Summary
ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。
Abstract
病気のマウスモデルが科学的な研究に不可欠であります。しかし、内視鏡や断層イメージングなど多くの診断ツールは、動物モデルで日常的には採用されません。従来実験的読み出しは、しばしば事後と前のヴィヴォ分析、個人内のフォロー アップ検査を防止し、必要な研究の動物の数を増やすに依存します。蛍光を介したトモグラフィーできます蛍光プローブの非侵襲的、反復的、定量的な三次元評価です。非常に敏感であり、特異的検出と異なる分子標的の特性評価を可能にする分子のメーカーの使用を許可します。特に、ターゲット プローブは、炎症、自己免疫疾患、感染症、血管疾患、細胞遊走、腫瘍などで遺伝子の活性化および蛋白質の表現の分析のための革新的なツールを表します。この記事で私たちは体内検出と (すなわちF4/80 陽性マクロファージ浸潤) の広く使用されているマウス モデルにおける炎症の評価のこの高度なイメージング技術のステップバイ ステップの手順を提供します。腸の炎症。この手法は免疫細胞と幹細胞の追跡など、他の研究分野でもされる可能性があります。
Introduction
動物モデルは、科学的な研究で広く使用されて、多くの非侵襲的な手順が存在するモニターの疾患活動性と活力を体重の増減の定量化や血液、尿、糞便の分析など。ただし、これらは個体間変動予告も間接代理パラメーターのみです。彼らはよく反復的な時点でシリアルの観察を防ぐ組織標本の事後分析によって補完する必要があります、生理や病理組織学的観察を処理で体内を直接します。断面イメージング、光学イメージング、および内視鏡検査は、これらのプロセスの直接可視化を実現し、同じ動物1の反復的な解析ができますクロスを含む高度な小動物イメージング技術が浮上しています。,2,3。 さらに、繰り返し同じ動物の疾患のさまざまな状態を監視する可能性、必要な動物の倫理の観点から望ましいと考えられる動物の数を減らします。
生体内蛍光イメージングのためにいくつか別の光イメージング技術が存在します。もともと、共焦点レーザー顕微鏡を用いて地表および地下の蛍光イベント4,5を研究します。最近では、ただし、三次元組織の定量的評価を可能にする断層システム先進6をされています。これが単色光源7検波器、低吸収を提供する近赤外線 (NIR) スペクトルで発光する蛍光プローブの開発によって達成されました。伝統的な断面解析イメージングしながらコンピューター断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)、超音波 (米国)、ほとんど物理的なパラメーターに依存して、形態を視覚化するなど光イメージングすることができます追加情報を提供します。基になる分子プロセスに内因性あるいは外因性蛍光プローブ8をの。
分子生物学の進歩は、ターゲットの増加する数のスマートかつターゲットを絞った蛍光分子プローブの生成を促進に貢献しています。たとえば、受容体を介した取り込みと特定のターゲット領域における分布視覚化できます carbocyanine 誘導体標識抗体9を使用しています。体のそうでなければアクセスできない領域に特定のトレーサーとして機能するラベル付けできますが、利用可能な抗体の豊富な腫瘍と神経変性のモデル分子・細胞のプロセスに前例のない洞察を提供します。心血管系、免疫学的、および炎症性疾患7。
本研究では大腸炎のマウスモデルにおける蛍光を介したトモグラフィの使用をについて説明します。デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導大腸炎、炎症性腸疾患 (IBD)10のような腸の炎症の標準化学物質誘発マウス モデル。腸炎症11の開発に生来の免疫システムの貢献を評価するために特に便利です。採用、アクティブ化、および単球やマクロファージの浸潤は、IBD の病因の重要なステップを表す、採用の可視化や浸潤の動態が、たとえばの効果をモニターします。12の臨床設定で、潜在的な治療剤。我々 は DSS 大腸炎の誘導をについて説明し、単球/マクロファージ マーカー F4/80 の具体的な可視化の蛍光分子トモグラフィーを用いた消化管粘膜へのマクロファージ浸潤の断層撮影による評価を示します13さらに、抗体はラベリング; などの補助および補足的な手順を示す。実験のセットアップ;疾患活動指標など従来の読み出しとの相関関係で、得られた画像の分析と解釈流れ cytometry と組織学的解析および免疫組織化学。我々 は、この手法との比較その他の画像診断装置の制限をについて説明します。
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Protocol
すべての動物実験は、Landesamt für Natur、ドイツ動物保護法 (Tierschutzgesetz) によると環 und Verbraucherschutz (LANUV) ノルトライン ・ ヴェストファーレン州によって承認されました。
