Summary
В этом исследовании представлена методология проведения многофакторных электрофизиологических записей in vivo из гиперректального пути под уретановой анестезией.
Abstract
Сходящиеся данные свидетельствуют о том, что многие нейропсихиатрические болезни следует понимать как расстройства крупномасштабных нейронных сетей. Чтобы лучше понять патофизиологическую основу этих заболеваний, необходимо точно охарактеризовать, каким образом обработка информации нарушается между различными нейронными частями схемы. Используя внеклеточную электрофизиологическую запись in vivo , можно точно определить активность нейронов в нейронной сети. Применение этого метода имеет ряд преимуществ по сравнению с альтернативными методами, например , с помощью функциональной магнитно-резонансной томографии и визуализации кальция, поскольку оно обеспечивает уникальное временное и пространственное разрешение и не зависит от генетически модифицированных организмов. Однако использование внеклеточных записей in vivo ограничено, поскольку оно является инвазивным методом, который нельзя применять повсеместно. В этой статье представлен простой и простой в использовании метод wС которой можно одновременно записывать внеклеточные потенциалы, такие как локальные потенциалы поля и многоуровневую активность на нескольких сайтах сети. Подробно, как можно добиться точного нацеливания подкорковых ядер с использованием комбинации стереотаксической хирургии и онлайн-анализа многоуровневых записей. Таким образом, показано, как полная сеть, такая как гиперректальная кортико-базальная ганглия-петля, может быть изучена у анестезированных животных in vivo .
Introduction
Недавние кумулятивные данные о различных нейропсихиатрических расстройствах, таких как болезнь Паркинсона (ПД) и шизофрения, свидетельствуют о том, что их патофизиология основана на критической дисфункции удлиненных нейронных схем, которые часто включают корковые и подкорковые структуры 1 , 2 , 3 . Согласно этой теории, клинические проявления заболеваний возникают вследствие нарушения информационной способности обработки сети клеток вместо отдельных клеток или специфических нейронных элементов 1 , 2 , 3 . Чтобы улучшить понимание этой сложной группы нейропсихиатрических заболеваний и найти новые варианты лечения, очень важно охарактеризовать динамику нейронов этих неупорядоченных сетей у пациентов с людьми и на животных моделях. ПревосходныйМетод изучения крупномасштабных сетей у живых существ - многофазная электрофизиологическая запись внеклеточных потенциалов 4 . Используя этот метод, можно одновременно оценить локальные потенциалы поля (LFP), которые в первую очередь представляют временное суммирование возбуждающих и тормозных постсинаптических токов и многоузловой активности (MUA), которая генерируется пресинаптическими потенциалами 5 . Запись внеклеточных потенциалов имеет несколько преимуществ по сравнению с альтернативными методами изучения сетей, например , с помощью функциональной магнитно-резонансной томографии и визуализации кальция, поскольку она обеспечивает более высокое временное и пространственное разрешение и потому что она не зависит от генетически модифицированных организмов 5 . Однако использование внеклеточных записей in vivo ограничено, поскольку оно является инвазивным методом, который нельзя применять повсеместно.
Электрофизиологическое восстановление in vivoОрдинаты могут выполняться как на спине, так и на животных, подвергшихся анестезии 6 . Оба метода сопровождаются конкретными плюсами и минусами. Исследования на активных животных позволяют регистрировать сигналы мозга во время выполнения определенных поведенческих задач, но подвержены связанным с движением и другим артефактам 7 , 8 . С другой стороны, записи у анестезированных животных дают возможность оценить LFP и MUA с минимальными артефактами в сильно определенных состояниях кортикальной синхронизации, но результаты также в некоторой степени отличаются от того, что можно найти у бодрствующих предметов 9 , 10 , 11 .
В последние годы было продемонстрировано, что выборка LFP особенно полезна для определения патологических изменений сетевой активности. Важным примером этого является исследование патофизиологии ПД у пациентаС и на животных моделях заболевания, где можно было показать, что усиленные бета-колебания в контуре кортико-базальных ганглиев связаны с двигательными симптомами Паркинсона 12 , 13 . Как следствие этой линии исследований, в настоящее время исследуется, могут ли бета-колебания использоваться в качестве онлайн-биомаркера обратной связи для стимуляции глубокого мозга с закрытым контуром 14 , 15 .
