Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

На месте Характеристика Shewanella oneidensis MR1 биоплёнки Сальви и ToF-SIMS

Published: August 18, 2017 doi: 10.3791/55944
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

Summary

Эта статья представляет метод для выращивания биопленки в situ время полета вторичной ионной масс-спектрометрии для химического сопоставления в своем гидратированных состоянии, активизируемые microfluidic реактора, системы для анализа на интерфейсе жидкий вакуум. Shewanella oneidensis -MR-1 с зеленым флуоресцирование белками использовался в качестве модели.

Abstract

Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые значительно учился понимать их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их роли в микробиологии окружающей среды. Это исследование описывает метод культивировать биопленки привязанность к системе для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви) и достичь в situ химического сопоставления жизни биопленки, время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS). Это делается путем культивирования бактерий как снаружи, так и внутри Сальви канал с нашей специализированной установки, а также оптические методы обработки изображений для обнаружения присутствия биопленки и толщина до анализа ToF-SIMS. Наши результаты показывают характеристика вершины Shewanella биопленки в своем естественном состоянии гидратированных, подчеркнув его локализованные водных кластеров окружающей среды, а также EPS фрагменты, которые резко отличаются от же биопленки обезвоженные состояние. Эти результаты демонстрируют возможности прорыва Сальви, что позволяет в situ биопленки изображений с вакуум основе химических изображений инструмент.

Introduction

Бактериальные биопленки, поверхность ассоциированных сообществ, которые развивались с течением времени как обороны для бактерий, чтобы выжить, различных неблагоприятных физических и механических раздражителей, которой клетки способны вложить и выжить во многих возможных средах. 1 , 2 биоплёнки значительно исследованы и имеют применение во многих областях, таких как биомедицина, биомедицинской инженерии, сельское хозяйство и промышленных исследований и разработок. 1 , 2 понимание химического сопоставления этих сложных микробных общин, включая их собственного производства внеклеточного полимерных веществ (EPS) и их местные воды в кластерной среде, имеет важное значение для получения точной и подробной Описание их деятельности в биологической области. 2

Биоплёнки существовать и развиваться в рамках сильно увлажненной государства. Это представляет большой проблемой при использовании вакуум-на основе анализа поверхности методы, такие как время полета вторичной ионной масс-спектрометрии (ToF-SIMS) из-за трудности в изучении летучих жидкостей в вакууме. В результате вакуум-на основе анализа поверхности методы были ограничены почти исключительно для изучения биопленки образцы только их сушеные штата. Однако изучая биопленки в состоянии сушеные препятствует точной расследование его истинное биологических микроокружения. Это часто вызывает радикальные изменения в EPS целостности и биопленки морфологии, которая была продемонстрирована после сравнения сухой биопленки массы спектральных результаты в situ жидкого исследования. 3 , 4 эта статья представляет собой решение для изучения биопленки в их естественном состоянии, увлажненной, используя использования нашей системы для анализа в жидкий вакуум интерфейс (Сальви),5,6 microfluidic реактора, содержит жидкость под ее тонкий кремния нитрид (SiN) мембраны в микроканальные из полидиметилсилоксан (PMDS), таким образом обеспечивая прямой доступ к Луч зонд вторичных ионов при сохранении структурной целостности жидкие матрицы в вакууме камеры. 7 , 8

S. oneidensis мутировал выразить зеленый флуоресценции белков (ГПУП) MR-1 был выбран в качестве модельного организма для этой процедуры иллюстрации биопленки благодаря метаболических универсальность и общего пользования в экологических и прикладной микробиологии, который был основан сильно на ее уникальной способностью для металлических сокращения и передачи внеклеточных электрона. 9 , 10 , 11 Кроме того, присутствие GFP позволило легко непрерывной биопленки толщина мониторинга через микроскопии флуоресцирования, используя фильтр флуоресцеин Изотиоцианаты (FITC). Наши предыдущие исследования показали доказательства этой бактерии пользу привязанность к окну грех, с использованием в operando визуализации флуоресценции для роста биопленки толщиной до 100 мкм. 4 , 12 в то время как этот документ будет обсуждать только подтверждение биопленки в присутствия посредством микроскопии флуоресцирования, Сальви совместим с другими оптических изображений методы, такие как супер резолюции флуоресценции изображений (т.е., структурированного освещения микроскопия (SIM)9) и Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) изображений4). Оптических изображений может служить для измерения толщины биопленки и получить изображение 3D, форма биопленки, как представляется, подтверждает его толщины и его привязанность к окну грех. 9 хотя GFP был использован в анализе SIMS, S. oneidensis без GFP использовался для роста кривой, как только необходимые измерения оптической плотности и не требует каких-либо флуоресцентных изображений. Как правило разница между GFP с тегами и непомеченным видов в кривая роста является незначительным. Кроме того в то время как этот протокол использует S. oneidensis GFP MR-1 в качестве модельного организма для описания процедуры, эта процедура предназначена для любых бактериальный штамм, который могут быть необходимы для выращивания в пределах SALVI. Хотя, учитывая знания бактериальный штамм необходимо, некоторые условия роста, например, времени, температуры и кислорода среды может потребоваться быть изменены для размещения штамм бактерий, которые будут использоваться. Для среднего роста эта процедура использует «нанопроволоки» средний, tryptic соевый бульон (TSB) без декстрозы и tryptic соевый агар (TSA) без декстроза для культивирования. Состав «нанопроволоки» средний специально разработан для роста и для мониторинга расширения мембраны и periplasm S. oneidensis , появляются принимать форму небольших проводов, и средний состав был создана в рамках предыдущих исследований. 13 , 14

Наш предыдущий протокол в situ жидкого ToF-SIMS продемонстрировал преимущество что Сальви предлагает для иммобилизации белков и привязанность к грех, а также подробный протокол на ToF-SIMS анализа и данных сокращения. 12 вместо того, чтобы подтвердить данные этапов сокращения, этот документ будет служить вместо этого сосредоточить внимание на уникальный подход, создание и выращивание биопленки в рамках нашей микроканальные Сальви, а также изображений шаги для обнаружения присутствия биопленки и толщина предварительного для анализа ToF-SIMS. В то время как биопленки ранее были ограничены только высушено образцов в рамках палаты поверхности аналитические методы, основанные на вакуум, детальное EPS и биопленки химическое картирование живой биоплёнки теперь могут быть получены, на месте из-за этой новой возможности.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка материалов

