Summary
Target-spezifische Sonden stellen ein innovatives Tool für die Analyse der molekularer Mechanismen, wie z. B. Protein-Expression in verschiedenen Arten von Krankheiten (z. B. Entzündungen, Infektionen und Tumorgenese). In dieser Studie beschreiben wir eine quantitative dreidimensionale tomographische Bewertung der intestinalen Makrophagen Infiltration in einem Mausmodell der Kolitis mit F4/80-spezifische Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
Abstract
Murine Modellen der Erkrankung sind unverzichtbar für die wissenschaftliche Forschung. Jedoch sind viele diagnostische Hilfsmittel wie Endoskopie oder computertomographischen Bildgebung nicht routinemäßig in Tiermodellen eingesetzt. Konventionellen experimentellen Messwerte verlassen sich oft auf post-mortem und ex-Vivo Analysen, die intra-individuelle Nachuntersuchungen zu verhindern und erhöhen Sie die Anzahl der Studie Tiere benötigt. Fluoreszenz-vermittelten Tomographie ermöglicht eine nicht-invasive, sich wiederholende, quantitative, dreidimensionale Beurteilung der fluoreszierende Sonden. Es ist sehr empfindlich und ermöglicht den Einsatz von molekularen Entscheidungsträger, die für die spezifische Erkennung und Charakterisierung von unterschiedliche molekulare Targets ermöglicht. Insbesondere stellen gezielte Sonden ein innovatives Tool für die Analyse der Genexpression Aktivierung und Protein in Entzündung, Autoimmun-Krankheit, Infektion, arterielle Verschlusskrankheit, Zellwanderung, Tumorgenese usw.dar. In diesem Artikel bieten wir schrittweise Anleitungen auf dieser anspruchsvollen imaging-Technologie für die in-Vivo -Erkennung und Charakterisierung von Entzündungen (z.B. F4/80-Positive Makrophagen eindringen) in einer weit verbreiteten Mausmodell der Darm-Entzündung. Diese Technik kann auch in anderen Forschungsbereichen wie immun Zelle oder Stammzell-Tracking verwendet werden.
Introduction
Tiermodelle sind weit verbreitet in der wissenschaftlichen Forschung, und viele nicht-invasiven Verfahren existieren, um Monitor Krankheitsaktivität und Vitalität, wie z. B. die Quantifizierung der Gewichtsveränderungen oder die Analyse von Blut, Urin und Kot. Diese sind jedoch nur indirekte Surrogatparameter, die auch interindividuelle Variabilität unterliegen. Sie müssen häufig durch post-mortem Analyse der Gewebeprobe, die serielle Beobachtung zu sich wiederholenden Zeitpunkten verhindert ergänzt werden und direkte Beobachtung der physiologische oder pathologische Prozesse in Vivo. Raffinierte kleine Tier bildgebende Verfahren entstanden einschließlich cross-sectional Imaging, optische Bildgebung und Endoskopie, ermöglicht die direkte Visualisierung dieser Prozesse und ermöglicht auch für sich wiederholende Analysen der gleichen Tiere1 , , 2 , 3. Darüber hinaus die Möglichkeit, die verschiedenen Stadien der Krankheit im gleichen Tier wiederholt überwachen könnte verringern die Zahl der Tiere notwendig, die aus Sicht der Tierethik wünschenswert sein könnte.
Verschiedene optische bildgebende Techniken existieren für die in Vivo Fluoreszenz-Bildgebung. Ursprünglich war konfokale Bildgebung eingesetzt, um die Oberfläche und Untergrund fluoreszierende Veranstaltungen4,5zu studieren. Jedoch vor kurzem, wurden tomographische Systeme, die für quantitative dreidimensionale Gewebe Bewertungen ermöglichen entwickelten6. Dies wurde durch die Entwicklung von fluoreszierenden Sonden erreicht, die Licht in das Nah-Infrarot (NIR) Spektrum, mit geringen Absorption, empfindliche Detektoren und monochromatischen Lichtquellen7emittieren. Während traditionelle Querschnitts-bildgebende Verfahren wie Computertomographie (CT), Magnetresonanztomographie (MRT) oder Ultraschall (US), setzen vor allem auf physikalische Parameter und Morphologie visualisieren, kann optische Bildgebung zusätzliche Informationen bereitstellen auf die zugrunde liegenden molekularen Prozesse Sonden mit endogenen oder exogenen fluoreszierende8.
Fortschritte in der Molekularbiologie haben dazu beigetragen, um die Generation der intelligente und gezielte fluoreszierenden molekularen Sonden für eine steigende Anzahl von Zielen zu erleichtern. Zum Beispiel können Rezeptor-vermittelte Aufnahme und Verteilung in einem bestimmten Zielgebiet mit Carbocyanine Derivat-markierten Antikörpern9visualisiert werden. Die Fülle an verfügbaren Antikörper, die als spezifische Tracer in sonst unzugänglichen Bereichen des Körpers funktionieren bezeichnet werden kann, bietet noch nie dagewesene Einblicke in die molekularen und zellulären Prozesse in Modellen der Tumorgenese und Neurodegenerative, Herz-Kreislauf-, immunologische und entzündliche Krankheiten7.
In dieser Studie beschreiben wir die Verwendung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie in einem Mausmodell der Kolitis. Dextran Natriumsulfat (DSS)-induzierte Kolitis ist eine chemisch induzierten Maus Standardmodell der Darmentzündung, die entzündliche Darm-Krankheit (IBD)10ähnelt. Es ist besonders nützlich, um den Beitrag des angeborenen Immunsystems zur Entwicklung der Darm Entzündung11zu bewerten. Da die Rekrutierung, Aktivierung und Infiltration von Monozyten und Makrophagen entscheidende Schritte in der Pathogenese der IBD vertreten, sind Visualisierung ihrer Einstellung und die Kinetik der Infiltration unerlässlich, um Überwachung, z. B. die Wirkung von mögliche therapeutische Substanzen in einem präklinischen Einstellung12. Wir beschreiben die Induktion der DSS Kolitis und demonstrieren die Tomographie-vermittelten Charakterisierung von Makrophagen Eindringen in die Darm-Schleimhaut mit molekularen Fluoreszenz-Tomographie für die spezifische Visualisierung des Markers Monocyte/Makrophagen F4/80 13. Darüber hinaus illustrieren wir Hilfs- und ergänzende Verfahren, z. B. Antikörper Kennzeichnung; der experimentelle Aufbau; und Analyse und Interpretation der erhaltenen Bilder, in Korrelation mit herkömmlichen Anzeigen wie Krankheit Aktivität Indizes, flow Cytometry und histologische Analyse und Immunohistochemistry. Wir diskutieren Einschränkungen dieser Technik und Vergleiche mit anderen bildgebenden Verfahren.
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Protocol
Alle Tierversuche stimmten der Forschungsdefizite Für Natur, Umwelt Und dieser (LANUV) Nordrhein-Westfalen nach dem deutschen Gesetz über Tier (Tierschutzgesetz).