В настоящем исследовании представлено подробное описание острой многофакторной электрофизиологической записи LFP и MUA in vivo у крыс, обезболивающих уретан. Показано, как полная сеть, такая как гипердиректный кортико-базальный ганглиевский путь, может быть охарактеризована электрофизиологически с использованием стандартных и настроенных электродов и как эти электроды могут быть построены. Особенно подчеркивается, как точное нацеливание ядер базальных ганглиев может быть достигнуто coMbining стереотаксическая хирургия вместе с онлайн-регистрацией MUA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Экспериментальные процедуры проводились в соответствии с Законом Германии о благополучии животных (последний пересмотренный в 2014 году) и европейскими нормами (2010/63 / ЕС). Эксперименты были одобрены местным органом по охране животных (LaGeSo, Берлин) и соответствовали местным ведомствам и международным руководящим принципам.
ПРИМЕЧАНИЕ. В представленном методе две модели электродов используются для записи с гиперректального кортико-базального ганглиального пути, который соединяет первичный моторный кортик (M1) с субталамическим ядром (STN) и ретикуляцией субстрата nigra (SNr). Для эпидуральных электрокортикограмм (ECoG) используются записи из M1 изготовленных на заказ низкоомных электродов Ag / AgCl. Записи от STN и SNr выполняются с коммерчески доступными высокоимпедантными вольфрамовыми электродами.
1. Строительство эпидуральных электродов Эпидурального Ag / AgCl
- Возьмите ок. Полоса длиной 5 см с чистой серебряной проволокой 99,99% с диаметромR 200 мкм и при необходимости удалите любое покрытие.
- Удерживайте кончик провода кончиком вниз в пламя зажигалки или свечи до тех пор, пока наконечник не начнет таять. Подождите, пока наконечник будет иметь форму шарика и имеет диаметр приблизительно 1 мм. Отрежьте предварительно отформованный электрод до общей длины 15 мм от начала шарообразного наконечника до конца провода.
- Припаяйте прецизионный разъем к концу провода, который подходит для используемой электрофизиологической системы записи. Накройте паяльную точку от конца провода до разъема проводящим серебряным лаком. Это помогает проводить электропроводность и улучшает качество сигнала.
- После того, как проводящий лак высохнет, накройте паяльную трубку термоусадочной трубкой от 3 мм до 1 мм. Внимательно используйте молоток часовщика, чтобы сгладить шарообразный наконечник до половины толщины.
- Наденьте защитные перчатки и возьмите ткань для чистки без ворса с 100% этанолом, чтобы удалить грязь и жир.
- Вставьте электроды в15 мл центрифужную пробирку или пробирку для культивирования клеток и наполните ее хлорным отбеливателем домашнего хозяйства (ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ, содержащее 2,8 г гипохлорида натрия на 100 г растворителя) до полного покрытия шаровидного наконечника.
ВНИМАНИЕ: Отбеливатель хлора является коррозионным; Всегда следуйте инструкциям производителя по технике безопасности. - Выньте электроды через 23 мин и тщательно промойте их дистиллированной водой. Успешное применение слоя хлорида серебра проявляется как однородное фиолетовое изменение цвета.
- Высушите на воздухе. После полного высыхания возьмите электроды с тонким пинцетом. С помощью тонкой кисти нанесите жидкую электрическую изоляцию. Начните с провода непосредственно за наконечником электрода и накройте все до термоусадочной трубки. Дайте изоляции высохнуть не менее 2 часов.
- Для контроля качества выполните проверку электропроводности с помощью мультиметра. Если это возможно, выполните тестирование импеданса на частоте 1 кГц с использованием соответствующего импедансного измерителя, в то время как электрод и тестЗонд объединяют в 0,9% NaCl, содержащем раствор H 2 O, не касаясь друг друга. Значения импеданса на частоте 1 кГц должны быть приблизительно 8 кОм.
2. Прикрепление электродов к стереотаксическому держателю
ПРИМЕЧАНИЕ. Для одновременной записи MUA и LFP используйте микроволновые электроды из вольфрама с импедансом 1,5 МОм. Если фокус записей выполнен на высококачественных записях отдельных единиц, выберите микропроводные электроды с более высоким импедансом (> 5 МОм). Если цель исследования направлена исключительно на LFP, электроды с более низкими импедансами могут быть приемлемыми. Для небольших структур, для которых часто необходимы дорсовентральные стереотаксические регулировки, используйте пары электродов с подходящим отделением дорсовентрального наконечника (в данном случае 250 мкм). Кроме того, это обеспечивает преимущество более локального электрода сравнения, если это необходимо. Стереотаксические координаты всегда измеряются от самого нижнего электрода иПересчитаны по отношению к бредге.
- Возьмите стандартный держатель стереотаксического электрода с акриловым блоком и зажимом и надежно положите его на плоскую поверхность в поле зрения хирургического микроскопа.
- Плотно закрепите первую пару электродов на акриловом блоке держателя кусочками липкой ленты (3 мм x 8 мм) с помощью тонких пинцетов. Электроды должны выступать из акрилового блока ок. 12 мм.