  1. Подготовка среднего трубки
    1. бутылки сыворотки (один в биопленки культуры и три необходимых за кривой роста необходимо)
      Примечание: как упоминалось во введении, любой рост среда подходит для обеспечивают питательные вещества, необходимые для штамма бактерий интерес может быть использован для выполнения этой процедуры; в этом случае " нанопроволоки " СМИ и БСЭ без декстрозы среднего был использован для роста S. oneidensis GFP MR-1. 13
      1. депозит 20 мл среднего роста в одну бутылку 70 мл сыворотки, крышка пробку и опрессовки бутылку. Крышка в верхней с кусочком чистой стерильной алюминиевой фольги.
      2. Автоклав бутылка с жидкой цикла в течение 30 мин при 121 ° C. Afterward, хранить бутылку стерилизации сыворотки при комнатной температуре.
    2. Анаэробные культуры трубы
      1. депозит 5 мл среднего роста в анаэробные культуры трубу с воздушных пустот, положить на пробку и опрессовки бутылку. Крышка в верхней с стерильных фольгой.
  2. Подготовке Пузырь ловушки трубки
    1. с помощью 22 иглы, тщательно пробивают отверстие резиновой пробкой флакон сыворотки.
    2. Вырезать 20 в 1/32 " из политетрафторэтилена (ПТФЭ) трубки с бритвой такие что один конец сегмента трубы остроконечное.
    3. Использование заостренным концом, поток PTFE Шланги через отверстие в верхней части резиновой пробкой. Протолкнуть трубку до тех пор, пока примерно через пробку 2 см и вырезать заостренным концом трубка PTFE с бритвой иметь плоский конец.
    4. Удалите поршень 5 мл шприц и вписываются в открытый конец шприца резиновую пробку из шага 1.2.3. 2 см конец PTFE Шланги находится в пределах ствол шприца. Это ловушка пузырь.
    5. Упаковка пузырь ловушки (PTFE Шланги, резиновой пробкой и шприц) сделали в шаге 1.2.4 с алюминиевой фольгой и закрепите скотчем автоклава. Автоклав, фольги пакет для стерилизации труб с гравитацией цикла при 121 ° C за 30 мин хранить герметичные фольги пакет при комнатной температуре до готовности для использования в шаг 2.4.
  3. Бактериальный рост кривой
    Примечание: этот протокол использует GFP MR-1 S. oneidensis качестве модельного организма для выращивания биопленки в SALVI. Однако эта процедура может быть адаптирована для размещения других бактерий, растущих высокоусвояемого или методом анаэробной очистки. В зависимости от того, какой сорт используется, время роста и охраны окружающей среды может потребоваться соответственно скорректированы.
    Примечание:-80 ° C бактериальным морозильник запасов состоял из 1:1 смесь TSB без декстрозы и глицерина. Пример кривой роста, показанный на рисунке 1 B был подготовлен с использованием закваски TSB с не декстрозы, переданы 70 мл сыворотки бутылки с 20 мл в количествах, соответствующих 0,2 мл три раза " нанопроволоки " среднего для удаления следов TSB. Однако этот протокол предполагает, что будет использоваться только один рост среднего, и что последующие переводы не будет проведено, как это было сделано с этим частности средних решения для S. oneidensis. Хотя не изложенные в настоящем Протоколе, дополнительных поставок, как это рекомендуется как первоначально напыления бактерий для богатых TSB помогает замороженных клеток восстановить; и три последующие переводы " нанопроволоки " гарантирует, что все TSB нет и что динамика типичный роста происходят.
    1. Прививки закваски
      1. снять приклад бактериальной глицерина из морозильной камеры-80 ° C и теплый акций с перчатке таять как можно быстрее. Переместите этот запас морозильник биологической безопасности кабинета (BSC).
      2. В пределах BSC, используйте 1 мл шприц с иглой 22G, придает передать ограничен и гофрированные анаэробные культуры трубка, содержащая 5 мл среднего роста с не декстрозы, подготовленную на этапе 1.1.2 0,1 мл бульона морозильник. Метод Dispose оставшихся запасов Морозильник в соответствующий контейнер биологических отходов, как замораживание снова может шокировать клетки.
      3. Инкубировать закваски в шейкер/инкубаторе при 30 ° C на 150 вращений в минуту (об/мин) и не забудьте взять оптической плотности на 600 Нм (600 OD) читать, когда готов к использованию. Рекордное время роста и ОД 600 таким образом, что это может быть сделано в то же время для каждого последующего использования, что воспроизводимость результатов. Например, этот закваски было позволено расти 15 h и используется в ОД 600 приблизительно 1.0.
    2. Прививки роста среднего
      1. взять бутылки три сыворотки, подготовленные на шаге 1.1.1.2 и закваски, подготовленный в 1.3.1.3 и приносят для BSC.
      2. В рамках ССП, с помощью стерильных 1 мл шприц с иглой 22G прилагается, передачи 0,1 мл раствора из закваски для каждого из сыворотки бутылки, соответственно.
      3. Стерилизируй-отпусти верхней части бутылки сыворотки с 70% этанола и накрыть стерилизованные алюминиевой фольги, маркировать соответствующим образом и передавать орбитальный шейкер в инкубаторе. Орбитальный шейкер равным 150 об/мин и установите инкубатора 30 ° C. инкубировать до тех пор, пока первая ОД 600 точка данных принимается в течение шаг 1.3.3.
    3. Получение ОД 600 точек данных
      1. подготовить чистую сдачи 100 мкл фильтр стерилизации дистиллированной деионизированной (ди) воды в стерильных кювет. Оберните пластиковые парафин фильм вокруг верхней части кюветы, таким образом, чтобы вода не будет быть загрязнены. Хранить при комнатной температуре. Использование этой пустой с УФ-Вид спектрофотометры до принятия каких-либо точек данных для кривой роста, вставив кювет и нажав " пустой ".
        Примечание: Каждые 48 ч, новый пустой должны быть готовы избежать неправильного чтение, как регулярно заменяя пробелом является хорошей практикой.
      2. Для каждой точки данных 600 ОД, удалите бутылки сыворотки, подготовленный на шаге 1.3.2.3 от инкубатора и передачи в стерилизованные BSC. Возьмите 0,1 мл среды, привитых от каждого бутылка сыворотки и депозит на три отдельно обозначены стерильные кюветы.
      3. После гашения, вставить кювета, содержащие культуры в ультрафиолетовой видимых спектрофотометр (УФ-вид) и читать ОД 600, один в то время и записывать все три чтения для этого момент.
        Примечание: Для S. oneidensis MR-1, точки данных были приняты на 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 и 105 h после прививки. Рост завершается, когда бактерии завершил этап смерти. Эти моменты следует соответствующим образом скорректированы, если есть нехватка знаний о времени определенного роста и тенденции бактерий, используемые в настоящем Протоколе. Если существует неопределенность относительно тенденции роста, точек должен быть сбор данных более часто, например, каждые три ч для первых 12 ч, каждые шесть для последующих 36 h, каждые 12 ч для следующих 100 h и интервалом 24 ч для окончательного 124 h.
      4. С помощью ОД 600 точек данных как по оси y и время, как по оси x, граф кривую в среднем три очка с стандартное отклонение погрешностей для каждой точки время с помощью графического программного обеспечения. В Рисунок 1 B в разделе представитель результаты отображается кривая роста S. oneidensis MR-1.
      5. Использование графа, подготовленную на этапе 1.3.3.4, определить сроки секции лаг фазы роста кривой. Для Shewanella это между 12 и 33 h роста; Поэтому можно сделать вывод, что на 24 h роста, Shewanella будет в пределах своих лаг фазы роста, при условии, что будет культивированный бактерии, используя же средства массовой информации и лечения перед использованием, который был использован для кривой роста.