1. 材料と実験のセットアップ
- 動物の世話。
- 20-25 g の体重で (例えばC57BL/6) に任意の DSS 感受性系統の性別と年齢をマッチさせたマウスを使用します。
- ローカル動物のケアのガイドラインに従ってマウス実験群とハウスあたり少なくとも 5 つ以上のマウスを計画します。
- ダイエットとオートクレーブ飲料水広告自由標準的な齧歯動物の食事を提供します。
- 標準的な食事を削除し、腔内自動蛍光を減らすためにスキャンする前に、少なくとも 3 日間無料のアルファルファの食事でそれを置き換えます。
- 急性 DSS 誘発大腸炎の誘導。
- DSS の 2 g を溶解 (分子量 40,000 〜 ダ) 2% (w/v ソリューション) を取得するオートクレーブ飲料水 100 ml。
- DSS ソリューション専用のマウスの酒の電源を記入し、推定 5 mL 1 日あたりマウスごとの液体の。コントロール マウス10DSS せず同じ飲料水を提供します。
注: は、実験の終わりまで毎日マウスを監視します。初期体重の 20% 以上を失うことまたはそれが瀕死になるマウスを安楽死させる (すなわち、永続的に減少の動き、姿勢を猫背、コートを建てる不自然な呼吸法、著しく) 動物に該当するローカルのガイドラインによると福祉。
- 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影の準備。
- 目的とする抗体 (例えばラット抗マウス F4/80) 蛍光色素をラベル (例えばCyanine7、λ励起: 750 nm、λ放出: 776 nm) 製造元のプロトコルで説明したよう。適切な透析膜で浄化された抗体の dialyze (細孔サイズ < 50 100 kDa) 少なくとも 2 時間または一晩の 0.15 M 塩化ナトリウムの 1 L に対して。
- 0.1 M NaHCO3の 1 L に抗体を転送し、少なくとも 2 時間の dialyze。
- ジメチルスルホキシド (DMSO) で蛍光染料の必要な量を解散 (抗体の 10.8 mg μ L/) 抗体溶液を加えると。20 モル過剰色素とタンパク質比は 1:3 を達成するために蛍光染料を使用します。
- 1 h. 無標号の抗体を削除は、0.15 M ナトリウムの 1 L に対して透析か PD 10 脱塩カラムを使用して、4 ° C で暗闇の中でインキュベートし、生体内でアプリケーションのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で解決します。
- 吸光光度法による最終的な抗体濃度とラベリングの比率を決定します。
- 250 330 nm の吸収でタンパク質濃度を測定し、染料による追加吸収を検討します。280 に極大吸収を修正 750 で最大の吸収の 11% (タンパク質) nm nm (次の手順) Cyanine7 の分類のため。
- 測定 250 800 nm (通常 1:10) 化合物の希釈と 750 Cyanine7 の濃度を抽出 nm。
- として色素とタンパク質比を決定する: 染料/抗体 = 750 で最大吸収 nm/200,000/(280 最大吸収 nm - 750 で最大吸収 x 0.11 nm)/170,000。
- 4 ° C で抗体溶液を保持し、注入前に漂白を避けるために光からシールドします。
- それが使用されるまで注入と光からの盾の直前に滅菌注射器に必要な抗体の解決の容積を読み込みます。
- プローブ注入の最適なタイミングとトレーサー動態に応じて、スキャンの手順を決定します。
- 酸素吸入 1.5 2.5% イソフルランを用いたマウスを麻酔安全標識抗体の尾静脈注射用専用落を置くか。
- フルレングスの抗体、標識抗体、少なくとも 24 h、スキャンする前にマウス大腸炎における抗マウス F4/80 マクロファージ可視化などを注入します。マウスを静脈注射 (静注) 尾経由で 2.0 nmol の色素に対応する額の標識抗体を静脈。
- 使用同様に標識非特異的抗体 (例えば、ラット IgG または一次抗体遺産に対応する別のアイソタイプ) 線量のアイソタイプ コントロールとして特定のプローブと同等。
注:生体内での結果をスキャン制御化合物の注入を画像データ特定のプローブの解釈のための参考資料として提供することができます後。 - 光の反射・吸収を最小限に抑えるため腹部の動物の毛皮を剃る電気かみそりを使用します。
- 目的とする抗体 (例えばラット抗マウス F4/80) 蛍光色素をラベル (例えばCyanine7、λ励起: 750 nm、λ放出: 776 nm) 製造元のプロトコルで説明したよう。適切な透析膜で浄化された抗体の dialyze (細孔サイズ < 50 100 kDa) 少なくとも 2 時間または一晩の 0.15 M 塩化ナトリウムの 1 L に対して。
2. 技術的な装置
- 小動物蛍光 (図 4) の獣医蛍光を介したトモグラフィ (FMT) デバイスを使用します。