- Тщательно зафиксируйте второй биполярный электрод рядом с первым электродом. Для ориентации структур гипердиадрового пути расстояние должно быть 2 мм ( рис. 1 ). Для большинства стандартных держателей стереотаксических электродов это смежная выемка. Для проверки используйте калибратор. Аналогичным образом можно подойти к различным сетям. Для этого акриловый блок может быть повернут в определенной степени.
- Отрегулируйте вторую пару электродов, осторожно сдвинув ее в положение, в котором самый вентральный наконечник составляет приблизительно 200Мкм по сравнению с первым электродом ( рис. 1 ). Сделайте это под микроскопическим видением. Для этого используйте 30-футовую канюлю (внешний диаметр 300 мкм), чтобы лучше оценить расстояние.
- Надавите на клейкую ленту, а затем закрепите металлическим зажимом держателя.
3. Хирургия
- Для электрофизиологических записей используйте уретан (ВНИМАНИЕ) для анестезии.
Осторожно: Уретан является токсичным и канцерогенным, поэтому всегда придерживайтесь правил безопасности и технических данных, предоставленных производителем вещества. - Подготовьте раствор 200 мг / мл уретана в 0,9% солевом растворе NaCl.
- Администрируйте в общей сложности 1,3 г / кг массы тела уретана внутрибрюшинно (IP). В зависимости от штамма крысы может быть разумным разделить дозу на две дозы с интервалом в 15 минут между инъекциями, чтобы повысить безопасность анестезии.
- Проверьте глубину анестезии, используя pРефлекс рефлексии и другие подходящие рефлексы. Если анестезия недостаточно глубока для проведения операции, введите 0,15 г / кг массы тела уретана и подождите еще 15 мин.
- Нанесите глазную мазь для предотвращения обезвоживания роговицы.
- Постоянно контролируйте частоту дыхания и рефлекс отмены педали во время анестезии. Используйте небольшую нагревательную подушку для животных с контролем температуры, чтобы обеспечить физиологическую температуру тела во время операции. Перед началом электрофизиологических записей замените неэлектрическую альтернативу ( например, насадку для ацетата натрия).
- Бритье мехом рядом с дорзальной стороной головы для достижения чистого хирургического поля. Дезинфицируйте вокруг участка разреза соответствующим хирургическим дезинфицирующим средством. Закрепите животное в стереотаксической рамке.
- Выполните 2-сантиметровый разрез головы в сагиттальном направлении с помощью скальпеля. Используйте скальпель, чтобы немного соскоблить апоневроз черепа и продезинфицировать череп. Использовать coTton почки, пропитанные 3% H 2 O 2, чтобы удалить оставшуюся ткань.
- При необходимости используйте электрокаутер или термопакер для контроля кровотечения. Остановите кровотечения из кости черепа и подкожной клетчатки, если кровотечение не прекратится спонтанно через 1-2 мин и мешает зрению на череп.
- Отрегулируйте выступ резца до тех пор, пока головка не будет установлена в плоское положение черепа, что означает, что брегма и лямбда в качестве стереотаксических опорных точек находятся в одной плоскости. Это наиболее важно для достижения высокой хирургической точности. Используйте стандартный стереотаксический инструмент для выравнивания крыс, откалибруйте назначенный наконечник до брегмы под микроскопическим зрением и отрегулируйте планку резца до тех пор, пока обозначенные точки для брегмы и лямбды на инструменте не коснутся черепа одновременно.
ПРИМЕЧАНИЕ. Вид с одной стороны с фокусированным светом от другого может помочь определить это условие. Альтернативно, возьмите стереотаксический держатель с тонкой канюлей и измерьте дорсовентральные координаты Брегмы aИ под микроскопическим зрением. Отрегулируйте планку резца до тех пор, пока дорсовентральные координаты Брегмы и лямбда не станут одинаковыми. - Используйте стереотаксический держатель с канюлей, откалибруйте до брегмы, а затем вычислите положение всех отверстий сверла на черепе. Используя стереотаксический держатель, отметьте положение отверстий, которые нужно просверлить, либо тщательно поцарапав череп, либо используя хирургический цветной маркер. Координаты для этого зависят от мишеней, координаты со ссылкой на брегму приведены для гиперпрямого пути в таблице 1 , включая предлагаемые координаты для опорных электродов мозжечка.
- С помощью микросверла тщательно сверлите все отверстия. Для STN и SNr просверлите общее отверстие (размером приблизительно 2 мм х 3 мм). Все остальные отверстия должны иметь диаметр около 1 мм.
- Возьмите две тонкие канюли (не менее 27 G) и согните их наконечники, чтобы сформировать крючкообразную форму, используя твердую поверхность или пинцет. Используйте их для удаления любых дебриS из отверстий сверла и тщательно вырезать и удалять твердую материю в общем отверстии STN / SNr.