2. Культивирование бактерий

  1. один день: прививки пластину агар
    Примечание: в этом разделе процедура была использована с агарозы плаTE принять одну единицу, образуя колонии (CFU) на лаг фазы, вместо жидкого закваски для кривой роста. Это можно предположить воспроизвести же условий роста, с тем, что TSA без декстрозы был использован и впоследствии переданы " нанопроволоки " среднего роста кривой процедуры и TSA имеет те же ингредиенты, которые составляют TSB.
    1. Удалить фондовая S. oneidensis MR-1 GFPbacteria от-80 ° C морозильника и место в ведёрке со льдом, место это ведро внутри стерилизованные BSC.
    2. В пределах BSC, использовать стерильные 1 мкл прививка цикл для царапать поверхности акций замороженных бактерий и используйте цикл для T-полоска поверхности пластины агарозы.
    3. После уплотнения стороны пластины с пластиковой парафин фильм, инвертировать пластину и хранить в 30 ° C-инкубатор для 24 h, пока не появятся отдельные колонии.
  2. Два дня: прививки сыворотки бутылка
    1. удалить пластину из инкубатора и открытых в BSC.
    2. В пределах BSC, очистить поверхность резиновую пробку на подготовленную сыворотки бутылку от шага 1.1.1 с 70% этанола в воде ди.
    3. Выберите отдельные кое от плиты агара и, используя стерильный шприц с прилагаемой 22 манометра, депонировать средства достаточно роста выбить колонии от плиты без касатьться любые соседние колонии и смешать колонии со средой с кончика игла.
      Примечание: А поодиночке колонии должен быть выбран, достаточно далеко от других бактерий на плите, что среднего могут быть зачислены на него, не касаясь других колоний.
    4. С помощью же шприц, извлеките жидкости с поверхности пластины.
    5. После настучав пузыри внутри шприца, придать жидкости в бутылку сыворотки и место на орбитальный шейкер в пределах 30 ° C в 150 об/мин – 24 ч.
      Примечание: Нажатие пузырьки из шприца имеет важное значение для того, чтобы избежать введения больше кислорода к бутылке, сыворотки, как представляя больше кислорода к бутылке можно изменить экспериментальных условий и снижения согласованности между раз роста бактерий.
  3. Два дня: стерилизация Сальви микроканальные
    Примечание: содействовать стерильность системы труб, шаги, которые требуют отсоединения шприц из труб и замену с новый шприц должно быть сделано в BSC. Чтобы сделать это, просто Отсоедините шприц из шприцевый насос, открутив держатель металлический шприц и принести шприц с труб прикреплены к стерильным BSC. Когда система труб упоминается в процедурах, это относится к шприцу, содержащие жидкость водохранилище, придает PTFE Шланги, прилагается к камере капельной, который имеет PEEK инжектор установку с инжектором Полиэфиркетон (PEEK) прилагается к Сальви впускной трубы, а также выход контейнер трубки розетки Сальви запечатан в.
    1. Использовать новое устройство Сальви и приложите установку PEEK и инжектор один конец трубки ПТФЭ.
      Примечание: Устройства Сальви готовятся свежие каждый следующий эксперимент, изготовление устройства подробно описаны в предыдущих исследований и патентов. 5 , 6 , 8 , 15
    2. учитывать шприц 2 мл 70% этанола и подключиться к PEEK установку на SALVI. После соединения шприц шприцевый насос и придавая выходе Сальви отходов бутылку, позволяют этанола ди водный раствор для запуска через Сальви 20 мкл/мин для 1,5 ч.
    3. Взять 4 мл стерилизованные ди воды в шприц и подключите к входу же Сальви. После подключения шприц к шприцевый насос, дайте воде через Сальви 20 мкл/мин для по крайней мере 3-х.
    4. В BSC, открыть фольги пакет, подготовленную на этапе 1.2.5 и подключить установку до конца шприц 5 мл и стерильным PEEK арматуры к концу шланга TFE стерильному PEEK. Возьмите ~ 3 мл стерильной среды в шприц и прикрепить к TFE трубки. Инвертировать камере капельной 5 мл и, с помощью стерильного шприца, привнести среднего роста в камере капельной, пока он не достигнет общим объемом 1 мл.
    5. Подключите конец камере капельной шприц 5 мл на входе SALVI.
    6. Учитывать стерильный шприц 10 мл среднего роста и подключитесь к впускной трубы капельного. После подключения шприц к шприцевый насос, позволяют средне-запустить через Сальви 20 мкл/мин для 12 h (или на ночь). Использование клейкой лентой для обеспечения этих частей. Обложка выходе бутылка с фольгой или пластиковые парафин фильм для сведения к минимуму вероятности частиц пыли и организмов, содержащиеся в нем для загрязнить среды. Подробное описание как должна выглядеть эта установка можно найти в Рисунок 1 A.
      1. Позволяют трубки капельного быть вертикальной, означает, что шприцевый насос должны быть размещены на повышенных поверхности с трубки капельного обеспеченных клейкой лентой и с Сальви, обеспеченные на плоской поверхности ниже.
      2. Среднего пробегают Сальви за 12 ч для обеспечения удаления всех следов этанола от микроканальные и труб Сальви до прививки с бактериями.
      3. Для дополнительной защиты, держите Сальви микроканальные палаты в стерилизованные Петри, с бортами, вырезать по размеру на входе и выходе трубопровода. Кроме того, держать ленту всегда на окне, чтобы защитить SiN мембраны и канала до визуализации анализа.
  4. Три дня: прививка Сальви микроканальные
