Summary
I denne studien presenteres metodikken for hvordan man utfører elektrofysiologiske innspillingssystemer i multi-site fra hyperdirektveien under uretanbedøvelse.
Abstract
Konvergerende bevis viser at mange nevropsykiatriske sykdommer skal forstås som forstyrrelser i storskala nevrale nettverk. For bedre å forstå det patofysiologiske grunnlaget for disse sykdommene, er det nødvendig å nøyaktig karakterisere på hvilken måte foredlingen av informasjon er forstyrret mellom de forskjellige nevroniske deler av kretsen. Ved bruk av ekstracellulære in vivo elektrofysiologiske opptak, er det mulig å nøyaktig avgrense nevronaktivitet i et nevronalt nettverk. Anvendelsen av denne metoden har flere fordeler i forhold til alternative teknikker, for eksempel funksjonell magnetisk resonansbilder og kalsiumbilder, da det tillater en unik tidsmessig og romlig oppløsning og ikke stole på genmodifiserte organismer. Imidlertid er bruken av ekstracellulære in vivo- opptak begrenset, da det er en invasiv teknikk som ikke kan brukes universelt. I denne artikkelen presenteres en enkel og lett å bruke metode wDer det er mulig å samtidig registrere ekstracellulære potensialer som lokale feltpotensialer og multiunitaktivitet på flere steder i et nettverk. Det er detaljert hvordan en nøyaktig målretting av subkortiske kjerne kan oppnås ved hjelp av en kombinasjon av stereotaktisk kirurgi og online analyse av multi-unit-opptak. Det er således demonstrert hvordan et komplett nettverk, som den hyperdirektiske cortico-basale ganglia-sløyfen, kan studeres i bedøvede dyr in vivo .
Introduction
Nylige kumulative bevis på ulike neuropsykiatriske forstyrrelser som Parkinsons sykdom (PD) og skizofreni tyder sterkt på at deres patofysiologi er basert på en kritisk dysfunksjon av utvidede nevronkretser som ofte involverer kortikale og subkortiske strukturer 1 , 2 , 3 . I følge denne teorien oppstår de kliniske manifestasjonene av sykdommene som en konsekvens av en svekket informasjonskapasitet for et nettverk av celler i stedet for enkeltceller eller spesifikke nevronelementer 1 , 2 , 3 . For å forbedre forståelsen av denne komplekse gruppen av nevropsykiatriske sykdommer og for å finne nye behandlingsalternativer, er det obligatorisk å karakterisere nevroniske dynamikken til de uordente nettverkene hos mennesker og i dyremodeller i detalj. Et utmerketEnt metode for å studere store nettverk i levende fag er multi-site elektrofysiologiske opptak av ekstracellulære potensialer 4 . Ved hjelp av denne metoden er det mulig å samtidig vurdere lokale feltpotensialer (LFPs), som primært representerer den tidsmessige summeringen av excitatoriske og inhibitoriske postsynaptiske strømmer og multi-unit aktivitet (MUA), som genereres av presynaptiske potensialer 5 . Opptaket av ekstracellulære potensialer har flere fordeler i forhold til alternative metoder for å studere nettverk, for eksempel funksjonell magnetisk resonansavbildning og kalsiumbilding, fordi det gir en høyere temporal og romlig oppløsning og fordi den ikke er avhengig av genetisk konstruerte organismer 5 . Imidlertid er bruken av ekstracellulære in vivo- opptak begrenset, da det er en invasiv teknikk som ikke kan brukes universelt.
In vivo elektrofysiologisk rekOrdninger kan utføres i våken så vel som i bedøvede dyr 6 . Begge metodene er ledsaget av bestemte fordeler og ulemper. Studier i våte dyr tillater opptak av hjernesignaler under utførelsen av definerte atferdsoppgaver, men er utsatt for bevegelsesrelaterte og andre gjenstander 7 , 8 . Opptak i bedøvede dyr gir derimot muligheten til å vurdere LFP og MUA med et minimum av artefakter ved høydefinerte kortikale synkroniseringsstilstander, men resultatene avviger også til en viss grad til det som finnes i våken fag 9 , 10 , 11 .
