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Chemistry

In Situ Caracterización de Shewanella oneidensis MR1 Biofilms por SALVI y ToF-SIMS

Published: August 18, 2017 doi: 10.3791/55944
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

Summary

Este artículo presenta un método para el crecimiento de la biopelícula para en situ ion secundaria tiempo de vuelo espectrometría para mapeo químico en su estado hidratado, habilitado por un reactor de microfluidos, sistema para el análisis en la interfase líquida del vacío. La Shewanella oneidensis MR-1 con la proteína de fluorescencia verde fue utilizado como un modelo.

Abstract

Biofilms bacterianos son comunidades asociadas de superficie que se estudian mucho para entender sus propia sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y sus papeles en Microbiología Ambiental. Este estudio describe un método para cultivar el apego de biofilm en el sistema para el análisis en la interfaz de vacío líquido (SALVI) y lograr en situ química asignación de una biopelícula de vida por spectrometry total de ion secundario de tiempo de vuelo (ToF-SIMS). Esto se hace mediante el cultivo de bacterias tanto fuera como dentro del canal SALVI con nuestra instalación especializada, así como a través de técnicas de imagen ópticas para detectar la presencia de biofilm y espesor antes del análisis de ToF-SIMS. Nuestros resultados muestran los picos característicos de la biopelícula de Shewanella en su estado hidratado natural, destacando en su entorno de clúster de agua localizada, así como la EPS fragmentos, que son drásticamente diferentes de la misma biopelícula deshidratado Estado. Estos resultados demuestran la capacidad de avance de SALVI que permite imágenes de biofilm en situ con un instrumento de proyección de imagen química basado en el vacío.

Introduction

Biofilms bacterianos son comunidades asociadas de superficie que han evolucionado como una defensa de las bacterias sobrevivir a diversos estímulos físicos y mecánicos adversos, en donde las células son capaces de conectar y sobrevivir en muchos ambientes posibles. 1 , 2 Biofilms son ampliamente investigados y tienen aplicaciones en muchos campos como la biomedicina, ingeniería biomédica, agricultura y la investigación industrial y desarrollo. 1 , 2 entender la cartografía química de estas complejas comunidades microbianas, incluyendo sus propia sustancias poliméricas extracelulares (EPS) y su entorno de clúster de agua local, es esencial para obtener una precisa y detallada representación de sus actividades biológicas. 2

Biofilms existen y crecen dentro de un estado altamente hidratado. Esto presenta un gran desafío en el uso de técnicas de análisis superficial basado en el vacío por ejemplo spectrometry total de ion secundario de tiempo de vuelo (ToF-SIMS) debido a la dificultad en el estudio de líquidos volátiles en vacío. Como resultado, técnicas de análisis de superficies basadas en vacío se han limitado casi exclusivamente al estudio de las muestras de la biopelícula en estado seco. Sin embargo, estudiar un biofilm en su estado seco inhibe la investigación precisa de su microambiente biológico verdadero. A menudo causa cambios drásticos en la morfología EPS integridad y biofilm, que se ha demostrado después de comparar resultados masa espectral biofilm seco en situ estudios de líquido. 3 , 4 este artículo presenta una solución para el estudio de biofilms en su estado hidratado natural empleando el uso de nuestro sistema para el análisis en la interfaz de vacío líquido (SALVI),5,6 un reactor de microfluidos que contiene líquido en su membrana de nitruro (pecado) de silicio fino en un microcanal de polidimetilsiloxano (MBAS), proporcionando así acceso directo a la viga de ion secundario sonda mientras mantiene la integridad estructural de la matriz líquida dentro de un vacío cámara. 7 , 8

S. oneidensis MR-1 mutado para expresar la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue elegido como un organismo modelo para esta ilustración del procedimiento de biopelícula debido a su versatilidad metabólica y de uso común en Microbiología Ambiental y aplicada, que se basa en su capacidad única para la reducción del metal y la transferencia de electrones extracelular. 9 , 10 , 11 Adicionalmente, la presencia de la GFP permite fácil continua biofilm-espesor de monitoreo a través de microscopía de fluorescencia, utilizando un filtro de fluoresceína isotiocianato (FITC). Nuestros estudios previos han mostrado evidencia de esta bacterias favoreciendo el apego a la ventana del pecado usando en operando imágenes de fluorescencia para el crecimiento de biofilm en un espesor de hasta cien micrómetros. 4 , 12 si bien este artículo discutirá solamente la confirmación de la presencia de biofilm mediante microscopía de fluorescencia, el SALVI es compatible con otros métodos de proyección de imagen ópticas como la estupendo-resolución imágenes de fluorescencia (es decir, estructurada iluminación microscopia (SIM)9) y el láser confocal de barrido microscopía (CLSM) imagen4). Imágenes ópticas pueden servir para medir el espesor de la biopelícula y obtener una imagen 3D de la forma de la biopelícula como parece, confirmando su grosor y su fijación a la ventana de pecado. 9 mientras GFP fue utilizado en el análisis de los SIMS, S. oneidensis sin GFP fue utilizado para la curva de crecimiento, como esta única medición de la densidad óptica y no requieren ninguna imagen fluorescente. Generalmente, la diferencia entre la GFP etiquetadas y especies sin etiquetar en la curva de crecimiento es insignificante. Además, mientras que este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como un organismo modelo para describir el procedimiento, este procedimiento está diseñado para cualquier cepa bacteriana que puede ser necesario para el cultivo dentro de SALVI. Aunque, dado el conocimiento de la cepa bacteriana es necesario, unas condiciones de crecimiento tales como tiempo, temperatura y oxígeno ambiente deba ser modificado para dar cabida a la cepa de bacterias para ser utilizado. Por medio del crecimiento, este procedimiento utiliza para el cultivo de caldo de soja tríptica, medio de "nanocables" (TSB) sin dextrosa y agar soja tríptico (CST) sin dextrosa. La composición del medio de "nanocables" ha sido especialmente formulada para el crecimiento y para el monitoreo de las extensiones de la membrana y periplasma de S. oneidensis que parecen tomar la forma de pequeños hilos y la composición media ha sido establecido en investigaciones anteriores. 13 , 14

Nuestro protocolo anterior en in situ líquido ToF-SIMS ha ilustrado el beneficio que SALVI ofrece para inmovilización de la proteína y el apego al pecado, así como un protocolo detallado en ToF-SIMS análisis y reducción de datos. 12 en lugar de reiterar medidas de reducción de datos, este documento servirá para centrarse en cambio en el enfoque único de establecer y cultivar biofilms dentro de nuestra MCP SALVI, así como los proyección de imagen pasos para detectar presencia de biofilm y espesor previo a análisis de ToF-SIMS. Mientras que anteriormente ya se habían limitados los biofilms que para sólo secar muestras dentro de la cámara de vacío base superficie técnicas analíticas, detallada cartografía química EPS y biofilm de biofilms vivo puede ahora obtener en situ debido a esta nueva capacidad.