- Промойте отверстия сверла физиологическим раствором. Нанесите капли физиологического раствора каждые 15 минут на отверстия для сверления, чтобы предотвратить высыхание мозга и твердой мозговой оболочки.
- Возьмите микрозажим и соответствующий микровинт из нержавеющей стали ( например, винт M 1.2 мм x 2 мм), просверлите отверстие и завинтите микровинт между отверстиями сверления эталонных эпидуральных электродов над мозжечком, сделайте то же самое для M1 эпидуральных электродов.
- Сдвиньте самодельные эпидуральные электроды Ag / AgCl в отверстия для эталонных электродов и электродов M1. Направьте наконечник электрода тонким пинцетом и сдвиньте его прямо под костью черепа в отверстие сверла.
- Закрепите все эпидуральные электроды двухкомпонентным зубным акрилом. Обязательно не закрывайте точку брегмы и не влияйте на общее отверстие STN / SNr.
- Вставьте подготовленный держатель из электрода вольфрамового микропроводаВ стереотаксическую рамку.
- Откалибруйте самый вентральный электрод, который предназначен для нацеливания STN, на бредгу. Отрегулируйте до расчетного положения над общим отверстием STN / SNr и опустите электроды вниз до мозга под микроскопическим зрением. Убедитесь, что вольфрамовые микропроводные электроды плавно входят в мозг.
4. Электрофизиологическое картографирование и запись
ПРИМЕЧАНИЕ. Для этого шага необходима клетка Faraday и многоканальная электрофизиологическая система записи с программным обеспечением для записи, способным к онлайн-фильтрации и онлайн-сортировке спайков. Предпочтительно использовать систему, которая работает с предусилителем, расположенным рядом с головкой животных, чтобы сохранить электрический шум и артефакты до абсолютного минимума. Помимо электродов вольфрамового микропровода требуется, по крайней мере, один эпидуральный и один эталонный электрод для записи записей гиперректального пути. Рекомендуется вставить эпидураль и референсE электродов, не касаясь друг друга, это помогает в случае неисправности и позволяет использовать различные типы ссылок при анализе данных.
- Поместите мобильную клетку Фарадея над стереотаксической рамкой. Если имеется только стационарная клетка Фарадея, аккуратно перемещайте стереотаксическую рамку в клетку Фарадея, убедившись, что глубокие мозговые электроды не опускаются в мозг до тех пор, пока стереотаксическая рамка не окажется в конечном положении.
- Подключите электроды к фазе электрофизиологической установки. Убедитесь, что эталонные электроды подключены к соответствующим опорным каналам.
- Настройте программное обеспечение для записи: Полосовой фильтр (0,05-8,000 Гц) и усилить (получить 1500-2000 пикселей) сигнал необработанных данных. Используйте онлайн-фильтр LFP и спайка с соответствующими настройками (полосовой фильтр 0,05-250 Гц для LFP, полосовой фильтр 300-8000 Гц для MUA). Для всех фильтров используйте фильтр типа butterworth.
- Установите порог всплеска, если применимо, для onlinE сортировка шипов. Большинство записывающих программ позволяет устанавливать порог пика, который является значением амплитуды, над которым сигнал помечен как всплеск программным обеспечением. Этот порог может быть определен математически как коэффициент или стандартное отклонение средней амплитуды фильтрованного шипового сигнала или может быть предпочтительно определен визуальной проверкой сегментов данных <500 мс и настроен как линия над сигнальным шумом в графическом пользовательский интерфейс.
ПРИМЕЧАНИЕ. Целью создания порога шипа является подсчет спайков и сортировочных единиц, чтобы предоставить информацию о том, сколько нейронов записано и как формируются их пики. - Медленно опустите вольфрамовые микропроволочные электроды на дорзальную часть мишени на 1 мм, что является STN для гипердиалогового пути. Подождите, пока сигнал стабилизируется, если необходимо.
- Для электрофизиологического картирования продвигайте электроды вентрально с шагом 100 мкм. На каждом шаге оцените шаблон стрельбы, стрельбу rЕли и форму шипов. Сравните их с типичными примерами, приведенными на рисунке 2 . Обычно плотные ядра проявляют быстрый и непрерывный пик на нескольких дорсовентральных ступенях, тогда как богатые волокнами структуры показывают низкие скорости обжига и меньшую гомогенную активность шипов на последующих вентральных стадиях.
- Для гипердетективного пути убедитесь, что самый вентральный электрод находится внутри STN.