- 「新研究」をクリックしてしてプロジェクトごとに新しい研究を作成ボタンをクリックし、、撮像パラメーターおよび将来の参考のための線量を含む関連するトレーサー研究説明に含めます。
- この研究の中で「新しい研究グループ」をクリックするとそれぞれの研究デザイン (例えば、特定のトレースと非特異的アイソタイプ コントロール) によると研究グループを作成するボタン。動物のそれぞれの番号を持つ各研究グループを装備します。
- トレーサーの構成要素のシステムを調整します。
- ラベルのバリエーションの正規化し、大井データから定量的測定を有効にするのにトレーサーの各バッチのキャリブレーションを実行します。
- 個々 のシステムの校正用測定器メーカーのガイダンスに従ってください。「新しいトレーサーを追加」を選択する、システムは手順のガイドを提供します。応用抗体溶液の希釈と計算される絶対プローブのトレーサー濃度を提供します。
- FMT、(重要な組織に似ている)、定義済みの厚さと吸収特性の組織模倣ファントムを使用し、使用される抗体の溶液の体積でそれを埋めます。FMT のデバイスでこれを測定します。
注: 将来体内測定から絶対トレーサー濃度を計算するのに指定されたプローブは、一緒に指定された濃度の基準値の測定は、システムが使用されます。
- スリーブ検査カセットを使用し温度 42 ° C
注: これは、検査中に低体温になるからマウスを防ぎます。
3. 動物の麻酔
- 1.5-2% vol % イソフルラン ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) マウスを麻酔する 1.5 L O2最低の連続的な流れを使用してください。
4. 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影スキャン
注: 適応、この FMT システムに固有の次の詳細については、必要に応じて、代替蛍光反射イメージング デバイスまたは FMT システムの研究 (材料の表を参照してください)。
- 検査カセットにその背中に麻酔下のマウスを置きます。
- スキャンの手順を実行します。
- イメージング システムにカセットを挿入し、連続的な麻酔を確実にすぐにそれを閉じます。以前作成した研究グループから適切なサンプルを選択します。トレーサー濃度の値は正しく計算するドロップ ダウン メニューから管理されるトレーサーを選択します。
- 適切な波長の蛍光反射率画像を取得 (720 nm Cyanine7) スキャン計画・概要」イメージの取得」ボタンをクリックしてスキャン フィールド。
- スキャン フィールド蛍光反射イメージ上のオーバーレイとして表示されますを参照してください。(例えば、コロンまたは腹部)、関心の領域に調整空気または残りの毛皮の領域を回避します。イメージ ターゲットに応じて画像数データ ポイント スキャン フィールド内から選択して設定粗い右側のメニューの中、細かいスキャン フィールドの解像度に。
注意: は、細かいスキャン フィールド可能性があります大幅に長くスキャン時間を犠牲にしてより良い空間分解能を提供することに注意します。 - 「スキャン」をクリックして選択した波長のデータ/画像の取得を開始します。
注: 腹部全体の中細スキャンのスキャン時間; 約 5 分になります今回は、各データ ポイントは個別に励起レーザーに照らされたされ生じる蛍光性が記録されます。 - スキャンの終わりにイメージングのカセットから動物を削除し、ケージに戻ってそれを置く前に完全回復する動物を許可します。
- 実験中にさまざまな時点で必要と認められる場合は FMT を繰り返します (0、5、および 9-10 日間など(試験終了))、しかし、バック グラウンド蛍光信号を増加させる体内の抗体の蓄積を考慮します。
5. スキャン後
- 個室ケージ赤光地球温暖化ランプの下でペーパー タオルの上にマウスを置きし、完全復旧までの不快感や苦痛の兆候をマウスを監視します。いつ完全に目を覚まし、それぞれのケージに戻るには、マウスを置きます。
- 100% (v/v) の用量でアイソレータへの CO2の配信実験の終わりにマウス、100 vol % と 3 L/分を安楽死させます。高濃度 CO2の突然の暴露は、苦痛を引き起こす可能性がありますと、CO2で商工会議所をあらかじめ記入しないでください。マウスが急激な頚部転位などの安楽死のそれに続くセカンダリ モードによる呼吸を停止した後は、死を確認します。
- 腹部の開腹手術で大腸を外植体し、手順に従って 4.2.1 - 4.2.4 explanted コロンの前のヴィヴォスキャンを実行します。縦 Metzenbaum 外科はさみを使用して各コロンを開き、さらに分析のためにそれを準備する前に生理食塩液を徹底的にすすいでください。
- メスを使用すると、遠位結腸から 0.5 cm の断片を切り取り、すぐに 1.5 mL クライオ チューブで。凍結液体窒素で-70 ° c 店さらに使用 (例えばミエロペルオキシダーゼ (MPO) 測定) まで。