(1) Materialien und Versuchsaufbau
- Pflege der Tiere.
- Verwenden Sie aufeinander abgestimmt von Geschlecht und Alter Mäuse DSS-anfälligen Sorte (z.B. C57BL/6) bei 20-25 g Körpergewicht.
- Planen Sie mindestens fünf oder mehr Mäuse pro Versuchsgruppe und Haus der Mäuse nach lokalen Tierpflege Richtlinien.
- Geben Sie ein standard Nagetier Chow, Ernährung und autoklaviert Trinkwasser Ad Libitum.
- Entfernen Sie den standard Chow und ersetzen Sie es mit Luzerne-freie Chow mindestens drei Tage vor dem Scannen um endoluminale Auto-Fluoreszenz zu reduzieren.
- Induktion von akuten DSS-induzierten Kolitis.
- Lösen Sie 2 g des DSS (Molekulargewicht ~ 40.000 Da) in 100 mL autoklaviert Trinkwasser um 2 % (w/V Lösung) zu erhalten.
- Füllen Sie die Trinkwasser Versorgung der Mäuse ausschließlich mit der DSS-Lösung und schätzen Sie 5 mL Flüssigkeit pro Maus pro Tag zu. Bereitstellen Sie die gleichen Trinkwasser ohne DSS, die Mäuse10.
Hinweis: Überwachen Sie die Mäusen täglich bis zum Ende des Experiments. Die Mäuse, die größer als 20 % ihres ursprünglichen Körpergewichts verlieren oder werden sterbenden, einschläfern (d. h. dauerhaft gebeugt Haltung, verminderte Bewegung, Atmung gearbeitet, deutlich Mantel errichten) nach lokalen Vorschriften auf Tier Wohlfahrt.
- Vorbereitung der Fluoreszenz-vermittelten Tomographie.
- Beschriften Sie den gewünschten Antikörper (z. B. Ratte Anti-Maus F4/80) mit Fluoreszenz-Farbstoff (z. B. Cyanine7, λErregung: 750 nm, λEmission: 776 nm) wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Dialyse gereinigte Antikörper in einer entsprechenden Dialysemembran (Porengröße < 50-100 kDa) gegen 1 L 0,15 M Natriumchlorid für mindestens 2 Stunden oder über Nacht.
- Den Antikörper auf 1 L von 0,1 M Nahco33 übertragen und Dialyse für mindestens 2 h.
- Die erforderliche Menge an fluoreszierenden Farbstoff in Dimethyl Sulfoxid (DMSO) auflösen (10,8 µL/mg des Antikörpers) und der Antikörper-Projektmappe hinzufügen. Verwenden der Fluoreszenzfarbstoff in 20-fold Molaren Überschuß ein Farbstoff-Protein-Verhältnis von 1:3 zu erreichen.
- Brüten im Dunkeln bei 4 ° C für 1 h entfernen unmarkierten Antikörper durch Dialyse gegen 1 L 0,15 M Natrium oder mithilfe einer PD-10 Entsalzung Spalte und in Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) für in-Vivo -Anwendung zu beheben.
- Bestimmen Sie die endgültige Antikörperkonzentration und Kennzeichnung Verhältnis durch Spektralphotometrie.
- Messen Sie die Proteinkonzentration bei einer Aufnahme von 250-330 nm und prüfen Sie, zusätzliche Absorption durch den Farbstoff. Korrigieren Sie die maximale Absorption bei 280 nm (Protein) um 11 % der maximalen Absorption bei 750 nm (nächster Schritt) für die Bezeichnung Cyanine7.
- Eine Verdünnung der Verbindung (in der Regel 01:10) bei 250-800 nm zu messen und extrahieren Sie die Konzentration der Cyanine7 bei 750 nm.
- Bestimmen Sie die Farbstoff-Protein-Verhältnis als: Farbstoff/Antikörper = maximale Absorption bei 750 nm / 200.000 / (maximale Absorption bei 280 nm - 0,11 x max Absorption bei 750 nm) / 170.000.
- Aufzubewahren Sie die Antikörperlösung bei 4 ° C und schützen Sie es vor Licht, Bleichen vor der Injektion zu vermeiden.
- Ladevolumen der notwendigen Antikörper-Lösung in eine sterile Spritze unmittelbar vor der Injektion und Schild aus Licht bis es verwendet wird.
- Bestimmen Sie den optimalen Zeitpunkt der Sonde Injektion und den Scanvorgang, je nach Tracer Pharmakokinetik.
- Betäuben Sie die Mäuse, die mit 1,5-2,5 % inhaliert Isofluran in Sauerstoff zu oder sie sicher in einer dedizierten Restrainer für die Rute Vene Einspritzung der beschriftete Antikörper.
- Für Full-length Antikörper injizieren der beschriftete Antikörper mindestens 24 h vor dem Scannen, z. B. für Anti-Maus F4/80 Makrophagen Visualisierung in murinen Kolitis. Mäuse intravenös zu injizieren (i.v.) über das Heck Vene mit beschriftete Antikörper in Höhe 2,0 Nmol des Farbstoffes.
- Verwendung beschriftet ebenso unspezifische Antikörper (z. B. Ratte IgG oder einer anderen Isotype entspricht dem Primärantikörper Erbe) als Isotype Kontrolle in Dosen entsprechen, die von der Sonde.
Hinweis: Die Ergebnisse der in-Vivo scannt nach Injektion der Steuerung Verbindung als Referenz für die Auslegung der speziellen Sonde Bilddaten dienen kann. - Verwenden Sie einen elektrischen Rasierer um zu rasieren, das Fell der Tiere in der Bauchregion, helle Reflexion und Absorption zu minimieren.
- Beschriften Sie den gewünschten Antikörper (z. B. Ratte Anti-Maus F4/80) mit Fluoreszenz-Farbstoff (z. B. Cyanine7, λErregung: 750 nm, λEmission: 776 nm) wie im Protokoll des Herstellers beschrieben. Dialyse gereinigte Antikörper in einer entsprechenden Dialysemembran (Porengröße < 50-100 kDa) gegen 1 L 0,15 M Natriumchlorid für mindestens 2 Stunden oder über Nacht.
2. technische Ausstattung
- Verwenden Sie ein Veterinär Fluoreszenz-vermittelten Tomographie (FMT) Gerät für kleine Tier Fluoreszenz ( Abbildung 4).
- Erstellen Sie eine neue Studie für jedes Projekt durch Klicken auf die "neue Studie"-Taste und die Studie Beschreibung der relevanten Tracer, einschließlich der bildgebenden Parameter und Dosen für zukünftige Referenz enthalten.
- Im Rahmen dieser Studie erstellen Lerngruppen entsprechend der jeweiligen Studiendesign (z. B. für die spezifischen Tracer und unspezifischen Isotype Kontrolle) durch Klicken auf die "neue Studiengruppe" Taste. Rüsten Sie jede Studiengruppe mit der jeweiligen Anzahl von Tieren.