ПРИМЕЧАНИЕ: STN достигается, когда значительное увеличение MUA обнаруживается вентрально для иннерты Zona. Вентральный к STN, пикировка останавливается почти полностью, потому что электрод достиг внутренней капсулы. Когда самый вентральный электрод находится в STN, конфигурация микроэлектродов вольфрама гарантирует, что задний, второй электрод находится в SNr. Возможно, потребуется дорсовентральная тонкая настройка небольшими приращениями для записи типичного MUA в STN и SNr одновременно. Обратите внимание, что частота MUA зависит от количества реально записанных нейронов и от уровня мозгаактивация. - Когда электроды находятся в желаемых структурах, настройте онлайн-фильтрацию и сортировку по шипу (см. Рис. 4 ), а затем начните запись данных. Типичные примеры для различных состояний кортикальной синхронизации, которые могут быть идентифицированы в записях LFP, показаны на рисунке 3 .
5. Конец эксперимента
- Когда записи сделаны, медленно поднимайте электроды из мозга и мгновенно вымывайте их физиологическим раствором. Электроды можно повторно использовать после тщательной промывки и визуального контроля. Изгибные изгибные электроды.
- Усыплять животных путем IP-инъекции передозировки уретана (2,5 г / кг массы тела).
ПРИМЕЧАНИЕ. Уретан следует использовать только для окончательной процедуры. - Если требуется гистологическая проверка положения электрода или других гистологических процедур окрашивания, удалите мозг из черепа и обработайтеТкани надлежащим образом.
ПРИМЕЧАНИЕ. В зависимости от предполагаемых методов окрашивания может потребоваться транскардиальная перфузия. Для посмертной проверки положения электрода стандартное окрашивание Ниссля в большинстве случаев является достаточным для визуализации траектории электрода, например, в средах коронального мозга. Дальнейшие подходы к облегчению гистологической проверки цели включают использование электрически индуцированных поражений в ткани головного мозга путем подачи электрического тока через регистрирующие электроды или применения биосовместимого красителя до введения электрода 16 , 17 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При использовании здесь регистрирующих электродов можно производить выборку LFP из первичной моторной коры, субталамового ядра и ретикулата основного вещества и MUA из STN и SNr. Первоначально LFP и многоуровневая активность записываются вместе в широкополосном сигнале. После этого LFP и MUAs разделяются полосовыми фильтрами (0,05-250 Гц для LFP и 300-4000 Гц для MUA).
Для правильного нацеливания подкорковых ядер, особенно небольших структур, таких как STN, выгодно согласовать запланированные стереотаксические координаты с онлайн-записанным сигналом MUA. Для траектории электрода, нацеленной на характерный характер STN, характерная картина MUA может быть записана ( рис. 2 ) 9 , 20 .
Для последующих этапов анализаЧасто обязательным для определения единичных единиц из многоуровневой активности по основному анализу компонентов ( рисунок 4 ).
В LFP-записи из M1 могут быть идентифицированы два спонтанно чередующихся состояния кортикальной синхронизации: состояние активированного состояния (AS) и состояние медленной волны (SWA) ( рисунок 3 ) 18 , 19 . В то время как в состоянии SWA преобладают высокоамплитудные медленные колебания около 1 Гц, AS характеризуется более быстрыми колебаниями с более низкой амплитудой ( рис. 3 ).
Рисунок 1: Настройка электродов из сверхмощного микропровода в стандартном стереотаксическом держателе. Обратите внимание на разделение наконечника между A, электродной парой дляSTN и B, электродная пара для SNr в дорсоветентном направлении ок. 200 мкм и переднеопорное направление ок. 2 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Характерная многоузловая активность от траектории Дорсовентрального электрода, направленная на СТН. ( А ) Многоуровневые записи вентрального заднемедиального таламического ядра (ВПМ), зонной инсерты (ЗИ), субталамового ядра (СТН) и ретикулярного сухожилия (SNr). VPM имеет разреженные и нерегулярные интервалы с высокой амплитудой. Эта схема шипов прекращается при приближении к ЗИ. Когда электрод входит в STN, типичная высокочастотная схема обжига с короткими импульсами со средним усилителемUde можно наблюдать. SNr можно идентифицировать по его высокой амплитуде и регулярному рисунку стрельбы. ( B) STN-траектории, наложенные на изображения из стереотаксического атласа 21 крысы. Верхняя часть: корональная плоскость. Нижняя часть: сагиттальная плоскость. Обратите внимание на прохождение наконечника электрода через VPM и ZI. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3. Кортикальные состояния синхронизации в записях LFP из первичной моторной коры при уретановой анестезии. ( A ) Представитель 600 с LFP-регистрации первичной моторной коры. Временные периоды с высокочастотной активностью с низкой амплитудой, соответствующей Активированному состоянию (i), и периодам времени с более медленным ритмом и высоким Амплитуда, соответствующая состоянию активности Медленной Волны (ii), может быть дифференцирована. ( B ) Соответствующий график по частоте в интервале 600 с, иллюстрирующий относительную мощность 0-20 Гц LFP, представленную в (A). Более теплые расцветки указывают на более высокую относительную мощность. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Сортировка отдельных единиц из многоуровневой активности STN. ( A ) Трехмерный вид единичных кластеров в пространстве объектов после анализа основных компонентов. Каждый кластер представляет собой предполагаемый единичный блок. ( B ) Шипковые сигналы и средние значения спайка, соответствующие кластерам в (A).0fig4large.jpg "target =" _ blank "> Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Координаты от Брегма | STN | SNr | M1 | Ссылка 1 | Ссылка 2 |
| передне-задний | -3,6 | -4,8 | +3,0 | -10,0 | -10,0 |
| медиально-латеральный | +2,5 | +2,5 | +3,0 | +3,0 | -3,0 |
| спинным-вентральной | -8,0 | не доступно | не доступно | не доступно | не доступно |
Таблица 1: Стереотаксические координаты для записи Hyperdirect CoRtico-базальный путь Ganglia. Все точки измерены от контрольной точки bregma на черепе в мм; Na- не применимо.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В настоящем исследовании продемонстрирован способ регистрации внеклеточных электрофизиологических сигналов одновременно с нескольких сайтов данной сети с использованием примера гиперточечного кортико-базального ганглиозного пути, который соединяет M1 с STN и SNr у грызунов.
Критическим шагом при записи небольших подкорковых структур, таких как STN, является точно управляемая вставка записывающих электродов в мишень. В представленном методе выполнение двух важных шагов обеспечивает высокую точность таргетинга. При приготовлении животного в стереотаксическом аппарате перед включением электродов в мозг абсолютно необходимо убедиться, что череп попал в положение «плоского черепа» 22 . Для достижения плоского положения черепа положение режущего стержня стереотаксической рамки изменяется до тех пор, пока высота опорных точек брегмы и лямбда oN череп находится на той же дорсовентральной плоскости 21 . Только гарантируя эту позицию, координаты, найденные в стереотаксических атласах, могут быть применены с высокой степенью точности к отдельному лабораторному животному, поскольку атласы основаны на положении 21 плоского черепа. Кроме того, экспериментальные данные доказывают, что точность таргетинга с использованием индивидуального плоского положения черепа превосходит фиксированную регулировку резца 23 . Положение регистрирующих электродов в дорсовентральной плоскости должно быть точно отрегулировано путем постоянной регистрации многоблочной активности. Различные структуры ядер и белого вещества вдоль траектории электрода показывают характерные образцы огня ( рис. 2 ), которые можно использовать для корректировки положения электрода 9 , 20 .
Другим важным шагом в представленном методе является размещение rЭлектрода. В представленном протоколе была выбрана позиция над корой мозжечка, поскольку в этот момент контрольный электрод не обнаруживает активность кортико-базальных ганглиев, которая была центральной точкой исследования. В исследованиях с интересом к методам анализа, которые подвержены объемной проводимости, следует использовать более локальную ссылку 5 .
Уретан - широко используемый анестетик для регистрации внеклеточных потенциалов нейронов в исследованиях животных 11 , 18 , 24 , 25 , 2 6 . Причиной этого является то, что единичная доза уретана может давать стабильный и долговременный наркоз в течение 8-12 часов с ограниченной депрессией активности центральной нервной системы по сравнению с другими анестетиками 27 . Однако уретановые анестезииА также активирует симпатическую нервную систему, что может привести к нежелательным побочным эффектам, таким как, например, гипергликемия 27 . Из-за его долговременного действия и отсутствия сильного лекарственного средства, чтобы противодействовать его анестетическому эффекту, уретан не должен использоваться для повторных экспериментов, которые разделяются часами или днями. Если планируется проведение нескольких сеансов записи на одном и том же животном или если есть техническая причина не использовать уретан, то газовая анестезия с изофлураном и инъекции таких препаратов, как кетамин и ксилазин, могут быть разумными альтернативами для электрофизиологических экспериментов in vivo 28 , 29 . Недостатком этих режимов наркозависимости является то, что они требуют более частых наблюдений и корректировок, чем использование уретана из-за их короткого периода полувыведения и накопления лекарств с течением времени. Кроме того, имеются доказательства того, что уретан может меньше вмешиваться в физиологический b Активность дождя, чем другие анестетики 30 .
