar sunduk. Sinaptik iletimi elde edilen modülasyon Şekil 7 ve şekil 8içinde tasvir. Buna ek olarak, bu Şekil 7 ve şekil 8 çıkış carbogenation (beyaz daireler, göreli oksijen seviyesini şekil 3' te 24-40 dk) tarafından küçük arabellek rezervuarlar oksijen seviyesini istikrar LTP geliştirilmiş gösterilir ve LTD indüksiyon (gri daireler, oksijen seviyesi 7-24 dk) rezervuar-carbogenation sadece ile deneyler ile karşılaştırıldığında. Biz did değil sınav çıkış-carbogenation ve rezervuar-carbogenation (7 / 24 dk) kombinasyonu ile daha düşük ve daha basit carbogen kullanmak deneysel bir sistem oluşturmak istiyorsanız olduğumuz için. Rezervuar-carbogenation olmayan (7 dakikaya kadar) geri dönüşüm oksijen aCSF Reservoir temel düzeyde temsil eder.
Şekil 1: Bir vibratome kullanarak Hipokampus enine dilim elde etmek için beyin hemisferlerin konumlandırma. (A) Hipokampal formasyonu yanal görünümünü yeniden oluşturulan fare beyin modeli içindeki yeşil sağ hemisfer belirtilir. (B) A ventral görünümü Hipokampal oluşumu. (C) rostral-için-Kaudal görünümü için yatay düzlemde, sağ hemisfer Hipokampal oluşumuna tahliyeleri ve orta parçası bir bölümünü gösterir. Hipokampüs septotemporal ekseni boyunca farklı bölgelerde farklı innervasyon ve işlev31,sahip bu yana,32, farklı kesme açısı dorsal Hipokampus enine dilim için gereklidir örnek. Ölçek çubuğu = 3 mm (yatay beyaz çizgiler). (D) fotoğraf vibratome platformu üzerinde yapıştırılmış bir sıçan beyin hemisfer gösterir. Ölçek çubuğu 6 mm. (E) = kroki için ayrılmış sağ hemisfer (noktalı siyah çizgi) ve beyin Dilimleme platform üzerinde oluşturulan yüzeyinde tutkal için döndürme (kırmızı ok) korteks (üst Şeması) dorsal kenar kesme açısı gösteriyor. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : ACSF rezervuarlar 50 mL aşağıda carbogenation sistemin tür öğeleriyle. (A)standart carbogenation sistemleri (a) delikli tüpler carbogen kabarcık aygıtı olarak kullanarak; bir tüp 250 µm-çapında paslanmaz çelik tel ile birden fazla delikler tarafından delikli. (B) çıkış-carbogenation (b) bir 3-yönlü tüp bağlayıcı tarafından (İç Çap: 2 mm) veya sıvı geri akışı ile hidrofobik filtre engeller (C) bir havalandırma ünitesi.3'lü boru bağlantılarının orta kol bir Manometre sonra bir carbogen tanka bağlı (gaz basıncı: < 1 atm) ve akış ölçer. Kalan silah aCSF çıkış tüp içinde bağlı. (D) carbogen akış hızı akış ölçerler tarafından kontrol edilir. Deneyler sırasında aCSF rezervuarlar 28-30 ° C'de tutulur Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Oksijen düzeyleri farklı koşullar, aCSF 40 ml. Rezervuar carbogenation sırasında oksijen seviyesini (fotoğraf çözünürlüğü-carb.) ve aCSF geri dönüşüm sürekli düşmüştür (gri dolu daireler, n = 3). Ancak, çıkış carbogenation (çıkış-carb.) aCSF sırasında geri dönüşüm temel düzeyde denge ulaştı oksijen seviyesini damla azaltılmış (beyaz doldurulmuş daireler, n = 3). Temel düzey fotoğraf çözünürlüğü-carb ile ölçüldü. aCSF geri dönüşüm olmadan. Dikey noktalı gri çizgiler farklı carbogenation protokolleri geçiş gösterir. (7-24 dk) geri dönüşüm ile fotoğraf çözünürlüğü-carb ve