- 木の棒を使用し、組織学的解析の粘膜の外側 (「スイスロール技法」) との近位端に遠位から残り縦に開かれているコロンをロールアップします。定着剤で準備を配置 (材料の表を参照してください)、-80 ° C14で凍結します。
6. データ再構築と解釈
- それぞれは、イメージング ソフトウェアの再構成ツールを使用して、raw 画像データから蛍光分布の 3次元マップを作成スキャンはスキャンしたときに、自動的に再構築ツールに追加する関数"キューに追加復興"が選択されます。
- それ以外の場合、それぞれの研究の下のドロップ ダウン メニューからスキャンを選択し研究グループ、スキャンを右クリックし、「復興に追加」を選択
- 詳細な分析、解析ソフトウェアにデータ セットを読み込みます。上部バーのドロップ ダウン メニューからそれぞれの研究を選択し、右側のメニューから [研究グループと個々 の動物この動物のため実行するスキャンのすべてが表示されます。正しいスキャンを選択し、「読み込み」をクリックしてください
注: トレーサー分布の三次元左側の当初取得蛍光反射率画像のオーバーレイとして表示されます。モデルを回転の分析を容易に拡大することができます。 - 非特異的ラベル蓄積 (例えば肝臓や尿膀胱) 再建された 3 D マップ上の病巣を特定し、ターゲット組織 (例えば腸や腸) から区別するため。
- 一番上のバーからターゲットの最も適切な ROI 形状を選択します。解析ソフトウェアのそれぞれの測定ツールを配置することによって利益 (率 ROI) の領域としてラベル対象組織ソフトウェアがモルのスキャンが済んでトレーサー量、投資収益率と同様、(ピコ) の蛍光強度を提供します。
- (組織) の炎症性の浸潤との相関関係の疾患活動性の評価のために最も適した相当として ROI サイズに正規化された、適切な投資収益率でトレーサーの合計量を選択します。
注: 特定のモデルの代表として適切な場合は、投資収益率の他の機能を選択できます。
7。Ex Vivo解析
- ヘマトキシリンとエオシン染色と蛍光抗体法。
- 70% のエタノール (エタノール); 2 分でそれらを配置することによって、セクションを deparaffinize します。その後水ですすいでください。5 分のヘマトキシリン液で染色し、その後 10 分間ぬるま湯ですすいでください。
- エオシン溶液 2 分間で対比染色、蒸留水ですすぎ、もう一度蒸留水ですすぎ。
- 場所 70 %etoh、96 %etoh、99% エタノール、およびキシレン (2 回) が脱水し、セクションをクリア各 2 分の。メディアを樹脂製マウントをマウントします。
- 蛍光抗体法。
- 螢光抗体の汚損のため以前に取得した組織切片 (「スイスロール」) を使用し、7 μ m の低温カット セクションを準備します。
- 10 分 5.0% ラット血清中のアセトン固定と冷凍コロン セクションをブロックし、希薄 (1/500 v/v) ビオチン化初代ラット抗マウス F4/80 抗体一晩インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で三度のセクションを洗浄し、PBS/BSA のストレプトアビジン FITC (1: 100 v/v) と孵化 (0.1 %w/v) 4 ° C でオーバー ナイト
- TBS の各セクションを洗って 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、1: 1000 v/v) コントラストを達成するために染まります。共焦点顕微鏡蛍光画像を分析 (フィルター キューブ N2.1 励起フィルター 515 560; 40 倍の倍率表の材料を参照) と高出力フィールドごと F4/80-陽性細胞をカウントします。
注: は、生体内でFMT と事後組織解析免疫組織染色や蛍光染色、意図されていたターゲットによってなどを結合するときに同じクローンとフォーマットの抗体を使用してください。F4/80 陽性マクロファージ体内と体外の検出、さまざまな形式が使用されました。
- MPO コロン サンプルの測定。
- 新鮮な取得、PBS 洗浄コロン サンプルや MPO 測定のため解凍試験片に使用します。すべてのサンプルの重量を量るし、組織を均質化、ELISA、換散バッファーのキット (材料の表を参照してください) 組織の mg 当たり換散バッファーの 20 μ L のボリュームで。
- 15 超音波 s (超音波周波数: 20 kHz、電力: 70 W) 200 x g と 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心力と
- 市販 ELISA キット (材料の表を参照) の使用のメーカー説明によると。重複のテストを実行します。
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Representative Results
大腸炎の評価:
DSS 誘発大腸炎は人間の IBD に似ており、減量、直腸出血、表面的な潰瘍、感受性のあるマウス15粘膜損傷につながる腸管炎症の化学物質誘発マウス モデルです。特に自然免疫炎症性腸10,11の開発の貢献の研究に有用です。合併の炎症を誘発する強力にマウスが継続的に実験を通じて DSS を投与します。体重の減少・便潜血は、炎症の臨床指標として使用されました。図 1 aのように、マウスは、水だけを受信制御動物は、体重の大幅な変更を示さなかったに対し、大腸炎、導入後 4 日目から始まる重量を失うことを始めた。さらに、次潜血スコアリング システムを用いて評価した合併動物 (図 1 b) の糞便潜血の排泄を増加を示した: 0 (血)、1 (潜血陽性)、2 (潜血プラスと visual ペレット出血)、および 4 (出血、肛門周りの血を総)16。大腸の長さは、炎症誘発大腸ショートニング、明らかに単独で水 (図 1) を受け取るコントロール マウスと比較して合併マウス内のコロンを大幅短縮を評価する測定しました。大腸損傷を直接評価するには、実験の終わりに組織学的解析を行った。組織損傷の定量的評価を行った大腸 H & の程度と炎症、クリプトの損傷、およびパーセント関与17の範囲に基づいて全体的な損傷コアを使用して E 染色のセクション。合併のマウスは重篤な炎症の徴候を示し、コントロール マウス DSS を受け取るない組織損傷 (図 1) は認められなかった。画像は、DSS 誘発大腸炎、破壊が特徴、上皮のアーキテクチャの杯細胞、クリプトの損傷、および主に保存されのではなく、粘膜の潰瘍の粘膜の炎症性変化の特性を示すコントロール マウス18の建築。グループ間の統計的な差異 (n = グループあたり 5) 分散分析 (ANOVA) 学生ニューマン クールズ (S.N.K.) によっての後で計算されました。ポスト アドホックテストまたは重要な分散不均一の場合ゲーム ハウエル投稿アドホックテスト続いて Welch の検定で。P-値 < 0.05 が重要と考えられていた。
単球やマクロファージ採用の評価:
DSS 誘発大腸炎は大腸の粘膜と粘膜に単球やマクロファージなどの免疫細胞の浸潤に関連付けられて我々 使用単球/マクロファージ マーカー F4/80 の免疫蛍光染色潜入を定量化します。合併マウス DSS を受信は、非合併コントロール マウス (図 2 a) と比較すると腸壁に浸潤する単球の数が有意に上昇を示した。コントロール マウス (図 2 b) と比較して炎症を起こしている大腸に好中球の大幅増大した移民を明らかに好中球マーカー、GR1 の免疫蛍光染色を用いて白血球浸潤さらに定量化。MPO を確認するには、両方の好中球数および炎症性の活動を反映して有意に高値合併マウス (図 2) の大腸組織で。分散分析と S.N.K.ポスト アドホックテストのグループの間の統計的有意性を計算する使用された (n = グループあたり 5)。統計的有意性設定された p < 0.05。
マクロファージ亜集団で全身の変更:
マウス単球成熟状態や炎症性サイト、参加を開始して、永続的な炎症性応答19どこに募集する能力が異なる別個の subpopulations の異種グループを網羅します。.したがって、我々 は CD11b の発現を分析することによって球を特徴し、Ly6C を用いたフローサイトメトリーします。急性の DSS 大腸炎の炎症性条件の下で予備実験条件と比較して炎症 CD11b高Ly6C高単球の大幅な増加を見ました。対照的に、このシフトは、非合併コントロール マウス DSS (図 3 a) なしで発生しませんでした。データ (n = グループあたり 5) 分散分析と S.N.K. を用いて全身性炎症のサロゲートを追加パラメーターとして DSS 投与マウス (図 3) の大幅な増加を明らかに、非合併のコントロールに比較して合併のマウス脾臓中の F4/80-陽性細胞の存在を評価しました。
蛍光を介した断層レントゲン写真撮影スキャン:
単球/マクロファージ募集と消化管粘膜への浸潤を測定する蛍光を介したトモグラフィーを使いました。生きている動物の活性化マクロファージを直接可視化する蛍光標識抗体マウス F4/80 が採用されました。ラベル付き、非特異的なラット IgG 抗体アイソタイプ コントロールとして使用されました。スキャン、マウス毛皮によって光の反射を最小限に抑えるために腹部の剃毛、連続イソフルラン供給によって麻酔され小動物蛍光.の獣医 FMT デバイスの検討図 4 a、非合併のコントロールと比較して合併マウスのコロンの蛍光トレーサーの大幅高蓄積につながった大腸炎の誘導で示すように、単球浸潤と分化の増加を示す合併動物でアクティブなマクロファージ。腹部の腸、合併 (DSS) も非合併 (水) グループは、プローブ対象の特異性を示す検出可能な蛍光応答を引き出さなかった不特定の蛍光標識 IgG のアプリケーションF4/80 抗体 (図 4 a) の相互作用。腹部領域の代表的な画像が表示されます。色コードを示します炎症性浸潤(図 4 bの範囲と4 Cに対応する蛍光強度のレベル)。F4/80 監督トレーサー集積 explanted コロンの測定前のヴィヴォF4/80 トレーサー蓄積 (図 5 aと5 b) の生体内で検出された信号の大腸の起源を確認しました。バインドされた抗体の計算量はよく相関 (R2 = 0.52) 浸潤マクロファージ (図 5および5 D) 組織学的に断固としたな数の特定のトレーサーとその生体内イメージングを確認することができますローカル病気の活動.を示すデータを p に設定する統計的有意水準で ANOVA および S.N.K. のホックの記事のテストで行った < 0.05。線形回帰と相関関係を求めた。