    1. удалить весь трубопровод системы (шприц подключен к капельного камеры подключены к Сальви, подключенных к отходов бутылка) из шприцевый насос и довести его до стерилизованные BSC. Кроме того, удалите сыворотки флакон из шага 2.2.5 от инкубатора и довести его до BSC.
    2. Очистки поверхности сыворотки бутылку пробкой с 70% этанола для предотвращения загрязнения и затем использовать стерильные шприц с прилагаемой стерильной иглой 22G для извлечения 4 мл бактерий из бутылки.
    3. Отсоедините SALVI из камеры 5 мл трубки капельного и подключить шприц с привитых среднего непосредственно на входе SALVI. Оставьте трубки капельного внутри пакет стерильных алюминиевой фольги или в BSC.
    4. Присоединить шприц с бутылка Сальви и выход к шприцевый насос для запуска в 20 мкл/мин за 3 ч до инокуляции канал Сальви, с тем чтобы позволить для нескольких изменений объема жидкости, содержащейся в пределах Сальви.
    5. После прививки, Отсоедините шприц с Сальви от шприцевый насос и приносят для BSC. После присоединения входе Сальви обратно к камере капельной 5 мл из шага 2.4.3, принять 20 мл среднего роста в стерильный шприц и приложите к впускной трубы капельного.
    6. Принести труб, прилагаемый к Сальви BSC для шприцевый насос и позволяют средне-пройти через трубку в размере 2 мкл/мин для шести до десяти дней, или до тех пор, пока флуоресценции изображений (рассматривается в шаге 3) показывает рост благоприятных видимых биопленки для Анализ ToF-SIMS. Пополнить свежие среднего как он истекает в течение BSC, заполнив новый стерильный шприц 10 мл среднего роста и присоединение к Сальви, после того, как закончился предыдущий средний рост.
      Примечание: После начала прививка 2 мкл/мин, скорость потока никогда не должна быть увеличена или уменьшилось, как изменение скорости потока будет создавать напряжение сдвига в пределах канала и отсоединение биопленки. Важно, что этот поток никогда не должно быть изменено; чтобы подготовиться к этой, ~ 24 h перед SIMS, наблюдать труб внимательно, чтобы убедиться, что есть никаких пузырей, так что нет необходимости добиваться более среднего более быстрыми темпами на протяжении всего трубопровода.
      1. Избежать пузырей в microchannel, как они могут подтолкнуть биопленки из канала. Важно быть осторожным пузырей в нижней части трубки капельного 5 мл, где он подключается к Сальви труб. Свежие среднего могут быть введены в конце инжектор PEEK для обеспечения, что воздух не будет насильно SALVI.

3. Оптических изображений биопленки в пределах Сальви микроканальные

  1. Флуоресцентной микроскопии изображений
    Примечание: Shewanella используется как модельный организм в рамках настоящего Протокола мутировал выразить GFP; таким образом, он не требует пятнать. Если бактерии требует окрашивания, это всегда должно быть сделано на же расхода (например, 2 мкл/мин) чтобы избежать биопленки отряда. Кроме того когда клетки без наличия питательных веществ, они будут отсоединить. Таким образом если требуется дополнительное окрашивание, пятно следует вводить среднего роста, а не воды перед подачей пятно клетки.
    1. Отсоединить SALVI из капельного трубы внутри BSC и закрыть Сальви, фитинги Фитинги PEEK ужесточить палец-союз PEEK.
    2. Лента трубы Сальви микроканальные камеры надежно на стеклянное скольжение, таким образом, что окно полностью плоские и облицовочные вверх. Удалите защитную пленку из окна. Зажим слайд на этап микроскопа, поместив стеклянное скольжение между стадии зажимы на платформе.
    3. Ниже Этап микроскопа таким образом, что в верхней части SALVI расположен достаточно близко к конце 10 X цели, где регулировки фокуса не вызовет объектив коснуться окна.
    4. Выключатель подсветки и найти канал, с помощью 10 x микроскопом цель, регулируя фокус. В это время убедитесь, что наличие бактериальных привязанность к окну грех Сальви очевидно по сравнению с окна канала управления с не привитых бактерий. Для более тесного изображений клеток, переключитесь на цели 20 x. По сравнению с пустой канал Сальви, наличие бактерий, прикрепленного к окну должны иметь сильный зеленый флуоресцирования.
    5. Выключить подсветку и включите источник ртути микроскопа. Подождите 2-3 мин и переключиться на FITC фильтром, установленным на Микроскоп Вид и захвата изображения биопленки, прикрепленного к окну. В качестве примера созрели биофильмов будет выглядеть как когда будете готовы, см. Рисунок 1 C.
    6. Поворот с источником ртути и отсоединить SALVI из слайда. При необходимости прикрепить к 2 мкл/мин средний поток еще раз, чтобы обеспечить более высокие темпы роста до изображений снова, или передавать Сальви вторичных сдерживания использования для анализа ToF-SIMS. Это необходимо, если толщина биопленки заключается не быть достаточно толстым, и перед ToF-SIMS анализа требуется больше времени для роста. Чтобы прикрепить к средний поток снова, обратитесь к шагу 2.3.6.
      Примечание: Если положить обратно под средний поток, флуоресценции изображений должно быть сделано снова перед анализом ToF-SIMS.
      1. Дать биопленки роста среднего кормить его, до тех пор, пока может проводиться анализ ToF-SIMS. Хотя не рекомендуется, если требуется, закрытые Сальви могут храниться в течение 4 ° C на ночь, но должно быть позволено нагреться до комнатной температуры перед вставкой в вакуумной камере ToF-SIMS. Однако, анализ биопленки сразу же после того, как отсоединена от потока среды для уменьшения биопленки отряда.