çıkış-carb etkileri. LTP ve LTD indüksiyon (beyaz daireler, 24-40 dk) geri dönüşüm ile Şekil 7 ve şekil 8tasvir edilmektedir. Verileri ortalama ± SEM sunulmaktadır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Çıkış-carbogenation batma dilim odası olarak deneyler için bileşenlerinin. (A)tanıtım batma dilim odası. U şekilli Platin tel Hipokampal bir dilim tutan naylon iplikler tasvir edilir. Gümüş teller gümüş tel Bitiş alanını artırmak için bir bobin oluşturma bir küçük kanül sarılı. Stimülasyon başvuru tel çıkış odasında yerleştirildi ve ana odada kayıt başvuru yapıldı. Referans elektrot potansiyel sıvı farklı düzeylerde istikrarlı, kayıt başvuru tel arabelleğe maruz tel, yalnızca "sualtı" bölümünü bırakarak bir plastik tüp izole edilmiş tutmak için. (B) alanını parlak görüntü bir temsilcisi akut Hipokampal dilim ve elektrotlar gösterir. CA1, CA3: Cornu Ammonis 1, 3; DG: dentat gyrus; alt: subiculum; EC: entorhinal korteks. (C) şematik akış ölçerler, carbogen ve Peristaltik pompa için bir gösterge yoktur-carbogenation, çıkış ana bileşenleri vurgular. Bir alçak geçiren Filtre aCSF akışı titreşme azaltmak için sadece satır içi ısıtıcı önünde yerleştirilebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : Bağımlılık stimülasyon gücü ve elektrotlar konumunu üzerine alan potansiyel şeklinin. (A)temsilcisi örnek olarak alan tabaka pyramidale (str. pyr.) ve stimülasyon güçlü üzerinden farklı mesafelerde uyarılmış potansiyeller, tasvir edilmektedir. Yatay siyah oklar nüfus ani artış alan potansiyel çürüme olumlu kaynak bileşeni gösterir. Nüfus spike olumlu kaynak bileşeni yaklaşık dışında bir çok yakın hücre vücut Katmanı (e) ilk fEPSP-artış hiç test aşaması "in-line" elektrot pozisyonları ortasında kaldı. (B) olumlu kaynak konumunu bileşeni olan nüfus spike büyük ölçüde stimülasyon ve kayıt elektrotları kayma nedeniyle farklı. Lac.: stratum lacunosum moleculare; Rad.: stratum radiatum; Pyr.: stratum pyramidale; Tavsiye edilen: elektrot kayıt; STIM.: stimülasyon elektrot. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Çıkış carbogenation, bir küçük aCSF rezervuar20 geri dönüşüm ile kullanarak Hipokampal sinaptik iletimi bir eEF2K inhibitörü etkileri temsilcisi örnek . FEPSPs 20 dk 1 dk aralıklarla kaydettikten sonra eEF2K inhibitörü A-484954 doğrudan aCSF rezervuar (yatay çizgi) eklendi. Sinaptik iletim hızlı bir artış tespit (daireler) beyaz doldurulmuş oldu. İlaç değil uygulandıysa, fEPSP-yamaç kayıt (gri dolu daireler) Zaman içinde sabit kalmıştır. (B) uygulamasını p38 MAPK inhibitörü (gri yatay çizgi), eEF2K inhibito-indüklenen geliştirme alan potansiyelleri engelledi. Verileri ortalama ± SEM sunulmaktadır Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: Etkinlik-bağımlı kullanılmasının muhtemelen sinaptik iletimi çıkış-carbogenation kullanarak temsilcisi kayıtları (çıkış-carb.; beyaz daireler) ve rezervuar-carbogenation (fotoğraf çözünürlüğü-carb.; siyah daireler), küçük bir aCSF geri dönüşüm ile rezervuar. Sonra 100 Hz/s trenler tarafından zaman noktası 0 üç kez kullanılmasının muhtemelen akımıdır (Tet.: tetanization, yüksek frekanslı uyarı). Verileri ortalama ± SEM köşeli ayraç sunulmaktadır: gruplar her zaman noktası; istatistiksel karşılaştırılması unpaired T tutarlı standart sapma saymak değil sınaması. * p < 0,05.Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Bağımlılık aktivite bağlı depresyon sinaptik iletimi üzerine stimülasyon güç ve carbogenation. (A)rezervuar-carbogenation kullanarak (res.-carb.) büyük aCSF hacmi geri dönüşüm ile maksimal fEPSP-yamaç %80 15 dakika 1 Hz stimülasyon sinaptik iletimi (beyaz daireler) güçlü bir depresyon uyarılmış. Ancak, (daha önce siyah izle) temsilcisi fEPSP izler ve (kırmızı izle 110inci dk) LTD indüksiyon gösterir sonra büyük ölçüde presynaptic fiber voleybolu (dikey siyah ok) düşürüldü. Bu uyarımı elektrot, elektrokimyasal süreçleri kısmen LTD ile ilgili mekanizmalar üzerinde dayanmaz bir depresyon neden afferents zarar verebilecek gösteren bir örnektir. Stimülasyon gücü fEPSP-yamaç en fazla % 50 azaltılması bir depresyon bir alt dereceye sinaptik iletimi indüklenen ama presynaptic fiber voleybolu değiştirmeden (gri dolu daireler). (B) LTD indüksiyon değil fEPSP-pistlerinin rezervuar carbogenation ile deneyler içinde kalıcı bir depresyon ve küçük aCSF rezervuarı geri dönüşüm uyandırmak (res.-carb.; gri dolu kareler). (Bir küçük aCSF rezervuarı geri dönüşüm ileC) çıkış-carbogenation LTD indüksiyon sonucu geliştirilmiş. Ekler mevcut temsilcisi fEPSPs (siyah izleri) önce ve sonra (110inci dk, kırmızı izleri) LTD indüksiyon. Temsilcisi fEPSPs için dikey ölçek Çubuklarõn 1 mV ve verileri akut Hipokampal dilimleri (350 µm) 1 2 ay eski C57/BL 6 fareler elde edilmiştir ve ortalama ± SEM parantez sunulan 2 Bayan karşılık gelen yatay ölçek çubukları : gruplar her zaman noktası; istatistiksel karşılaştırılması unpaired T tutarlı standart sapma saymak değil sınaması. * p < 0,05, ns: önemli olmayan. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her ne kadar daha sağlam sinaptik yanıt-e doğru25,26,27,28arabirimi dilim chambers sergi, batma chambers yama-kelepçe kayıt ve floresan için ek kolaylık sağlar görüntüleme. Bu nedenle, alan potansiyel kayıtları kolayca floresan problar nöronlar17,18içinde görüntüleme için genişletilebilir bir ticari batma dilim odası kullanarak akut Hipokampal dilimleri içinde çeşitli yönlerini tarif var, 19. Dilim hazırlık25yanı sıra, birçok saat sonra kayıt odasında bir sabit carbogen düzeyi bakımından engellerden biri temsil eder. Carbogen düzeyi yalnızca aCSF rezervuar ilk doygunluk tarafından kontrol edilebilir olduğundan, aCSF oksijen düzeyindeki farklılıklar kolayca günlük deneylerde elde edilir. Böylece, bir oksijen metre ilgili hata giderme hızlandırmak için ve en az 28 mg/L ulaşmak için koşulları (Örneğin, sıcaklık, carbogen akış hızı, carbogenation araçları ve aCSF geri dönüşüm oranı) ayarlamak için tavsiye edilir aCSF rezervuar istikrarlı, oksijen düzeyleri. Buna ek olarak, uyuşturucu uygulama aCSF kapsayıcısı boyutunu değiştirmek için yaygın bir uygulama carbogen seviyelerine farklılıkları nedeniyle alan potansiyelleri üzerinde etkileri tetikleyebilir.