図 1.臨床パラメーターおよび組織学的損傷急性 DSS 大腸炎の経過。
C57bl/6 マウスは、DSS と挑戦された (2 %w/v) で 8 日間の水を飲む。コントロール マウス DSS なしの飲料水を与えられました。動物は、9 日に安楽死されました。1 つの実験からのデータが示されている (n = グループあたり 5) ± (SEM) 平均値の標準誤差。(A)体重の変化は、初期の重量を基準にして掲載されています。グアヤク試験によって決定される、 (B)血液、糞便中に排泄 (潜血、0 = 負、4 肉眼的血を =)。(C) 事後コロンの長さ。(D)クリプト被害の程度、炎症の程度からみた組織学的損傷。代表的な組織学的イメージを示す (ヘマトキシリン ・ エオシン染色。 倍率: (上部) × 10、(下段) x 20) 合併 (左のパネル) またはコントロール (右側のパネル) マウスの。上皮構造の深い破壊し炎症性浸潤 (矢印)。棒グラフ: 傷害スコア。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.腸内の単球とマクロファージに侵入します。
DSS 大腸炎 C57BL/6 DSS のアプリケーションによって誘導された (2 %w/v) で水を飲む。コントロール マウスを受け取っただけで水を飲む。N からデータ 5 を = グループあたりマウス粘膜 ± SEM. (A)蛍光可視化マクロファージ浸潤を示しています。アンチ-F4/80 染色合併の代表的なイメージを表示とマウスを制御します。棒グラフ: 細胞数/高電力フィールド (HPF)。(B)粘膜好中球浸潤の蛍光可視化。抗 Gr 1 染色合併動物とコントロールを表すイメージを示します。棒グラフ: カウント/HPF を携帯します。(C)合併・非合併のマウスの大腸組織で MPO 濃度。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.腸内のコンパートメントに単球採用。
コントロール マウスと同様に、合併のマウスから末梢血単球 (n = グループあたり 5) CD11b 陽性細胞で Ly-6 C の式のフローサイトメトリーで分析しました。セルは、SSC と CD11b 発現に基づいてソートされます。マウス単球が SSC低CD11b高細胞、として識別され、その Ly6C 式を行った。(A)比例変化炎症性 Ly6C高単球 (% 変化 ± SEM) 予備実験条件を基準にして描かれています。Ly6C 細胞上発現 SSClowCD11b高合併動物の前に、と大腸炎誘導 (下のパネル) とコントロール前と後の実験 (上部パネル) の後の(B) FACS ドット プロット。(C)合併・非合併のマウスの脾細胞をフローサイトメトリー (平均蛍光輝度 ± SEM) による F4/80 の表現のため評価しました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.マウス大腸炎.のマクロファージ浸潤の断層可視化
合併マウスの FMT をスキャンし、非合併コントロール投与マウス F4/80 Cyanine7 共役抗体 (n = グループあたり 5)。(A)棒グラフ: 合計蛍光染料の pmol では、投資収益率で決定された、投与マウスにおける炎症性浸潤の範囲に対応する色の蛍光強度と描かれた ± SEM. 代表画像が表示されます特定のプローブ (抗マウス F4/80) と(B)と非特異的制御 (ラット IgG) (C)。どちらの場合も、同じサイズの投資収益率はさらに分析の上腹部の横に置かれました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.前のヴィヴォマウス大腸炎のトレーサーの特異性の検証します。
生体内で特定のプローブ (抗マウス F4/80) 合併投与で FMT スキャンが得られるトレーサー信号の大腸の起源を示す explanted 腸の平面蛍光スキャン前のヴィヴォが続いていた体内。N の合計で 2 つの実験からのデータ 8 = 動物が表示されます。色分けされた蛍光を用いた合併マウスの生体内でFMT スキャンを描いた代表的な画像を示す炎症性浸潤の程度に対応した強さ(A) です。Explanted 腸の反射蛍光トレーサー蓄積で特定の地域を識別するためことができます(B) です。代表的な事後免疫蛍光染色などの分野から F4/80-陽性マクロファージの生体内での結果を確認(C).マクロファージの浸潤の数、免疫蛍光染色によりトレーサー蓄積体内測定と相関した(D).この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
医療イメージング技術は、近年急速に進化してきたが我々 はまだ開発のごく初期の段階で炎症性プロセスまたは他の病気と同様、腫瘍を検出する当社の能力に制限されます。ただし、これは理解腫瘍の成長、侵略、または転移開発および炎症性疾患と変性、心血管及び免疫疾患の開発の細胞プロセスに重要です。伝統的なイメージング技術は、身体的または生理学的なパラメーターに依存して中、分子イメージングは、体内の特定の分子マーカー20の可視化を実現。 にします。
小動物イメージング用蛍光を介したイメージング、超音波、核駆動型のアプローチ (例えば、sイングル光子放射型断層撮影 (SPECT)、陽電子放出断層撮影 (PET)) を特定を視覚化する使用ことができます。分子標的の構造。最も利用可能なトレーサーのバックボーンとしてフルレングス抗体の使用には、長期的なラベル、長い循環回と遅い組織浸透遅延トレーサー アプリケーション後のイメージングの時間が必要です。したがって、典型的なイメージング放射性核種は、生体内イメージング抗体の分布のため適していません。Cu64 や In111 のような長く生きている同位体の使用により、抗体を用いたトレーサー同位体生成、放射線安全ラベリング処理中に前後にまたがる複雑なインフラストラクチャを要求、シールド プローブ アプリケーション後動物の住宅。コスト効果の高いより安全なバリアントとする蛍光を介したイメージングします。
いくつか生体内イメージング検出システム、生きている動物の色素分布の測定および可視化を過去の二十年の21以上紹介されています。ほとんどのシステムは、急速の平面イメージ投射表在病変イメージングに適したを有効にします。光の吸収、散乱、信号の深いため組織は、平面イメージ投射を回避します。この問題の最も顕著なソリューションは蛍光断層撮影22です。数理モデルに基づいて、散乱と光吸収の画像信号を修正し、仮想 3 D データセットは複数の投影データセット8から計算されます。アルゴリズムは、ターゲット濃度/式23の特定の地域代表のトレーサー濃度の推定を有効にする完全に定量的なデータを提供します。FMT の関連する制限は、解剖学的イメージング技術、目的の可能性があります-によってターゲット妥協の特定の解剖学的構造を分子情報の配分と比較すると空間的解像度が低いに関連付けられます。別の制限は、光を吸収、近赤外スペクトルの範囲23への赤色の蛍光を発するプローブの使用を必要とする組織の制限の浸透深さにあります。
形態学的超音波の利点と蛍光イメージングから分子情報の取得の可能性を組み合わせた最近導入されたイメージ投射様相は、光音響イメージングです。初期の研究からの予備結果は、こと-にもかかわらずさらに技術的な洗練された光音響イメージング素晴らしい将来性分子イメージングと潜在的な翻訳アプリケーションの24のための必要性を提案します。
腸管の壁への白血球の募集は開始と、IBD の永続化に重要なステップで感染症や自己免疫疾患など、多くの免疫疾患の炎症部位に炎症性細胞の募集です。感染症、血管疾患、腫瘍、および多くより25。単球の活性化と腸の粘膜に浸潤が IBD の病因の重要なステップ、ケモカインとインテグリンの細胞接着分子の相互作用によって仕組まれた単球浸潤の抑制は有望な治療12,26 をアプローチします。したがって、白血球の炎症部位に人身売買の監視調査薬の抗炎症効果を可視化する新たな治療選択肢の開発で非常に重要です。これ可能性があります特別な関心の白血球が人身売買を標的としたが開発され、いくつかの抗インテグリン抗体、既に IBD 治療のため更なる成分が近い将来26で利用できるでしょう。Vedolizumab、腸固有 α4β7 インテグリン サブユニットと Etrolizumab 腸 α4β7 と αEβ7 インテグリン ヘテロの β7 サブユニットに結合するヒト化モノクローナル抗体は、承認された27,28をされています。他のエージェント (例えばMAdCAM 1 PF 00547659 とスフィンゴシン-1-リン酸 (S1P) 受容体モジュレーター Ozanimod など) は現在 IBD29,30の治療のため評価を受けています。