- Das System für die Tracer-Konstrukte zu kalibrieren.
- Führen Sie die Kalibrierung für jede Charge von Tracern zu normalisieren die Variation in der Kennzeichnung und quantitative Messung von OI-Daten ermöglichen.
- Befolgen Sie das Instrument des Herstellers Anleitung zur Kalibrierung von jedem einzelnen System; nach der Auswahl von "Hinzufügen neuer Tracer" wird das System einen Leitfaden durch die einzelnen Schritte bieten. Bieten Sie die Verdünnung der angewandten Antikörper-Lösung und die berechnete absolute Konzentration der Tracer in der Sonde.
- Verwenden Sie für FMT eine Nachahmung von Gewebe Phantom der definierten Dicke und Absorption Eigenschaften (ähnlich wichtige Gewebe) und füllen Sie ihn mit einem bestimmten Volumen der Antikörper-Lösung verwendet. Messen Sie dies auf dem FMT-Gerät.
Hinweis: Das System wird die Referenzmessung der mitgelieferten Sonde, zusammen mit der vorgegebenen Konzentration verwenden, um absolute Tracer Konzentrationen von zukünftigen in Vivo Messungen zu berechnen.
- Verwenden Sie eine beheizbaren Prüfung Kassette mit einer Temperatur von 42 ° C.
Hinweis: Dies verhindert die Mäuse hypothermen während der Untersuchung.
3. Tier Anästhesie
- Verwenden Sie einen kontinuierlichen Fluss von 1,5-2 % Vol % Isofluran ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) und 1,5 L O2/min um die Mäuse zu betäuben.
(4) Fluoreszenz-vermittelten Tomographie Scan
Hinweis: Passen die folgenden Details, die speziell für die FMT-Systematik in diesem Studie (siehe die Tabelle der Materialien) für alternative Fluoreszenz Reflexion imaging-Geräte oder FMT-Systeme, je nach Bedarf.
- Platzieren Sie die narkotisierten Maus auf dem Rücken in der Prüfung-Kassette.
- Führen Sie den Scanvorgang.
- Setzen Sie die Kassette in das Abbildungssystem und schließen Sie es sofort, um kontinuierliche Anästhesie zu gewährleisten. Wählen Sie die entsprechende Probe aus der Studiengruppe, die zuvor erstellte. Wählen Sie die verabreichte Tracer aus dem Dropdown-Menü um sicherzustellen, dass die Werte für Tracerkonzentration richtig berechnet werden.
- Fluoreszenzbild Reflexion bei der entsprechenden Wellenlänge zu erwerben (720 nm für Cyanine7) für Scan Planung und Gliederung der Scan-Bereich durch Anklicken des Buttons "Bild holen".
- Sehen Sie, dass das Scan-Feld als Overlay auf Reflexion Fluoreszenzbild erscheint. Anpassen, um die Region von Interesse (z. B. Darm oder Bauch), Luft oder Bereiche der restlichen Fell zu vermeiden. Je nach Bildziel Anzahl der Bild Datenpunkte im Scan-Bereich durch Auswahl aus dem groben auf mittlerer und feiner Auflösung der Scan-Bereich im Menü auf der rechten Seite.
Hinweis: Denken Sie daran, dass ein Feinscan Feld bessere räumlichen Auflösung auf Kosten deutlich längere Scanzeiten bieten könnte. - Daten/Bildaufnahme bei der ausgewählten Wellenlänge zu starten, indem Sie auf "Scannen".
Hinweis: Die Scan-Zeit für eine mittelfeine Scan des gesamten Abdomens werden rund 5 min; in dieser Zeit jeden Datenpunkt wird separat von der Erregung Laser beleuchtet, und die daraus resultierende Fluoreszenz aufgezeichnet. - Das Tier aus der bildgebenden Kassette am Ende des Scans und lassen Sie das Tier wieder vollständig, bevor sie zurück in den Käfig platziert.
- Das FMT zu wiederholen, falls notwendig, zu verschiedenen Zeitpunkten während des Experiments (z. B. Tage 0, 5 und 9-10 (Ende des Experiments)), aber die Anhäufung von Antikörper im Körper, was die Fluoreszenz Hintergrundsignal betrachten.
5. Post-scan
- Platzieren Sie den Mauszeiger in einem separaten Käfig auf einem Papiertuch unter einem Rotlicht-Wärmelampe und überwachen Sie die Maus auf Anzeichen von Unbehagen oder Stress bis zur endgültigen Genesung. Platzieren Sie den Mauszeiger wieder in seinem jeweiligen Käfig wenn ganz wach.
- Die Mäuse am Ende des Experiments durch die Lieferung von CO2 an den Isolator bei einer Dosis von 100 % (V/V), 100 Vol% und 3 L/min einschläfern. Nicht vorab füllen Sie die Kammer mit CO2, als eine plötzliche Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CO2 not verursachen dürfte. Überprüfen Sie Tod, nachdem die Maus durch einen anschließenden sekundären Modus der Sterbehilfe wie schnelle zervikale Dislokation atmen aufgehört hat.
- Explant Dickdarm durch abdominale Laparotomie und führen einen ex-Vivo -Scan der explantierten Doppelpunkt, wie in Schritten 4.2.1 - 4.2.4 erläutert. Öffnen Sie jedem Doppelpunkt längs mit chirurgischen Metzenbaumschere und spülen Sie gründlich mit Kochsalzlösung vor bereitet sie für die weitere Analyse.
- Verwenden Sie ein Skalpell schneiden ein 0,5-cm-Fragment aus dem distalen Dickdarm und sofort in eine Kryo 1,5-mL-Tube statt. Frieren Sie in flüssigem Stickstoff und Store bei-70 ° C bis zur weiteren Verwendung (z.B.Myeloperoxidase (MPO) Messungen ein).
- Verwenden Sie einen Holzstab und die restlichen längs eröffnete Doppelpunkt aus dem distalen proximalen Ende mit der Schleimhaut nach außen ("Swiss Roll-Technik"), für histologische Analysen aufrollen. Legen Sie die Vorbereitung in ein Fixiermittel (siehe die Tabelle der Materialien) und bei-80 ° C14einfrieren.
6. Daten Rekonstruktion und Interpretation
- Verwenden der Rekonstruktions-Werkzeug für die jeweilige Software zur Abbilderstellung 3D-Karten der Fluoreszenz-Verteilung aus der rohen Bilddaten zu erstellen; Scans zu Rekonstruktions-Werkzeug, wenn beim Scannen automatisch hinzukommen, die Funktion "zur Rekonstruktion Warteschlange hinzufügen" ausgewählt ist.
- Andernfalls wählen Sie die Scans aus dem Dropdown-Menü unter der jeweiligen Studie und Studiengruppe, mit der rechten Maustaste des Scans, und wählen Sie "add to Wiederaufbau."