I de senere år har det vist seg at prøvetaking av LFP er spesielt nyttig for å avgrense patologiske endringer av nettverksaktivitet. Et fremtredende eksempel på dette er forskning på patofysiologi av PD i menneskelig pasientS og dyremodeller av sykdommen, hvor det kunne bli vist at forbedrede beta-oscillasjoner i cortico-basal ganglia-sløyfen er knyttet til parkinsoniske motoriske symptomer 12 , 13 . Som en følge av denne forskningen, er det for tiden undersøkt om beta-svingninger kan brukes som en online tilbakemelding biomarkør for lukket hjuls dyp hjerne stimulering 14 , 15 .
I den foreliggende studien er det gitt en detaljert beskrivelse av akutte multi-site in vivo elektrofysiologiske opptak av LFP og MUA hos rotter bedøvet med uretan. Det er demonstrert hvordan et komplett nettverk, som den hyperdirektiske cortico-basale ganglia-banen, kan karakteriseres elektrofysiologisk ved hjelp av standard og tilpassede elektroder og hvordan disse elektrodene kan bygges. Det legges særlig vekt på hvordan en presis målretting av basale ganglia kjerner kan oppnås ved coMbining stereotaktisk kirurgi sammen med online registrering av MUAs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med tysk lov om dyrevelferd (sist revidert i 2014) og europeiske forskrifter (2010/63 / EU). Eksperimenter ble godkjent av den lokale dyrevelferdsmyndigheten (LaGeSo, Berlin), og i samsvar med lokale avdelinger og internasjonale retningslinjer.
MERK: I den presenterte metoden brukes to elektrodemodeller til å registreres fra den hyperdirektiske cortico-basale ganglia-banen som forbinder primærmotorcortexen (M1) med subthalamuskjernen (STN) og substantia nigra pars reticulate (SNr). For epidural elektrokortikogram (ECoG) brukes opptak fra M1 tilpassede lavimpedans Ag / AgCl elektroder. Opptakene fra STN og SNr utføres med kommersielt tilgjengelige høyimpedans wolframelektroder.
1. Konstruksjon av Epidural Ag / AgCl Epidural Elektroder
- Ta en ca. 5 cm lang stripe med 99,99% ren sølvtråd med diametreR på 200 μm og fjern eventuelt belegg.
- Hold ledetråden med spissen nedover i en flamme av en lighter eller stearinlys til spissen begynner å smelte. Vent til spissen er kuleformet og har en diameter på ca 1 mm. Klipp av den forformede elektroden til en total lengde på 15 mm fra begynnelsen av den kulformede spissen til ledningens ende.
- Løsn en presisjonskontakt til trådenden, som passer til det brukte elektrofysiologiske opptakssystemet. Dekk loddetidet fra ledningens ende til kontakten med ledende sølvlakk. Dette bidrar til ledningsevne og gir bedre signalkvalitet.
- Etter at den ledende lakken har tørket, skal du dekke loddepunktet med et 3 mm til 1 mm varmekrympeslange. Forsiktig bruk en urmakers hammer til å flate den kuleformede spissen til halv tykkelsen.
- Ta på eksamenshansker og ta en luddfri rengjøringsklut med 100% etanol for å fjerne smuss og fett.
- Sett elektrodene innEt 15 ml centrifugerør eller cellekulturrør og fyll det opp med klorblekemiddel til husholdning (FORSIKTIG, inneholder 2,8 g natriumhypoklorid per 100 g løsningsmiddel) til den kuleformede spissen er helt dekket.
FORSIKTIG: Klorblekemiddel er etsende; Følg alltid produsentens sikkerhetsanvisninger. - Ta elektrodene ut etter 23 minutter og spyl dem generøst med destillert vann. Den vellykkede anvendelse av et sølvkloridlag fremstår som en homogen lilla forandring i farge.
- Tørk i luften. Etter helt tørket, ta elektrodene med fine pinsetter. Med en fin pensel bør du bruke væskeisolasjon. Start på ledningen rett bak elektrodespissen og dekk alt opp til varmekrympeslangen. La isolasjonen tørke i minst 2 timer.
- For kvalitetskontroll, utfør en kontroll av elektrisk ledningsevne med et multimeter. Hvis det er tilgjengelig, utfør impedans testing ved 1 kHz ved hjelp av en passende impedansmåler, mens elektroden og testenSonden settes sammen i en 0,9% NaCl som inneholder H20 løsning uten å berøre hverandre. Impedansverdier ved 1 kHz skal være ca 8 kΩ.