FMT を実行すると、技術の可能な修正には異なるトレーサー-ターゲットの組み合わせとして FMT を組み合わせる構造イメージング貧しい空間分解能を補うためにアプローチの選択が含まれます。プローブ ターゲットの組み合わせの広い配列を確立されており、実用化します。カスタム抗体の分類、特定のプロジェクトにすることができますするラベリング商業使用キットおよび上記プロトコル。抗体またはターゲット部位に選ばれた小さいペプチドによっては、商業的供給元は、異なるラベルの広い配列を提供しています。アプリケーションに応じて、必要な仕分けを考慮: 深い組織イメージング、近赤外スペクトルで動作して色素 (などCy7、λex/em 750/780 nm) 可能性があります適して、染料の全体的な明るさと効果的な光を供給しながらスペクトル (例えば、 GFP 類縁体) の近くに表示されている範囲内で望ましいかもしれない。システイン バインディングのマレイミドなど特定のラベリング タグ31 装備蛋白質の分類のためのビオチン ラベル リジン残基代替結合部分と同様、蛋白質の活性エステルとして事実上すべての染料を得ることができます。.ラベルの選択は、原則プロトコルは変更されませんが、単ラベリング手順のわずかな変更が必要です、良い撮像結果を重要です。空間分解能の限界を克服するもう一つの魅力的な変更は、CT や MRI、分子情報を解剖学的構造の注釈を有効にすると FMT を組み合わせることです。構造情報も取得できます順番に事前情報として、または同時に、ハイブリッド計測器32,33をイメージングを必要とします。
特定のプロトコルの手順特別な注目に値する。この手法は、さまざまな異なる分子プロセスの代表的な特定の分子をターゲットとする蛍光 photoprobes の多数のために合わせることができる、プローブとの濃縮の十分な配布を許可する非常に重要です、目的のターゲットの領域。イメージングのための理想的な時間ポイント プローブとターゲットの組み合わせに応じて異なります。たとえば、抗体は、腫瘍の受容体のターゲットは、腫瘍、吸収と代謝、肝臓および可能な免疫原性副作用34に普及率が影響かもしれません。また特定のイメージング技術の関連するコントロールを検討します。特定のトレーサーは、血流効果と非特異的結合 (例えば、 Fc 受容体を介したバインディング) を反映したアイソタイプ コントロールに対して常に検証しなければなりません。負の対象動物は、ノックアウトのようなモデルが存在する場合、特異性トレーサーの付加的な制御として使用できます。また、35抗体ターゲット相互作用の特異性を証明するためには、実験をブロックを実行できます。
プロシージャの実用性に関する重要な手順を次に示します: (1) DSS 濃度の使用を慎重に決定、DSS 感受性によって異なります可能性があります別のマウス系統し製造/バッチ36。(2) 慎重にプローブ ターゲットの組み合わせを選択します。(3) 腹部全体の十分なスキャンのスキャン時間 5 分程度を許可します。最適な時間はトレーサー アプリケーションとイメージの作成手順の間ポイント対象地域におけるトレーサー集積ように慎重に決定する必要があります。マウス大腸炎における腸 F4/80 検出、標識抗体はスキャンする前に 24 時間注入する必要があります。(4) と非特異的ラベル蓄積が発生する (例えば、肝臓)、投資収益率としてそれぞれの測定ツールを配置することによって適切な標的組織にラベルを付けることが重要です。さらに、非特異的トレーサー分布のため十分なコントロール含まれている-してください血流効果とノックアウトまたはトレーサー ターゲット相互作用を検証するブロックの研究を排除する非特異的アイソタイプ コントロール。
不適切な動物の位置、フィールド、および露出時間をスキャンがスキャンのプロシージャとデータの再構成に関連するエラーの典型的なソースあります。動物を配置するときは、組織再建ノイズを最小限に抑えるためにすべての側面によって蛍光病変を囲む必要があります。動物とイメージングのカセットの前面ガラス プレートの間に閉じ込められた気泡ノイズを増やす可能性がありますも、少し動物を移動することによって削除する必要があります。オーバーまたは露出不足のイメージのスキャン画面にある変更された露出設定で買い戻しスキャンを要求できます (反射率画像のブロック: 正面の LED 輝度と露出時間の調整)。事後組織学的解析、免疫組織化学免疫蛍光染色などで抗体を用いた生体内でFMT 測定を結合するときは、同じクローンとフォーマットの抗体の使用を考えるべき。また、同じ動物で繰り返し FMT 測定の実行、時同じ形式とクローンが使可能な交差反応性や異なるエピトープのターゲットを防ぐために
一緒に取られて、蛍光を介した分子トモグラフィーにより、病気の経過の反復的な監視および病態生理学的プロセスの基礎となります。バイオメディカル研究の茄多に適用できる、薬物検査を加速させる役に立つかもしれないかの客観的エンドポイントとして個別セラピー。浸透とも従来に良い相関を発揮しながら炎症細胞の蓄積を定量化を視覚化して貴重な非侵襲的ツールを提供する炎症モデルにおける F4/80 を発現したマクロファージの FMT ターゲット読み出し。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
優れたテクニカル サポート、さんソニア Dufentester、さんエルケ ・ ウェーバーと夫人クローディア Niepagenkämper に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
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