Çıkış-carbogenation küçük bir geri dönüşüm arabellek birimin kullanımı sinaptik plastisite deneyler sonucu geliştirilmiş. Sıvı oksijen geliştirilmiş eriterek carbogen arasındaki sıvı temas bölgesinin büyük oranı temel alır. Buna ek olarak, çıkış carbogenation aCSF Reservoir carbogen tükenmiş aCSF arz azaltır. Carbogenation kararlılığını daha fazla ticari ürünler29ilkesine dayanarak özel tasarlanmış bir venturi tarafından geliştirilmiş.
En iyi dilim hazırlık ve kurulum koşulları ile bile, bu kez izolasyonlu metal stimülasyon elektrot kullanıldığında alan potansiyelleri indüklenen değil kaçınılmazdır. Çoğu zaman, yalıtım bükme veya temizlik nedeniyle zarar görmüş olduğunu nedenidir. Biz yöntemlerdeki belirtildiği gibi basit bir yaklaşım kabarcık oluşumu, düşük DC gerilim kontrol etmektir. Buna ek olarak, bu adım ucunu temiz ve stimülasyon elektrot empedans azaltmak için yardımcı olur. Cam Pipetler kullanımı uyarılması için yaygın ve lif stimülasyon daha dar bir alanı sağlayan bir avantaja sahiptir. Çoğu zaman, cam pipet stimülasyon kullanıldığında bir maksimal fEPSP yamaç bulmak mümkün değil. Nüfus spike olumlu kaynak bileşeninin görünümünü fEPSP-çürüme aşamasında sonra stimülasyon gücü23ayarlamak için kullanılabilir.
Yayın ile ilgili etkinlik bağımlı sinaptik plastisite indüksiyon olabilir ve farklı sinyal yolları uygulanan indüksiyon Protokolü bağımlı katılımı kullanılabilir10vardır. Ancak, metodolojik açıdan, sinaptik plastisite başarılı indüksiyon engelleyebilir farklı eserler yüksek frekanslı stimülasyon neden olabilir. Tekrarlanan bir 100 Hz/1 s stimülasyon polarizasyon stimülasyon elektrotlar veya elektrokimyasal reaksiyonlara30sinaptik iletimi depresyon (örnek için bkz: şekil 8 ) afferents için zarar sonuçlanan, neden olabilir. Elektrokimyasal işlemlerin en aza indirmek için bifazik stimülasyon bakliyat ve stimülasyon güç 2 V'den daha fazla kullanımı temel kayıtları için önerilir.
Özet olarak, çıkış-carbogenation bir küçük arabellek rezervuar ilaç deneyleri maliyet verimliliğini arttırmak, geri dönüşüm itimat deneylerde oksijen seviyesini dengelemek için yardımcı olur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar araştırma potansiyel bir çatışması olarak yorumlanamaz herhangi bir ticari veya mali ilişkileri yokluğunda yapılmıştır bildirin.