4. Приобретение данных ToF-SIMS

Примечание: Этот раздел служит обзор и обсуждается более подробно в рамках нашей ранее протокола, описывая адсорбированных белка молекулы жидкости SIMS анализ. 12

  1. Установить Сальви в камеру Loadlock ToF-SIMS
    Примечание: перчатки следует надевать на все времена когда обработка Сальви устройства и его установки на ToF-SIMS этапе избежать потенциальных загрязнений во время поверхность анализ.
    1. Горе Сальви на сцену и исправить ее с несколькими винтами. Убедитесь, что окно грех является плоской, регулировочный винт герметичности и вставки кремниевой пластины штук в нижней части камеры микроканальные PDMS. Удалите защитную пленку из окна, а затем загрузить сцену в камеру loadlock ToF-SIMS.
    2. Открыть loadlock ToF-SIMS, удерживайте и установить сцену горизонтально на грузовой платформы и закройте дверцу loadlock. Инициировать вакуумный насос и ждать, чтобы обеспечить, что подходящие вакуум достигается.
    3. Переместите Сальви в основной камеры после стабилизации вакуум до 1 x 10 -7 мбар.
  2. Глубина профилирования и сбор данных точек
    1. найти microfluidic канал с помощью оптического микроскопа, оборудованы ToF-SIMS.
    2. Режим положительным или отрицательным до сбора данных. Использование 25 кэВ Bi 3 + луч как основной ионного пучка в всех измерений и использовать электронно-наводнение пушки для нейтрализации зарядки во время всех измерений поверхности.
      3. Ширина
    3. сканирования луча 3 + Bi с 150 НС импульсов на круглой площади с диаметром ~ 2 мкм с 64 x 64 пикселей. После штамповки через окно грех 100 Нм, продолжать сканировать еще 150 s для сбора данных высокой интенсивности для изображений. После punch-through графов значительно возрастет в пределах глубины, профилирование региона. После стабилизации, это может быть передано как высокой интенсивности региона.
    4. Уменьшить ширину импульса до 50 НС для сбора данных для получения спектров с лучшим разрешением массового. Продолжать это приобретение для примерно еще 200 s.
    5. Повторите эти шаги для сбора по меньшей мере три положительные и три точки негативных данных.
      Примечание: Не забудьте пространство удар через районы, что окно грех не сломается и утечки в камеру пылесоса от компрометации целостности окна.

5. Анализ данных ToF-SIMS

  1. массы калибровки с использованием программного обеспечения IonToF
    1. открытое программное обеспечение анализа ToF-симов (измерение Explorer) и нажмите кнопку " профилей ", " спектры " и " изображение " кнопки, соответственно, чтобы процесс глубина профиля, m/z спектра и данные изображения.
    2. Открытых файлов данных, полученных на протяжении всего сбора данных ToF-SIMS.
    3. Выберите глубина профилирования данных, представляющих интерес и реконструкции спектров зависимости от глубины профиля временной серии.
    4. Пресс " F3 " открыть " массовая калибровка " окно. Выберите пики для калибровки на основе химических соединений, которые, как ожидается, будут существовать в образце конкретных.
  2. Пики интерес выбор
    1. как пик выделения необходимых для анализа проб, определить характерные вершины образца согласно литературе или другие предыдущие выводы, если таковые имеются. Сравнения интенсивности пиков интерес в спектрах м/z. При необходимости добавить новые вершины или удалить вмешательства пиков в списке пик.
    2. Нажмите на пик, найти красные линии в левом нижнем окне. Переместить красные линии заключить весь пик.
    3. Выберите сопоставления химическая формула в окне спектра основных пика и затем нажмите кнопку " добавить пик " кнопку над окном. < /Li >
  3. Экспорт данных калиброванные массы
    1. для экспорта списка пик, в " пик список " меню, выберите " сохранить … " в списке пик " itmil " формат.
    2. Для экспорта глубина профиля, в " Профиль " окно, нажмите на " файл " меню, затем выберите " экспорт " и затем выберите " сохранить как " " .txt " файл.
    3. Для экспорта файла спектра m/z, в " спектры " окно, нажмите на " файл " меню, затем выберите " экспорт " и затем выберите " сохранить как " " .txt " файл.
    4. Для экспорта файла изображения, в " изображение " окно, печать экрана и сохранить как файл изображения.