Все описанные здесь подробные условия записи критически определяют, как полученные данные могут быть дополнительно обработаны и проанализированы в автономном режиме, поэтому необходимо скорректировать все настройки в соответствии с требованиями запланированных этапов анализа. Поскольку существует много вариантов анализа многоканальных внеклеточных записей, использование доступных наборов инструментов с открытым исходным кодом может быть выгодным 31 .
Запись внеклеточных потенциалов in vivo - это метод, который предлагает уникальное временное и пространственное разрешение сигналов мозга, которое превосходит альтернативные методы, такие как функциональная магнитно-резонансная томография и визуализация кальция 5 . Представленный метод может быть применен не только к записи гипердревесного пути, но может быть легко скорректирован на множество других экспериментальных моделей и вопросов исследованияF "> 24 , 32 , 33. Однако, поскольку он включает в себя стереотаксическую хирургию, существует множество исследовательских установок, где он не может применяться и где должен быть выбран неинвазивный метод.
В будущем необходимо реализовать комбинацию представленного внеклеточного метода многосайтовой записи с оптогенными инструментами для дальнейшего улучшения нашего понимания сетевой дисфункции, лежащей в основе различных нейропсихиатрических заболеваний, чтобы найти новые методы лечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), KFO 247, за финансирование нашего исследования.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ag/AgCl custom epidural electrodes | Goodfellow GmbH D-61213 Bad Nauheim, Germany info@goodfellow.com |
Product-ID AG005127 for 99.99% silver wire | Ag/AgCl electrodes will allow for better signal quality, but may only be used in acute experiments. Possible replacement: Stainless steel electrodes |
| Stereotaxic holder with acrylic block | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 1770 Standard Electrode Holder | Make sure the acrylic block has recesses which suit the electrode setup for the desired target. Acrylic blocks can easily be modified with a file to obtain the desired configuration. Possible replacement: Self-constructed electrode holders |
| Tungsten microwire electrodes 1.5 MΩ impedance | Microprobes.com 18247-D Flower Hill Way Gaithersburg, Maryland, 20879 USA |
Product-ID WE3ST31.5A5-250um | The 1.5 MΩ is necessary to record MUA and LFP at the same time. Possible replacement: Microelectrodes of different materials can be used. The electrodes have to be straight, robust and as thin as possible. |
| Rat alignment tool | David Kopf Instruments, 7324 Elmo Street, Tujunga, CA 91042, USA |
Product ID Model 944 Rat Alignment Tool | Allows the exact orientation of the brain to match stereotaxic atlases. Possible replacement: Stereotaxic holder with a cannula |
| Two-component dental acrylic | Associated Dental Products Ltd. Kemdent Works, Purton, Swindon Wiltshire, SN5 4HT, United Kingdom |
Simplex Rapid Powder Clear 225g, Product code: ACR803; Simplex Rapid Liquid 150ml, Product code: ACR920 | Depending in the electrodes used, superglue might be an easy alternative, if the electrodes are small and lightweight. Possible replacement: Superglue (Cyanacrylate-based) |
| Faraday cage | Self-construction | A proper Faraday cage will be the best protection from electromagnetic artifacts, but everything which can be formed into a box shape or applied to a frame and is made of conductive material may help. Possible replacement: Aluminum foil or copper mesh | |
| Electrophysiological setup with recording software and online spike-sorting capabilities | OmniPlex® Neural Data Acquisition System Plexon Inc 6500 Greenville Avenue, Suite 700 Dallas, Texas 75206 USA |
Offline sorting software is a potential alternative, multiple scripts and softwares can be found for free in the open source community. |
References
- Lozano, A. M., Lipsman, N. Probing and regulating dysfunctional circuits using deep brain stimulation. Neuron. 77 (3), 406-424 (2013).
- Mathalon, D. H., Sohal, V. S. Neural Oscillations and Synchrony in Brain Dysfunction and Neuropsychiatric Disorders: It's About Time. JAMA Psychiatry. 72 (8), 840-844 (2015).
- Uhlhaas, P. J., Singer, W. Neuronal dynamics and neuropsychiatric disorders: toward a translational paradigm for dysfunctional large-scale networks. Neuron. 75 (6), 963-980 (2012).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Buzsaki, G., Anastassiou, C. A., Koch, C. The origin of extracellular fields and currents--EEG, ECoG, LFP and spikes. Nat Rev Neurosci. 13 (6), 407-420 (2012).
- Brazhnik, E., Novikov, N., McCoy, A. J., Cruz, A. V., Walters, J. R. Functional correlates of exaggerated oscillatory activity in basal ganglia output in hemiparkinsonian rats. Exp Neurol. 261, 563-577 (2014).
- Avila, I., et al. Beta frequency synchronization in basal ganglia output during rest and walk in a hemiparkinsonian rat. Exp Neurol. 221 (2), 307-319 (2010).