2. Fest elektrodene til en stereotaksisk holder
MERK: For å registrere MUA og LFP samtidig, bruk wolframmikrofilelektroder med en impedans på 1,5 MΩ. Hvis fokuset på opptakene er på høyopptak av enkeltenheter, velg mikrofireelektroder med høyere impedans (> 5 MΩ). Hvis målet med studien er rettet mot LFPs, kan elektroder med lavere impedanser være akseptable. For små strukturer, for hvilke dorsoventrale stereotaksiske justeringer ofte er nødvendige, bruk par elektroder med passende dorsoventral spisseparasjon (i dette tilfellet 250 μm). Videre gir dette fordelen av en mer lokal referanselektrode, om nødvendig. De stereotaksiske koordinatene måles alltid fra den nederste elektroden og aRe beregnet i referanse til bregma.
- Ta en standard stereotaksisk elektrodeholder med en akrylblokk og klemme og legg den på en flat overflate i synsfeltet på et kirurgisk mikroskop.
- Fest det første par elektroder løst løs til akrylblokken på holderen med stykker tape (3 mm x 8 mm) ved hjelp av fine pinsetter. Elektrodene skal stikke akrylblokken ca. 12 mm.
- Sett forsiktig den andre bipolare elektroden ved siden av den første elektroden. For å målrette strukturen til hyperdirektveien, skal avstanden være 2 mm ( figur 1 ). For de fleste standard stereotaxiske elektrodeholdere er dette den tilstøtende fordypningen. Bruk en måler for å verifisere. Ulike nettverk kan kontaktes på samme måte. For dette kan akrylblokken vendes til en viss grad.
- Juster det andre paret elektroder ved å skyve det forsiktig til en posisjon, hvor den mest ventrale spissen er ca. 200Μm forsynt i forhold til den første elektroden ( figur 1 ). Gjør dette under mikroskopisk syn. For dette, bruk en 30 G kanyle (ytre diameter 300 μm) for å bedre estimere avstanden.
- Trykk på klebebåndet, og fest det med holderenes metallklemme.
3. Kirurgi
- For elektrofysiologiske opptak, bruk uretan (FORSIKTIG) for anestesi.
Forsiktig: Uretan er giftig og kreftfremkallende, så følg alltid sikkerhetsforskriften og databladet gitt av stoffets produsent. - Klargjør en løsning av 200 mg / ml uretan i 0,9% NaCl medisinsk saltløsning.
- Administrer totalt 1,3 g / kg kroppsvekt uretan intraperitonealt (IP). Avhengig av rottebelastningen kan det være rimelig å dele dosen i to doser med et 15 min intervall mellom injeksjonene for å øke sikkerheten til bedøvelsen.
- Kontroller dybden av anestesi ved å bruke pEdal-tilbaketrekningsrefleks og andre egnede reflekser. Hvis bedøvelsen ikke er dyp nok til å utføre kirurgi, injiser du 0,15 g / kg kroppsvekt av uretan-IP og vent ytterligere 15 minutter.
- Påfør et øyesalve for å forhindre korneal dehydrering.
- Overvåk kontinuerlig respirasjonsfrekvens og tilbaketrekningsfrekvens under anestesi. Bruk en liten dyrepute med temperaturkontroll for å sikre at en fysiologisk kroppstemperatur opprettholdes gjennom hele operasjonen. Før de elektrofysiologiske opptakene starter, bytt til et ikke-elektrisk alternativ ( f.eks. Natriumacetatpute).
- Barber pelsen sammen med den dorsale siden av hodet for å oppnå et rent kirurgisk felt. Desinfiser rundt innsnittet med egnet kirurgisk desinfeksjonsmiddel. Fest dyret i stereotaktisk ramme.
- Utfør en 2 cm lang snitt av hodebunnen i sagittal retning med en skalpell. Bruk en skalpell til å litt skrape av skallen aponeurosis og desinfisere skallen. Bruk coTton knopper gjennomvåt i 3% H 2 O 2 for å fjerne gjenværende vev.
- Bruk en elektrocauter eller termocauter til å kontrollere blødning, om nødvendig. Stopp blødninger fra skallenbenet og hypodermen hvis blødningen ikke stopper spontant etter 1-2 minutter og hindrer synet på skallen.