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Protocol

1. preparación de materiales

    1. botellas de suero (una necesaria cultura del biofilm y tres necesitan por curva de crecimiento) la Preparación de medio tubo
      Nota: como se mencionó en la introducción, crecimiento medio adecuado para proporcionar los nutrientes necesarios para la cepa de bacterias de interés puede ser utilizado para este procedimiento; en este caso, " nanohilos " medios de comunicación y TSB sin medio dextrosa fue utilizado para el crecimiento de S. oneidensis MR-1 GFP. 13
      1. depósito 20 mL de medio de cultivo en un frasco de suero 70 mL, tapa el tapón y la botella de la encrespadura. Tapa con un trozo de papel de aluminio estéril limpio.
      2. Autoclave la botella con un ciclo líquido durante 30 min a 121 ° C. después, guarde la botella de suero esterilizada a temperatura ambiente.
    2. Tubos de cultivo anaerobio
      1. depositar 5 mL de medio de cultivo en un tubo de cultivo anaerobio espacios vacíos de aire, poner el tapón y la botella de la encrespadura. Tapa con papel de aluminio estéril.
  2. Preparar tubería de trampa burbuja
    1. cuidadosamente usando una aguja de 22 calibre, perforar un agujero a través de un tapón de goma de la botella de suero.
    2. 20 cortar en 1/32 " politetrafluoroetileno (PTFE) de la tubería con una maquinilla de afeitar de tal que un extremo del segmento de la tubería está apuntando.
    3. Usando la punta del hilo de rosca del tubo de PTFE a través del orificio en la parte superior del tapón de goma. Introducir el tubo hasta aproximadamente 2 cm es a través del tapón y cortar la punta del tubo PTFE con una maquinilla de afeitar con un extremo plano.
    4. Quitar el émbolo de una jeringa de 5 mL y ajustar el tapón de goma del paso 1.2.3 en el extremo abierto de la jeringa. El extremo de 2 cm de tubería de PTFE está dentro del barril de la jeringa. Esta es la trampa de la burbuja.
    5. Envolver la botella lavagases (PTFE tubería, tapón de goma y jeringa) hecho en el paso 1.2.4 con papel de aluminio y asegure con cinta de autoclave. Ciclo del paquete de papel para esterilizar el tubo con una gravedad a 121 ° C durante 30 minutos autoclave almacenar el paquete de papel sellado a temperatura ambiente hasta que esté listo para su uso en el paso 2.4.
  3. Curva de crecimiento bacteriano
    Nota: este protocolo usa S. oneidensis MR-1 GFP como un organismo modelo para el crecimiento de la biopelícula en SALVI. Sin embargo, este procedimiento puede ser adaptado para dar cabida a otras bacterias creciendo aeróbicamente o anaeróbicamente. Dependiendo de qué cepa se utiliza, tiempo de crecimiento y medio ambiente deba ajustarse en consecuencia.
    Nota: las acciones bacterianas congelador de-80 ° C consistió en una mezcla 1:1 de TSB sin dextrosa y glicerina. El ejemplo de la curva de crecimiento se muestra en la figura 1 B se preparó con una cultura de arrancador de TSB no dextrosa, transferido en cantidades respectivas 0,2 mL tres veces a botellas de suero 70 mL con 20 mL " nanohilos " medio para eliminar restos de TSB. Sin embargo, este protocolo asume que se usará solamente un medio, y que las transferencias subsecuentes no se realizará, como esto fue hecho con estas soluciones medio particular para S. oneidensis. Aunque no se describe en este protocolo, transferencias extras como este se recomiendan como depositar inicialmente las bacterias a la TSB rico ayuda a las células congeladas a recuperarse; y tres transferencias posteriores a " nanohilos " garantiza que todos TSB ha desaparecido y que la dinámica de crecimiento típico está ocurriendo.
    1. Inocular la cultura de arrancador
      1. Quite completamente la culata del glicerol bacteriana del congelador de-80 ° C y caliente la culata con una mano enguantada para descongelar lo antes posible. Esta acción del congelador hacia el gabinete de la seguridad biológica (BSC).
      2. Dentro de la BSC, use una jeringa de 1 mL con una aguja de 22G para transferir 0,1 mL del stock de congelador a un tubo de cultivo anaerobio tapado y plegados que contiene 5 mL de medio de cultivo con no dextrosa, preparado en el paso 1.1.2. Disponer de las acciones restantes del congelador en el contenedor adecuado de residuos biológico, como congelar otra vez podría sorprender las células.
      3. Incubar la cultura de arrancador en una coctelera de la incubadora a 30 ° C a 150 revoluciones por minuto (rpm) y asegúrese de tener una densidad óptica a 600 nm (OD 600) lectura cuando esté listo para su uso. Registrar el tiempo de crecimiento y OD 600 que se puede hacer en ese mismo tiempo para el uso posterior, tal que los resultados son reproducibles. Como ejemplo, esta cultura de arrancador fue permitió que creciera para 15 h y a un OD 600 de aproximadamente 1.0.
    2. Inocular el medio de cultivo
      1. tomar las botellas de tres suero preparadas en el paso 1.1.1.2 y la cultura de arrancador en 1.3.1.3 y llevar a ambos a la BSC.
      2. Dentro de la BSC utilizando una jeringa estéril de 1 mL con una aguja de 22G unida, 0,1 mL de solución de transferencia de la cultura de arrancador a cada una de las botellas de suero, respectivamente.
      3. Esterilizar la parte superior de las botellas de suero con el 70% de etanol y cubierta con papel de aluminio esterilizado, etiquetar adecuadamente y transferir a un agitador orbital dentro de una incubadora. El agitador orbital a 150 rpm y la incubadora a 30 ° C. Incubar hasta el primer OD 600 punto de datos se toma, en paso 1.3.3.
    3. OD obtener 600 puntos de datos
      1. preparar un espacio en blanco para depositar 100 μl de filtro esterilizado destilada desionizada (DI) agua en una cubeta estéril. Envolver película de parafina plástica alrededor de la tapa de la cubeta para que el agua no sea contaminada. Almacenar a temperatura ambiente. Uso este espacio en blanco con el espectrofotómetro antes de tomar cualquier puntos de datos para la curva de crecimiento por insertar la cubeta y presionando " en blanco ".
        Nota: Cada 48 horas un nuevo espacio en blanco debe estar preparado para evitar una lectura incorrecta, como reemplazar regularmente un espacio en blanco es una buena práctica.
      2. Para cada punto de datos de 600 OD, retire las botellas de suero preparadas en el paso 1.3.2.3 de la incubadora y la transferencia a un BSC esterilizado. Tomar 0,1 mL de medio inoculado de cada botella de suero y depósito en tres etiquetados por separado cubetas estériles.
      3. Después de esconder, inserte la cubeta que contiene la cultura en el ultravioleta visible (UV) espectrofotómetro y leer el OD 600 uno a la vez y registrar todas las tres lecturas para ese momento.
        Nota: Para S. oneidensis MR-1, los puntos de datos se tomaron en 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 y 105 h después de la inoculación. El crecimiento es completo cuando la bacteria ha completado la fase de muerte. Estos puntos se deben ajustar por consiguiente si hay falta de conocimiento en el tiempo especial de crecimiento y tendencia de las bacterias utilizadas en el presente Protocolo. Si existe incertidumbre sobre la tendencia de crecimiento, datos puntos deben ser recogidos con mayor frecuencia, por ejemplo, cada tres h para las primeras 12 h, cada 6 h para posterior 36 h, a intervalos de 12 h para lo siguiente 100 h y a intervalos de 24 horas para el final 124 h.
      4. Con el OD 600 puntos de datos como el de las ordenadas y el tiempo como el eje x, ver una curva de la media de los tres puntos con desviación estándar barras de error para cada punto de tiempo usando un software de graficación. La curva de crecimiento S. oneidensis MR-1 se muestra en la figura 1 B en la sección de resultados representativos.
      5. Con el gráfico elaborado en el paso 1.3.3.4, identificar el tiempo de la sección de la fase logarítmica de la curva de crecimiento. Por Shewanella, esto es entre 12 y 33 h de crecimiento; por lo tanto se puede inferir que a las 24 h de crecimiento, Shewanella estará en su fase logarítmica de crecimiento, asumiendo que las bacterias se cultivan utilizando los mismos medios de comunicación y tratamiento antes del uso que se utilizó para la curva de crecimiento.