- Zur weiteren Analyse laden Sie ein Datensatzes in der Analyse-Software. Wählen Sie aus dem Dropdown-Menü in der oberen Leiste die jeweilige Studie und wählen Sie dann aus dem Menü auf der rechten Seite der Study Group und das einzelne Tier; alle Scans durchgeführt für dieses Tier werden angezeigt. Wählen Sie den richtigen Scan und klicken Sie auf "laden".
Hinweis: Die 3D-Rekonstruktion der Tracerverteilung wird als Überlagerung der ursprünglich erworbenen Fluoreszenzbild Reflexion auf der linken Seite angezeigt. Das Modell kann gedreht und vergrößert für einfachere Analyse. - Brennpunkte der unspezifischen Label Akkumulation (z. B. Leber oder Urin Blase) auf rekonstruierten 3D-Karten zu identifizieren und unterscheiden von Zielgeweben (z. B. Darm oder Darm).
- Wählen Sie in der oberen Leiste die ROI-Form am besten geeignet für das Ziel. Label Zielgewebe wie Regionen von Interesse (ROI) indem man den jeweiligen Messwerkzeuge in der Analyse-Software; die Software liefert eine Fluoreszenzintensität für den ROI, sowie (Pico) molare Mengen des Tracers, die für der Scan kalibriert wurde.
- Wählen Sie den Gesamtbetrag der Tracer in die entsprechenden ROI, normalisiert die ROI-Größe, als das am besten geeignete Äquivalent zur Beurteilung der Krankheitsaktivität im Zusammenhang mit entzündlichen Infiltrat (Histologie).
Hinweis: Weitere Features des ROI können gegebenenfalls als repräsentativ für das jeweilige Modell gewählt werden.
7.Ex-Vivo Analysen
- Hämatoxylin und Eosin Färbung und Immunfluoreszenz-Färbung.
- Deparaffinize Abschnitte, indem man sie in 70 % igem Ethanol (EtOH) für 2 min; anschließend mit destilliertem Wasser abspülen. Färben mit Hämatoxylin Lösung für 5 min und anschließend mit warmem Leitungswasser für 10 min spülen.
- Mit destilliertem Wasser spülen Sie ab, Gegenfärbung mit Eosin-Lösung für 2 min, und wieder mit destilliertem Wasser abspülen.
- Ort in 70 % EtOH, 96 % EtOH, 99 % EtOH und Xylol (2 Mal) für 2 min pro zu entwässern und die Abschnitte zu löschen. Mit harzigen Eindeckmedium montieren.
- Immunfluoreszenz-Färbung.
- Verwenden Sie die zuvor erhaltenen Gewebeschnitte ("Swiss-Roll") für Immunfluoreszenz-Färbung und bereiten Sie Cryo-Schnitt Abschnitte von 7 µm.
- Blockieren Sie Aceton fixiert und gefrorenen Doppelpunkt Abschnitte in 5,0 % Ratte Serum für 10 min zu und inkubieren Sie über Nacht mit verdünnter (1/500 V/V) biotinylierte primäre Ratte Anti-Maus F4/80 Antikörper. Waschen Sie die Abschnitte dreimal in Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS) und inkubieren Sie mit Streptavidin-FITC (1: 100 V/V) in PBS/BSA (0,1 % w/V) über Nacht bei 4 ° C.
- Waschen Sie die Abschnitte in TBS und Flecken mit 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 1: 1000 V/V) Kontrast zu erzielen. Fluoreszenzbilder unter einem confocal Mikroskop analysieren (siehe die Tabelle der Materialien; 40 X Vergrößerung; Filter Cube N2.1 mit Erregung Filter 515-560) und zählen die F4/80-positiven Zellen pro Hochleistungs-Feld.
Hinweis: Verwenden Sie Antikörper Klon und Format beim in-Vivo FMT und post-mortem Histologie Analysen wie Immunohistochemistry oder Immunfluoreszenz-Färbung, je nachdem das beabsichtigte Ziel zu kombinieren. Für die Erkennung von F4/80-Positive Makrophagen in Vivo und ex Vivowurden unterschiedliche Formate verwendet.
- MPO-Messungen im Dickdarm Proben.
- Verwendung bezogen frisch, PBS gespült Doppelpunkt Proben oder aufgetauten Probe für MPO Messungen. Wiegen alle Proben und homogenisieren des Gewebes in Lyse Puffer im ELISA kit (siehe die Tabelle der Materialien), bei einem Volumen von 20 µL der Lyse Puffer pro mg des Gewebes.
- Beschallen für 15 s (Ultraschall-Frequenz: 20 kHz, Leistung: 70 W) und Zentrifugieren Sie Proben für 10 min bei 200 x g und 4 ° C.
- Verwendung eines kommerziell erhältlichen ELISA kit (siehe die Tabelle der Materialien) laut Hersteller Beschreibung. Führen Sie den Test in Duplikate.
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Representative Results
Bewertung der Colitis:
DSS-induzierte Kolitis ist eine chemisch induzierten Mausmodell der Darmentzündung, die ähnelt menschlichen IBD und führt zu Gewichtsverlust, rektale Blutungen, oberflächliche Ulzeration und Schleimhaut Schaden anfällig Mäuse15. Es ist besonders nützlich, um den Beitrag des angeborenen Immunsystems zur Entwicklung der Darmentzündung10,11studieren. Potent colitic Entzündungen induzieren, Mäuse waren kontinuierlich verabreicht DSS während des Experiments. Abnahme des Körpergewichts und Fäkales Okkultes Blut im Stuhl dienten als klinische Indizes der Entzündung. Wie in Abbildung 1Adargestellt, begann Mäuse ab Tag 4 nach der Induktion der Kolitis, Gewicht zu verlieren, während Kontrolltiere Vorfluter allein keine signifikanten Veränderungen des Körpergewichts zeigte. Darüber hinaus colitic Tiere zeigten erhöhte Ausscheidung von okkultes Blut im Stuhl mit Kot (Abbildung 1 b), wie anhand der folgenden Hemoccult scoring-System: 0 (kein Blut), 1 (Hemoccult positiv), 2 (Hemoccult positive und visuelle Pellet Blutungen) und 4 () Brutto-Blutungen, Blut um Anus)16. Doppelpunkt-Länge wurde gemessen, um Entzündung induziert Kolon Verkürzung, enthüllt deutlich verkürzte Doppelpunkte in colitic Mäusen im Vergleich zu Kontroll-Mäusen Vorfluter allein (Abbildung 1) zu bewerten. Um direkt Kolon Schadensbewertung, wurde am Ende des Experiments histologische Analyse durchgeführt. Eine quantitative Beurteilung der histologischen Schäden erfolgte am Kolon H & E-gefärbten Abschnitte mit einer allgemeinen Verletzungen Core basierend auf den Grad und Ausmaß der Entzündung, Krypta Schäden und prozentuale Beteiligung17. Colitic Mäuse zeigten Anzeichen einer schweren Entzündung, während Kontrollmäusen empfangen keine DSS keine histologischen Schäden (Abbildung 1 zeigte). Die Bilder zeigen typische entzündliche Veränderungen in DSS-induzierte Kolitis, zeichnet sich durch die Zerstörung der epithelialen Architektur, mit dem Verlust von Becherzellen, Krypta Schaden und Schleimhaut-Ulzerationen, im Gegensatz zu der weitgehend erhaltenen Schleimhaut- Architektur in Kontrolle Mäuse18. Statistischen Unterschiede zwischen den Gruppen (n = 5 pro Gruppe) wurden berechnet, indem der Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von Student-Newman-Keuls (S.N.K.) Post Hoc test oder durch Welch Test, gefolgt von Spiele-Howell post Hoc Test bei erheblichen Abweichung Inhomogenität. Ein p-Wert von < 0,05 galt als bedeutende.