Acknowledgments
WW yürütülen, analiz ve deneyler tasarlanmış ve el yazması yazdı. D.X. ve C.P. şekil hazırlanmasında destekli ve deneyler yaptı. Bu eser NSFC (31320103906) tarafından desteklenen ve tüberküloz için 111 Projesi (B16013)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents required | |||
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019318 | |
| KCl | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10016318 | |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10017618 | |
| MgCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10012818 | |
| CaCl2 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10005861 | |
| NaHCO3 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10018960 | |
| Glucose | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10010518 | |
| NaH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20040718 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Sodium pyruvate | Sigma | A4043 | |
| MgSO4 | Sinopharm Chemical Reagent, China | 20025118 | |
| NaOH | Sinopharm Chemical Reagent, China | 10019718 | |
| Tools and materials for dissection | |||
| Decapitators | Harvard apparatus | 55-0012 | for rat decapitation |
| Bandage Scissors | SCHREIBER | 12-4227 | for mouse decapitation |
| double-edge blade | Flying Eagle, China | 74-C | |
| IRIS Scissors | RWD, China | S12003-09 | |
| Bone Rongeurs | RWD, China | S22002-14 | |
| Spoon | Hammacher | HSN 152-13 | |
| dental cement spatula | Hammacher | HSN 016-15 | |
| dental double end excavator | Blacksmith Surgical, USA | BS-415-017 | |
| Vibrating Microtome | Leica, Germany | VT1200S | |
| surgical blade | RWD, China | S31023-02 | |
| surgical holder | RWD, China | S32007-14 | |
| Electrophysiology equipment and materials | |||
| Vertical Pipette Puller | Narishige, Japan | PC-10 | |
| Vibration isolation table | Meirits, Japan | ADZ-A0806 | |
| submerged type recording chamber | Warner Instruments | RC-26GLP | |
| 4 Axis Micromanipulator | Sutter, USA | MP-285, MP-225 | |
| Platinum Wire | World Precision Instruments | PTP406 | |
| Amplifier | Molecular Devices, USA | Multiclamp 700B | |
| Data Acquisition System | Molecular Devices, USA | Digidata 1440A | |
| Anaysis software | Molecular Devices, USA | Clampex 10.2 | |
| Fluorescence Microscope | Nikon, Japan | FN1 | |
| LED light source | Lumen Dynamics Group, Canada | X-cite 120LED | |
| micropipettes | Harvard apparatus | GC150TF | extracelluar recording |
| borosilicate micropipettes | Sutter, USA | BF150-86 | patch clamp |
| tungsten electrode | A-M Systems, USA | 575500 | |
| peristaltic pump | Longer, China | BT00-300T | |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0309 | 1x inflow, ID: 1.02 mm |
| tubes for peristaltic pump | ISMATEC, Wertheim, Germany | SC0319 | 2x tubes for outflow, ID: 2.79 mm |
| CCD camera | PCO, Germany | pco.edge sCMOS | |
| lens cleaning paper | Kodak | ||
| 50 mL conical centrifuge tube | Thermo scientific | 339652 | |
| Prechamber | Warner Instruments | BSC-PC | |
| Inline heater | Warner Instruments | SF-28 | |
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B |
References
- McIlwain, H. Metabolic response in vitro to electrical stimulation of sections of mammalian brain. Biochem J. 48 (4), (1951).
- McIlwain, H., Richards, C. D., Somerville, A. R. Responses in vitro from the piriform cortex of the rat, and their susceptibility to centrally-acting drugs. J Neurochem. 14 (9), 937-938 (1967).
- Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13 (12), 1333-1343 (1966).
- Andersen, P., Bliss, T. V., Lomo, T., Olsen, L. I., Skrede, K. K. Lamellar organization of hippocampal excitatory pathways. Acta Physiol Scand. 76 (1), 4-5 (1969).
- Skrede, K. K., Westgaard, R. H. The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro. Brain Res. 35 (2), 589-593 (1971).
- Kirov, S. A., Sorra, K. E., Harris, K. M. Slices have more synapses than perfusion-fixed hippocampus from both young and mature rats. J Neurosci. 19 (8), 2876-2886 (1999).
- Schwartzkroin, P. A. Characteristics of CA1 neurons recorded intracellularly in the hippocampal in vitro slice preparation. Brain Res. 85 (3), 423-436 (1975).
- Schwartzkroin, P. A., Wester, K. Long-lasting facilitation of a synaptic potential following tetanization in the in vitro hippocampal slice. Brain Res. 89 (1), 107-119 (1975).
- Reymann, K. G., Frey, J. U. The late maintenance of hippocampal LTP: requirements, phases, 'synaptic tagging', 'late-associativity' and implications. Neuropharm. 52 (1), 24-40 (2007).
- Bliss, T. V., Collingridge, G. L., Morris, R. G. Synaptic plasticity in health and disease: introduction and overview. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 369 (1633), 20130129 (2014).