2. Cultivo de la Bacteria

  1. primer día: inocular la placa de Agar
    Nota: esta sección del procedimiento se utilizó con un pla de agarosate tomar una unidad formadora de colonias (UFC) en fase logarítmica, en lugar de la cultura de arrancador líquido utilizada para la curva de crecimiento. Esto puede suponer para reproducir las mismas condiciones de crecimiento, debido a que TSA sin dextrosa fue utilizado y posteriormente trasladado a " nanohilos " medio en el procedimiento de la curva de crecimiento y la TSA tiene los mismos ingredientes que componen TSB.
    1. Quitar stock S. oneidensis MR-1 GFPbacteria del congelador de-80 ° C y en un cubo de hielo, coloque este cubo interior esterilizada BSC.
    2. En el BSC, utilice un asa de inoculación estéril de 1 μL para raspar la superficie de la acción de las bacterias congeladas y el lazo a T-raya la superficie de una placa de agarosa.
    3. Después de sellar los lados de la placa con película de plástico de la parafina, invertir la placa y guardar en una incubadora de 30 ° C durante 24 h, hasta que aparezcan las colonias individuales.
  2. Día: inocular la botella de suero
    1. Retire la placa de la incubadora y abrir dentro de la BSC.
    2. Dentro del BSC, limpiar el tapón de goma en una botella de suero preparado en el paso 1.1.1 con etanol al 70% en agua de DI.
    3. Seleccione un UFC individual de la placa de agar y, utilizando una jeringa estéril con un adjunto 22 calibrador de la aguja, depositar suficiente medios de crecimiento para desalojar la colonia de la placa sin tocar cualquier colonias vecinas y mezcla la Colonia con el medio con la punta de la aguja de.
      Nota: Un solo Colonia debe seleccionarse lo suficientemente lejos de otras bacterias en la placa, que medio puede ser depositado sobre él sin tocar otras colonias.
    4. Utilizando la misma jeringa, extraiga el líquido de la superficie de la placa de.
    5. Después de golpear ligeramente hacia fuera de las burbujas en la jeringa, inyectar el líquido en la botella de suero y colocar en un agitador orbital dentro de 30 ° C a 150 rpm durante 24 h.
      Nota: Aprovechando las burbujas de la jeringa es importante para evitar la introducción de más oxígeno a la botella de suero, como introducir más oxígeno a la botella puede cambiar las condiciones experimentales y reducir la coherencia entre los tiempos de crecimiento para las bacterias.
  3. Día: esterilización de la MCP SALVI
    Nota: para promover la esterilidad del sistema de tubería, pasos que requieren separar la jeringa de la tubería y el reemplazo con una jeringa nueva se deben hacer dentro de la BSC. Para hacer esto, simplemente separar la jeringa de la bomba de jeringa, desatornillar el soporte de jeringa metálica y llevar la jeringa con un tubo conectado a un BSC estéril. Cuando sistema de la tubería se menciona en los procedimientos, se refiere a la jeringa que contiene el depósito de líquido, atado con un inyector de polyetheretherketon (OJEADA) a la tubería de PTFE, conectada a la cámara de goteo, que tiene un inyector PEEK accesorio conectado a la Tubería, así como el contenedor de salida que se sella la tubería de salida de SALVI a la entrada SALVI.
    1. Usar un nuevo dispositivo SALVI y conecte un accesorio de PEEK y el inyector a un extremo de una tubería de PTFE.
      Nota: Dispositivos SALVI se preparan frescos para cada siguiente experimento la fabricación del dispositivo detallada en investigaciones previas y las patentes. 5 , 6 , 8 , 15
    2. tomar 2 mL de etanol al 70% en una jeringa y conectar a la guarnición de PEEK en el SALVI. Después de conectar la jeringa a una bomba de jeringa y conectar la salida de la SALVI a una botella de residuos, deje que la solución de agua etanol DI recorren el SALVI en 20 μl/min 1,5 h.
    3. Tomar 4 mL de DI esterilizada en una jeringa de agua y conecte a la entrada de la misma SALVI. Después de conectar la jeringa a una bomba de jeringa, permitir que el agua corra a través de la SALVI a 20 μL/min para por lo menos 3 h.
    4. Dentro de un BSC, abra el paquete de papel de aluminio preparado en el paso 1.2.5 y una inyección PEEK estéril en el extremo de la jeringa de 5 mL estéril PEEK guarniciones hasta el final de la tubería de TFE. Tomar ~ 3 mL de medio estéril en una jeringa y coloque en el tubo TFE. Invierta la cámara de goteo de 5 mL y, usando una jeringa estéril, inyecte el medio de crecimiento en la cámara de goteo hasta alcanzar un volumen total de 1 mL.
    5. Conecte el extremo de la cámara de goteo de jeringa de 5 mL a la entrada de la SALVI.
    6. Tomar 10 mL de medio de cultivo en una jeringa estéril y conectar a la entrada de la tubería de goteo. Después de conectar la jeringa a una bomba de jeringa, permitir que el medio a través de la SALVI a 20 μl/min durante 12 h (o toda la noche). Utilice cinta adhesiva para fijar estas piezas. Cubrir la botella toma con hoja o película de plástico de la parafina para reducir al mínimo la probabilidad de que las partículas de polvo y organismos que en él figuran para contaminar el medio. Una descripción detallada de cómo debe ser esta configuración puede encontrarse en la figura 1 A.
      1. Permita que el tubo de goteo que vertical, lo que significa que la bomba de jeringa debe colocarse en una superficie elevada con goteo Tubería asegurada con cinta y con el SALVI aseguró sobre una superficie plana abajo.
      2. Medio recorren la SALVI para 12 h para garantizar que se hayan retirado todos los restos de etanol de la MCP y el tubo de la SALVI antes de inocular con bacterias.
      3. Para mayor protección, mantener la cámara de microchannel SALVI dentro de una caja Petri esterilizada, con los lados cortados para caber la entrada y la tubería de salida. Además, mantenga la cinta siempre en la ventana para proteger la membrana del pecado y el canal antes de análisis de imagen.