Bewertung der Monocyte und Makrophagen Rekrutierung:
DSS-induzierte Kolitis ist verbunden mit der Infiltration der immunen Zellen wie Monozyten und Makrophagen, in die Mukosa und Submukosa des Dickdarms, haben wir immunofluorescent Färbung des Markers Monocyte/Makrophagen F4/80 um das Infiltrat zu quantifizieren. Colitic Mäuse erhalten DSS zeigten deutlich erhöhte Zahl von Monozyten infiltriert die Darmwand im Vergleich zu nicht-colitic Kontroll-Mäusen (Abbildung 2A). Leukozyten-Infiltration wurde zusätzlich quantifiziert mit immunofluorescent Färbung für die Neutrophilen Marker GR1, enthüllt die deutlich erhöhte Einwanderung von Neutrophilen in den entzündeten Darm im Vergleich zu Kontroll-Mäusen (Abb. 2 b). Um zu bestätigen, MPO waren Ebenen reflektiert beide Neutrophilenzahl Nummer und entzündliche Aktivität im Dickdarm Gewebe des colitic Mäuse (Abbildung 2) deutlich erhöht. ANOVA und S.N.K. Post Hoc Test wurden verwendet, um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu berechnen (n = 5 pro Gruppe). Statistischer Signifikanz wurde auf p festgelegt < 0,05.
Systemische Veränderungen in Makrophagen Subpopulation:
Maus Monozyten umfasst eine heterogene Gruppe von verschiedenen Subpopulationen, die unterscheiden sich in Reifen Zustand und ihre Fähigkeit zur entzündlichen Websites eingestellt werden wo sie teilnehmen, bei der Initiierung und verewigen die Entzündungsreaktion19 . Daher wir Blut Monozyten durch Analyse der differentiellen Expression der CD11b gekennzeichnet und Ly6C mit flow Cytometry. Unter entzündlichen Erkrankungen akute DSS Colitis beobachteten wir eine deutliche Zunahme der entzündlichen CD11bhoheLy6Chohe Monozyten im Vergleich zu Pre-Experiment Bedingungen. Im Gegensatz dazu auftreten diese Verschiebung nicht in nicht-colitic Kontroll-Mäusen ohne DSS (Abbildung 3A). Die Daten (n = 5 pro Gruppe) wurden analysiert mit ANOVA und S.N.K. Als zusätzliche Surrogatparameter für die systemische Entzündung untersuchten wir das Vorhandensein von F4/80-positiven Zellen in der Milz von colitic Mäusen im Vergleich zu nicht-colitic Kontrollen, die eine deutliche Zunahme der DSS-behandelten Mäusen (Abbildung 3) offenbart.
Fluoreszenz-vermittelten Tomographie Scan:
Wir haben Fluoreszenz-vermittelten Tomographie um Monocyte/Makrophagen Rekrutierung und Infiltration in die Darm-Schleimhaut zu messen. Ein Fluoreszenz-markierten Antikörper gegen murine F4/80 wurde eingesetzt, um die aktivierte Makrophagen in lebenden Tieren direkt sichtbar zu machen. Beschriftete, unspezifische Ratte IgG-Antikörper wurden als die Isotype-Kontrolle verwendet. Für das Scannen, wurden Mäuse in der Bauchregion, Lichtreflexion zu minimieren durch das Fell rasiert, betäubt durch kontinuierliche Isofluran Versorgung und untersucht in einem tierärztlichen FMT-Gerät für kleine Tier Fluoreszenz. Wie in Abbildung 4A, die Induktion der Kolitis führte zu einer deutlich erhöhten Ansammlung von Fluoreszenz Tracer in die Doppelpunkte colitic Mäuse im Vergleich zu nicht-colitic Kontrollen, angibt, eine Erhöhung der Monocyte Infiltration und Differenzierung in aktiven Makrophagen bei colitic Tieren. Die Anwendung von einer unspezifischen Fluoreszenz-markierten IgG keine nachweisbar Fluoreszenz Reaktion in den Bauch und Darm, weder in der colitic (DSS) noch nicht colitic (Wasser)-Gruppe, Nachweis der Spezifität der Sonde-Targets auslösen. Zusammenspiel von F4/80 Antikörper (Abb. 4A). Repräsentative Bilder von der Bauchregion angezeigt werden. Der Farbcode zeigt den Ladezustand der Fluoreszenzintensität, die das Ausmaß der entzündlichen Infiltrat()Abbildung 4 b und 4 Centspricht).Ex-Vivo -Messungen der F4/80-Regie Tracer Akkumulation in explantierten Doppelpunkte überprüft den Kolon Ursprung des Signals in Vivo erkannt der F4/80 Tracer Akkumulation (Abbildung 5A und 5 b). Berechneten Beträge von gebundenen Antikörper korreliert gut (R2 = 0,52) mit histologisch ermittelten Zahlen der Infiltration von Makrophagen (Abbildung 5 und 5D), bestätigt, dass in-Vivo Bildgebung mit spezifischen Tracer kann sein bezeichnend für lokale Krankheitsaktivität. Daten analysiert wurden durch ANOVA und S.N.K. post Hoc Test mit einem statistischen Signifikanzniveau p festgesetzt < 0,05. Die Korrelation wurde als lineare Regression berechnet.
Abbildung 1 . Klinischen Parameter und histologischen Verletzungen im Laufe der akuten DSS Kolitis.
C57BL/6 Mäusen wurden aufgefordert, mit DSS (2 % w/V) im Trinkwasser für 8 Tage. Kontroll-Mäusen erhielten Trinkwasser ohne DSS. Tiere wurden am 9. Tag eingeschläfert. Gezeigt werden Daten aus einem Experiment (n = 5 pro Gruppe) ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM). (A) Veränderungen im Körpergewicht sind bezogen auf das ursprüngliche Gewicht vorgestellt. (B) Ausscheidung im Kot, Blut, wie durch die Guajak-Papier-Test bestimmt (Hemoccult, 0 = negativ, 4 = Blut makroskopisch). (C) Post-mortem Doppelpunkt Länge. (D) histologischen Verletzungen als beurteilt den Grad der Schädigung der Krypta und dem Ausmaß der Entzündung. Gezeigt werden repräsentative histologische Bilder (Hämatoxylin/Eosin Färbung; Vergrößerungen: 10 x (obere Abdeckung), 20 x (untere Leiste)) colitic (linken Panels) oder Kontrollmäusen (richtigen Platten). Beachten Sie die tiefgreifende Zerstörung der epithelialen Architektur und entzündliche Infiltrate (Pfeilspitzen). Balkendiagramm: Verletzungen Partitur. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 . Intestinale Monocyte und Makrophagen infiltrieren.
DSS ulcerosa wurde in C57BL/6 von der Anwendung des DSS induziert (2 % w/V) in das Trinkwasser. Kontroll-Mäusen erhielt Trinkwasser allein. Die Daten von n = 5 Mäuse pro Gruppe sind ± SEM (A) Immunofluorescent Visualisierung von Makrophagen Infiltrationen in der Schleimhaut gezeigt. Gezeigt werden repräsentative Bilder der Anti-F4/80 Färbung in colitic und Mäuse zu kontrollieren. Balkendiagramm: Zelle Graf/hohe Kraftfeld (HPF). (B) Immunofluorescent Visualisierung der Schleimhaut Neutrophilenzahl Infiltrationen. Gezeigt werden repräsentative Bilder der Anti-Gr-1 Färbung bei colitic Tieren und Kontrollen. Balkendiagramm: Handy-Graf/HPF. (C) MPO Konzentration im Kolon Gewebe des colitic und nicht colitic Mäuse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 . Monocyte Rekrutierung zum Darm Fach.
Peripheren Blut Monozyten aus colitic Mäuse sowie Kontroll-Mäusen (n = 5 pro Gruppe) wurden durch Durchflusszytometrie für den Ausdruck von Ly - 6C auf CD11b-positiven Zellen analysiert. Zellen wurden basierend auf SSC und CD11b Ausdruck sortiert. Maus Monozyten als SSCniedrigenCD11bhohe Zellen identifiziert wurden, und ihren Ly6C Ausdruck wurde analysiert. (A) Proportional ändert sich in Richtung entzündliche Ly6Chohe Monozyten relativ Pre-Experiment Bedingungen (Veränderung % ± SEM) dargestellt werden. (B) FACS Punkt plottet Ly6C Ausdruckslosigkeit SSClowCD11bhohe Zellen von colitic Tieren vor und nach ulcerosa Induktion (untere Platten) und Kontrollen vor und nach dem Experiment (oberen Platten). (C) Splenocyten von colitic und nicht colitic Mäusen wurden für den Ausdruck von F4/80 von Durchflusszytometrie (mittlere Fluoreszenz Intensität ± SEM) bewertet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 . Tomographische Visualisierung der Makrophagen zu infiltrieren in murinen Kolitis.
FMT scannt bei colitic Mäusen und nicht colitic Steuerelemente verwaltet Cyanine7 konjugierten Antikörper gegen murine F4/80 (n = 5 pro Gruppe). (A) Balkendiagramm: total Fluoreszenzintensität in Pmol des Farbstoffes wurde in der ROI ermittelt und abgebildeten ± SEM Vertreter Bilder mit farbcodierten Fluoreszenzintensität entspricht das Ausmaß der entzündlichen Infiltrat bei Mäusen injiziert angezeigt werden mit der Sonde (Anti-Maus F4/80) (B) und einer unspezifischen Steuerung (Ratte IgG) (C). In beiden Fällen wurde ein ROI von gleicher Größe quer im Oberbauch zur weiteren Analyse gelegt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 . Ex-vivo Validierung der Tracer Spezifität in murinen ulcerosa.
In vivo FMT-Scans bei colitic Mäusen injiziert mit der Sonde (Anti-Maus F4/80) folgten ex Vivo planar Fluoreszenz Scans von explantierten Darm zu zeigen, das Kolon Herkunftsland der Tracer-Signal erhalten in-vivo. Daten aus zwei Experimente mit einer Gesamtfläche von n = 8 Tiere gezeigt. Repräsentative Bilder angezeigt werden, Darstellung in Vivo FMT Scans von colitic Mäuse mit farbcodierten Fluoreszenz Intensität entspricht das Ausmaß der entzündlichen Infiltrat (A).Fluoreszenz Reflexion Bildgebung des Darms explantierten ermöglicht die Identifikation bestimmter Regionen mit Tracer Ansammlung (B). Repräsentative post-mortem immunofluorescent Färbung für F4/80-Positive Makrophagen aus solchen Bereichen bestätigt die Ergebnisse in Vivo (C). Die Anzahl der Infiltration von Makrophagen, wie durch Immunfluoreszenz-Färbung, bestimmt wurden korreliert mit in Vivo gemessen Tracer Ansammlung (D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Obwohl medizinische bildgebende Verfahren in den letzten Jahren rasant entwickelt haben, sind wir noch in unsere Fähigkeit, entzündliche Prozesse oder Tumoren sowie andere Krankheiten in ihren frühesten Stadien der Entwicklung erkennen begrenzt. Dies ist jedoch entscheidend zum Verständnis Tumorwachstum, Invasion, oder Metastasen Entwicklung und zelluläre Prozesse bei der Entwicklung von entzündlichen Erkrankungen und degenerative, Herz-Kreislauf- und immunologischen Erkrankungen. Herkömmliche bildgebende Verfahren basieren, zwar auf physische oder physiologische Parameter ermöglicht molekularer Bildgebung die Visualisierung der spezifische molekulare Marker in Vivo20.
Für das kleine Tier Imaging Radionuklid getriebenen Ansätze (z. B. sIngle-Photonenemission berechnet Tomographie (SPECT) und Positronen-Emissions-Tomographie (PET)), Ultraschall und Fluoreszenz-vermittelten Imaging lässt sich spezifische visualisieren molekularen Zielstrukturen. Die Verwendung von Full-length Antikörper als die meisten verfügbaren Tracer Rückgrat erfordert langlebige Etiketten, als lange Zirkulation Zeiten und langsame Gewebe eindringen Verzögerung der Zeitpunkt der Bildgebung nach Tracer Anwendung. Typische bildgebende Radionuklide eignen sich daher nicht für die in-Vivo Bildgebung der Antikörper-Distribution. Der Einsatz von langlebigen Isotopen wie Cu64 oder In111 kann Antikörper-basierten Taster aber erfordert eine komplexe Infrastruktur Isotop Generation, Strahlenschutz vor und während der Etikettierung, überspannt und Tierhaltung nach Sonde Anwendung abgeschirmt. Kostengünstige und sicherere Variante würde Fluoreszenz-vermittelt imaging.
Mehrere in-Vivo imaging-Systemen für die Erkennung, wurden über die vergangenen zwei Jahrzehnte21Visualisierung und Messung der Fluoreszenzfarbstoff Verteilung in lebenden Tieren vorgestellt. Die meisten Systeme ermöglichen schnelle planare Bildgebung geeignet für oberflächliche Läsion Bildgebung. Durch Lichtabsorption und Streuung, Signale, die tief in das Gewebe entziehen planare Bildgebung. Die prominenteste Lösung für dieses Problem ist Fluoreszenz-Tomographie22. Basierend auf mathematische Modellierung, das Bildsignal ist für die Streuung und leichte Aufnahme korrigiert und eine virtuelle 3D Dataset errechnet sich aus der Multi-Projektion Dataset-8. Der Algorithmus bietet voll quantitative Daten, ermöglicht die Abschätzung der Tracerkonzentration in bestimmten Regionen als repräsentativ für die Ziel-Konzentration/Ausdruck-23. Eine entsprechende Einschränkung des FMT bezieht sich auf schlechte räumliche Auflösung im Vergleich zu anatomischen bildgebende Verfahren, die Macht-je nach der gewünschten Ziel-Kompromiss die Zuweisung von molekularen Informationen an bestimmte anatomische Strukturen. Eine weitere Einschränkung liegt in die eingeschränkte Eindringtiefe des Lichtes in das Gewebe, das erfordert die Verwendung von Proben absorbieren und fluoreszierend Rot bis NIR Spektralbereich23.
Eine kürzlich eingeführte bildgebende Modalität, die kombiniert die Vorteile der morphologischen Ultraschall und die Möglichkeit der Erlangung von molekularen Informationen von Fluoreszenz-Bildgebung ist Optoacoustic Bildgebung. Vorläufige Ergebnisse aus frühen Studien deuten darauf hin, dass-trotz Notwendigkeit weitere technische Raffinesse-Optoacoustic imaging hält viel versprechend für molekulare Bildgebung und potenzielle translationale Anwendungen24.
Die Rekrutierung von Leukozyten an die Darmwand ist ein entscheidender Schritt in der Initiierung und Aufrechterhaltung der IBD, wie die Rekrutierung von Entzündungszellen an den Ort der Infektion oder Entzündung in vielen immun-vermittelte Krankheit, wie Autoimmunerkrankung ist, Infektion, arterielle Verschlusskrankheit, Tumorgenese und viele weitere25. Wie Monocyte Aktivierung und Infiltration in der Darmschleimhaut ist ein wesentlicher Schritt in der Pathogenese der IBD, ist die Hemmung der Monocyte Infiltration, orchestriert von Chemokinen und Integrin-zelluläre Adhäsion Molekül Interaktion, eine vielversprechende therapeutische 12,26zu nähern. Daher ist die Überwachung Leukozyten Handel an den Ort der Entzündung entscheidend bei der Entwicklung von neuen Therapiemöglichkeiten, die entzündungshemmende Wirkung der untersuchten Drogen zu visualisieren. Dies kann von besonderem Interesse sein, weil Agenten auf Leukozyten Menschenhandel entwickelt worden, und einige Anti-Integrin-Antikörper sind bereits erhältlich für CED-Therapie, weitere Komponenten in die nahe Zukunft26erhältlich sein werden. Vedolizumab, ein humanisierter monoklonaler Antikörper gegen den Darm-spezifische α4β7 Integrin-Untereinheit und Etrolizumab, die β7-Untereinheit der intestinalen α4β7 und αEβ7 Integrin Heterodimere bindet, wurden genehmigten27,28. Sonstiges (z. B. MAdCAM-1 PF-00547659 und Sphingosine-1-Phosphat (S1P)-Rezeptor-Modulatoren wie z. B. Ozanimod) werden derzeit Auswertung für die Behandlung von IBD29,30.
Bei FMT, eventuelle Änderungen der Technik gehören die Auswahl von verschiedenen Tracer-Ziel Kombinationen sowie die Kombination von FMT mit strukturellen Bildgebung Ansätze zu kompensieren, schlechte räumliche Auflösung. Eine Vielzahl von Kombinationen der Sonde-Ziel hat gegründet und vermarktet. Für konkrete Projekte, die Kennzeichnung von benutzerdefinierten Antikörper können sein Kennzeichnung erfolgt mit kommerziellen, Kits und das oben beschriebene Protokoll. Je nach Antikörper oder kleinere Peptid als targeting Abstimmungsunterlagen gewählt bieten kommerzielle Anbieter eine breite Palette von verschiedenen Labels. Betrachten Sie die gewünschte Farbe, je nach Anwendung: für Deep-Tissue-imaging, einen Farbstoff in die NIR-Spektrum tätig (z. B. Cy7, λex / Em 750/780 nm) möglicherweise gut geeignet, während die Gesamthelligkeit und wirkungsvolles Licht von Farbstoffen liefern Betrieb im in der Nähe von sichtbaren Bereich des Spektrums (z. B. GFP Analoga) möglicherweise vorzuziehen. Praktisch alle Farbstoffe erhalten Sie als eine aktive Ester Label Lysin-Reste von Proteinen sowie mit alternativen verbindliche Moieties, z. B. Maleimides für Cystein Bindung oder Biotin für die Kennzeichnung der Proteine mit spezifischen Kennzeichnung Tags31 ausgestattet . Die Auswahl des Labels ändert nicht das Prinzip Protokoll aber verlangt lediglich geringfügige Änderungen der Kennzeichnung Verfahren und ist wichtig für ein gutes Ergebnis der bildgebenden. Eine weitere attraktive Modifikation zur Überwindung der Grenzen im räumlichen Auflösung ist FMT mit CT oder MRT, wodurch die Kommentierung der anatomischen Strukturen mit molekularen Informationen zu kombinieren.Die Strukturinformationen kann entweder sequenziell als apriorische Informationen oder gleichzeitig erworben werden hybride Bildgebung Instrumentierung32,33, wonach.
Bestimmte Schritte des Protokolls verdienen besondere Aufmerksamkeit. Da diese Technik angepasst für eine Vielzahl von fluoreszierenden Photoprobes, die eine Vielzahl von bestimmten Molekülen Vertreter der verschiedenen molekularen Prozessen abzielen werden kann, unbedingt zu ermöglichen, die ausreichende Verteilung von Sonden und Anreicherung in der gewünschte Zielregion. Der ideale Zeitpunkt für die Bildgebung variieren entsprechend der Sonde-Ziel-Kombination. Beispielsweise könnte durch die Diffusionsgeschwindigkeit, Tumoren, Aufnahme und Metabolismus durch die Leber und die möglichen Nebenwirkungen immunogen34Antikörper gezielt Tumor Rezeptoren beeinflusst werden. Auch berücksichtigen Sie entsprechende Kontrollen für bestimmte bildgebende Ansätze. Spezifischen Tracer sollte immer gegen Isotype-Kontrollen, die reflektierende Perfusion Effekte und unspezifische Bindung (z. B. Fc-Rezeptor-vermittelte Bindung) überprüft werden. Ziel-Negative Tiere dienen als eine zusätzliche Kontrolle für Tracer Spezifität, wenn solche Ko-Modelle vorhanden. Alternativ kann blockieren Experimente durchgeführt werden, um die Spezifität der Antikörper-Ziel Interaktionen35zu beweisen.
Im folgenden werden wichtige Schritte in Bezug auf die praktischen Aspekte des Verfahrens: (1) sorgfältig bestimmen die DSS-Konzentrationen verwendet werden, da DSS Anfälligkeit zwischen variieren könnten andere Maus Stämme und Hersteller/Chargen36. (2) vorsichtig Sonde-Ziel Kombinationen auswählen. (3) ermöglichen Sie ca. 5 min von Scan-Zeit für eine ausreichende Scan des gesamten Abdomens. Der optimale Zeitpunkt zwischen Tracer Anwendung und der bildgebenden Verfahren muss sorgfältig ermittelt werden, um für die Tracer-Akkumulation in der gewünschten Region zu ermöglichen. Für die Erkennung von intestinalen F4/80 in murinen Kolitis sollte der beschriftete Antikörper 24 h vor dem Scannen injiziert werden. (4) da unspezifische Bezeichnung Akkumulation (z. B. in der Leber) auftreten kann, ist es entscheidend, das entsprechende Zielgewebe als ROI zu kennzeichnen, indem man die jeweiligen Messwerkzeuge. Darüber hinaus werden ausreichende Kontrollen für unspezifische Tracerverteilung aufgenommen-sollten unspezifischen Isotype Steuerelemente Perfusion Effekte und Ko oder blockierende Studien zur Validierung von Tracer-Ziel Interaktion auszuschließen.
Typische Fehlerquellen im Zusammenhang mit der Scan Verfahren und Daten Rekonstruktion gehören falsche Tier Position, scan-Bereich und Belichtungszeit. Wenn das Tier zu positionieren, sollte die fluoreszierende Läsion durch Gewebe auf allen Seiten zum Wiederaufbau Lärm zu minimieren umgeben sein. Zwischen dem Tier und die vordere Glasplatte der bildgebenden Kassette eingeschlossene Luftbläschen erhöhen könnte auch Lärm und sollte durch Verschieben des Tieres leicht entfernt werden. Über- oder Unterbelichtung des Bildes kann erfordern einen ausdrückliche Scan mit modifizierten Belichtungseinstellungen, die im Fenster Scan gefunden werden können (Reflexionsgrad Bildblock: Anpassungen der vordere LED Intensität und Belichtung Zeit). Beim Kombinieren von in Vivo Antikörper-basierten FMT Messungen mit post-mortem histologische Analysen, z. B. Immunohistochemistry oder immunofluorescent Färbung, sollte die Verwendung von Antikörpern gleicher Klon und Format betrachtet werden. Auch sollte bei sich wiederholenden FMT-Messungen in der gleichen Tiere die gleichen Formate und Klone verwendet werden zur Verhinderung von möglichen Kreuzreaktivität oder die Ausrichtung der verschiedenen Epitope.
Zusammengenommen kann vermittelt-molekulare Computertomographie Fluoreszenz die sich wiederholende Überwachung der Verlauf der Krankheit und die zugrunde liegenden pathophysiologischen Prozesse. Es kann zu einer Vielzahl von biomedizinischen Studien angewendet werden und könnte nützlich sein, Drogen-Tests zu beschleunigen oder als objektive Endpunkt in individualisierte Therapien. FMT-targeting von F4/80-Ausdruck Makrophagen in den Modellen der Entzündung bietet ein nicht-invasive Werkzeug zu visualisieren und zu quantifizieren, die Infiltration und Akkumulation von Entzündungszellen und demonstriert auch gute Korrelation zu den herkömmlichen anzeigen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Frau Sonja Dufentester, Frau Elke Weber und Frau Klaudia Niepagenkämper für die hervorragende technische Unterstützung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Alfalfa-free diet | Harlan Laboritories, Madison, USA | 2014 | |
| Bepanthen eye ointment | Bayer, Leverkusen, Germany | 80469764 | |
| Dextran sulphate sodium (DSS) | TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden | DB001 | |
| Eosin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 4382 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | E 9884 | |
| Florene 100V/V | Abbott, Wiesbaden, Germany | B506 | |
| Haematoxylin | Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany | HHS32-1L | |
| O.C.T. Tissue Tek compound | Sakura, Zoeterwonde, Netherlands | 4583 | fixative for histological analyses |
| Phosphate buffered saline, PBS | Lonza, Verviers, Belgium | 4629 | |
| Sodium Chloride 0,9% | Braun, Melsungen, Germany | 5/12211095/0411 | |
| Sodium bicarbonate powder | Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany | S5761 | |
| Standard diet | Altromin, Lage, Germany | 1320 | |
| Tissue-Tek Cryomold | Sakura, Leiden, Netherlands | 4566 | |
| Hemoccult (guaiac paper test) | Beckmann Coulter, Germany | 3060 | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody | Serotec, Oxford, UK | MCA497B | |
| Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1 | BD Pharmingen, Heidelberg Germany | 553125 | |
| Streptavidin-Alexa546 | Molecular Probes, Darmstadt, Germany | S-11225 | excitation/emission maximum: 556/573nm |
| Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC | Calteg, Burlingame, USA | R2b06 | |
| Purified anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123102 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | D9542 | |
| FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 553104 | |
| FACS buffer | BD Pharmingen, Heidelberg, Germany | 342003 | |
| Cy7 NHS Ester | GE Healthcare Europe, Freiburg, Germany | PA17104 | |
| MPO ELISA | Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany | K 6631B | |
| Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody | BioLegend, London, UK | 123127 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5 | eBioscience, Waltham, USA | 45-4801-80 | ready to use labelled Antibodies (alternative) |
| DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 67-68-5 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 792632 | |
| Ethanol | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | 64-17-5 | |
| Bovine Serum Albumins (BSA) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | A4612 | |
| Tris Buffered Saline Solution (TBS) | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | SRE0032 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| FACS Calibur Flow Cytometry System | BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany | ||
| FMT 2000 In Vivo Imaging System | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | FMT2000 | |
| True Quant 3.1 Imaging Analysis Software | PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA | included in FMT2000 | |
| Leica DMLB Fluorescent Microscope | Leica, 35578 Wetzlar, Germany | DMLB | |
| Bandelin Sonopuls HD 2070 | Bandelin, 12207 Berlin, Germany | HD 2070 | ultrasonic homogenizer |
| Disposable scalpel No 10 | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z692395-10EA | |
| Metzenbaum scissors 14cm | Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany | 22398330 | |
| luer lock syringe 5ml | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z248010 | |
| syringe needles | Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany | Z192368 | |
| Falcon Tube 50ml | BD Biosciences, Erembodegem, Belgium | 352070 |
References
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