- Juster forspenningsbjelken til hodet er plassert i flathodestilling, noe som betyr at bregma og lambda som stereotaksiske referansepunkter er i samme plan. Dette er viktigst for å oppnå høy kirurgisk presisjon. Bruk et standard stereotaksisk rotasjonsjusteringsverktøy, kalibrere det angitte tipset til bregma under mikroskopisk syn og juster skjærstangen til de angitte punktene for bregma og lambda på verktøyet berører skallen på samme tid.
MERK: En visning fra den ene siden med fokusert lys fra den andre kan bidra til å bestemme denne tilstanden. Alternativt kan du ta en stereotaksisk holder med en fin kanyle og måle de dorsoventrale koordinatene til Bregma aNd lambda under mikroskopisk syn. Juster skjærstangen til de dorsoventrale koordinatene til Bregma og lambda er de samme. - Bruk en stereotaksisk holder med kanyle, kalibrere til bregmaen og beregne deretter posisjonen til alle borehullene på skallen. Bruk stereotaksisk holderen til å markere posisjonene til hullene som skal bores, enten ved å forsiktig skrape skallen eller ved å bruke en kirurgisk fargemarkør. Koordinatene for dette avhenger av målene, koordinater med referanse til bregmaen er gitt for hyperdirektveien i tabell 1 , inkludert de foreslåtte koordinatene for cerebellarreferanseelektroder.
- Ved å bruke en mikrodrill bor nøye alle hull. For STN og SNr bor et felles hull (ca 2 mm x 3 mm i størrelse). Alle andre borehull bør ha en diameter på ca 1 mm.
- Ta to fine kanyler (minst 27 G) og bøy deres tips for å danne en hektet form ved hjelp av en hard overflate eller pincett. Bruk disse til å fjerne eventuelle debriS fra borehullene, og skar forsiktig og fjern dura materen i det felles STN / SNr hullet.
- Spyl borehullene med fysiologisk saltvann. Påfør en dråpe fysiologisk saltløsning hvert 15. minutt til borehullene for å forhindre at hjernen og dura tørker ut.
- Ta en mikrodrill og matchende rustfritt stålmikroskrue (for eksempel en M 1,2 mm x 2 mm skrue), bor et hull og skru inn en mikroskrue mellom borebrønnene i referanse-epiduralelektroder over cerebellum, gjør det samme for M1 epidural elektroder.
- Skyv de selvbygde Ag / AgCl epidural elektrodene inn i borehullene for referanseelektroder og M1-elektroder. Før elektrodespissen med fine pinsetter og skyv den rett under skallenbenet inn i borehullet.
- Fest alle epidural elektroder med to-komponent dental akryl. Pass på at du ikke dekker bregma-punktet eller påvirker det vanlige STN / SNr-hullet.
- Sett den forberedte holderen med wolframmikrofilelektrodenEs i den stereotaksiske rammen.
- Kalibrere den mest ventrale elektroden, som er beregnet til å målrette mot STN, til bregma. Juster til den beregnede posisjonen over det vanlige STN / SNr-hullet og senk elektrodene ned til hjernen under mikroskopisk syn. Forsikre deg om at wolframmikrolyselektroderene går jevnt i hjernen.
4. Elektrofysiologisk kartlegging og opptak
MERK: For dette trinnet er det nødvendig med et Faraday bur og et flerkanals elektrofysiologisk opptakssystem med innspillingsprogramvare som er i stand til å filtrere online og spike. Bruk helst et system som virker med en forforsterker som er plassert nær dyrets hode for å holde elektrisk støy og gjenstander til et absolutt minimum. Foruten wolframmikrofilelektrodene er minst en epidural og en referanseelektrode nødvendig for å utføre opptak av hyperdirektveien. Det anbefales å sette inn epidural og referencE elektroder parvis uten at de berører hverandre, dette hjelper i tilfelle feil og muliggjør ulike typer referanser i data analyse.
- Sett en mobil Faraday bur over stereotaksisk ramme. Hvis bare et stasjonært Faraday-bur er tilgjengelig, flytt forsiktig den stereotaksiske rammen inn i Faraday-buret mens du sørger for at dype hjerneelektroder ikke senkes inn i hjernen til den stereotaksiske rammen er i sin endelige posisjon.
- Koble elektrodene til hodet av det elektrofysiologiske oppsettet. Kontroller at referanselektroderene er koblet til passende referansekanaler.