- Javor-Duray, B. N., et al. Early-onset cortico-cortical synchronization in the hemiparkinsonian rat model. J Neurophysiol. 113 (3), 925-936 (2015).
- Beck, M. H., et al. Short- and long-term dopamine depletion causes enhanced beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop of parkinsonian rats. Exp Neurol. 286, 124-136 (2016).
- Magill, P. J., Bolam, J. P., Bevan, M. D. Relationship of activity in the subthalamic nucleus-globus pallidus network to cortical electroencephalogram. J Neurosci. 20 (2), 820-833 (2000).
- Magill, P. J., et al. Changes in functional connectivity within the rat striatopallidal axis during global brain activation in vivo. J Neurosci. 26 (23), 6318-6329 (2006).
- Brown, P. Abnormal oscillatory synchronisation in the motor system leads to impaired movement. Curr Opin Neurobiol. 17 (6), 656-664 (2007).
- Stein, E., Bar-Gad, I. beta oscillations in the cortico-basal ganglia loop during parkinsonism. Exp Neurol. 245, 52-59 (2013).
- Little, S., Brown, P. What brain signals are suitable for feedback control of deep brain stimulation in Parkinson's disease? Ann N Y Acad Sci. 1265, 9-24 (2012).
- Priori, A., Foffani, G., Rossi, L., Marceglia, S. Adaptive deep brain stimulation (aDBS) controlled by local field potential oscillations. Exp Neurol. , 77-86 (2013).
- Brozoski, T. J., Caspary, D. M., Bauer, C. A. Marking multi-channel silicon-substrate electrode recording sites using radiofrequency lesions. J Neurosci Methods. 150 (2), 185-191 (2006).
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Mallet, N., et al. Disrupted dopamine transmission and the emergence of exaggerated beta oscillations in subthalamic nucleus and cerebral cortex. J Neurosci. 28 (18), 4795-4806 (2008).
- Steriade, M. Corticothalamic resonance, states of vigilance and mentation. Neuroscience. 101 (2), 243-276 (2000).
- Maesawa, S., et al. Long-term stimulation of the subthalamic nucleus in hemiparkinsonian rats: neuroprotection of dopaminergic neurons. J Neurosurg. 100 (4), 679-687 (2004).
- Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (1998).
- Oliveira, L. M. O., Dimitrov, D. Methods for Neural Ensemble Recordings Frontiers in Neuroscience. Nicolelis, M. A. L. , (2008).
- Torres, E. M., et al. Increased efficacy of the 6-hydroxydopamine lesion of the median forebrain bundle in small rats, by modification of the stereotaxic coordinates. J Neurosci Methods. 200 (1), 29-35 (2011).
- Hadar, R., et al. Rats overexpressing the dopamine transporter display behavioral and neurobiological abnormalities with relevance to repetitive disorders. Sci Rep. 6, 39145 (2016).
- Parr-Brownlie, L. C., Poloskey, S. L., Bergstrom, D. A., Walters, J. R. Parafascicular thalamic nucleus activity in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 217 (2), 269-281 (2009).
- Steriade, M., Nunez, A., Amzica, F. A novel slow (< 1 Hz) oscillation of neocortical neurons in vivo: depolarizing and hyperpolarizing components. J Neurosci. 13 (8), 3252-3265 (1993).
- Maggi, C. A., Meli, A. Suitability of urethane anesthesia for physiopharmacological investigations in various systems. Part 1: General considerations. Experientia. 42 (2), 109-114 (1986).
- Goldberg, J. A., Kats, S. S., Jaeger, D. Globus pallidus discharge is coincident with striatal activity during global slow wave activity in the rat. J Neurosci. 23 (31), 10058-10063 (2003).
- Karain, B., Xu, D., Bellone, J. A., Hartman, R. E., Shi, W. X. Rat globus pallidus neurons: functional classification and effects of dopamine depletion. Synapse. 69 (1), 41-51 (2015).
- Paasonen, J., et al. Comparison of seven different anesthesia protocols for nicotine pharmacologic magnetic resonance imaging in rat. Eur Neuropsychopharmacol. 26 (3), 518-531 (2016).
- Mahmud, M., Vassanelli, S. Processing and Analysis of Multichannel Extracellular Neuronal Signals: State-of-the-Art and Challenges. Front Neurosci. 10, 248 (2016).
- Hadar, R., et al. Altered neural oscillations and elevated dopamine levels in the reward pathway during alcohol relapse. Behav Brain Res. 316, 131-135 (2017).
- Voget, M., et al. Altered local field potential activity and serotonergic neurotransmission are further characteristics of the Flinders sensitive line rat model of depression. Behav Brain Res. 291, 299-305 (2015).