6. ToF-SIMS данных печати и презентации

  1. использовать графический инструмент для импорта данных.
  2. Сделать сюжет используя m/z в качестве оси x и пиковой интенсивности как по оси y чтобы показать реконструированный спектра. Пример приведен на рис. 2 А.
  3. Комбинат реконструирован двухмерные (2D) изображения различных m/z и форма матрицы показать любой положительный или отрицательный ион сопоставления. Пример приведен в рисунке 2 Б.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Эти представительные результаты служат Показать как химического профиля прилагаемый биопленки могут быть определены и интерпретируется, как полученные через ToF-SIMS. После построения массовых спектров от сбора данных ToF-SIMS, кратко говорится в разделе процедуры, пик идентификации должны проводиться для того, чтобы присвоить каждое значение соответствующих m/z тождества. Это может быть сделано через обзор обширной литературы по масс-спектрометрии на бактерии и конкретные химические фрагментов, которые, как ожидается, будут присутствовать в бактерии, учился, как различные кластеры воды, жирные кислоты и фрагменты белка. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 эти представитель результаты показывают только негативные массового спектры как полученные S. oneidensis MR-1 биопленки и образца воды ди. Интерпретация положительных спектров выполните аналогичную процедуру.

Рисунок 1 A показана схема установки согласно протоколу при возделывании биопленки в Сальви микроканальные. В верхней левой шприц прилагается к шприцевый насос, который держит средних течет с постоянной скоростью, во всей системе труб PFTE и внутри микроканальные. Шприцевой насос помещается выше капельного палаты, которая предотвращает обратную загрязнение в средних резервуар для предотвращения подвижные организмов от плавание вверх по течению. Средний течет из капельного палаты водохранилища прямо в PFTE труб Сальви, который проходит через микроканальные и через выход трубы к бутылке герметичные розетки. Пунктирные линии указывают из окна греха к изображению созрели S. oneidensis GFP MR-1 клетки захвачен микроскопии флуоресцирования, подробно описанные в шаге 3.1. Рисунок 1 B показывает пример роста кривой с использованием модели организма для этого протокола, S. oneidensis MR-1. Из фазы роста в этой графе можно сделать вывод, что лаг фаза роста происходит между 15-32 h в этих условиях конкретных культивирования. Дополнительная информация от этот график показывает, что 0-15 h является отставание фазы роста, и 33-105 h представляет стационарной фазы роста. Рисунок 1 C — это изображение, приобретенных при микроскопии флуоресцирования, показываю пример созрели биопленки.

Рисунок 2 A показывает отрицательный массового спектры гидратированных S. oneidensis MR-1 биопленки в пределах microfluidic канал, как полученные в situ жидкость ToF-SIMS. Этот график показывает пример выбранного диапазона массы (m/z 100-350) сравнения между биопленки S.oneidensis MR-1 и ди воды, последний был получен как элемент системы управления. Рисунок 2 B Отображение сравнения 2D изображений пиков интереса к MR-1 биопленки и DI воды, полученные ToF-SIMS. После того, как интересные m/z значения могут быть определены из изучения массовых спектры, пик определение значения m/z правильно объяснить химических фрагменты, поддержанные IonToF SIMS программного обеспечения библиотеки и литературы обследования. Пики интерес в рисунке 2A включить кластеры воды (т.е., 107 (H2O) m/z5OH–, 125 (H2O)6OH–, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 O)8OH–, 179 (H2O)9OH–, 197 (H2O)10OH–, 215 (H2O)11OH–, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH–, 269 (H2O)14OH–, OH15287 (H2O)–, OH17323 (H2O)-, 341 (H2O)19OH–))9, как обозначаются красными линиями выше соответствующих вершин, кворума связанных соединений биомаркеров (т.е., m/z 175 C10H9№2–), EPS субпродуктов (m/z 123 C2H4PO4-, 159 P 2 O8H–, 216 Cr2O7–, 285 octadecanoethiols, 325 полярных соединений, C12 полярных соединений)15,16,18и цепи жирных кислот фрагменты (т.е. m/z 127 [C2H3(2CH)3COO]-, 255 C16:0 жирных кислот, 279 линолевой кислоты, C18H31O2–, 325 C21H40O2 -, 341 поверхности липиды, 18-МПС связаны через тиоэфиром связь, стеариновая кислота C18H35O2–, ионы monoacylglyceryls, пальмитиновая кислота C19H17O6 -). 16 , 19

Так как биопленки увлажненной, это не удивительно, что некоторые пики, видели в образце биопленки похожи на те, нашли в воде ди. Эти пики кластеров воды, отмеченные красной линией выше каждого пика в рисунке 2A, включая m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 и 341 и соответствующего (H2O)5OH– (H2O) 6 Ох– (H2O)7OH– (H2O)8OH– (H2O)9OH– (H2O)10OH– (H2 O)11OH– (H2O)12OH– (H2O)13OH– (H2O)14OH– (H2O)15о- (H2O)17OH– (H2O)19OH-, соответственно. 9 как распространенность многие характерные водных кластеров в этом массовые спектр, это результаты предоставляет убедительные доказательства химической водной среды кластера в гидратированных биопленки. Кроме того кластер-вода связанные пики наблюдаются в обоих спектров часто может объясняться как вмешательство пиков, обычно от PDMS, компонент microfluidic канала. Например один общий известные вмешательства пик от PDMS является m/z 137 в режиме отрицательных ионов.

При сравнении биопленки SIMS массы спектры ди воды, как показано на рисунке 2A, некоторые пики не присутствуют в воде ди, но они появляются биопленки. Например, пик на m/z 255 ([CH3(2CH)14COO]-, пальмитиновая кислота) присутствует в высокой интенсивности в образце биопленки, но не на всех в образце воды ди. Это предполагает, что c сигналыОме от биопленки, скорее биопленки и/или его самостоятельно генерируемые EPS. Много интересных пики были определены в рисунке 2A. Например, EPS связанные пики включают m/z 123-, подлежащими C2H4PO4-, 159 (P2O8H–), 216 (Cr2O7–), 285 (octadecanoethiols) и 325 (полярных соединений, C 12 полярных соединений). 17 , 18 , 20 пиков, связанные с жирных кислот были найдены в 127 ([C2H3(2CH)3COO]–), 255 ([CH3(2CH)14COO]-, пальмитиновая кислота), 279 ([CH3 (2CH)15COO]-, линолевая кислота), 317 (C21H33O2–), 325 (C21H40O2–) и 341 (поверхности липиды, 18-МПС связаны через тиоэфиром связь, стеариновая кислота C18H35O2-, ионы monoacylglyceryls, пальмитиновая кислота C19H17O6–). 16 , 19 наконец, хинолона сигнал кворума зондирования сигнал связанных пик C10H9на m/z 175 был замечен не2– .