  4. Día tres: inoculación de los microcanales de SALVI
    1. desmontar el tubo entero (jeringa conectada para conectarse SALVI conectado a la botella de residuos de la cámara de goteo) de la bomba de la jeringuilla y darle un BSC esterilizada. Además, sacar la cubeta de suero de paso 2.2.5 de la incubadora y llevarlo a la BSC.
    2. Limpiar la superficie del tapón de la botella de suero con etanol al 70% para evitar cualquier contaminación y luego utilizar una jeringa estéril con una aguja de 22G estéril fija para extraer 4 mL de bacterias de la botella.
    3. Separar la SALVI de la cámara de 5 mL de la tubería de goteo y conecte la jeringa con medio inoculado directamente a la entrada de la SALVI. Dejar el tubo de goteo dentro de un paquete de papel de aluminio estéril o el BSC.
    4. Acople la jeringa SALVI y toma la botella de la bomba de jeringa a 20 μl/min durante 3 h para inocular el canal de la SALVI, para permitir múltiples cambios en el volumen del líquido contenido dentro de SALVI.
    5. Después de la inoculación, desconectar la jeringa con SALVI de la bomba de jeringa y traer a la BSC. Después de conectar la entrada de la SALVI a la cámara de goteo de 5 mL de paso 2.4.3, tomar 20 mL de medio de cultivo en una jeringa estéril y conecte a la entrada de la tubería de goteo.
    6. Traer el tubo acoplado a la SALVI de BSC a la bomba de jeringa y permitir que el medio pasar a través de la tubería a una velocidad de 2 μl/min por seis a diez días, o hasta imágenes de fluorescencia (discutido en el paso 3) muestran un crecimiento favorable biofilm visible para Análisis de ToF-SIMS. Rellenar medio fresco como que acabe dentro de la BSC llenando una nueva jeringa estéril de 10mL de medio de cultivo y adjuntando a la SALVI después de que haya agotado el medio de crecimiento anterior.
      Nota: Después del inicio de la inoculación de 2 μl/min, el flujo nunca debe ser aumentado o disminuido, como cambiar la velocidad de flujo crearía tensión de esquileo dentro del canal y soltar en el biofilm. Es fundamental que este flujo nunca debe ser cambiado; para prepararse para este, ~ 24 h antes de los SIMS, observar la tubería de cerca para asegurarse de que no hay burbujas, por lo que no es necesario hacer más de medio a un ritmo más rápido a lo largo de la tubería.
      1. Evitar burbujas en el microchannel, como puede llevar a la biopelícula en el canal. Es importante ser cauteloso de las burbujas en la parte inferior de la tubería de goteo de 5 mL que se conecta a la tubería de SALVI. Medio fresco se puede inyectar en el extremo del inyector PEEK para asegurar que ningún aire se verá obligado en el SALVI.

3. Óptica de proyección de imagen de la biopelícula en los microcanales de SALVI

  1. Imágenes de microscopía de fluorescencia
    Nota: la Shewanella utilizado como organismo modelo dentro de este protocolo es mutado para expresar GFP; como tal, no requiere de tinción. Si las bacterias requieren tinción, esto debe hacerse siempre en el mismo caudal de agua (p. ej., 2 μl/min) para evitar el desprendimiento de la biopelícula. Además, cuando las células sin la disponibilidad de nutrientes, se separan. Por lo tanto, si una tinción adicional se requiere, la mancha se debe inyectar el medio de cultivo en lugar de agua antes de proceder para teñir las células.
    1. Desmonten el SALVI de goteo Tubería dentro de la BSC y cierren el SALVI atornillando las guarniciones de PEEK para apriete la Unión PEEK.
    2. Cinta adhesiva el tubo de la cámara de microchannel SALVI sobre un portaobjetos de vidrio, tal que la ventana es totalmente plana y frente hacia arriba. Retire la cinta protectora de la ventana. Sujete la corredera a la etapa del microscopio colocando el portaobjetos de cristal entre las abrazaderas de la etapa en la plataforma de.
    3. Baje la etapa del microscopio tal que la parte superior de la SALVI se coloca lo suficientemente cerca para el final del objetivo 10 X, en ajuste del foco no provocará la lente toque la ventana.
    4. Interruptor de luz de fondo y buscar el canal con el objetivo de 10 x microscopio ajustando el foco. En este momento, asegúrese de que la presencia de la fijación bacteriana a la ventana del pecado de la SALVI es evidente en comparación con la ventana de un canal de control con ningunas bacterias inoculadas. Para más imágenes de células, cambiar el objetivo 20 x. En comparación con un canal vacío de SALVI, la presencia de bacterias a la ventana debe tener una fuerte fluorescencia verde.
    5. Apagar la luz y encender la fuente de mercurio de microscopio. Espere 2-3 min y cambie al FITC filtro situado en el microscopio para ver y capturar imágenes del biofilm a la ventana. Como ejemplo de la biopelícula madura se verá como cuando esté listo, consulte la figura 1 C.
    6. Vuelta apagado la fuente de mercurio y separar el SALVI de la diapositiva. Si es necesario, conecte a 2 μl/min flujo medio una vez más para permitir más crecimiento antes otra vez la proyección de imagen, o transferir el SALVI a uso de contención secundaria para análisis de ToF-SIMS. Esto es necesario si el espesor de la biopelícula se concluye a no ser lo suficientemente espesa, y se requiere más tiempo de crecimiento antes de análisis de ToF-SIMS. Para adjuntar a flujo medio una vez más, consulte el paso 2.3.6.
      Nota: Si volver bajo flujo medio, proyección de imagen de fluorescencia debe hacerse antes de análisis de ToF-SIMS.
      1. Dé la biopelícula medio de cultivo para alimentar hasta análisis de ToF-SIMS. Mientras que no se recomienda, si es necesario, el SALVI cerrada puede almacenarse a 4 ° C durante la noche, pero se debe calentar a la temperatura ambiente antes de introducir a la cámara de vacío de los ToF-SIMS. Sin embargo, analizar el biofilm inmediatamente después de flujo medio para reducir el desprendimiento de la biopelícula.

4. Adquisición de datos de ToF-SIMS

Nota: esta sección sirve como un resumen y se discute con mayor detalle dentro de nuestro protocolo anterior que describe análisis de SIMS líquido de moléculas de proteína adsorbida. 12

  1. Instalar SALVI en la cámara de ToF-SIMS Loadlock
    Nota: guantes se deben usar en todo momento cuando el dispositivo SALVI de manejo e instalación en el ToF-SIMS etapa para evitar posibles contaminaciones durante la superficie Análisis.
    1. Monte SALVI en el escenario y fíjela con tornillos varios. Asegúrese de que la ventana de pecado es por ajuste de tornillo de tirantez e insertar la oblea de silicio pedazos en la parte inferior de la cámara de microchannel PDMS. Retire la cinta protectora de la ventana, luego la etapa de carga en la cámara de ToF-SIMS loadlock.
    2. Abrir el loadlock ToF-SIMS, sostenga el escenario horizontalmente sobre la plataforma de carga y cierre la puerta de loadlock. Iniciar la bomba de vacío y espere para alcanza ese vacío conveniente.
    3. Mover el SALVI en la cámara principal, una vez que el vacío se estabiliza a 1 x 10 -7 mbar.
  2. Profundidad y recoger los puntos de datos
    1. encontrar el canal de microfluidos con el microscopio óptico equipado en ToF-SIMS.
    2. Seleccione el modo positivo o negativo antes de adquisición de datos. Uso el 25 keV Bi 3 + de la viga como el haz de iones primario en todas las medidas y utilizar el arma de la inundación de electrones para neutralizar la superficie carga durante todas las mediciones.
    3. Exploración de la viga de 3 + de Bi con pulso ns 150 ancho en un área circular con un diámetro de 2 μm con 64 x 64 píxeles de resolución. Después de perforar a través de la ventana de pecado nm 100, continuar buscar otros 150 s para recopilar datos de alta intensidad para la proyección de imagen. Después de la irrupción, las cuentas aumentarán significativamente dentro de la región de perfiles de profundidad. Tras estabilizar, esto puede se conoce como la región de alta intensidad.
    4. Reducir el ancho de pulso de 50 ns para recopilación de datos para adquirir espectros con mejor resolución de masa. Continuar esta adquisición para cerca de 200 otro s.
    5. Repita estos pasos para la recolección de al menos tres positivos y tres puntos de datos negativos.
      Nota: Asegúrese de las irrupción de las zonas del espacio tal que no se rompa la ventana del pecado y fugas en la cámara de vacío de comprometer integridad ventana.

5. Análisis de datos de ToF-SIMS

  1. calibración de masa utilizando IonToF Software
    1. Abra el software de análisis de ToF-SIMS (medición de Explorer) y haga clic en el " perfiles ", " spectra " y " imagen " botones, respectivamente, y Perfil de profundidad de proceso, espectro de m/z, datos de la imagen.
    2. Abrir los archivos de datos obtenidos a través de adquisición de datos de ToF-SIMS.
    3. Seleccione la profundidad de perfiles de datos de interés y reconstruir los espectros según las series temporales de profundidad perfil.
    4. Prensa " F3 " para abrir la " masa de calibración " ventana. Elegir picos de calibración basado en compuestos químicos que existen en la muestra específica.
  2. Picos de interés selección
    1. selección de pico es necesario para el análisis de la muestra, determinar picos característicos de la muestra según la literatura u otros resultados anteriores, si alguna. Comparar la intensidad de los picos de interés en los espectros de m/z. Si es necesario, añadir nuevos picos o eliminar picos de interferencia en la lista de pico.
    2. Click en el pico, encontrar las líneas rojas en la ventana inferior izquierda. Mover las líneas rojas para incluir el pico entero.
    3. Seleccione un pico que la fórmula química en la ventana principal del espectro y luego haga clic en el " añadir pico " boton arriba de la ventana. < /li >
  3. Exportar datos de calibrado de masa
    1. para exportar una lista de pico, en la " lista de pico " menú, seleccione " guardar … " la lista de pico en la " itmil " formato.
    2. Exportar un perfil de profundidad, en el " perfil " ventana, haga clic en el " archivo " menú, seleccione " de exportación " y luego seleccione " guardar como " un " .txt " archivo.
    3. Para exportar un archivo de espectro de m/z, en el " Spectra " ventana, haga clic en el " archivo " menú, seleccione " de exportación " y seleccione " guardar como " un " .txt " archivo.
    4. Exportar un archivo de imagen, en la " imagen " ventana, imprimir pantalla y guardar como el archivo de imagen.

6. ToF-SIMS datos trazar y presentación

  1. usar una herramienta gráfica para importar los datos.
  2. Hacer una parcela de uso m/z como el eje x y pico de intensidad como el eje y para mostrar el espectro reconstruido. Un ejemplo se da en la figura 2 A.
  3. Cosechadora reconstruido imágenes bidimensionales (2D) de diferentes m/z y forma una matriz para mostrar cualquier asignación de iones positivos o negativos. Un ejemplo se da en la figura 2 B.

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Representative Results

Estos resultados representativos sirven para mostrar cómo se puede identificar e interpretado, el perfil químico de la biopelícula adjunto obtenido a través de ToF-SIMS. Después de trazar los espectros de masas de adquisición de datos de ToF-SIMS, destacada brevemente en la sección de procedimientos, identificación de pico debe realizarse con el fin de asignar identidades a cada valor de m/z respectivos. Esto puede hacerse a través de la revisión de literatura extensa sobre espectrometría de masas en bacterias y fragmentos químicos específicos que se esperan que se presente dentro de las bacterias estudiadas, como varios racimos del agua, ácidos grasos, fragmentos de la proteína. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 estos resultados representativos sólo muestran los espectros de masa negativo obtenido por el biofilm de S. oneidensis MR-1 y una muestra de agua DI. Interpretación de espectros positivo seguir un procedimiento similar.

Figura 1 A muestra la disposición esquemática según este protocolo al labrar un biofilm en los microcanales SALVI. En la parte superior izquierda, se une la jeringa a una bomba de jeringa, que mantiene el medio que fluye a un ritmo constante en todo el sistema de tubería de PTFE y dentro de la MCP. La bomba se coloca por encima de la cámara de goteo, que evita la contaminación al medio depósito para evitar que los organismos móviles de nadar río arriba hacia atrás. El medio fluye desde el depósito de la cámara de goteo directamente en el tubo de PTFE de SALVI, que pasa a través de la MCP y la tubería de salida a una botella de salida sellada. Las líneas punteadas señalan desde la ventana de pecado a una imagen de un madurado S. oneidensis células GFP MR-1 capturadas por microscopía de fluorescencia, detallado en el paso 3.1. Figura 1 B muestra un ejemplo de una curva de crecimiento con el organismo modelo para este protocolo, S. oneidensis MR-1. De las fases de crecimiento en este gráfico, se puede concluir que la fase logarítmica de crecimiento se produce entre 15-32 h en estas condiciones de cultivo específicas. Información adicional de este gráfico muestra que h 0-15 es la fase de retraso de crecimiento, y 33-105 h representa la fase estacionaria de crecimiento. Figura 1 C es una imagen obtenida con microscopía de fluorescencia que muestra un ejemplo de una biopelícula madura.

Figura 2 A se muestran los espectros de masa negativo de un hidratado S. oneidensis MR-1 biofilm dentro del canal microfluídico, obtenida por el líquido en situ ToF-SIMS. Este gráfico muestra un ejemplo de la comparación de la gama total seleccionada (m/z 100-350) entre el biofilm del agua S.oneidensis MR-1 y DI, este último se obtuvo como un sistema de control. Figura 2 B muestra una comparación de imágenes 2D de los picos de interés en el biofilm del MR-1 y DI agua obtenida por ToF-SIMS. Una vez interesantes valores de m/z pueden ser identificado del estudio de los espectros de masas, identificación de potencial máximo de los valores de m/z correctamente se atribuyen a fragmentos químicos, apoyada por la encuesta de biblioteca y literatura de software de IonToF SIMS. Picos de interés en la figura 2A incluyen racimos del agua (m/z (H2O) 1075OH–, 125 (H2O)6OH–, (H2O) 1437OH-, 161 (H2 O)8OH–, 179 (H2O)9OH–, 197 (H2O)10OH–, 215 (H2O)11OH–, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH–, 269 (H2O)14OH–, 287 (H2O)15OH–, 323 (H2O)17OH-, (H2O) 34119OH–))9, como denota por líneas rojas sobre picos respectivos, quórum sensing relacionadas con biomarcadores de compuestos (es decir, m/z 175 C10H9NO2–), subproductos de la EPS (m/z 123 C2H4PO4-, P 159 2 O8H–, 216 Cr2O7–, 285 octadecanoethiols, 325 compuestos polares, compuestos de Polar C12 )15,16,18y la cadena de ácidos grasos fragmentos (es decir, m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, ácidos grasos de C16: 0 255 279 ácido linoleico C18H31O2–, C 32521H40O2 -, lípidos, 18-MEA enlazado a través del thioester enlace, ácido esteárico C18H35O2–, iones de monoacylglyceryls de ácido palmítico C19H17O6 de la superficie de 341 -). 16 , 19

Desde el biofilm es hidratado, no es sorprendente que algunos picos en la muestra de biofilm son similares a los encuentra en agua desionizada. Estos picos de cluster de agua están marcados con una línea roja por encima de cada pico en la figura 2A, incluyendo m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 y 341 y correspondiente a (H2O)5OH– (H2O) 6 OH– (H2O)7OH– (H2O)8OH– (H2O)9OH– (H2O)10OH– (H2 O)11OH– (H2O)12OH– (H2O)13OH– (H2O)14OH– (H2O)15OH- (H2O)17OH– (H2O)19OH-, respectivamente. 9 como hay predominio de muchos racimos de agua característicos en este espectro de masas, este resultado proporciona una fuerte evidencia de la entorno de cluster químico del agua presente en el biofilm hidratado. Además, no agua cluster relacionado con picos observados en ambos espectros pueden atribuirse comúnmente como picos de interferencia, típicamente de los PDMS, un componente del canal microfluídico. Por ejemplo, un pico de interferencia conocido común de PDMS es m/z 137 en el modo de iones negativos.

Cuando comparando el biofilm SIMS masa espectros del agua DI, como se muestra en la figura 2A, algunos picos no están presentes en el agua de DI, pero aparecen en el biofilm. Por ejemplo, el pico en m/z 255 ([CH3(CH2)14COO]-, ácido palmítico) está presente con alta intensidad en la muestra de biofilm, pero no en la muestra de agua DI. Esto sugeriría que los señales come de la biopelícula, es muy probable que el biofilm o su EPS generado. Muchos picos interesantes fueron identificados en la figura 2A. Por ejemplo, EPS relacionadas picos m/z 123-, se encontró que C2H4PO4-, 159 (P2O8H–), 216 (Cr2O7–), 285 (octadecanoethiols) y 325 (compuestos polares, C 12 compuestos polares). 17 , 18 , 20 picos asociados con los ácidos grasos fueron encontrados para ser 127 ([C2H3(CH2)3COO]–), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, ácido palmítico), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, ácido linoleico), 317 (C21H33O2–), 325 (C21H40O2–) y 341 (lípidos de la superficie, 18-MEA enlazado a través de Thioester enlace, ácido esteárico C18H35O2-, iones de monoacylglyceryls de ácido palmítico C19H17O6–). 16 , 19 por último, una quinolona quórum detección la señal relacionados con pico de C10H9NO2– se observó en el m/z 175.

Figura 2 B muestra las imágenes 2D de la distribución de cuatro diferentes iones interesantes entre el biofilm de S. oneidensis MR-1 (fila superior) y agua desionizada (fila inferior). El valor de m/z 107 ((H2O)5OH–) se muestra un clúster de agua de significativa intensidad dentro de las muestras, el valor de m/z 175 (C10H9NO2–) representa un quórum detección relacionados con señal, m/z 255 es un ácido graso ([CH3(CH2)14COO]-, ácido palmítico), y m/z 341 (C21H41O2–) puede representar ambos fragmentos de lípidos y agua clusters debido a la precisión de masa de 1 uma. 9 regiones más brillantes de las imágenes 2D indican una cuenta más alta del ion molecular presente en la imagen. Como era de esperar, compuesto de señales para el QS y lípidos fueron mucho mayores en cantidad dentro de la muestra de biofilm. Mientras que la señal para el clúster de agua (m/z 107) era más fuerte a lo largo de la muestra de biofilm, también estuvo presente en la muestra de agua DI, como se esperaba. Por último, la señal en m/z 341 fue encontrada para ser homogénea dentro de la muestra de biofilm, pero muy débil dentro de la muestra de agua DI. Mientras que m/z 341 era un pico de cluster de agua, también era representante de varios diferentes ácidos grasos y los lípidos superficiales. 16 su presencia más fuerte dentro de la muestra de biofilm después de normalización de los datos sugiere que la presencia de fragmentos de lípidos es mayor que la presencia de racimos del agua.

Figure 1
Figura 1 : Esquema experimental. (A) muestra el esquema experimental de la configuración del biofilm que aparece dentro del laboratorio. A partir de la parte superior izquierda, medio flujos de la jeringa (1), que se une a la bomba de jeringa (2), controlar la velocidad en que líquido se mueve a través de. Las flechas indican la dirección del flujo en todo el sistema. La jeringa (1) está conectada vía un inyector PEEK guarnición (3) a la tubería de la TFE (4). Medio fluye a través de una cámara de goteo (5) para evitar la contaminación y eventualmente se mueve a través de la SALVI (6) en el contenedor de salida sellados (7). La bomba de jeringa se coloca sobre una superficie elevada (9) tal que sea perpendicular a la superficie plana (8) que el SALVI (6) se coloca sobre la cámara de goteo (5). (B) crecimiento de la curva de Shewanella oneidensis MR-1 en medio de "nanocables". Tiempo de 0-15 h representa la fase lag, tiempo 15-33 h representa la fase de registro, tiempo 33-105 h representa la fase estacionaria y 105 horas o ya representa la fase de muerte. Barras de error representan la desviación estándar. (C) A imagen de la biopelícula madura con microscopía de fluorescencia. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2 : Las comparaciones de ToF-SIMS negativos espectros de la hidratada Shewanella oneidensis biofilm y MR-1 medio en los microcanales SALVI. (A) m/z SIMS espectrométricos de la biopelícula de Shewanella oneidensis MR-1 y DI agua. Este último se utilizó como control. Líneas rojas indican lugares de picos de cluster de agua característico. (B) comparación de imagen en 2D de los picos de interés entre la biopelícula y agua desionizada. De izquierda a derecha, las imágenes muestran un racimo del agua (m/z 107 (H2O)5OH–), una señal de quorum sensing/hormona (m/z 175, C10H9NO2–), un ácido graso (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, ácido palmítico) y la superficie fragmentos de lípidos/EPS (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2–). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Después de inocular en la fase de registro, es importante comprobar el número de días y la temperatura en la cual el biofilm debe crecer antes de que sea saludable y lo suficientemente gruesa como para la proyección de imagen, como se describe en el paso 3.1. Este procedimiento cubre específicamente el cultivo un S. oneidensis MR1 biofilm a temperatura ambiente; sin embargo diferentes temperaturas ambiente puede influir en la tasa de crecimiento. Por lo tanto, es fundamental utilizar la proyección de imagen óptica para entender si el biofilm está listo antes de proceder al análisis de ToF-SIMS. Del mismo modo, diferentes cepas de bacterias requieren diferentes condiciones de crecimiento y longitud para lograr un espesor conveniente para el análisis. Mientras que la curva de crecimiento en la Figura 1b muestra la fase de registro 200 de la bacteria a ser h 12-32, y esto fue utilizada a las 24 h durante todo el procedimiento, es importante tener en cuenta que esta vez no puede usarse como fase logarítmica para otras cepas de bacterias sin establecer la curva de crecimiento independientemente. Mientras que la fase de registro era entre 12 y 33 h de crecimiento para S. oneidensis, 24 h fue elegido debido a que estaba en la parte de donde el oxígeno estaba empezando a limitar la tasa de crecimiento del organismo, hacia el final de la fase logarítmica de crecimiento. Experimentos demostrados que se trataba de las células de tiempo comenzaron a producir nanohilos, así preparado en forma biofilms exitosas que podrían sobrevivir en ambientes de poco oxígeno. 3 , 13 por lo tanto, el tiempo escogido usar las bacterias en fase de registro debe ser influenciado por investigación experiencia y conocimiento ganaron de la literatura en el estudio experimental de las bacterias estudiadas. Además, debe establecerse una curva de crecimiento independiente para comprender la fase de registro para todas las cepas diferentes de bacterias que se utilizarán para el crecimiento de biopelículas usando este acercamiento. La tasa de crecimiento de 2 μl/min fue calculado así como no sobrepasar la tasa máxima de crecimiento de S. oneidensis MR-1 y el tiempo total fue elegido para conseguir un biofilm maduro que no fue invadido y propensos a la separación. Estas tarifas se pueden ajustar por consiguiente al conocimiento de diferentes bacterias para ser utilizado con esta configuración.

Algunas limitaciones al uso de SALVI para el crecimiento de la biopelícula son incrustaciones biológicas dentro del canal, así como la probabilidad de bacterias para fijar a las paredes del planas del canal. A pesar del crecimiento a un ritmo constante, recomendado que sea de 2 μl/min dentro de este protocolo, biofouling puede ocurrir aún si el biofilm puede crecer demasiado. En tal caso y sin aviso, el biofilm puede separar de la ventana y salir el SALVI a la contención de la salida. Biofouling también puede ocurrir simplemente por añadir fuerza mecánica (es decir, en movimiento) el SALVI, que no se puede evitar. Sin embargo, ésta se puede guardar bajo control mediante la visualización de la fijación de la biopelícula en la ventana de pecado antes de análisis de ToF-SIMS bajo un microscopio de luz. Una otra limitación incluye la suavidad de los microcanales PDMS que pueden hacer difícil para algunas bacterias fijar. Sin embargo, esto puede cambiarse en el diseño de la SALVI para poder crear cantos estriados en el canal, si el accesorio de las bacterias es un problema. Por último, puede hacerse un recuento en lugar de lecturas de OD600 para determinación de curva de crecimiento. Por ejemplo, estudios han demostrado correlación directa y constante de un recuento de lecturas de OD600 . 21 por tanto, OD600 se considera suficiente en la evaluación del crecimiento de biopelícula.

Limitaciones de esta técnica son pocos, como el SALVI actúa esencialmente como un plato de cultura que tiene gran versatilidad para su uso en muchas aplicaciones, tales como anaeróbicamente dentro de una guantera, o dentro de cualquier cámara con control de temperatura. Algunas limitaciones menores incluyen habitación incontrolable condiciones tales como humedad relativa, temperatura, ubicación cerca de la luz del sol, que todavía pueden ser acomodados, para las condiciones de crecimiento óptimo de cada bacteria específica. Además, algunos de estos problemas técnicos se pueden superar con una incubadora con temperatura o mediación RH características en la configuración del biofilm.

SALVI es una interfaz compatible con vacío microfluídicos. En este trabajo, se utilizó un canal de 200 x 300 μL microfluídicos para biofilms con SIMS óptico y líquido de la cultura. Líquidos presentan un desafío técnico para estudiar técnicas de vacío basado, porque son volátiles y difíciles de retener en la fase líquida en el vacío. Así técnicas de vacío como ToF-SIMS han sido tradicionalmente restringidas a muestras sólo seco y criogénicas. 22 además, SALVI puede utilizarse para diversas imágenes y espectroscopia usando una variedad de técnicas de microscopia y espectroscopia. 4 , 9 nuestro grupo ha trabajado para expandir continuamente diversas aplicaciones de SALVI en análisis en situ de interfaces sólido-líquido y líquido. 15 , 23 , 24 nuestro esfuerzo más reciente ha efectivamente demostrado bacterias fijación a la membrana del pecado. 9 después de apego inicial, corriente continua del medio con el tiempo se ha demostrado con éxito cultivar una biopelícula directamente en la ventana del pecado de la SALVI. Durante ToF-SIMS, el haz de iones primario se utiliza para bombardear los agujeros de 2 μm de diámetro. Esta dimensión es similar a la longitud de la célula del biofilm a la ventana de pecado, así proporcionando un perfil químico de la biopelícula en su microambiente natural hidratado. Esto es muy importante debido a la diferencia de identidad química de un biofilm, la presencia de EPS y el medio ambiente de cluster de agua cuando se comparan los biofilms en su estado hidratado con muestras secas. 9 sin el uso de SALVI, ToF-SIMS puede sólo realizarse en muestras secas y criogénicas, proporciona mapeo químico que es incapaz de captar el perfil químico de una muestra en su estado hidratado natural.

Como se muestra en la figura 1A, es importante mantener la bomba de la jeringuilla por encima de la tubería de goteo con el fin de permitir que la tubería de goteo para ser perpendicular a la MCP SALVI. Además, las burbujas serán menos propensas a quedar atrapados dentro de la tubería del dispositivo, si la tubería de salida de PTFE (dentro de la botella de la salida) es menor que la tubería de entrada (conectada a la cámara de goteo). Otro paso fundamental de cultivar bacterias de crecimiento SALVI debe primero obtener una curva de crecimiento de la cepa particular de bacterias que se utilizarán, como se describe en el paso 1.3. Esto puede hacerse mediante la obtención de las curvas de crecimiento con las mediciones de densidad óptica. Una curva de crecimiento, como se muestra en la figura 1B, es importante para comprender el tiempo en el cual las bacterias será dentro de la fase logarítmica de crecimiento, cuando se puede suponer que las bacterias son más saludables. Las bacterias dentro de esta fase de crecimiento facilita la creación de un microambiente de biofilm saludable y asegura que el biofilm crecerá al ritmo esperado. El microchannel SALVI es esterilizada a temperatura con etanol al 70% y agua desionizada, como no puede ser tratado en autoclave para su esterilización antes de usar con ToF-SIMS. Esto es debido a la autoclave puede dañar la ventana de la SALVI e introducir vapor de agua al canal. Después de varios días de crecimiento, debe revisarse el microchannel con microscopía de fluorescencia para validar la fijación bacteriana. Un ejemplo puede encontrarse en la figura 1C, esta imagen fue tomada para mostrar una biopelícula madura. Debido a la trayectoria del flujo del medio, las bacterias más favorable se fija y crece a lo largo de los bordes de la MCP, como este lugar es donde el flujo y las fuerzas de corte son lowest.

En Resumen, SALVI es un método excelente para que a la cultura y estudio de biopelículas usando en situ mapeo químico, ya que permite para que el biofilm de la vida en su estado hidratado natural al espectrómetro de masas por imágenes basado en el vacío. Este enfoque único puede proporcionar más información sobre agua cluster microambiente de la biopelícula, así como para obtener una comprensión más profunda de sus subproductos EPS. Esta información podría utilizarse para comprender las actividades biológicas de un biofilm y puede ser utilizada en diversas aplicaciones tales como en biomedicina, ingeniería biomédica, agricultura y la investigación industrial y desarrollo.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Agradecemos al laboratorio nacional del Noroeste Pacífico (PNNL) tierra y ciencias biológicas (EBD) misión semilla laboratorio dirigido investigación y desarrollo (LDRD) Fondo de apoyo. Se ofrece acceso instrumental a través de una propuesta General de usuario de W. R. Wiley ambiental Molecular Ciencias laboratorio (Page). Page es una instalación de usuario científico nacional patrocinada por la oficina de biológicas y ambientales (BER) de investigación en PNNL. Los autores agradecen a Dr. Yuanzhao Ding para prueba leyendo el manuscrito y proporcionar información útil. PNNL es operado por Battelle para la coneja bajo contrato DE-AC05-76RL01830.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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References

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Química número 126 SALVI ToF-SIMS biofilm en situ la proyección de imagen molecular microfluídica
<em>In Situ</em> Caracterización de <em>Shewanella oneidensis</em> MR1 Biofilms por SALVI y ToF-SIMS
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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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