- Bliss, T. V., Gardner-Medwin, A. R. Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the unanaestetized rabbit following stimulation of the perforant path. J Physiol. 232 (2), 357-374 (1973).
- Reid, K. H., Edmonds, H. L., Schurr, A., Tseng, M. T., West, C. A. Pitfalls in the Use of Brain-Slices. Prog Neurobiol. 31 (1), 1-18 (1988).
- Rambani, K., Vukasinovic, J., Glezer, A., Potter, S. M. Culturing thick brain slices: an interstitial 3D microperfusion system for enhanced viability. J Neurosci Methods. 180 (2), 243-254 (2009).
- Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. Eur J Neurosci. 29 (2), 319-327 (2009).
- Redondo, R. L., et al. Synaptic tagging and capture: differential role of distinct calcium/calmodulin kinases in protein synthesis-dependent long-term potentiation. J Neurosci. 30 (14), 4981-4989 (2010).
- Stopps, M., et al. Design and application of a novel brain slice system that permits independent electrophysiological recordings from multiple slices. J Neurosci Methods. 132 (2), 137-148 (2004).
- Behnisch, T., Matsushita, S., Knopfel, T. Imaging of gene expression during long-term potentiation. Neuroreport. 15 (13), 2039-2043 (2004).
- Karpova, A., et al. Encoding and transducing the synaptic or extrasynaptic origin of NMDA receptor signals to the nucleus. Cell. 152 (5), 1119-1133 (2013).
- Karpova, A., Mikhaylova, M., Thomas, U., Knopfel, T., Behnisch, T. Involvement of protein synthesis and degradation in long-term potentiation of Schaffer collateral CA1 synapses. J Neurosci. 26 (18), 4949-4955 (2006).
- Weng, W., Chen, Y., Wang, M., Zhuang, Y., Behnisch, T. Potentiation of Schaffer-Collateral CA1 Synaptic Transmission by eEF2K and p38 MAPK Mediated Mechanisms. Front Cell Neurosci. 10 (247), (2016).
- Meduna, L. J., Jackman, A. I. Carbon dioxide inhalation therapy. Res Publ Assoc Res Nerv Ment Dis. 31, 280-286 (1953).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. J Vis Exp. (49), (2011).
- Yuanxiang, P., Bera, S., Karpova, A., Kreutz, M. R., Mikhaylova, M. Isolation of CA1 nuclear enriched fractions from hippocampal slices to study activity-dependent nuclear import of synapto-nuclear messenger proteins. J Vis Exp. (90), e51310 (2014).
- Leutgeb, J. K., Frey, J. U., Behnisch, T. LTP in cultured hippocampal-entorhinal cortex slices from young adult (P25-30) rats. J Neurosci Meth. 130 (1), 19-32 (2003).
- Kloosterman, F., Peloquin, P., Leung, L. S. Apical and basal orthodromic population spikes in hippocampal CA1 in vivo show different origins and patterns of propagation. J Neurophysiol. 86 (5), 2435-2444 (2001).
- Thiemann, W., Malisch, R., Reymann, K. G. A new microcirculation chamber for inexpensive long-term investigations of nervous tissue in vitro. Brain Res Bull. 17 (1), 1-4 (1986).
- Shetty, M. S., et al. Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents. J Vis Exp. (103), (2015).
- Du, H., Lin, J., Zuercher, C. Higher efficiency of CO2 injection into seawater by a venturi than a conventional diffuser system. Bioresour Technol. 107, 131-134 (2012).
- Weinman, J., Mahler, J. An Analysis of Electrical Properties of Metal Electrodes. Med Electron Biol Eng. 2, 299-310 (1964).
- Fanselow, M. S., Dong, H. W. Are the dorsal and ventral hippocampus functionally distinct structures. Neuron. 65 (1), 7-19 (2010).
- Wang, M., et al. Translation of BDNF-gene transcripts with short 3' UTR in hippocampal CA1 neurons improves memory formation and enhances synaptic plasticity-relevant signaling pathways. Neurobiol Learn Mem. , (2016).