- Sett opp innspillingsprogramvaren: Bandpass-filter (0,05-8,000 Hz) og forsterker (få 1.500-2.000x) det rå datasignalet. Bruk et online LFP og piggfilter med passende innstillinger (bandpassfilter 0,05-250 Hz for LFPs, bandpassfilter 300-8000 Hz for MUA). For alle filtre, bruk et butterworth-type filter.
- Sett opp en spike terskel, hvis aktuelt, for onlinE spike sortering. De fleste innspillingsprogramvarene gjør det mulig å sette opp en spike-terskel, som er en amplitudeverdi over hvilken et signal er merket som en spike av programvaren. Denne terskelen kan enten bestemmes matematisk som en faktor eller standardavvik av middelamplituden til det filtrerte spikesignalet, eller kan fortrinnsvis bestemmes ved visuell inspeksjon av datasegmenter <500 ms og settes opp som en linje over signalstøyen i en grafisk brukergrensesnitt.
MERK: Formålet med å opprette en spike-terskel er å telle pigger og sortere enheter for å gi informasjon om hvor mange nevroner som for tiden er registrert, og hvordan pigger er formet. - Senk wolfram-mikroelektroder sakte til 1 mm dorsal av målet, som er STN for hyperdirektvei. Vent til signalet stabiliseres om nødvendig.
- For elektrofysiologisk kartlegging, før elektrodene ventralt i trinn på 100 μm. På hvert trinn vurderer du skytemønsteret, skyter rSpiste og form av pigger. Sammenlign de med de typiske eksemplene som er gitt i figur 2 . Vanligvis viser tette kjerner fort og kontinuerlig spiking over flere dorsoventrale trinn, mens fiberrike strukturer viser lave brennhastigheter og mindre homogen spikeaktivitet i etterfølgende ventrale trinn.
- For hyperdirektveien, sørg for at den mest ventrale elektroden er inne i STN.
MERK: STN er nådd når en betydelig økning i MUA oppdages ventral av Zona incerta. Ventral til STN, spiking stopper nesten helt fordi elektroden har nådd den indre kapsel. Når den mest ventrale elektroden er i STN, sikrer konfigurasjonen av wolframmikroelektroder den bakre, andre elektroden er i SNr. Dorsoventral finjustering i små trinn kan være nødvendig for å registrere typisk MUA i STN og SNr samtidig. Merk at frekvensen av MUA avhenger av antall neuroner som faktisk er registrert og på hjernenivåaktivering. - Når elektrodene er i de ønskede strukturene, må du opprette online filtrering og spikesortering (se figur 4 ), og deretter starte opptaket av dataene. Typiske eksempler på de ulike kortikale synkroniseringsstatusene som kan identifiseres i LFP-opptakene er vist i figur 3 .
5. End of Experiment
- Når opptakene er ferdige, øker elektrodene langsomt ut av hjernen og spyler dem øyeblikkelig med fysiologisk saltvann. Elektrodene kan gjenbrukes etter grundig spyling og visuell inspeksjon. Utladningsbøyelektroder.
- Euthanize dyrene ved en IP-injeksjon av en overdose uretan (2,5 g / kg kroppsvekt).
MERK: Uretan bør bare brukes til sluttprosedyrer. - Hvis det kreves histologisk verifisering av elektrodposisjonen eller andre histologiske fargeprosedyrer, fjern hjernen fra skallen og behandle denVev passende.
MERK: Avhengig av tilsiktede fargemetoder kan transkardiell perfusjon være nødvendig. For etter mortem verifisering av elektrodposisjonen er en standard Nissl-farging tilstrekkelig i de fleste tilfeller for å visualisere elektrodbanen i f.eks. Koronale hjerneseksjoner. Ytterligere tilnærminger for å lette histologisk målverifikasjon inkluderer bruk av elektrisk inducerte lesjoner i hjernevævet ved å påføre elektrisk strøm via opptakselektroder eller påføring av biokompatibelt fargestoff før elektrodeinnsetting 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med de heri brukte opptakselektroder, er det mulig å prøve LFPer fra primærmotorisk cortex, subthalamuskjernen og substantia nigra pars reticulata og MUA fra STN og SNr. I utgangspunktet registreres LFPs og multi-unit aktivitet sammen i et bredbåndssignal. Deretter separeres LFP og MUAs med bandpassfiltre (0,05-250 Hz for LFP og 300-4000 Hz for MUA).
For riktig målretting av subkortiske kjerner, spesielt av små strukturer som STN, er det fordelaktig å justere de planlagte stereotaksiske koordinatene med elektronisk registrert MUA-signal. For elektrodebane-målingen kan det STN-karakteristiske MUA-mønsteret registreres ( figur 2 ) 9 , 20 .
For senere trinn av analysen er detOfte obligatorisk å definere enkelt enheter fra multi-enhet aktivitet ved prinsippkomponentanalyse ( figur 4 ).
I LFP-opptakene fra M1 kan to spontant alternerende kortikale synkroniseringsstilstander identifiseres: Aktivert tilstand (AS) og Slow Wave Activity (SWA) tilstand ( Figur 3 ) 18 , 19 . Mens SWA-staten domineres av langsomt svingninger med høy amplitude på rundt 1 Hz, kjennetegnes AS ved raskere svingninger med lavere amplitude ( figur 3 ).
Figur 1: Konfigurasjon av dyphjerne-mikrobølgeelektroder i en standard stereotaksisk holder. Legg merke til spisseparasjonen mellom A, elektrodeparet forSTN og B, elektrodeparet for SNr i dorsoventral retning på ca. 200 μm og anterioposterior retning ca. 2 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Karakteristisk multi-enhet aktivitet fra en Dorsoventral elektrodbane Målretting av STN. ( A ) Multi-enhet registreringer av den ventrale posteromediale thalaminkjernen (VPM), zona incerta (ZI), subthalamuskjernen (STN) og substantia nigra pars reticularis (SNr). VPM utviser sparsomme og uregelmessige mellomrom med høy amplitude. Dette mønsteret av pigger opphører når nærmer seg ZI. Når elektroden går inn i STN et typisk høyfrekvent fyringsmønster med korte sprekker med medium forsterkningUde kan observeres. SNr kan identifiseres ved sitt høye amplitude og vanlige brennemønster. ( B) STN-baner legges over på bilder fra en rotte-stereotaktisk atlas 21 . Øvre del: koronalplan. Nedre del: sagittalplan. Merk passeringen av elektrodespissen gjennom VPM og ZI. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3. Kortiske synkroniseringsstater i LFP-opptak fra primær motorcortex under uretananestesi. ( A ) Representant 600 s LFP-opptak av primærmotorkortexen. Tidsperioder med høyfrekvens, lav amplitudeaktivitet som svarer til aktivert tilstand (i) og tidsperioder med langsommere rytme og høye Er amplitude som tilsvarer tilstanden Slow Wave Activity (ii), kan differensieres. ( B ) Tilsvarende tidsfrekvensplan over et intervall på 600 s som viser 0-20 Hz relativ effekt av LFPene presentert i (A). Varmere fargestoffer indikerer høyere relativ effekt. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Sortering av enkle enheter fra STN Multi-unit Activity. ( A ) Tredimensjonal visning av enhetsklynger i funksjonsrommet etter hovedkomponentanalyse. Hver klynge representerer en formodet enkelt enhet. ( B ) Spike bølgeformer og spike bølgeform gjennomsnitt som tilsvarer klyngene i (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Koordinater fra Bregma | STN | SNR | M1 | Referanse 1 | Referanse 2 |
| anterior-posterior | -3,6 | -4,8 | 3,0 | -10,0 | -10,0 |
| medial-lateral | 2,5 | 2,5 | 3,0 | 3,0 | -3,0 |
| dorsal-ventral | -8,0 | na | na | na | na |
Tabell 1: Stereotaksiske koordinater for opptak av Hyperdirect CoRtico-basal ganglia banen. Alle punkter måles fra bregma referansepunkt på skallen i mm; Ikke anvendelig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I den foreliggende studien er metoden demonstrert hvordan man registrerer ekstracellulære elektrofysiologiske signaler samtidig fra flere steder i et gitt nettverk ved hjelp av eksemplet på hyperdirect cortico-basal ganglia-banen som forbinder M1 med STN og SNr i gnagere.