Рисунок 2 B отображение 2D изображения распределения ионов четырех различных интересных между биопленки S. oneidensis MR-1 (верхняя строка) и ди воды (Нижняя строка). Значение m/z 107 (OH–(H2O)5) показывает кластер воды значительной интенсивности в пределах образцы, значение m/z 175 (C10H9№2–) изображает кворума зондирования соответствующий сигнал, m/z 255 жирные кислоты ([CH3(2CH)14COO]-, пальмитиновая кислота), и m/z 341 (C21H41O2–) может представлять обоих фрагментов липидов и водных кластеров из-за массового точности 1 Аму. 9 яркие области 2D изображений указывают выше количество молекулярных ионов в изображении. Как и ожидалось, сигналы для QS подворье, и липиды были намного больше в количестве в образце биопленки. В то время как сигнал для воды кластера (m/z 107) был сильнее течение образца биопленки, он также присутствовал в образце воды ди, как ожидалось. Наконец было обнаружено сигнала на m/z 341 однородной в образце биопленки, но очень слабо в пределах образца воды ди. В то время как m/z 341 был пик кластеров воды, было также представителем нескольких различных жирных кислот и поверхности липиды. 16 его сильнее присутствие в образце биопленки после нормализации данных свидетельствует о том, что наличие липидов фрагментов намного перевешивают наличие кластеров воды.

Figure 1
Рисунок 1 : Экспериментальная схема. (A) отображает экспериментальная схема установки биопленки, как он появляется в лаборатории. Начиная в верхнем левом углу, средние потоки из шприца (1), который прилагается к шприцевый насос (2), контролировать скорость, с которой жидкость движется через. Стрелки указывают направление потока во всей системе. Шприц (1) подключен через инжектор PEEK, арматура (3) до TFE труб (4). Средний протекает через капельного палаты (5) чтобы избежать загрязнения и в конечном итоге движется через Сальви (6) к контейнеру герметичные розетки (7). Шприцевой насос позиционируется на повышенных поверхности (9), таким образом, что камера капельная (5) может быть перпендикулярно поверхности плоской (8), что предъявляемые Сальви (6). (B) рост кривой для Shewanella oneidensis MR-1 в среде «нанопроволоки». Время 0-15 h представляет участка запаздывания, время 15-33 h представляет собой фазу журнала, время 33-105 h представляет неподвижной фазой и время 105 ч или больше представляет собой фазу смерти. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение. (C) A картина созрели биопленки, приобретенных с помощью микроскопии флуоресцирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2 : Сравнение ToF-SIMS отрицательные спектры гидратированных Shewanella oneidensis биопленки и MR-1 среднего Сальви микроканальные. (A) m/z SIMS массового спектры Shewanella oneidensis биопленки в MR-1 среднего и DI воды. Последний был использован как элемент управления. Красные линии указывают местах характеристика воды кластера пиков. (B) 2D изображения сравнение пики интерес между биопленки и DI воды. Слева направо, образы отображения воды кластера (m/z 107 (H2O)5OH–), сигнал зондирования/гормон кворума (m/z 175, C10H9№2–), жирные кислоты (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, пальмитиновая кислота) и поверхности фрагменты липидов/EPS (m/z 341, 18-МПС, C21H41O2–). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

После прививки в лаг фазы, важно проверить количество дней и температуры, при котором биопленки должен расти, прежде чем это здоровым и достаточно толстым для изображений, как описано в пункте 3.1. Эта процедура конкретно охватывает выращивание S. oneidensis MR1 биопленки при комнатной температуре; Однако различные комнатной температуре может влиять на темпы роста. Таким образом важно, чтобы использовать оптических изображений, чтобы понять, готова ли биопленки прежде чем приступить к анализу ToF-SIMS. Аналогичным образом различных штаммов бактерий требуют различных условий и длины для достижения желательной толщины для анализа. Хотя кривая роста на рисунке 1b изображена фаза 200 журнала бактерий, чтобы быть 12-32 h, и это было использовано в 24 h на протяжении всей процедуры, важно отметить, что на этот раз не может использоваться как лаг фазы для других штаммов бактерий без установления кривая роста самостоятельно. Хотя журнал фазы между 12 и 33 h роста для S. oneidensis, 24 h был выбран с тем, что он был в части роста, где кислорода начинают ограничить темпы роста организма, в конце лаг фазы. Эксперименты показали, что это было время клетки начали производить нанопроволоки, таким образом заливают до формы успеха биопленки, которые могли бы выжить в условиях низкой кислорода. 3 , 13 следовательно, время, решили использовать бактерии этапе журнала должны быть под влиянием исследований опыт и знания, накопленный литературы на экспериментальное исследование бактерий, изучается. Кроме того необходимо создать отдельный рост кривой понять лаг фазы для всех различных штаммов бактерий, которые будут использоваться для роста биопленки, используя этот подход. Темп роста 2 мкл/мин был рассчитанные так, как не должен превышать максимальный прирост S. oneidensis MR-1 и общее время был выбран, чтобы получить пожилые биопленки, который не был заросший и подверженным отсоединение. Эти ставки могут корректироваться соответственно знания о различных бактерий, которые будут использоваться с этой установки.

Некоторые ограничения использования Сальви биопленки роста включают биообрастания внутри канала, а также вероятность возникновения бактерий для присоединения к плоские стены канала. Несмотря на рост с постоянной скоростью, рекомендуется наносить 2 мкл/мин в рамках настоящего Протокола биообрастания все еще может произойти, если биофильмов будет позволено расти слишком долго. В таком случае и без предупреждения биопленки можно отсоединить от окна и выход Сальви для сдерживания розетки. Биообрастания также может произойти путем простого добавления механической силы (т.е., перемещение) Сальви, которого нельзя избежать. Однако это может храниться в проверить, просмотрев вложение биопленки в окно грех перед ToF-SIMS анализа под микроскопом света. Одно ограничение включает гладкость PDMS microchannel, который может сделать его трудным для некоторых бактерий для присоединения. Однако это можно изменить в дизайн Сальви для размещения, создавая ребристый края в канал, если вложение бактерий является проблемой. И наконец клеток может быть сделано вместо ОД600 чтений для определения кривой роста. Например исследования показали прямую и последовательного соотношение клеток к ОД600 чтений. 21 таким образом, ОД600 считается достаточным для оценки роста биопленки.

