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Chemistry

In Situ Charakterisierung von Shewanella Oneidensis MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS

Published: August 18, 2017 doi: 10.3791/55944
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

Summary

Dieser Artikel stellt eine Methode für den Anbau eines Biofilms für in Situ Time-of-Flight secondary Ion Massenspektrometrie für chemische Zuordnung im hydratisierten Zustand durch einen mikrofluidischen Reaktor, System zur Analyse an der flüssigen Vakuum-Schnittstelle aktiviert. Die Shewanella Oneidensis MR-1 mit grünen Fluoreszenz-Protein wurde als Modell verwendet.

Abstract

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die stark untersucht werden, um ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre Rolle im Umweltmikrobiologie zu verstehen. Diese Studie beschreibt eine Methode zum Biofilm Bindung an das System für die Analyse bei flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI) zu kultivieren und in Situ chemische Zuordnung der lebende Biofilm durch Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) zu erreichen. Dies geschieht durch die Kultivierung von Bakterien sowohl außerhalb als auch innerhalb des Kanals SALVI mit unseren spezialisierten Einrichtung sowie durch optische bildgebende Verfahren zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor der ToF-SIMS-Analyse. Unsere Ergebnisse zeigen die charakteristischen Gipfel des Biofilms Shewanella in seinem Naturzustand hydratisiert dehydriert Hervorhebung auf seine lokalisierte Wasser-Cluster-Umgebung, sowie EPS Fragmente, die sich drastisch von des gleichen Biofilms unterscheiden Zustand. Diese Ergebnisse zeigen die Durchbruch-Fähigkeit von SALVI, der in Situ Biofilm Bildgebung mit einem Vakuum-basierten chemischen Bildgebung Instrument ermöglicht.

Introduction

Bakterielle Biofilme sind Oberfläche-assoziierte Gemeinschaften, die im Laufe der Zeit als eine Verteidigung gegen Bakterien überleben unterschiedlicher ungünstige physikalische und mechanische reizen, wobei Zellen in der Lage sind zu befestigen und in vielen möglichen Umgebungen überleben entwickelt haben. 1 , 2 Biofilme werden erheblich untersucht und finden Anwendung in vielen Bereichen wie Biomedizin, biomedizinische Technik, Landwirtschaft und industrielle Forschung und Entwicklung. 1 , 2 die chemische Zuordnung dieser komplexe mikrobielle Gemeinschaften, einschließlich ihre selbst produzierten extrazellulären Polymeren Substanzen (EPS) und ihre lokalen Wasser-Cluster-Umgebung zu verstehen gilt, gewinnt eine genaue und detaillierte Darstellung ihrer biologischen Aktivitäten. 2

Biofilme bestehen und wachsen innerhalb eines stark hydratisiert Staates. Dies stellt eine große Herausforderung im Umgang mit Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken wie Time-of-Flight secondary Ion mass Spectrometry (ToF-SIMS) aufgrund der Schwierigkeiten bei der Untersuchung der flüchtiger Flüssigkeiten im Vakuum. Infolgedessen wurden Vakuum-basierten Oberflächenanalyse Techniken beschränkt sich fast ausschließlich auf Biofilm Proben im getrockneten Zustand zu studieren. Studium einen Biofilm im getrockneten Zustand hemmt jedoch die genaue Untersuchung der seine wahre biologische Mikroumgebung. Es führt oft zu drastische Veränderungen der EPS Integrität und Biofilm-Morphologie, die nach einem Vergleich trocken Biofilm Masse spektrale Ergebnisse in Situ flüssige Studien nachgewiesen wurde. 3 , 4 dieser Artikel stellt eine Lösung für das Studium von Biofilmen innerhalb ihrer natürlichen hydratisierten Zustand durch die Verwendung unseres Systems zur Analyse an flüssigen Vakuum Schnittstelle (SALVI),5,6 mikrofluidischen Reaktor, enthält Flüssigkeit unter seine dünne Silizium-Nitrid (SiN) Membran in eine Microchannel gemacht von Polydimethylsiloxan (PMDS), so bietet direkten Zugang zu den sekundären Ionenstrahl Sonde unter Beibehaltung der strukturellen Integritätdes der flüssigen Matrix in einem luftleeren Raum Kammer. 7 , 8

S. Oneidensis MR-1 mutiert auszudrücken, grüne Fluoreszenz-Protein (GFP) wurde gewählt, als Modellorganismus für dieser Biofilm Verfahren Abbildung aufgrund seiner metabolischen Vielseitigkeit und gemeinsame Nutzung in Umwelt- und angewandte Mikrobiologie, basiert stark auf seine einzigartige Fähigkeit zur Verringerung der Metall und extrazelluläre Elektronentransfer. 9 , 10 , 11 darüber hinaus ermöglichte das Vorhandensein von GFP einfach kontinuierliche Biofilm-Dicke Überwachung durch Fluoreszenz-Mikroskopie, mithilfe eines Filters Fluorescein erfolgt (FITC). Unsere frühere Studien haben Hinweise auf diese Bakterien begünstigt Anlage zum Fenster SiN mit in Operando Fluoreszenz-Bildgebung für Biofilm Wachstum bis zu einer Dicke von bis zu hundert Mikrometern gezeigt. 4 , 12 während dieses Papier nur die Bestätigung der Biofilm Präsenz durch Fluoreszenzmikroskopie besprechen, die SALVI ist kompatibel mit anderen optischen bildgebenden Verfahren wie Höchstauflösung Fluoreszenz-Bildgebung (d. h. die strukturierte Beleuchtung Mikroskopie (SIM)9) und konfokale Laser-scanning-Mikroskopie (CLSM) imaging-4). Optische Bildgebung kann dienen zur Messung der Dicke von Biofilm und ein 3D-Bild der Form des Biofilms erhalten, wie es scheint, seine Stärke und seine Verbundenheit mit der Sünde-Fenster bestätigt. 9 während GLP diente in der SIMS-Analyse, S. Oneidensis , ohne GFP diente für die Wachstumskurve, als diese nur erforderliche Messung der optischen Dichte und Fluoreszenz-Bildgebung nicht erforderlich. In der Regel die Differenz zwischen der GFP markiert und untagged Arten in der Wachstumskurve ist bedeutungslos. Darüber hinaus während dieses Protokoll S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus verwendet, um das Verfahren zu beschreiben, ist dieses Verfahren für jeden Bakterienstamm ausgelegt, die für den Anbau in SALVI erforderlich sein kann. Obwohl Wissen der bakteriellen Belastung benötigt gegeben, müssen einige Bedingungen wie Zeit, Temperatur und Sauerstoff-Umgebung den Bakterienstamm zu verwendende angepasst werden. Wachstumsmedium verwendet dieses Verfahren "Nanodrähte" Mittel, tryptic Soy Bouillon (TSB) ohne Traubenzucker und tryptic Soy Agar (TSA) ohne Traubenzucker zur Kultivierung. Die Zusammensetzung des "Nanodrähte" Medium speziell formuliert für das Wachstum und für die Überwachung von Erweiterungen der Membran und Periplasma S. Oneidensis , die angezeigt werden, nehmen die Form von kleinen Drähten und die mittlere Zusammensetzung wurde in früheren Untersuchungen niedergelassen. 13 , 14

Unsere vorherigen Protokoll auf in Situ illustrierte flüssige ToF-SIMS nutzen SALVI für Protein Immobilisierung und Verbundenheit mit der Sünde, sowie ein detailliertes Protokoll auf ToF-SIMS Analyse und Datenreduktion zu bieten hat. 12 statt Daten Reduzierung Schritte wiederholen, wird dieses Papier dienen sich stattdessen auf den einzigartigen Ansatz der Einrichtung und Pflege von Biofilmen innerhalb unserer SALVI Microchannel sowie die bildgebenden Schritte zur Erkennung von Biofilm Präsenz und Stärke vor ToF-SIMS-Analyse. Während Biofilme zuvor begrenzt worden, haben nur getrocknet Proben innerhalb der Kammer Vakuum-basierten analytische Oberflächentechniken, detaillierte EPS und Biofilm chemische Zuordnung von Biofilmen Leben jetzt in Situ durch diese neue Funktion erhalten.

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Protocol

1. Vorbereitung der Materialien

  1. Vorbereitung der Medium Tubing
    1. Serum-Flaschen (eine pro Biofilm Kultur und drei pro Wachstumskurve benötigt benötigt)
      Hinweis: wie bereits in der Einführung, Wachstum Medium geeignet, um die Nährstoffe benötigt, für den Bakterienstamm Interesse bieten kann für dieses Verfahren genutzt werden; in diesem Fall " Nanodrähte " Medien und TSB ohne Dextrose Medium für das Wachstum von S. Oneidensis MR-1 GLP verwendet wurde. 13
      1. Anzahlung 20 mL Nährmedium in einer 70 mL Serum-Flasche, den Stopfen verschließen und crimp-die Flasche. Decken Sie die Spitze mit einem sauberen sterilen Aluminiumfolie.
      2. Autoklaven die Flasche mit einem flüssigen Zyklus für 30 min bei 121 ° C. danach die sterilisierte Serum-Flasche bei Raumtemperatur lagern.
    2. Anaerobe Kultur Röhren
      1. 5 mL Wachstumsmedium auf eine anaerobe Kultur-Schlauch mit Luft Headspace einzahlen, auf den Stopper und crimp-Flasche. Decken Sie die Spitze mit einer sterilen Folie.
  2. Vorbereitung Bubble Trap Schlauch
    1. mit einer 22 Gauge-Nadel sorgfältig punch ein Loch durch einen Gummistopfen Serum Flasche.
    2. Cut 20 in 1/32 " Polytetrafluorethylen (PTFE) Schlauch mit einem Rasiermesser so, dass ein Ende des Segments Schlauch gerichtet ist.
    3. Mit dem spitzen Ende den PTFE-Schlauch durch das Loch im oberen Bereich des Gummistopfens thread. Schieben Sie den Schlauch durch, bis etwa 2 cm über den Stopper und schneiden Sie das Spitze Ende der PTFE-Schlauch mit einem Rasiermesser, ein flaches Ende haben.
    4. Entfernen Sie den Kolben der Spritze 5 mL und passen den Gummistopfen aus Schritt 1.2.3 in das offene Ende der Spritze. 2 cm endet PTFE Schlauch in den Lauf von der Spritze. Dies ist die Blase Falle.
    5. Wickeln die Blase Falle (die PTFE Schläuche, Gummistopfen und Spritze) machte im Schritt 1.2.4 mit Alu-Folie und mit Autoklav Klebeband zu sichern. Autoklaven die Folienverpackung, sterilisieren, die Schläuche mit einem Schwerpunkt bei 121 ° C für 30 min. Zyklus speichern die versiegelten Folienverpackung bei Raumtemperatur bis bereit für Schritt 2.4.
  3. Bakterielle Wachstumskurve
    Hinweis: dieses Protokoll verwendet S. Oneidensis MR-1 GFP als Modellorganismus für den Anbau des Biofilms in SALVI. Dieses Verfahren kann jedoch an anderen Bakterien wachsen aerob oder anaerob unterzubringen. Je nachdem welche Belastung verwendet wird, Wachstumszeit und Umwelt müssen entsprechend angepasst werden.
    Hinweis:-80 ° C bakterielle Gefrierschrank Aktien bestand aus einer 1:1 Mischung von TSB ohne Traubenzucker und Glycerin. Das Wachstum Kurve Beispiel in Abbildung 1 B bereitete keine Dextrose in jeweiligen 0,2 mL Mengen dreimal auf 70 mL Serum Flaschen mit 20 mL übertragen eine Starterkultur von TSB mit " Nanodrähte " Medium, Spuren von TSB zu entfernen. Dieses Protokoll setzt jedoch voraus, dass nur ein Wachstumsmedium verwendet werden und, dass spätere Übertragungen nicht, als dies durchgeführt werden mit diesen bestimmten mittleren Lösungen für S. Oneidensis geschah. Obwohl nicht in diesem Protokoll beschrieben, sind zusätzliche Übertragungen wie dies empfohlen, da zunächst Hinterlegung der Bakterien, die reiche TSB die gefrorenen Zellen wiederherstellen hilft; und drei weiteren Transfers zu " Nanodrähte " gewährleistet, dass alle TSB verschwunden ist und typische Wachstumsdynamik auftreten.
    1. Impfen die Starterkultur
      1. den bakteriellen Glycerin bestand aus dem-80 ° C Gefrierschrank zu entfernen und warm die Aktie mit einem behandschuhten Hand so schnell wie möglich Auftauen. Verschieben Sie diesen Gefrierschrank bestand in der biologischen Sicherheitsschrank (BSC).
      2. Innerhalb der BSC, verwenden Sie eine 1 mL Spritze mit einer 22G Nadel befestigt um 0,1 mL Gefrierschrank bestand auf eine angeschnittene Ärmel und gekräuselte anaerobe Kultur-Röhrchen mit 5 mL des Kulturmediums mit keine Dextrose in Schritt 1.1.2 vorbereitet zu übertragen. Entsorgen Sie die Restposten Gefrierschrank in der entsprechenden biologischen Abfallbehälter, als wieder einfrieren könnte die Zellen schockieren.
      3. Brüten die Starterkultur in einem Shaker/Inkubator bei 30 ° C bei 150 Umdrehungen pro Minute (u/min) und achten Sie darauf, eine Extinktion bei 600 nm (OD 600) lesen, wenn Sie bereit sind für den Einsatz zu nehmen. Notieren Sie die Zeit des Wachstums und der OD 600 derart, dass es gleichzeitig für den späteren Gebrauch, getan werden kann, so, dass die Ergebnisse reproduzierbar sind. Als Beispiel dieser Starterkultur für 15 h wachsen durfte und verwendet bei einer OD 600 von ca. 1,0.
    2. Impfen Wachstumsmedium
      1. die drei Serum-Flaschen im Schritt vorbereitet, 1.1.1.2 und die Starterkultur in 1.3.1.3. zubereitet, und bringen sowohl für die BSC.
      2. Innerhalb der BSC mit einer sterilen 1 mL Spritze mit einer 22G Nadel befestigt, Transfer 0,1 mL der Lösung aus der Starterkultur zu jedem der Serum-Flaschen bzw..
      3. Sterilisation oben auf die Serum-Flaschen mit 70 % Ethanol und Abdeckung mit sterilisierten Aluminiumfolie, entsprechend zu kennzeichnen, und übertragen auf einem Orbitalschüttler im Inkubator. Die Orbitalschüttler bis 150 u/min und den Inkubator auf 30 gesetzt ° C. Incubate bis der erste OD 600 Datenpunkt erfolgt im Schritt 1.3.3.
    3. Erlangung OD 600 Datenpunkten
      1. bereiten eine leere durch Hinterlegung 100 µL Filter sterilisiert destilliertem deionisiertes (DI) Wasser in einen sterilen Küvette. Wickeln Sie Kunststoff Paraffin Film um den oberen Rand der Küvette, so dass das Wasser nicht verunreinigt wird. Bei Raumtemperatur lagern. Verwendung dieser leer mit der UV/Vis-Spektralphotometer vor der Einnahme alle Datenpunkte für die Wachstumskurve durch Einfügen der Küvette und drücken " leer ".
        Hinweis: Alle 48 h eine neue leere sollten bereit sein, falsche Lesung zu vermeiden wie regelmäßig ersetzen eine leere ratsam ist.
      2. Für jeden Datenpunkt OD 600, entfernen die Serum-Flaschen im Schritt 1.3.2.3. aus dem Inkubator und Transfer zu einem sterilisierten BSC vorbereitet. Nehmen Sie 0,1 mL des Mediums beimpften von jedem Serum Flasche und Kaution in drei separat beschriftet sterile Küvetten.
      3. Nach Ausblendung, legen Sie die Küvette mit der Kultur in der ultravioletten sichtbar (UV/Vis) Spektralphotometer OD 600 eine zu einem Zeitpunkt zu lesen und erfassen alle drei Lesungen für diesen Zeitpunkt.
        Hinweis: Für S. Oneidensis MR-1, waren Datenpunkte zu 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 und 105 h nach der Inokulation eingenommen. Das Wachstum ist abgeschlossen, wenn die Bakterien hat der Tod abgeschlossen. Diese Punkte sollten entsprechend angepasst werden, wenn es Mangel an Wissen auf bestimmten Wachstumszeit und Tendenz der Bakterien, die in diesem Protokoll verwendeten. Besteht Unsicherheit über die Wachstumstendenz, sollte Daten häufiger, z. B. alle drei Stunden für die ersten 12 h, alle 6 Std. für nachfolgende 36 h, 12 h Abständen für die folgenden 100 h und 24 h Abständen für die endgültige 124 h.
      4. Mit OD 600 Datenpunkte als y-Achse und die Zeit als die x-Achse graph eine Kurve mit dem Durchschnitt der drei Punkte mit Standardabweichung Fehlerindikatoren für jeden Zeitpunkt mit einem Grafik-Software übernommen. Die Wachstumskurve S. Oneidensis MR-1 wird in Abbildung 1 B im Abschnitt repräsentative Ergebnisse.
      5. Verwendung des Diagramms vorbereitet im Schritt 1.3.3.4, den Zeitrahmen des Abschnitts Log-Phase die Wachstumskurve zu identifizieren. Für Shewanella ist dies zwischen 12 und 33 h des Wachstums; Daher kann gefolgert werden, dass bei 24 h von Wachstum, Shewanella werden innerhalb der Log-Phase des Wachstums, vorausgesetzt, dass die Bakterien kultiviert werden werden, mit den gleichen Medien und Behandlung vor der Verwendung, der für die Wachstumskurve verwendet wurde.

2. Kultivierung von Bakterien

  1. ersten Tag: impfen die Agarplatte
    Hinweis: in diesem Abschnitt des Verfahrens mit einer Agarose-Pla verwendet wurdeTe, eine Kolonie-bildende Einheit (KBE) in Log-Phase, statt der flüssigen Starterkultur verwendet für die Wachstumskurve zu nehmen. Dies könnte davon ausgegangen werden, um die gleichen Wachstumsbedingungen zu reproduzieren, dass TSA ohne Traubenzucker verwendet wurde und anschließend ins " Nanodrähte " Medium in das Wachstum Kurve Verfahren und die TSA hat die gleichen Inhaltsstoffe, die TSB umfassen.
    1. S. Oneidensis MR-1 GFPbacteria Lager von-80 ° C Gefrierschrank und Ort in einem Eiskübel zu entfernen, setzen Sie diese Eimer innerhalb des sterilisierten BSC.
    2. Innerhalb der BSC verwenden eine sterile 1 µL Impfschlinge kratzen die Oberfläche des gefrorenen Bakterien-Lager und die Schleife zu T-Streifen die Oberfläche eines Agarose-Platte.
    3. Nach der Versiegelung der Seiten der Platte mit Kunststoff Paraffin-Film, die Platte umdrehen und speichern in einem 30 ° C Inkubator für 24 h, bis einzelne Kolonien erscheinen.
  2. Tag 2: impfen die Serum-Flasche
    1. Entfernen Sie die Platte aus dem Inkubator und öffnen in der BSC.
    2. Innerhalb der BSC, reinigen Sie die Oberfläche des Gummistopfens auf einer vorbereiteten Serum-Flasche aus Schritt 1.1.1 mit 70 % Ethanol in Wasser DI.
    3. Wählen Sie einen einzelnen KBE aus der Agarplatte und mit einer sterilen Spritze mit einer angehängten 22 gauge Nadel, genügend Wachstumsmedien um die Kolonie von der Platte zu vertreiben, ohne Sie zu berühren alle benachbarten Kolonien einzahlen und mischen die Kolonie mit dem Medium mit der Spitze des die Nadel.
      Anmerkung: A einzeln Kolonie gewählt werden, die weit genug weg von anderen Bakterien auf den Teller, so dass Medium drauf ohne irgendwelche anderen Kolonien hinterlegt werden kann.
    4. Mit der gleichen Spritze die Flüssigkeit von der Oberfläche der Platte zu extrahieren.
    5. Nach dem Abstich, Luftblasen in der Spritze, Spritzen Sie die Flüssigkeit in der Serum-Flasche, und legen Sie auf einem Orbitalschüttler innerhalb von 30 ° C einstellen bei 150 u/min für 24 h
      Hinweis: Tippen auf die Luftblasen aus der Spritze ist wichtig zur Vermeidung von Einführung mehr Sauerstoff in die Flasche Serum wie experimentelle Bedingungen ändern und Kohärenz zwischen den Zeiten für Bakterien verringern kann mehr Sauerstoff in die Flasche einführen.
  3. Tag 2: Sterilisation von SALVI Microchannel
    Hinweis: zur Förderung der Sterilität der das Schlauchsystem Schritte, die erfordern, lösen die Spritze aus dem Schlauch und Ersatz mit einer neuen Spritze innerhalb der BSC getan werden. Hierzu lösen Sie einfach die Spritze aus der Spritzenpumpe durch Abschrauben des Halters Metall Spritze, und bringen Sie die Spritze mit Schlauch angebracht zu einem sterilen BSC. Wenn Schlauchsystem wird erwähnt in den Verfahren, dies bezieht sich auf die Spritze mit der Flüssigkeitsbehälter, verbunden mit einem Injektor Polyetheretherketon (PEEK), PTFE-Schläuche, befestigt die Tropfkammer, hat einen PEEK-Injektor passend angebracht die SALVI Zulauf Schlauch, sowie die Outlet-Container, dem SALVI Outlet Schläuche zu dicht ist.
    1. Verwenden ein Neugerät SALVI und einseitig von einem PTFE-Schläuche eine PEEK-Montage und Injektor beimessen.
      Hinweis: SALVI Geräte werden frisch für jedes Experiment Folgendes zubereitet Gerät Herstellung frühere Studien und Patente detailliert. 5 , 6 , 8 , 15
    2. eine Spritze 2 mL 70 % igem Ethanol berücksichtigen und verbinden mit der PEEK-Montage auf die SALVI. Nach dem Anschluss der Spritze um eine Spritzenpumpe und Befestigung der Steckdose die SALVI an einer Abfallflasche, erlauben die Ethanol DI-Wasser-Lösung durch die SALVI mit 20 µL/min für 1,5 h laufen
    3. Nehmen 4 mL sterilisiert DI Wasser in eine Spritze und schließen Sie an den Eingang des gleichen SALVI. Nachdem Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe verbinden, lassen Sie das Wasser durch die SALVI mit 20 μl/min für mindestens 3 h laufen
    4. In ein BSC, die Folie Paket vorbereitet im Schritt 1.2.5 öffnen und schließen eine sterile PEEK-Injektion passend zum Ende der 5 mL-Spritze und sterile PEEK Armaturen bis zum Ende des TFE-Schläuche. Nehmen ~ 3 mL steriles Medium in eine Spritze und heften sich an die TFE-Röhre. Die 5 mL Tropfkammer invertieren und mit einer sterilen Spritze, das Wachstumsmedium injizieren in die Tropfkammer, bis zu einem Gesamtvolumen von 1 mL.
    5. Schließen Sie das Ende der Tropfkammer 5 mL Spritze mit dem Einlass der SALVI.
    6. 10 mL Wachstumsmedium in eine sterile Spritze und anschließen mit dem Einlass der Tropf Schläuche. Ermöglichen Sie nachdem Sie die Spritze mit einer Spritzenpumpe verbinden Mittel-und führen Sie durch die SALVI mit 20 µL/min für 12 h (oder über Nacht). Verwenden Sie Klebeband um diese Teile zu sichern. Decken Sie die Steckdose Flasche mit Folie oder Kunststoff Paraffin Film um die Wahrscheinlichkeit von Staubpartikeln und Organismen, die darin enthaltenen Medium verunreinigen zu minimieren. In Abbildung 1 A finden Sie eine detaillierte Darstellung wie diese Einrichtung aussehen soll.
      1. Erlauben die Tropf-Schläuche werden vertikal, was bedeutet, dass die Spritzenpumpe auf einer erhöhten Fläche mit Tropf, Schläuche gesicherten mit Band und mit der SALVI gesichert auf einer ebenen Fläche unten platziert werden soll.
      2. Medium durchlaufen die SALVI für 12 h um sicherzustellen, dass alle Spuren von Ethanol entfernt wurden aus dem Microchannel und Schläuche von den SALVI vor mit Bakterien impfen.
      3. Für zusätzlichen Schutz, halten die SALVI Microchannel Kammer innerhalb einer sterilisierten Petrischale mit den Seiten geschnitten, um den Einlass und Auslass-Schlauch. Darüber hinaus halten Sie Band immer am Fenster zum Schutz der Sünde Membran und Kanal vor bildgebende Analyse.
  4. Tag 3: Inokulation von SALVI Microchannel
    1. die gesamte Schlauchsystem (Spritze angeschlossen, um die Kammer SALVI, verbunden mit der Abfallflasche verbunden Tropfen) aus der Spritzenpumpe zu entfernen und bringen es auf eine sterilisierte BSC. Darüber hinaus entfernen Sie das Serum-Fläschchen aus Schritt 2.2.5 aus dem Inkubator und bringen es auf den BSC.
    2. Reinigen Sie die Oberfläche des Serum-Flaschenverschluss mit 70 % Ethanol um jegliche Kontamination zu verhindern, und verwenden Sie dann eine sterile Spritze mit einer angehängten sterile 22G Nadel 4 mL Bakterien aus der Flasche zu extrahieren.
    3. SALVI aus der 5 mL-Kammer der Tropf Schläuche zu trennen und verbinden Sie die Spritze mit beimpften Medium direkt mit dem Einlass der SALVI. Lassen Sie den Tropf-Schlauch in eine sterile Aluminium-Folie-Paket oder innerhalb der BSC.
    4. Die Spritzenpumpe mit 20 µL/min für 3 h den Kanal von SALVI, impfen, um mehrere Volumenänderungen der Flüssigkeit enthaltenen SALVI ermöglichen laufen die Spritze mit SALVI und Auslass Flasche beimessen.
    5. Nach der Inokulation, trennen Sie die Spritze mit SALVI aus der Spritzenpumpe und bringen in der BSC. Nach dem Anbringen des Einlass der SALVI zurück, die 5 mL Tropfkammer aus Schritt 2.4.3, eine sterile Spritze 20 mL Wachstumsmedium berücksichtigen und den Einlass der Tropf Schläuche beimessen.
    6. Bringen den Schlauch an die SALVI von der BSC zur Spritzenpumpe befestigt und ermöglichen das Medium durch den Schlauch mit einer Rate von 2 µL/min für sechs bis zehn Tage oder bis Fluoreszenz-Bildgebung (in Schritt 3 beschrieben) für günstige sichtbar Biofilm Wachstum zeigt ToF-SIMS-Analyse. Füllen Sie frisches Medium, wie es abläuft innerhalb der BSC eine neue sterile Spritze mit 10mL Wachstumsmedium füllen und Zuweisen der SALVI, nachdem das vorherige Wachstumsmedium abgelaufen ist.
      Hinweis: Nach Beginn der Impfung mit 2 µL/min, die Durchflussmenge sollte nie erhöht werden oder verringert, wie das Ändern des Durchfluss würde erstellen Schubspannung innerhalb des Kanals und den Biofilm zu lösen. Es ist wichtig, dass diese Durchflussrate nie geändert werden sollte; zur Vorbereitung dieser, ~ 24 h vor SIMS beobachten Sie den Schlauch eng, um sicherzustellen, gibt es keine Bläschen, so dass es keine Notwendigkeit, weitere Mittel zu drücken mit einer schnelleren Rate in den Schlauch.
      1. Vermeiden Sie Luftblasen in der Microchannel wie sie den Biofilm aus dem Kanal schieben können. Es ist wichtig, Blasen in der Unterseite der 5 mL Tropf Schläuche vorsichtig zu sein, wo es auf das SALVI Rohr verbindet. Frisches Medium kann in das Ende des Injektors PEEK um sicherzustellen, dass keine Luft in die SALVI gezwungen werden injiziert werden.

3. Optische Bildgebung des Biofilms innerhalb der SALVI Microchannel

  1. Fluoreszenz Mikroskopie Imaging
    Hinweis: Shewanella verwendet als Modellorganismus innerhalb dieses Protokolls auszudrücken, GFP mutiert ist, als solche ist nicht erforderlich Färbung. Wenn die Bakterien Färbung benötigen, sollte dies immer an den gleichen Durchfluss (z. B. 2 µL/min), Biofilm ablösen zu vermeiden erfolgen. Darüber hinaus Wenn Zellen ohne Nährstoffverfügbarkeit gehen, werden sie sich lösen. Daher, wenn zusätzliche Färbung erforderlich ist, sollte der Fleck das Wachstumsmedium anstatt Wasser injiziert werden vor der Auslieferung um die Zellen zu beflecken.
    1. Lösen die SALVI aus den Tropf, Schläuche im Inneren der BSC und Schrauben die PEEK-Armaturen um Finger-anziehen die PEEK-Union in der Nähe der SALVI.
    2. Mit Klebeband die Schläuche der SALVI Microchannel Kammer sicher auf einen Glasobjektträger derart, dass das Fenster ganz flach und nach nach oben. Entfernen Sie die Schutzfolie vom Fenster. Klemmen Sie die Folie auf die Bühne des Mikroskops durch den Objektträger zwischen Bühne Klemmen auf der Plattform platzieren.
    3. Niedriger die Bühne des Mikroskops so dass oben die SALVI positioniert ist nahe genug, um das Ende des 10 X-Objektiv, wo Anpassung des Fokus wird nicht dazu führen, dass das Objektiv, das Fenster zu berühren.
    4. Schalter auf die Hintergrundbeleuchtung und finden Sie den Kanal mit der 10-fach Mikroskopobjektiv durch Einstellung des Fokus. Sicherstellen Sie zu diesem Zeitpunkt, dass das Vorhandensein der bakteriellen Anlage zum Fenster SiN die SALVI im Vergleich zu Fenster einen Steuerkanal mit keine beimpften Bakterien hervorgeht. Zur genaueren Darstellung der Zellen, wechseln Sie zu den 20 X Objektiv. Im Vergleich zu einem leeren SALVI Kanal sollte das Vorhandensein von Bakterien an das Fenster angebracht eine starke grüne Fluoreszenz haben.
    5. Schalten Sie die Hintergrundbeleuchtung und der Mikroskop-Quecksilber-Quelle. Warten Sie 2-3 Minuten und wechseln Sie zu der FITC Filtersatz am Mikroskop zu Ansicht und Capture Bilder des Biofilms an das Fenster angebracht. Als ein Beispiel wie die gereifte Biofilm aussehen wird wenn Sie bereit sind, beziehen sich auf Abbildung 1 C.
    6. Turn off die Quecksilber-Quelle und SALVI aus der Folie lösen. Bei Bedarf legen auf 2 µL/min mittlere Strömung wieder, um mehr Wachstum vor imaging wieder zu ermöglichen, oder die SALVI Auffangeinrichtungen Verwendung für ToF-SIMS Analyse übertragen. Dies ist erforderlich, wenn Biofilm Dicke der Schluss gezogen wird, nicht dick genug sein, und mehr Zeit für Wachstum ist vor der ToF-SIMS Analyse erforderlich. Um Strom steht erneut zuordnen, finden Sie unter Schritt 2.3.6.
      Hinweis: Ob setzen Sie wieder unter Strom steht, Fluoreszenz-Bildgebung wieder vor der ToF-SIMS-Analyse durchgeführt werden soll.
      1. Geben den Biofilm Wachstumsmedium um es zu füttern, bis ToF-SIMS-Analyse durchgeführt werden kann. Obwohl dies nicht empfohlen, wenn nötig, die geschlossene SALVI kann über Nacht innerhalb von 4 ° C gelagert werden, darf aber auf Raumtemperatur erwärmen vor dem Einlegen in die Vakuumkammer der ToF-SIMS. Jedoch analysieren den Biofilm unmittelbar nach losgelöst von Medium-Fluss, Biofilm ablösen zu reduzieren.

4. ToF-SIMS Data Acquisition

Hinweis: Dieser Abschnitt dient als Überblick und wird ausführlicher in unseren früheren Protokoll beschreibt adsorbierten Protein Molekül SIMS Flüssigkeitsanalyse diskutiert. 12

  1. Installieren SALVI in die ToF-SIMS Klemmbalken Kammer
    Hinweis: sollten Handschuhe getragen werden, in allen Zeiten als SALVI Handhabung und installieren Sie es auf die ToF-SIMS zur Vermeidung von möglichen Kontaminationen während Oberfläche Stadium Analyse.
    1. Mount SALVI auf die Bühne und mit mehreren Schrauben befestigen. Sicherstellen Sie, dass die Sünde Fenster flach durch Anpassung Schraube Dichtigkeit und einfügen Silizium-Wafer Stücke am unteren Rand der PDMS Microchannel Kammer. Entfernen Sie die Schutzfolie aus dem Fenster, dann laden Sie die Bühne in der ToF-SIMS Klemmbalken Kammer.
    2. Öffnen der ToF-SIMS Klemmbalken, halten die Bühne horizontal auf der Ladefläche und Klemmbalken Tür schließen. Die Vakuumpumpe zu initiieren und warten, um sicherzustellen, dass geeignete Vakuum erreicht ist.
    3. Die SALVI in die Hauptkammer zu bewegen, sobald das Vakuum bis 1 x 10 -7 Mbar stabilisiert wird.
  2. Tiefe Profilierung und sammeln Daten Punkte
    1. den Mikrofluidik-Kanal das optische Mikroskop ausgestattet in ToF-SIMS zu finden.
    2. Positive oder negative Auswahlmodus vor der Datenerfassung. Nutzung der 25 keV Bi 3 + beamen als der primäre Ionenstrahl in allen Messungen, und Flut Elektronenkanone verwenden, um die Aufladung bei allen Messungen Oberfläche neutralisieren.
    3. Scan der Bi-3 +-Strahl mit 150 ns Impuls Breite auf einer runden Fläche mit einem Durchmesser von ~ 2 µm mit 64 Pixel x 64 Pixel Auflösung. Nach dem Stanzen durch Fenster SiN 100 nm, weiterhin für weitere 150 scan s high-Intensity-Daten für die Bildgebung zu sammeln. Nach Punch through erheblich in die Tiefe Profilierung der Region die Grafen. Nach Stabilisierung, dies kann bezeichnet werden als die Region von hoher Intensität.
    4. Reduzieren die Impulsbreite bis 50 ns für die Datenerfassung, Spektren mit besseren Massenauflösung zu erwerben. Diese Akquisition für über 200 weiter s.
    5. Wiederholen Sie diese Schritte für das Sammeln von mindestens drei Positive und drei negative Datenpunkte.
      Hinweis: Achten Sie darauf, die Punch through Bereichen Raum so, dass die Sünde-Fenster nicht brechen wird und Leck in die Kammer des Vakuums aus Fenster Integrität gefährdet.

5. ToF-SIMS Datenanalyse

    1. Masse Kalibrierung mittels IonToF Software die Analysesoftware von ToF-SIMS (Messung Explorer) zu öffnen und klicken Sie dann auf die " Profile ", " Spektren " und " Bild " Tasten, bzw., um Prozess-Tiefenprofil, m/Z Spektrum und Bilddaten.
    2. Öffnen die Datendateien im gesamten ToF-SIMS Datenerfassung erhalten.
    3. Wählen Sie die Tiefe Profilerstellungsdaten von Interesse und rekonstruieren die Spektren entsprechend der zeitlichen Tiefe Profilserie.
    4. Presse " F3 " öffnen die " Masse Kalibrierung " Fenster. Wählen Sie Spitzen für die Kalibrierung anhand von chemischen Verbindungen, die voraussichtlich in der spezifischen Probe vorhanden sind.
  2. Peaks of Interesse Selection
    1. Peak Auswahl zur Probenanalyse notwendig ist, charakteristische Peaks der Probe nach Literatur oder anderen bisherigen Erkenntnissen, festzustellen, wenn überhaupt. Vergleichen Sie die Intensität der Gipfel des Interesses an den m/Z-Spektren. Bei Bedarf neue Spitzen hinzufügen oder Löschen von Störungen Gipfeln in der Spitze Liste.
    2. Klick auf einen Höhepunkt finden die roten Linien am linken unteren Fenster. Verschieben Sie die roten Linien zu umschließen die ganze Spitze.
    3. Wählen Sie ein Peak passend die chemische Formel im wichtigsten Spektrumfenster, und dann klicken Sie auf die " Höhepunkt hinzufügen " Taste über dem Fenster. < /Li >
  3. Masse kalibriert Daten exportieren
    1. Export eine Peak-Liste, in der " Peak Liste " Menü, wählen Sie " sparen … " der Peak-Liste in der " Itmil " Format.
    2. Ein Tiefenprofil, Export in das " Profil " Fenster, klicken Sie auf die " Datei " Menü, wählen Sie dann " exportieren ", und wählen Sie dann " speichern als " eine " .txt " Datei.
    3. Eine m/Z-Spektrum-Datei exportieren in die " Spektren " Fenster, klicken Sie auf die " Datei " Menü, wählen Sie dann " exportieren ", und wählen Sie dann " speichern als " eine " .txt " Datei.
    4. Export eine Image-Datei in das " Bild " Fenster "" Bildschirm drucken und speichern Sie als Image-Datei.

6. ToF-SIMS Daten Plotten und Präsentation

  1. ein Grafik-Tool verwenden, um die Daten zu importieren.
  2. Machen ein Grundstück mit m/Z als die x-Achse und Peak Intensität als y-Achse das rekonstruierte Spektrum zeigen. Ein Beispiel ist dargestellt in Abbildung 2 A.
  3. Rekonstruiert kombinieren zweidimensionale (2D) Bilder von verschiedenen m/Z und bilden eine Matrix, entweder positiv oder Negativ-Ionen-Zuordnung zu zeigen. Ein Beispiel ist dargestellt in Abbildung 2 B.

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Representative Results

Diese repräsentative Ergebnisse dienen, wie das chemische Profil des angehängten Biofilms kann erkannt und interpretiert, zu zeigen, wie durch ToF-SIMS erhalten. Nach dem Plotten Massenspektren von ToF-SIMS Datenerfassung, kurz im Abschnitt "Vorgehensweise" hervorgehoben sollte Peak Identifikation durchgeführt werden, um Identitäten zu jeder jeweiligen m/Z-Wert zuweisen. Dies kann erfolgen durch umfangreiche Literaturrecherche auf Massenspektrometrie auf Bakterien und bestimmte chemische Fragmente, die innerhalb der Bakterien untersucht, wie verschiedene Wasser-Cluster, Fettsäuren und Proteinfragmente vorhanden sein dürften. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 diese repräsentative Ergebnisse zeigen nur die negativen Massenspektren von S. Oneidensis MR-1 Biofilm und eine Wasserprobe DI erhalten. Interpretation der positiven Spektren folgen ein ähnliches Verfahren.

Abbildung 1 A zeigt die schematische Aufbau nach diesem Protokoll beim Anbau von Biofilm in den SALVI Microchannel. Auf der linken oberen ist die Spritze eine Spritzenpumpe beigemessen, was mit einer konstanten Rate während der CF-Schlauchsystem und innerhalb der Microchannel hält Mittel fließen. Die Spritzenpumpe wird über die Tropfkammer platziert, die nach hinten Verschmutzung der Mediumspeicher verhindert, bewegliche Organismen aus Up-Stream schwimmen zu verhindern. Das Medium fließt aus dem Tropf-Kammer-Behälter direkt in die CF-Schläuche von SALVI, die durch die Microchannel und durch den Auslass-Schlauch an eine versiegelte Outlet-Flasche weitergibt. Die gestrichelten Linien zeigen Sie auf ein Bild von einem gereiften S. Oneidensis vom Fenster SiN MR-1 GLP-Zellen durch Fluoreszenz-Mikroskopie, Schritt 3.1 detailliert erfasst. Abbildung 1 B zeigt ein Beispiel einer Wachstumskurve, die mit Hilfe der Modellorganismus für dieses Protokoll, S. Oneidensis MR-1 hergestellt. Aus der Wachstumsphasen in diesem Diagramm kann geschlossen werden, dass die Log-Phase des Wachstums zwischen 15-32 h in dieser spezifischen Anbaubedingungen auftritt. Zusatzinformationen aus diesem Diagramm zeigt, dass 0-15 h der Lag-Phase des Wachstums ist und 33-105 h die stationäre Phase des Wachstums stellt. Abbildung 1 C ist ein Bild mit Fluoreszenz-Mikroskopie zeigt ein Beispiel für eine ausgereifte Biofilm erworben.

Abbildung 2 A zeigt die negative Massenspektren von einer hydratisierten S. Oneidensis MR-1 Biofilm innerhalb der mikrofluidischen Kanal, wie durch in Situ Flüssigkeit ToF-SIMS erhalten. Diese Grafik zeigt ein Beispiel für die ausgewählten Massenbereich (m/Z 100-350) Vergleich zwischen der Biofilm von S.oneidensis MR-1 und DI, letztere als eine Systemsteuerung erhielt. Abbildung 2 B zeigt einen Vergleich von 2D Bildern der Gipfel des Interesses an den MR-1 Biofilm und VE-Wasser von ToF-SIMS erhalten. Sobald interessante m/Z-Werte ermittelt werden kann aus dem Studium der Massenspektren, mögliche Gipfel Identifizierung von m/Z-Werte sind richtig zugeschrieben chemische Fragmente, wie von der Umfrage IonToF SIMS, Software, Bibliothek und Literatur unterstützt. Gipfel des Interesses an Abbildung 2A gehören Wasser-Cluster (m/Z 107 (H2O)5OH–, 125 (H2O)6OH–, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 O)8OH–, 179 (H2O)9OH–, 197 (H2O)10OH–, 215 (H2O)11OH–, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH–, 269 (H2O)14OH–, 287 (H2O)15OH–, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH–))9, als gekennzeichnet durch rote Linien über jeweiligen Gipfeln, Quorum sensing bezogene Verbindungen Biomarker (z.B. m/Z 175 C10H9NO2–), EPS Nebenprodukte (m/Z 123 C2H4PO4-, 159 P 2 O8H–, 216 Cr2O7–, 285 Octadecanoethiols, 325 polaren Verbindungen, C12 polaren Verbindungen)15,16,18und Fettsäure-Kette Fragmente (d.h. m/Z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, 255 C16:0 Fettsäure, 279 Linolsäure, C18H31O2–, 325 C21H40O2 -, Oberfläche 341 Lipide, 18-MEA durch Thioester-Bindung, Stearinsäure C18H35O2–, Monoacylglyceryls von Palmitinsäure C19H17O6 -Ionen gebunden -). 16 , 19

Da der Biofilm hydratisiert ist, ist es nicht verwunderlich, dass einige Gipfel in der Biofilm-Probe gesehen ähnlich denen in VE-Wasser sind. Diese Wasser-Cluster-Spitzen zeichnen sich durch eine rote Linie über jeden Gipfel in Abbildung 2A, einschließlich m/Z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, und 341 und entsprechende (H2O)5OH– (H2O) 6 O– (H2O)7OH– (H2O)8OH– (H2O)9OH– (H2O)10OH– (H2 O)11OH– (H2O)12OH– (H2O)13OH– (H2O)14OH– (H2O)15OH- (H2O)17OH– (H2O)19OH-, beziehungsweise. 9 wie es Prävalenz von vielen charakteristischen Wassercluster in diesem Massenspektrum, diese Ergebnisse liefert eine starke Hinweise auf die chemische Wasser-Cluster-Umgebung in einen hydratisierten Biofilm vorhanden. Darüber hinaus bezogene nicht-Wasser-Cluster Gipfel beobachtet in beiden Spektren häufig als Einmischung Peaks, in der Regel aus PDMS, eine Komponente des Kanals mikrofluidischen zugeschrieben werden können. Zum Beispiel ist eine gemeinsame Bekannte Störungen Peak von PDMS m/Z 137 im Negativ-Ionen-Modus.

Beim Vergleich des Biofilms SIMS Masse Spektren der VE-Wasser, wie in Abbildung 2Agezeigt, einige Gipfel sind nicht in der DI-Wasser, doch sie scheinen im Biofilm. Zum Beispiel der Peak bei m/Z 255 ([CH3(CH2)14COO]-, Palmitinsäure) mit hoher Intensität in der Biofilm-Probe, aber überhaupt nicht in der Wasserprobe DI vorhanden ist. Dies würde darauf hindeuten, dass die Signale cOME aus in den Biofilm, höchstwahrscheinlich der Biofilm und/oder ihre selbst erzeugten EPS. Viele interessante Gipfel wurden in Abbildung 2Aidentifiziert. Z. B. EPS im Zusammenhang mit Gipfeln gehören m/Z 123-, festgestellt, dass C2H4PO4-, 159 (P2O8H–), 216 (Cr2O7–), 285 (Octadecanoethiols) und 325 (polaren Verbindungen, C 12 -Polar-Verbindungen). 17 , 18 , 20 Gipfeln verbunden mit Fettsäuren erwiesen sich 127 ([C2H3(CH2)3COO]–), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, Palmitinsäure), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, Linolsäure), 317 (C21H33O2–), 325 (C21H40O2–) und 341 (Oberfläche Lipide, 18-MEA gebunden durch Thioester Gestänge, Stearinsäure C18H35O2-, Ionen des Monoacylglyceryls von Palmitinsäure C19H17O6–). 16 , 19 schließlich im Zusammenhang ein Chinolon Signal Quorum sensing Signal Peak C10H9NO2– wurde bei m/Z 175 beobachtet.

Abbildung 2 B zeigt 2D Bilder der Verteilung der vier verschiedene interessante Ionen zwischen S. Oneidensis MR-1 Biofilm (obere Reihe) und VE-Wasser (untere Zeile). Die m/Z-Wert 107 ((H2O)5OH–) zeigt einen Wasser-Cluster erhebliche Intensität innerhalb der Proben, die m/Z-Wert 175 (C10H9NO2–) zeigt ein Quorum-sensing-Verwandte Signal, m/Z 255 ist eine Fettsäure ([CH3(CH2)14COO]-, Palmitinsäure), und m/Z 341 (C21H41O2–) kann sowohl Lipid-Fragmente dar, die Wasser-Cluster durch die Massengenauigkeit 1 amu. 9 hellere Regionen der 2D Bilder zeigen eine höhere Anzahl von der molekularen Ion im Bild vorhanden. Wie erwartet, zusammengesetzte Signale für die QS und Lipide waren weitaus größere Menge innerhalb der Biofilm-Probe. Während das Signal für die Wasser-Cluster (m/Z 107) im gesamten Biofilm Beispiel stärker war, war es auch in der DI-Wasser-Probe, wie erwartet. Zu guter Letzt das Signal bei m/Z 341 erwies sich homogen in der Biofilm-Probe, aber sehr schwach in der DI-Wasser-Probe. Während m/Z 341 einen Wasser-Cluster-Höhepunkt war, war es auch Vertreter von mehreren verschiedenen Fettsäuren und Oberfläche Lipide. 16 die stärkere Präsenz innerhalb der Biofilm-Probe nach Normalisierung der Daten legt nahe, dass das Vorhandensein von Lipid Fragmente bei weitem das Vorhandensein von Wasser-Cluster übertrifft.

Figure 1
Abbildung 1 : Experimentelle Schaltplan. (A) zeigt die experimentelle schematische Darstellung der Biofilm-Setup als es innerhalb des Labors wird angezeigt. Beginnend oben links, Medium fließt aus der Spritze (1), ist die Spritzenpumpe (2), Steuern die Geschwindigkeit, mit welcher Flüssigkeit durchläuft beigefügt. Pfeile zeigen die Flussrichtung im gesamten System. Die Spritze (1) ist über eine PEEK-Injektor passend (3) zu den TFE-Schlauch (4) verbunden. Medium fließt durch eine Tropfkammer (5) zur Vermeidung von Kontaminationen und schließlich bewegt sich durch die SALVI (6) in den versiegelten Outlet-Container (7). Die Spritzenpumpe befindet sich auf einer erhöhten Fläche (9), daß die Tropfkammer (5) senkrecht zur Fläche (8) werden kann, die an die SALVI (6) gestellt ist. (B) Wachstum Kurve für Shewanella Oneidensis MR-1 in "Nanodrähte" Medium. Zeit 0-15 h Verzögerung Phase darstellt, Zeit 15-33 h steht für Log-Phase, Zeit 33-105 h stellt stationäre Phase und die Uhrzeit 105 h oder mehr Tod Phase darstellt. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung. (C) A Bild des gereiften Biofilm mit Fluoreszenz-Mikroskopie erworben. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2 : Vergleiche von ToF-SIMS negative Spektren der hydratisierten Shewanella Oneidensis Biofilm und MR-1 Medium in die SALVI Microchannel. (A) m/Z SIMS Massenspektren des Biofilms Shewanella Oneidensis MR-1 Mittel-und VE-Wasser. Letztere diente als Kontrolle. Rote Linien zeigen die Standorte der charakteristischen Wasser-Cluster-Gipfel. (B) 2D-Bild Vergleich der Gipfel des Interesses zwischen den Biofilm und VE-Wasser. Von links nach rechts, Anzeige von Bildern einen Wasser-Cluster (m/Z 107 (H2O)5OH–), ein Quorum sensing/Hormon-Signal (m/Z 175, C10H9NO2–), einer Fettsäure (m/Z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, Palmitinsäure), und der Oberfläche Lipide/EPS-Fragmente (m/Z 341, 18-MEA, C21H41O2–). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Nach dem impfen bei Log-Phase, ist es wichtig, die Anzahl der Tage und die Temperatur bei dem der Biofilm wachsen sollte, bevor es gesund und dick genug für die Bildgebung, wie unter Punkt 3.1 beschrieben testen. Dieses Verfahren umfasst speziell Kultivierung einer S. Oneidensis MR1 Biofilm bei Raumtemperatur; jedoch können unterschiedliche Raumtemperaturen die Wachstumsrate beeinflussen. Daher ist es wichtig um zu verstehen, ob der Biofilm bereit, bevor Sie fortfahren, ToF-SIMS Analyse ist verwenden optische Bildgebung. Ebenso erfordern verschiedene Bakterienstämme verschiedenen Wachstumsbedingungen und Länge eine wünschenswerteste Dicke für die Analyse zu erreichen. Während die Wachstumskurve in Abbildung 1 b Log-Phase 200 der Bakterien zeigt zu 12-32 h, und dieses, um 24 Uhr während des Verfahrens verwendet wurde, ist es wichtig zu beachten, dass diesmal als Log-Phase für andere Stämme von Bakterien verwendet werden kann, ohne dass die Wachstumskurve unabhängig voneinander. Während die Log-Phase zwischen 12 und 33 h des Wachstums für S. Oneidensis war, wurde 24 h gewählt, da es im Bereich des Wachstums wo Sauerstoff fing war an, die Wachstumsrate des Organismus gegen Ende der Log-Phase zu begrenzen. Experimente zeigten, dass dies die Zeit Zellen begann Nanodrähte, so grundiert, Form erfolgreich Biofilme, die in sauerstoffarmen Umgebungen überleben könnte zu produzieren. 3 , 13 folglich die Zeit gewählt, um die Bakterien während der Log-Phase verwenden sollten beeinflusst werden durch Forschung Erfahrungen und Kenntnisse aus der Literatur auf experimentelle Studie der untersuchten Bakterien gewonnen. Darüber hinaus muss eine separate Wachstumskurve hergestellt werden, die Log-Phase für alle verschiedenen Bakterienstämme zu verstehen, die für Biofilm Wachstum mit diesem Ansatz verwendet wird. Die Wachstumsrate von 2 µL/min wurde so berechnet, als um nicht zu überschreiten die maximale Wachstumsrate von S. Oneidensis MR-1 und die Gesamtzeit wurde gewählt, um eine Reife Biofilm zu erhalten, der nicht bewachsen war und neigen zu trennen. Diese Preise können entsprechend angepasst werden, Kenntnis der verschiedenen Bakterien mit diesem Setup verwendet werden.

Einige Einschränkungen bei der Verwendung von SALVI für Biofilm Wachstum gehören Biofouling in den Kanal sowie die Wahrscheinlichkeit von Bakterien an die flache Wand des Kanals zu befestigen. Trotz des Wachstums mit einer konstanten Rate, empfohlen, 2 µL/min innerhalb dieses Protokolls werden kann Biofouling weiterhin auftreten, wenn der Biofilm erlaubt ist zu lang wachsen. In einem solchen Fall und ohne Vorwarnung kann der Biofilm lösen aus dem Fenster und die Steckdose Eindämmung der SALVI herausgehen. Biofouling kann auch auftreten, indem Sie einfach mechanische Kraft (d.h., Bewegung) SALVI, die nicht vermieden werden kann. Jedoch kann dies in Schach gehalten werden, indem Sie die Befestigung des Biofilms an der Sünde-Fenster vor der ToF-SIMS Analyse unter einem Lichtmikroskop anzeigen. Eine andere Einschränkung enthält die Glätte der PDMS-Microchannel macht es schwierig für manche Bakterien zu befestigen. Jedoch kann dies bei der Gestaltung der SALVI, durch die Schaffung von gerippter Kanten an den Kanal unterzubringen, wenn Anhaftung der Bakterien ein Problem geändert werden. Zu guter Letzt können Zellenzahlen anstelle OD600 Lesungen für Wachstum Kurve Bestimmung erfolgen. Zum Beispiel haben Studien direkte und konsistente Korrelation der Zellzahlen, OD600 Lesungen gezeigt. 21 darum, OD600 bei der Bewertung von Biofilm Wachstum ausreichend gilt.

Einschränkungen für diese Technik sind nur wenige, da die SALVI im Wesentlichen als einer Kulturschale, hat viel Vielseitigkeit für den Einsatz in vielen Anwendungen dient, wie z. B. anaerob in einem Handschuhfach oder innerhalb jeder temperaturgeführte Klimakammer. Einige geringfügigen Einschränkungen beinhalten unkontrollierbare Raumbedingungen wie Luftfeuchtigkeit, Temperatur, Platzierung in der Nähe von Sonnenlicht, die sind noch möglich, für jede spezifische Bakterien optimale Wachstumsbedingungen untergebracht werden. Darüber hinaus können einige dieser technischen Herausforderungen mit einem Inkubator mit Temperatur oder RH Vermittlung Features im Biofilm Setup überwunden werden.

SALVI ist eine vakuumtaugliche mikrofluidischen Schnittstelle. In dieser Arbeit wurde ein 200 x 300 µL mikrofluidischen Kanal zur Biofilme folgte mit optischen und flüssigen SIMS imaging Kultur. Flüssigkeiten sind eine technische Herausforderung für Studie mit Vakuumtechnik basierend, weil sie flüchtig und schwer in der flüssigen Phase im Vakuum zu halten sind. So wurden Vakuumtechnik wie ToF-SIMS traditionell eingeschränkt, nur trocken und kryogene Proben. 22 außerdem SALVI kann für diverse Bildgebung und Spektroskopie mit einer Vielzahl von Techniken, Mikroskopie und Spektroskopie verwendet werden. 4 , 9 unsere Gruppe hat gearbeitet, um ständig verschiedene SALVI Anwendungen in Situ Analyse von Flüssigkeiten und fest-flüssig-Schnittstellen erweitern. 15 , 23 , 24 unsere jüngste Versuch hat effektiv Bakterien Anhaftung an die Sünde Membran gezeigt. 9 nach der ursprünglichen Befestigung, kontinuierlicher Fluss des Mediums im Laufe der Zeit nachweislich einen Biofilm direkt am Fenster SIN die SALVI erfolgreich zu kultivieren. Während ToF-SIMS dient der primären Ionenstrahl Löcher von 2 µm im Durchmesser zu bombardieren. Diese Dimension ist ähnlich wie die Zelle Länge des Biofilms zum Fenster SiN, wodurch eine chemische Profil des Biofilms in seiner natürlich hydratisiert Mikroumgebung befestigt. Dies ist sehr wichtig wegen der Unterschied der chemischen Identität eines Biofilms, Vorhandensein von EPS und Wasser-Cluster-Umgebung, beim Vergleich von Biofilmen in seiner hydratisierten Zustand mit getrockneten Proben. 9 ohne den Einsatz von SALVI, konnten ToF-SIMS nur durchgeführt werden auf trockenen und kryogene Proben, chemische Zuordnung nicht das chemische Profil einer Probe in seinem Naturzustand hydratisiert zu erfassen.

Wie in Abbildung 1Adargestellt, ist es wichtig, die Spritzenpumpe über den Tropf-Schlauch zu halten um den Tropf Schlauch senkrecht zur SALVI Microchannel ermöglichen. Darüber hinaus werden Luftblasen wahrscheinlich weniger innerhalb der Schlauch des Gerätes eingeklemmt werden, wenn der Auslass PFTE Schlauch (in der Outlet-Flasche) niedriger als der Zulauf-Schlauch (verbunden mit der Tropfkammer) ist. Ein weiterer entscheidender Schritt der Kultivierung von Bakterien für SALVI Wachstum ist zunächst eine Wachstumskurve von bestimmten Bakterien-Stamm, der verwendet wird, wie in Schritt 1.3 beschrieben. Dies kann durch den Erwerb von Wachstumskurven mit optischen Dichtemessungen. Wachstumskurs, ist wie in Abbildung 1B, wichtig für das Verständnis des Zeitrahmens, den Bakterien in der Log-Phase des Wachstums, werden wenn davon auszugehen ist, dass die Bakterien gesündesten sind. Verwendung von Bakterien in dieser Phase des Wachstums erleichtert die Schaffung einer gesunden Biofilm Mikroumgebung und sorgt dafür, dass der Biofilm mit seiner erwarteten Rate wachsen. SALVI Microchannel wird bei Zimmertemperatur mit 70 % Ethanol und VE-Wasser, sterilisiert, da es für die Sterilisation vor dem Gebrauch mit ToF-SIMS autoklaviert werden kann. Dies ist aufgrund der Tatsache, dass Autoklavieren Fenster die SALVI beschädigen und Wasserdampf in den Kanal einführen kann. Nach einigen Tagen des Wachstums sollte der Mikrokanal mit Fluoreszenz-Mikroskopie bakterielle Anlage überprüfen überprüft werden. Ein Beispiel finden in Abbildung 1C, dieses Bild wurde aufgenommen, einen ausgereiften Biofilm zu zeigen. Aufgrund der Fließweg des Mediums die Bakterien günstiger beimisst und wächst an den Rändern der Microchannel, wie dieser Ort ist wo fließen und Scherkräfte Lowes sindt.

Zusammenfassend lässt sich sagen ist SALVI eine hervorragende Methode für die an Kultur und Studium Biofilme mit in Situ chemische Zuordnung, da es erlaubt für die Bereitstellung des lebende Biofilms in seinem natürlichen hydratisierten Zustand zum Vakuum-basierten imaging Massenspektrometer. Dieser einzigartige Ansatz kann mehr Informationen über einen Biofilm Wasser Cluster Mikroumgebung, sowie über ein tieferes Verständnis für seine EPS-Nebenprodukte zu gewinnen. Diese Informationen kann verwendet werden, um einen Biofilm biologischen Aktivitäten zu verstehen und in verschiedenen Anwendungen wie Biomedizin, biomedizinische Technik, Landwirtschaft und industrielle Forschung und Entwicklung genutzt werden.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für Unterstützung des Pacific Northwest National Laboratory (PNNL) Erde und biologischen Wissenschaften (EBD) Mission Samen Labor leitete Forschung und Entwicklung (LDRD) Fonds. Instrumental wurde durch W. R. Wiley Umwelt Molecular Sciences Laboratory (EMSL) allgemeine Benutzer Vorschlag zur Verfügung. EMSL ist eine nationale wissenschaftliche Benutzer Einrichtung Büro der biologischen und ökologischen Forschung (BER) auf PNNL gesponsert. Die Autoren danken Dr. Yuanzhao Ding zum Beweis das Manuskript zu lesen und nützliche Rückmeldungen. Battelle für DOE unter Vertrag DE AC05 76RL01830 PNNL gesteuert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

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References

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Chemie Ausgabe 126 SALVI ToF-SIMS Biofilm in Situ molekulare Bildgebung Mikrofluidik
<em>In Situ</em> Charakterisierung von <em>Shewanella Oneidensis</em> MR1 Biofilmen von SALVI und ToF-SIMS
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Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

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