Et kritisk trinn i opptak av små subkortiske strukturer som STN er den nøyaktig styrte innsetting av opptakselektroder inn i målet. I den presenterte metoden sørger det for å ta vare på to viktige skritt en høy nøyaktighet av målingen. Når du forbereder dyret i det stereotaktiske apparatet før elektrodene blir introdusert i hjernen, er det absolutt obligatorisk å sørge for at skallen blir ført inn i "flatskjell" -posisjonen 22 . For å oppnå den flate skalleposisjonen endres posisjonen til forkjølingsstangen av den stereotaktiske rammen til høydene til bregma- og lambda-referansepunktene oN skallen er på samme dorsoventralplan 21 . Bare ved å sikre denne posisjonen kan koordinater funnet i stereotaktiske atlasser påføres med høyt presisjonsnivå til det enkelte laboratoriedyr, siden atlassene er basert på den flate skalleposisjonen 21 . Eksperimentelt bevis viser også at målretningsnøyaktigheten ved hjelp av en individualisert flat skjoldstilling er overlegen til en fast justering av skjærstangen 23 . Plasseringen av innspillingselektroder i dorsoventralplanet bør finjusteres ved konstant registrering av multi-unit-aktivitet. De forskjellige kjerne- og hvite materia-strukturer langs elektrodbanen viser karakteristiske brannmønstre ( Figur 2 ), som kan brukes til å justere elektrodens 9 , 20 posisjon .
Et annet viktig skritt i den presenterte metoden er plasseringen av rEference elektrode. I den presenterte protokollen ble en posisjon over cerebellar cortex valgt fordi på dette punkt ikke detekterer den cortico-basale gangliaaktiviteten som var det sentrale punktet i studien. I studier med interesse for analysemetoder som er utsatt for volumledelse, bør en mer lokal referanse gis 5 .
Uretan er en mye brukt bedøvelse for opptak av neuronale ekstracellulære potensialer i dyreforskning 11 , 18 , 24 , 25 , 26 . Årsaken til dette er at en enkeltdose uretan kan produsere en stabil og langvarig narkose i 8-12 timer med bare begrenset depresjon av sentralnervesystemet i forhold til andre bedøvelsesmidler 27 . Men uretan anesthesiA aktiverer også sympatisk nervesystem, noe som kan føre til uønskede bivirkninger som for eksempel hyperglykemi 27 . På grunn av sin langvarige virkning og mangelen på et kraftig stoff for å motvirke sin bedøvelseseffekt, bør uretan ikke brukes til gjentatte forsøk som er adskilt av timer eller dager. Hvis det er planlagt å gjøre flere opptakssesjoner på samme dyr eller hvis det er en teknisk grunn til ikke å bruke uretan, kan gassbedøvelse med isofluran og injeksjoner av medisiner som ketamin og xylazin være rimelige alternativer for elektrofysiologiske in vivo- eksperimenter 28 , 29 . Ulempen med disse narkotiske regimer er at de krever hyppigere overvåkning og justeringer enn bruk av uretan, på grunn av deres korte halveringstid og akkumulering av legemidlene over tid. Videre er det bevis på at uretan kan forstyrre mindre med fysiologisk b Regnaktivitet enn andre bedøvelsesmidler 30 .
Alle de detaljerte opptaksbetingelsene heri bestemmer kritisk hvordan de oppnådde dataene kan bearbeides videre og analyseres offline, derfor er det obligatorisk å justere alle innstillinger til kravene i de planlagte analysestrinnene. Siden det er mange muligheter for analyse av multikanals ekstracellulære opptak, kan bruk av tilgjengelige åpen kildekode-verktøykasser være fordelaktig 31 .
Innspillingen av ekstracellulære potensialer in vivo er en metode som gir en unik tidsmessig og romlig oppløsning av hjerne signaler som er overlegen mot alternative metoder som funksjonell magnetisk resonans imaging og kalsium imaging 5 . Den presenterte metoden kan ikke bare brukes på opptak av hyperdirektveien, men kan lett justeres til en rekke andre eksperimentelle modeller og forskningsspørsmålF "> 24 , 32 , 33. Men siden det innebærer stereotaktisk kirurgi, er det mange forskningsinnstillinger der det ikke kan brukes og hvor en ikke-invasiv metode skal velges.
I fremtiden bør en kombinasjon av den presenterte ekstracellulære multi-site-opptaksteknikken med optogenetiske verktøy realiseres for å ytterligere forbedre vår forståelse av nettverksdysfunksjonen som ligger til grunn for forskjellige nevropsykiatriske sykdommer for å finne nye behandlinger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, for å finansiere vår studie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