Ограничения на этот метод мало, как Сальви по существу действует как культуры блюдо, которое имеет много универсальность для использования во многих приложениях, таких как анаэробно в перчаточный ящик или в пределах любой контролируемой температурой окружающей среды камеры. Некоторые незначительные ограничения включают неконтролируемой номер условий, таких как относительная влажность, температура, размещение вблизи солнечного света, которые все еще можно быть приспособлено для, для каждой конкретной бактерии оптимальные условия роста. Кроме того некоторые из этих технические проблемы могут быть преодолены с инкубатор с температуры или RH посреднические функции в настройках биопленки.

Сальви — это microfluidic вакуум совместимый интерфейс. В этой работе 200 x 300 мкл microfluidic канал был использован для культуры биоплёнки с оптическим и жидких SIMS изображений. Жидкости представляют собой техническую проблему для исследования с использованием вакуума на основе методов, потому что они являются неустойчивыми и трудно сохранить в жидкой фазе в вакууме. Таким образом вакуумные методы, такие как ToF-СИМЫ были традиционно ограничивается только сухой и криогенных образцов. 22 Кроме того, Сальви может использоваться для различных изображений и спектроскопия, используя разнообразные методы микроскопии и спектроскопии. 4 , 9 наша группа стремится постоянно расширять различные Сальви приложений в situ анализа жидкостей и твердое вещество жидкость интерфейсов. 15 , 23 , 24 эффективно наших последних усилиях показал бактерий привязанность к мембране грех. 9 после первоначального вложения, непрерывного потока среды со временем было показано успешно культивировать биопленки непосредственно в окне ГРЕХ Сальви. Во время ToF-SIMS основной Ион луч используется для бомбардировки отверстия 2 мкм в диаметре. Этот аспект похож на длину клетки биопленки, прикрепленного к окну грех, таким образом обеспечивая химического профиля биопленки в его естественно гидратированных микроокружения. Это очень важно из-за разности химическая идентификация биопленки, наличие EPS и водной среды кластера при сравнении биопленки в его гидратированных состоянии с высушенных образцов. 9 без использования Сальви, ToF-СИМЫ могут проводиться только на сухой и криогенных образцов, обеспечивая химического сопоставления, которая не удается захватить химического профиля выборки в своем естественном состоянии гидратированных.

Как показано на рис. 1А, важно сохранить шприцевый насос выше трубки капельного для трубки капельного перпендикулярно к Сальви микроканальные. Кроме того пузыри будет меньше шансов стать в ловушке внутри трубки устройства, если розетка PFTE трубы (в розетке бутылка) меньше чем впускной трубы (прилагается к камере капельной). Еще один важный шаг культивирования бактерий для роста Сальви необходимо сначала получить кривую роста конкретного бактерий штамма, который будет использоваться, как описано в шаге 1.3. Это может быть сделано путем получения кривых роста с измерения оптической плотности. Рост кривой, как показано на рисунке 1B, имеет важное значение для понимания таймфрейма, на котором бактерии будет в рамках лаг фазы роста, когда можно предположить, что бактерии являются здоровыми. Использование бактерий в течение этой фазы роста облегчает создание здоровой биопленки микроокружения и гарантирует, что биофильмов будет расти его ожидаемыми темпами. Микроканальные Сальви обеззараживается при комнатной температуре с 70% этанол и вода ди, как это не может быть газобетона для стерилизации до использования с ToF-SIMS. Это связано с тем, что автоклавирования могут повредить окна Сальви и ввести водяного пара в канал. После нескольких дней роста микроканальные должны быть проверены с флуоресцентной микроскопии для подтверждения бактериальной вложений. Пример можно найти в Рисунок 1C, этот образ был взят Показать созрели биопленки. Из-за путь потока среды бактерии более благоприятно придает и растет по краям microchannel, как это место где потока и перерезывающих сил Лоуст.

В целом Сальви является отличным способом для которого для культура и образование биопленки, используя в situ химического сопоставления, как это позволяет для обеспечения жизни биопленки в своем естественном состоянии гидратированных вакуум основе изображений масс-спектрометр. Этот уникальный подход может обеспечить дополнительную информацию о биопленки воды кластера микроокружения, а также чтобы получить более глубокое понимание его EPS побочных продуктов. Эта информация может использоваться для понимания биопленки биологической деятельности и может быть использован в различных приложениях, таких как в биомедицине, биомедицинской инженерии, сельском хозяйстве и промышленных исследований и разработок.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Мы благодарны Тихоокеанская северо-западная Национальная лаборатория (PNNL) земли и биологических наук (EBD) Миссия семян лаборатории направлены фонд научных исследований и развития (МЦРУ) для поддержки. Инструментальный доступ обеспечивается через общее предложение пользователя W. р Уили экологических молекулярных наук лаборатории (ЛСМЭ). ЛСМЭ является объектом национальной научной пользователя под эгидой Бюро биологических и экологических исследований (BER) в PNNL. Авторы благодарят доктор Дин Yuanzhao за доказательство читать рукопись и обеспечения полезной обратной связи. PNNL эксплуатируется Battelle для Доу под контракт де-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. , (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. , (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. , (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9 (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. , Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. , John Wiley & Sons Inc. 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136 (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).

Tags

Химия выпуск 126 Сальви ToF-SIMS биопленки в месте Молекулярное воображение микрофлюидика
<em>На месте</em> Характеристика <em>Shewanella oneidensis</em> MR1 биоплёнки Сальви и ToF-SIMS
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill,… More

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter