In Situ Karakterisatie van Shewanella oneidensis MR1 Biofilms door SALVI en ToF-SIMS

Summary

Dit artikel presenteert een methode voor het kweken van een biofilm voor in situ secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie voor toewijzing van de chemische in haar gehydrateerd staat, ingeschakeld door een microfluidic-reactor, systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm-Interface. De heer Shewanella oneidensis -1 met groene fluorescentie eiwit werd gebruikt als een model.

Abstract

Bacteriële biofilms zijn oppervlak-geassocieerde gemeenschappen die enorm worden bestudeerd om te begrijpen hun zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) en hun rollen in milieu-microbiologie. Deze studie beschrijft een methode om te cultiveren van biofilm gehechtheid aan het systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI) en in situ chemische toewijzing van een levende biofilm bereiken door secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie (ToF-SIMS). Dit wordt gedaan via de kweken van bacteriën zowel buiten als binnen het SALVI kanaal met onze gespecialiseerde setup, alsmede via optische beeldvormingstechnieken te detecteren van de aanwezigheid van biofilm en de dikte vóór ToF-SIMS analyse. Onze resultaten tonen aan de karakteristieke pieken van de biofilm Shewanella in zijn natuurlijke staat gehydrateerd, markeren op de gelokaliseerde watermilieu cluster, evenals de EPS-fragmenten, die drastisch afwijken van de dezelfde biofilm gedehydrateerde staat. Deze resultaten tonen aan het vermogen van de doorbraak van SALVI waarmee met een vacuüm gebaseerde chemische imaging instrument voor in situ biofilm imaging.

Introduction

Bacteriële biofilms zijn oppervlak-geassocieerde gemeenschappen die geëvolueerd in de tijd als een verdediging voor bacteriën om te overleven, variërend van ongunstige fysieke en mechanische stimuli, waarin cellen kunnen hechten en overleven in veel mogelijk omgevingen. ^{1 , 2} Biofilms enorm worden onderzocht en hebben toepassingen in vele gebieden zoals biogeneeskunde, biomedische technologie, landbouw, en industrieel onderzoek en ontwikkeling. ^{1 , 2} inzicht in de chemische toewijzing van deze complexe microbiële gemeenschappen, met inbegrip van hun zelf geproduceerde extracellulaire polymere stoffen (EPS) en hun lokale water-clusteromgeving, is van essentieel belang bij het verkrijgen van een nauwkeurige en gedetailleerde voorstelling van hun biologische activiteit. ²

Biofilms bestaan en groeien binnen een sterk gehydrateerd staat. Dit vormt een grote uitdaging in het gebruik van vacuüm gebaseerde oppervlakteanalyse technieken zoals secundaire ion time-of-flight massaspectrometrie (ToF-SIMS) als gevolg van de moeilijkheid bij het bestuderen van vluchtige vloeistoffen in vacuüm. Dientengevolge, is oppervlakteanalyse vacuüm gebaseerde technieken vrijwel uitsluitend aan biofilm monstes alleen hun gedroogde toestand beperkt gebleven. Echter remt het bestuderen van een biofilm in zijn gedroogde staat het nauwkeurig onderzoek van de echte biologische communicatie. Het veroorzaakt vaak drastische wijzigingen in de EPS-integriteit en biofilm morfologie, die na het vergelijken van droge biofilm massa spectrale resultaten in situ vloeibare studies is aangetoond. ^{3 , 4} dit artikel biedt een oplossing voor het bestuderen van biofilms binnen hun natuurlijke gehydrateerd staat door het gebruik van ons systeem voor analyse op de vloeibare vacuüm Interface (SALVI),^5,6 een reactor van microfluidic die bevat vloeistof onder haar dunne siliciumnitride (SiN) membraan in een microchannel gemaakt van Polydimethylsiloxaan (PMDS), waardoor directe toegang tot de secundaire ion sonde lichtbundel terwijl nog het handhaven van de structurele integriteit van de vloeibare matrix binnen een vacuüm kamer. ^{7 , 8}

S. oneidensis heer-1 gemuteerd om uit te drukken van groene fluorescentie proteïne (GFP) werd gekozen als een modelorganisme voor deze biofilm procedure illustratie vanwege de metabole veelzijdigheid en gemeenschappelijk gebruik in milieu en toegepaste microbiologie, dat gebaseerd was zwaar op de unieke mogelijkheid voor de vermindering van de metalen en de extracellulaire elektron overdracht. ^{9 , 10 , 11} daarnaast de aanwezigheid van GFP toegestaan voor gemakkelijk continu biofilm-dikte controle door middel van fluorescentie microscopie, met behulp van een fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-filter. Onze vorige studies hebben aangetoond bewijs van deze bacterie ten gunste van gehechtheid aan het venster van de zonde met behulp van in operando fluorescentie imaging voor biofilm groei tot een dikte van maximaal honderd micrometer valt. ^{4 , 12} terwijl deze paper slechts de bevestiging van de aanwezigheid van biofilm door fluorescentie microscopie te bespreken zal, de SALVI compatible met andere optische beeldvorming methoden, zoals Super-resolutie fluorescentie imaging (dat wil zeggen, gestructureerde verlichting microscopie (SIM)⁹) en confocale laser scanning microscopie (CLSM)⁴imaging). Optische beeldvorming kan dienen voor het meten van de dikte van de biofilm, en verkrijgen van een 3D-beeld van de vorm van de biofilm, zoals deze wordt weergegeven, de dikte en zijn gehechtheid aan het venster van de zonde te bevestigen. ⁹ terwijl GFP werd gebruikt in de analyse van de SIMS, S. oneidensis zonder GFP werd gebruikt voor de groeikromme, als deze enige vereiste meting van optische dichtheid en een fluorescerende imaging niet meer vereist. In het algemeen, het verschil tussen het GFP gelabeld en niet-gecodeerde soort(en) in de groeicurve is te verwaarlozen. Bovendien, terwijl dit protocol S. oneidensis heer-1 GFP als een modelorganisme gebruikt voor het beschrijven van de procedure, is deze procedure ontworpen voor elk bacteriële stam die nodig kan zijn voor teelt binnen SALVI. Hoewel, kennis van de bacteriële stam nodig, wellicht bepaalde voorwaarden groei zoals tijd, temperatuur en zuurstof milieu worden gewijzigd voor de spanning van bacteriën worden gebruikt. Voor groeimedium, deze procedure maakt gebruik van "nanowires" gemiddeld, al soja Bouillon (TSB) zonder dextrose, en al soja agar (TSA) zonder dextrose voor kweken. De samenstelling van "nanowires" medium is speciaal geformuleerd voor de groei en voor het toezicht op extensies van het membraan en het periplasma van S. oneidensis , die lijken te nemen van de vorm van kleine draden en de middellange samenstelling geweest gevestigde eerder onderzoek. ^{13 , 14}

Onze vorige protocol betreffende in situ vloeibare ToF-SIMS heeft het voordeel dat SALVI te bieden heeft voor proteïne immobilisatie en gehechtheid aan de zonde, evenals een gedetailleerd protocol op ToF-SIMS analyse en gegevens geïllustreerd. ¹² in plaats van te herhalen gegevens reductie stappen, dit document zal dienen om in plaats daarvan richten op de unieke aanpak van instellen en het cultiveren van biofilms binnen onze microchannel SALVI, evenals de imaging stappen voor het detecteren van de aanwezigheid van biofilm en dikte voorafgaande ToF-SIMS analyse. Terwijl biofilms hebben eerder is beperkt tot alleen gedroogde monsters in de kamer van vacuüm gebaseerde oppervlakte analytische technieken, kan gedetailleerde EPS en biofilm chemische in kaart brengen van levende biofilms nu worden verkregen in situ vanwege deze nieuwe functionaliteit.

Protocol

1. voorbereiding van materialen

1. Voorbereiding van Medium buis
   1. Serum flessen (één per biofilm cultuur en drie nodig per groeicurve nodig)
      Opmerking: zoals vermeld in de inleiding, een groei medium geschikt is om de voedingsstoffen die nodig zijn voor de spanning van bacteriën van belang kan worden gebruikt voor deze procedure; in dit geval " nanowires " media en TSB zonder dextrose medium werd gebruikt voor de groei van S. oneidensis heer-1 GFP. ¹³
      1. storting 20 mL groeimedium in één 70 mL serum fles, cap de stop en krimp van de fles. Betrekking hebben op de top met een stuk van schone steriele aluminiumfolie.
      2. Autoclaaf de fles met een vloeibare cyclus voor 30 min op 121 ° C. Afterward, slaan de gesteriliseerde serum fles op kamertemperatuur.
   2. Anaërobe cultuur buizen
      1. 5 mL groeimedium storten op een buis van de anaërobe cultuur met lucht headspace, de stop zetten en krimp van de fles. Betrekking hebben op de top met steriele folie.
2. Voorbereiding Bubble Trap buizen
   1. met behulp van een naald van 22 gauge, zorgvuldig punch een gat door een serum fles rubberstop.
   2. Knippen 20 in van 1/32 " polytetrafluorethyleen (PTFE) buizen met een scheermes zo dat één uiteinde van het segment van de buis is puntige.
   3. De PTFE-buis door het gat in het bovenste gedeelte van de rubberstop met behulp van het puntige einde, draad. De buis erdoor tot ongeveer 2 cm door middel van de stop is en snijd het puntige einde van de PTFE-buis met een scheermes dat een platte einde.
   4. Verwijderen van de zuiger van een injectiespuit 5 mL en de rubberstop vanaf stap 1.2.3 past het open einde van de spuit. Het einde van de 2 cm van de PTFE-buis is binnen het vat van de spuit. Dit is de waterventiel.
   5. Wrap de waterventiel (PTFE slang, rubberstop, en spuit) gebruikt dat is gemaakt in stap 1.2.4 met aluminiumfolie en veilig met autoclaaf tape. Autoclaaf steriliseren van de buis met een dichtheid van het folie pakket cyclus bij 121 ° C gedurende 30 min. de verzegelde folie pakket bij kamertemperatuur bewaren tot klaar voor gebruik in stap 2.4.
3. Bacteriële groeicurve
   Opmerking: dit protocol S. oneidensis heer-1 GFP gebruikt als een modelorganisme voor het kweken van de biofilm in SALVI. Deze procedure kan echter aangepast aan andere bacteriën groeien aëroob of anaëroob. Afhankelijk van welke stam wordt gebruikt, tijd van de groei en milieu wellicht dienovereenkomstig worden aangepast.
   Opmerking:-80 ° C bacteriële vriezer voorraden bestond uit een 1:1 mengsel van TSB zonder dextrose en glycerol. De groei curve voorbeeld in Figuur 1 B werd opgesteld op basis van een starter cultuur van TSB met geen dextrose, overgedragen in de respectieve 0,2 mL hoeveelheden driemaal aan 70 mL serum flessen met 20 mL " nanowires " medium om sporen van TSB te verwijderen. Echter, dit protocol wordt ervan uitgegaan dat slechts één groeimedium zal worden gebruikt, en dat daaropvolgende overdrachten niet, aangezien dit plaatsvinden zal werd gedaan met deze bepaalde middelgrote oplossingen voor S. oneidensis. Hoewel die niet worden beschreven in dit protocol, worden extra overdrachten als deze aanbevolen als aanvankelijk storten de bacteriën naar de rijke TSB de bevroren cellen herstellen helpt; en de drie daaropvolgende overdrachten aan " nanowires " zorgt ervoor dat alle TSB verdwenen is en dat de typische groeidynamiek zich voordoen.
   1. Enten van de Starter cultuur
      1. de bacteriële glycerol voorraad verwijderen uit de diepvries-80 ° C en warm de voorraad met een gehandschoende hand te ontdooien, zo spoedig mogelijk. Deze vriezer voorraad verplaatsen naar de biologische veiligheidskast (BSC).
      2. Binnen de BSC, gebruik een 1 mL injectiespuit met een naald van 22G verbonden wilt overbrengen van 0,1 mL van diepvries materieel naar een afgetopte en gekruld anaërobe cultuur buis met 5 mL groeimedium met geen dextrose, bereid in stap 1.1.2. Vervreemding van de resterende voorraad van de vriezer in de passende biologische afval container, als de bevriezing weer kon de cellen schok.
      3. Broeden de starter cultuur in een shaker/incubator bij 30 ° C op 150 rotaties per minuut (rpm) en neem een extinctie lezing 600 nm (OD ₆₀₀) wanneer klaar voor gebruik. Registreren de tijd van groei en OD ₆₀₀ zodanig dat het dat tegelijkertijd voor elke latere gebruik gebeuren kan, zodanig dat de resultaten reproduceerbaar zijn. Als voorbeeld, deze starter cultuur was toegestaan om te groeien voor 15u en gebruikt op een OD-₆₀₀ voor ongeveer 1.0.
   2. Enten groeimedium
      1. nemen de drie serum-flessen bereid in stap 1.1.1.2 en de cultuur van de starter in 1.3.1.3 voorbereid en brengen zowel de BSC.
      2. Binnen de BSC, met behulp van een steriele 1 mL injectiespuit met een naald van 22G aangesloten, overdracht 0,1 mL van de oplossing van de starter cultuur naar elk van de serum-flessen, respectievelijk.
      3. Sterilize de top van de serum-flessen met 70% ethanol cover met gesteriliseerde aluminiumfolie, label op de juiste manier en overbrengen naar een roteerschudapparaat binnen een incubator. De roteerschudapparaat ingesteld op 150 rpm en de incubator tot 30 ° C. Incubate totdat de eerste OD ₆₀₀ gegevenspunt wordt genomen, binnen stap 1.3.3.
   3. OD verkrijgen ₆₀₀ gegevenspunten
      1. bereiden een leeg door neerlegging 100 µL van filter-gesteriliseerde gedestilleerd gedeïoniseerd (DI) water in een steriele cuvette. Wikkel kunststof paraffine film rond de top van de meetcel zodat het water zal niet worden besmet. Bewaren bij kamertemperatuur. Gebruik dit leeg met de UV/Vis spectrofotometer alvorens alle gegevenspunten voor de groeikromme door de cuvette invoegen en druk op " lege ".
         Opmerking: Elke 48 uur een nieuwe lege moeten bereid zijn om te voorkomen dat onjuiste lezing, zoals regelmatig ter vervanging van een leeg is een goede gewoonte.
      2. Voor elk gegevenspunt OD ₆₀₀, verwijderen de serum-flessen bereid in stap 1.3.2.3 van de incubator en de overdracht naar een gesteriliseerde BSC. Nemen van 0,1 mL geënte voedingsbodem van elk serum fles en storting op drie afzonderlijk label steriele cuvettes.
      3. Na blanking, Cuvet met de cultuur in de ultraviolet, zichtbaar (UV/Vis) spectrofotometer invoegen de OD-₆₀₀ een tegelijk lezen en opnemen van alle drie lezingen voor dat tijdstip.
         Opmerking: Voor S. oneidensis heer-1, gegevenspunten werden genomen op 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 en 105 h na inoculatie. De groei is voltooid zodra de bacteriën de dood-fase is voltooid. Deze punten moeten dienovereenkomstig worden aangepast als er gebrek aan kennis op de specifieke groei-tijd en de neiging van bacteriën die in dit protocol worden gebruikt is. Als er onzekerheid over de neiging van de groei, gegevens punten moeten worden verzameld vaker, bijvoorbeeld elke drie h gedurende de eerste 12 uur, elke zes h voor latere 36 h, voor de volgende 100 h tussenpozen 12 h, en voor de definitieve 124 h. tussenpozen 24 h
      4. Met behulp van de OD ₆₀₀ gegevenspunten als de y-as en de tijd als de x-as, grafiek een curve van het gemiddelde van de drie punten genomen met foutbalken van de standaarddeviatie voor elk punt van de tijd met behulp van een grafische software. De groeikromme S. oneidensis heer-1 wordt weergegeven in Figuur 1 B in de sectie representatieve resultaten.
      5. Het tijdsbestek van de sectie log-fase van de groeicurve met behulp van de grafiek bereid in stap 1.3.3.4, identificeren. Voor Shewanella is dit tussen 12 en 33 h van groei; Daarom kan worden afgeleid dat 24u van groei, Shewanella binnen zijn log-fase van groei zijn zal, ervan uitgaande dat de bacteriën zullen worden gekweekt met behulp van de dezelfde media en behandeling vóór gebruik dat werd gebruikt voor de groeikromme.

2. Kweken van de bacterie

1. dag: enten van de agarplaat
   Opmerking: dit gedeelte van de procedure werd gebruikt met een agarose plate op te nemen één kolonie-vormende eenheid (CFU) log-fase, in plaats van de cultuur van de vloeibare starter gebruikt voor de groeicurve. Dit kan worden aangenomen dat dezelfde groei voorwaarden reproduceren wijten aan het feit dat TSA zonder dextrose werd gebruikt en vervolgens overgedragen aan " nanowires " medium in de groei curve procedure, en de TSA heeft dezelfde ingrediënten die deel uitmaken van de TSB.
   1. S. oneidensis heer-1 GFPbacteria voorraad verwijderen uit-80 ° C vriezer en plaats in een ijsemmer, plaatst u deze emmer binnenkant van gesteriliseerde BSC.
   2. Binnen het Comité voor Bankentoezicht, gebruik een steriele 1 µL inoculatie lus om schraap de oppervlakte van de bevroren bacteriën voorraad en de lus aan het oppervlak van de plaat van een agarose T-streak.
   3. Na de verzegeling van de zijkanten van de plaat met kunststof paraffine film, de plaat omkeren en op te slaan in een incubator van de 30 ° C gedurende 24 uur, totdat afzonderlijke kolonies worden weergegeven.
2. Dag twee: enten van de Serum-fles
   1. verwijderen de plaat uit de incubator en open binnen het Comité voor Bankentoezicht.
   2. Binnen het Comité voor Bankentoezicht, reinig het oppervlak van de rubberstop op een fles bereid serum uit stap 1.1.1 met 70% ethanol in DI water.
   3. Selecteren een individuele CFU uit de agarplaat en met behulp van een steriele injectiespuit met een bijgevoegde 22 gauge naald, storten voldoende groei media om te verjagen van de kolonie van de plaat zonder het aanraken van een naburige kolonies en meng de kolonie met het medium met het topje van de naald.
      Nota: A afzonderlijk kolonie moet worden geselecteerd die is ver genoeg weg van andere bacteriën op de plaat, zodanig dat medium kan worden gestort op het zonder te raken alle andere kolonies.
   4. Met behulp van de dezelfde spuit, de vloeistof uit het oppervlak van de plaat halen.
   5. Na te onttrekken uit bellen binnen de spuit, injecteren van de vloeistof in het flesje serum en plaats op een roteerschudapparaat binnen 30 ° C ingesteld op 150 rpm voor 24 h.
      Opmerking: Te tikken van de belletjes uit de spuit is belangrijk om te voorkomen dat de invoering van meer zuurstof naar de serum-fles, zoals invoering van meer zuurstof aan de fles kunt wijzigen van de experimentele omstandigheden en verminderen van consistentie tussen groei tijden voor bacteriën.
3. Dag twee: sterilisatie van de Microchannel SALVI
   Opmerking: ter bevordering van de steriliteit van de buis systeem, stappen die vereisen loskoppelen van de spuit uit de buis en de vervanging met een nieuwe spuit moeten gebeuren binnen de BSC. Om dit te doen, gewoon de spuit uit de spuitpomp loskoppelen door de metalen spuit houder unscrewing, en brengen de spuit met slang aangesloten op een steriele BSC. Wanneer slang systeem wordt genoemd in de procedures, dit refereerd naar de spuit met de vloeibare reservoir, gekoppeld met een polyetheretherketon (PEEK) injector aan de PTFE-buis, gekoppeld aan de drip kamer, die heeft een PEEK injector passend gekoppeld aan de SALVI inlaat tubing, evenals de outlet container die de SALVI uitlaat slang is verzegeld.
   1. Gebruik een nieuw SALVI-apparaat en een PEEK montage en injector koppelen aan één uiteinde van een PTFE-buis.
      Opmerking: SALVI apparaten worden vers bereid voor elk experiment na de fabricage van het apparaat in eerder onderzoek en octrooien beschreven. ^{5 , 6 , 8 , 15}
   2. 2 mL ethanol 70% rekening met een injectiespuit en sluit aan op de PEEK montage op de SALVI. Na een spuitpomp verbinden met de spuit en de uitlaat van de SALVI koppelen aan een afval fles, toestaan dat de ethanol DI water oplossing om uit te voeren via de SALVI op 20 µL/min voor 1,5 h.
   3. Gesteriliseerde DI nemen 4 mL water in een spuit en sluit aan op de inlaat van de dezelfde SALVI. Na het aansluiten van de spuit op een spuitpomp, laat het water te lopen via de SALVI op 20 l/min voor ten minste 3 h.
   4. Binnen een BSC, opent u het folie pakket bereid in stap 1.2.5 en verbinding maken met een steriele PEEK injectie aanpassen aan het einde van de 5 mL spuit en steriele PEEK fittingen aan het einde van de buis TFE. Nemen ~ 3 mL steriele voedingsbodem in een spuit en hechten aan de TFE buis. Omkeren van de 5 mL infuus kamer en met een steriele injectiespuit, injecteren het groeimedium in de drip bedwelmingsruimte totdat zij een totaal volume van 1 mL tot.
   5. Sluit het uiteinde van de 5 mL spuit infuus kamer aan de inlaat van de SALVI.
   6. 10 mL groeimedium rekening met een steriele injectiespuit en sluit aan de inlaat van de drip-buis. Na het aansluiten van de spuit op een spuitpomp, toestaan dat het medium de SALVI op 20 µL/min voor 12u doorlopen (of 's nachts). Gebruik plakband om deze onderdelen veilig te stellen. Betrekking hebben op de outlet-fles met folie of kunststof paraffine film om te minimaliseren van de kans op stofdeeltjes en organismen die daarin om te vervuilen het medium. In Figuur 1 A vindt u een gedetailleerde voorstelling van hoe deze setup eruit moet zien.
      1. Toestaan de drip buis als verticaal, wat betekent dat de spuitpomp moet worden geplaatst op een verhoogde oppervlak met infuus buizen beveiligd met tape, en met de SALVI beveiligd en opgeslagen op een vlakke ondergrond hieronder.
      2. Medium doorlopen de SALVI voor 12 h om ervoor te zorgen dat alle sporen van ethanol zijn verwijderd uit de microchannel en leidingen van de SALVI voordat het enten met bacteriën.
      3. Voor extra bescherming, houden de SALVI microchannel kamer binnen een gesteriliseerde petrischaal, met de zijkanten gesneden te passen de inlaat en uitlaat buizen. Bovendien houden tape altijd op het venster ter bescherming van de membraan van de zonde en kanaal voorafgaand aan imaging analyse.
4. Dag drie: inoculatie van de Microchannel SALVI
   1. de hele buis systeem (spuit verbonden kamer aangesloten op SALVI verbonden met de afval fles druppelen) uit de spuitpomp verwijderen en breng het naar een gesteriliseerde BSC. Bovendien, verwijderen de serum-flacon uit stap 2.2.5 uit de incubator en breng het naar de BSC.
   2. Reinigen van het oppervlak van de serum-tie met 70% ethanol om verontreiniging te voorkomen en gebruik vervolgens een steriele injectiespuit met een bijgevoegde steriele naald van 22G 4 mL bacteriën uit de fles uitpakken.
   3. Loskoppelen van de SALVI uit de kamer 5 mL van de drip buis, en verbinden van de spuit met geënte medium rechtstreeks aan de inlaat van de SALVI. Laat de slang van het infuus binnen een steriele aluminiumfolie pakje of binnen de BSC.
   4. De spuit met SALVI en outlet fles hechten aan de spuitpomp op 20 µL/min gedurende 3 uur om te enten van het kanaal van de SALVI, zodat meerdere veranderingen van het volume van de vloeistof die deel uitmaakt van SALVI uitgevoerd.
   5. Na inoculatie, de spuit met SALVI verbreken de spuitpomp en brengen het Comité voor Bankentoezicht. Na de inlaat van de SALVI koppelen terug naar de 5 mL infuus kamer vanaf stap 2.4.3, 20 mL groeimedium rekening met een steriele injectiespuit en hechten aan de inlaat van de drip slang.
   6. Breng van de leidingen die zijn verbonden met de SALVI vanaf de BSC aan de spuitpomp en laat het medium te passeren de slang met een snelheid van 2 µL/min gedurende zes tot tien dagen of totdat de fluorescentie imaging (besproken in stap 3) toont gunstige zichtbaar biofilm groei voor ToF-SIMS analyse. Bijvullen van vers medium loopt uit binnen de BSC door een nieuwe steriele injectiespuit te vullen met 10mL groeimedium en koppelen aan de SALVI, nadat het vorige groeimedium heeft uitgeput.
      Opmerking: Na het begin van inoculatie bij 2 µL/min, het debiet nooit opgevoerd worden of daalde, zoals veranderend het debiet zou maken schuifspanning binnen het kanaal en loskoppelen van de biofilm. Het is essentieel dat dit debiet nooit moet worden gewijzigd; ter voorbereiding van deze, ~ 24 h vóór SIMS, observeren de buis nauw samen om ervoor te zorgen dat er geen luchtbellen zijn zodat er is geen behoefte om te duwen meer medium in een sneller tempo in de buis.
      1. Vermijden bubbels in de microchannel, als ze de biofilm uit het kanaal duwen kunnen. Het is belangrijk voorzichtig te zijn van de bubbels in de onderkant van de 5 mL infuus buis waar het verbindt met de SALVI-buis. Verse medium kan worden geïnjecteerd in het einde van de PEEK injector om ervoor te zorgen dat geen lucht worden om de SALVI gedwongen zal.

3. Optische beeldvorming van de Biofilm binnen de Microchannel SALVI

1. Fluorescentie microscopie Imaging
   Opmerking: het Shewanella gebruikt als een modelorganisme binnen dit protocol is gemuteerd om uit te drukken GFP; als zodanig, is het niet nodig kleuring. Als de bacteriën nodig kleuring, moet dit altijd gebeuren bij de dezelfde debiet (bijvoorbeeld, 2 µL/min) om te voorkomen dat de biofilm detachement. Bovendien, wanneer cellen gaan zonder voedingsstoffen beschikbaarheid, zal zij losmaken. Daarom, als een extra kleuring vereist is, de vlek moet worden geïnjecteerd het groeimedium in plaats van water vóór levering om vlekken van de cellen.
   1. Losmaken van de SALVI uit de drip buizen binnen de BSC en sluit de SALVI door schroeven de PEEK hulpstukken om Draai de Unie PEEK.
   2. Tape de slang van de SALVI microchannel kamer veilig op een glasplaatje, zodanig dat het venster volledig vlak en geconfronteerd met omhoog is. De Beschermingstape verwijderen in het venster. Klem de dia naar het werkgebied van de Microscoop door het plaatsen van het glasplaatje tussen de klauwen van de etappe op het perron.
   3. Lager het stadium van de Microscoop zodanig dat de bovenkant van de SALVI ligt dichtbij genoeg om het einde van de 10 X doelstelling, waar aanpassing van de focus zal niet leiden tot de lens te raken van het venster.
   4. Schakelaar op de achtergrondverlichting en vinden het kanaal met behulp van de 10 x Microscoop doelstelling door de focus aan te passen. Op dit moment, door ervoor te zorgen dat de aanwezigheid van bacteriële gehechtheid aan het venster van de zonde van de SALVI blijkt ten opzichte van het venster van een besturingskanaal met geen geënte bacteriën. Voor nauwere beeldvorming van cellen, overschakelen naar de doelstelling van 20 x. In vergelijking met een lege SALVI-kanaal, de aanwezigheid van bacteriën die zijn gekoppeld aan het venster moeten een sterke groene fluorescentie.
   5. Schakelt u de achtergrondverlichting en op de Microscoop kwik bron. Wacht 2-3 min en overschakelen naar de FITC-filter ingesteld op de Microscoop op weergave en vangen beelden van de biofilm gekoppeld aan het venster. Als een voorbeeld van wat de gerijpte biofilm eruit zal zien wanneer u klaar bent, verwijzen naar Figuur 1 C.
   6. Beurt uit de bron van kwik en loskoppelen van de SALVI uit de dia. Indien nodig, hechten aan 2 µL/min volumestroom medium nogmaals met het oog op meer groei voor imaging weer of als de SALVI naar secundaire inperking gebruik ToF-SIMS p.a. overbrengt. Dit is nodig als de dikte van de biofilm wordt gesloten als niet dik genoeg, en meer tijd voor groei is verplicht vóór ToF-SIMS analyse. Als u wilt koppelen aan de volumestroom medium nogmaals, zie stap 2.3.6.
      Opmerking: Indien uitgeoefend volumestroom medium, fluorescentie imaging weer voor ToF-SIMS analyse gebeuren moet.
      1. Geven de biofilm groeimedium te voeden tot ToF-SIMS analyse kan worden uitgevoerd. Hoewel niet aanbevolen, indien nodig, de gesloten SALVI kan worden opgeslagen binnen 4 ° C's nachts, maar mag opwarmen tot kamertemperatuur voordat u naar de Vacuuemcel van de ToF-SIMS. Echter, het analyseren van de biofilm onmiddellijk nadat losgekoppeld van de volumestroom medium om de biofilm detachement.

4. ToF-SIMS Data-acquisitie

Opmerking: deze sectie fungeert als een overzicht, en wordt besproken in meer detail in onze eerdere protocol geadsorbeerde eiwit molecuul vloeibare SIMS analyse beschrijven. ¹²

1. Installeren SALVI naar de ToF-SIMS Loadlock kamer
   Opmerking: handschoenen moeten gedragen worden in alle tijden wanneer vastpakt het SALVI-apparaat en installeert het op de ToF-SIMS fase om te voorkomen dat potentiële verontreinigingen tijdens oppervlak analyse.
   1. Mount SALVI op het podium en repareren met enkele schroeven. Zorg ervoor dat het zonde venster plat door aanpassing schroef krapte en invoegen silicium wafer stukken op de bodem van het PDMS microchannel-kamer. De Beschermingstape verwijderen uit het venster, dan laden de fase in de bedwelmingsruimte ToF-SIMS loadlock.
   2. Opent het loadlock ToF-SIMS, houd het decor horizontaal op het laadplatform en sluit de deur van de loadlock. De vacuümpomp starten en wachten om ervoor te zorgen dat passende vacuüm is bereikt.
   3. De SALVI in de belangrijkste kamer verplaatsen zodra het vacuüm is gestabiliseerd op 1 x 10 ^-7 mbar.
2. Diepte Profiling en verzamelen gegevens punten
   1. vinden het microfluidic-kanaal met behulp van de optische Microscoop voorzien in ToF-SIMS.
   2. Selecteer positief of negatief modus voor data-acquisitie. Gebruik de 25 keV Bi ₃ ⁺ balk als de primaire ion beam in alle maten, en de overstroming elektronenkanon gebruiken om te neutraliseren het oppervlak opladen tijdens alle metingen.
   3. Scan de Bi ₃ ⁺ bundel met 150 ns puls breedte op een ronde gebied met een diameter van ~ 2 µm met 64 pixels bij 64 pixelresolutie. Na het ponsen door de 100 nm zonde raam, blijven zoeken naar een andere 150 s om hoge intensiteit gegevens voor imaging te verzamelen. Na de punch-through, zal de graven aanzienlijk te verhogen binnen de diepte profilering van de regio. Na het stabiliseren, dit kan worden genoemd de hoge intensiteit regio.
   4. Verminderen de pulsbreedte tot 50 ns voor gegevensverzameling te verwerven van de spectra met een betere resolutie van de massa. Blijven deze overname voor ongeveer een andere 200 s.
   5. Herhaal deze stappen voor het verzamelen van ten minste drie positieve en drie negatieve gegevenspunten.
      Opmerking: Zorg ervoor dat tot de ruimte van de punch-door gebieden zodanig dat het venster van de zonde niet breken zal en lek in de zaal van het vacuüm van gecompromitteerd venster integriteit.

5. ToF-SIMS gegevensanalyse

1. massa kalibratie met behulp van Software van de IonToF van
   1. de analysesoftware van ToF-SIMS (meting Explorer) openen en klik vervolgens op de " profielen ", " spectra " en " beeld " knoppen, respectievelijk naar proces diepte profiel, m/z spectrum en afbeeldingsgegevens.
   2. Open de gegevensbestanden in heel ToF-SIMS data-acquisitie verkregen.
   3. Selecteer de diepte profilering van gegevens van belang en reconstrueren van de spectra volgens de diepte profiel temporele series.
   4. Pers " F3 " om te openen de " massa kalibratie " venster. Kies pieken voor kalibratie op basis van chemische verbindingen die verwachting te bestaan in de specifieke steekproef.
2. Pieken van de selectie van de rente
   1. piek selectie is noodzakelijk voor de analyse van monster, bepalen karakteristieke pieken van het monster overeenkomstig het literatuur of andere eerdere bevindingen, indien van toepassing. Vergelijk de intensiteit van de pieken van belang in de spectra m/z. Indien nodig, toevoegen van nieuwe pieken of interferentie pieken in de piek-lijst verwijderen.
   2. Klik op een piek, vinden de rode lijnen op de linker onderkant venster. Verplaats de rode lijnen om te omsluiten de hele piek.
   3. Selecteer een piek die overeenkomen met de chemische formule in de belangrijkste spectrum venster, en vervolgens te klikken op de " piek toevoegen " knop boven het venster. < /Li >
3. Massa gekalibreerd gegevens exporteren
   1. een piek om lijst te exporteren, in de " piek lijst " menu, selecteer " opslaan … " de lijst van de piek in de " itmil " formaat.
   2. Voor het exporteren van een profiel van de diepte, in de " profiel " venster, klik op het " bestand " menu, selecteert u " exporteren ", en selecteer " opslaan als " een " .txt " bestand.
   3. Een m/z spectrum om bestand te exporteren, in de " Spectra " venster, klik op het " bestand " menu, selecteert u " exporteren ", en selecteer " opslaan als " een " .txt " bestand.
   4. Voor het exporteren van een imagebestand, in de " afbeelding " venster scherm afdrukken en opslaan als het afbeeldingsbestand.

6. ToF-SIMS gegevens plotten en presentatie

1. een grafisch hulpprogramma gebruiken om de gegevens te importeren.
2. Maken een perceel met behulp van de m/z als de x-as en de piek intensiteit als de y-as te tonen van het gereconstrueerde spectrum. Een voorbeeld is gegeven in Figuur 2.
3. Combineren gereconstrueerd tweedimensionale (2D) afbeeldingen van verschillende m/z en vorm een matrix aan beide positief of negatief ion toewijzing weergegeven. Een voorbeeld is gegeven in Figuur 2 B.

Representative Results

Deze representatieve resultaten dienen om te tonen hoe het chemisch profiel van de bijgevoegde biofilm kan worden geïdentificeerd en geïnterpreteerd, verkregen door middel van ToF-SIMS. Na het uitzetten van de massaspectra van ToF-SIMS data-acquisitie, kort gemarkeerd in de sectie procedures moet piek identificatie worden gevoerd om identiteiten aan elke respectieve m/z-waarde toewijzen. Dit kan gebeuren door middel van uitgebreide literatuurstudie over Spectrometrie van de massa op bacteriën en specifieke chemische fragmenten die verwachting moet aanwezig zijn binnen de bacteriën bestudeerd, zoals verschillende water clusters, vetzuren en eiwitten fragmenten. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} deze representatieve resultaten tonen alleen de negatieve massaspectra verkregen door de biofilm S. oneidensis heer-1 en een watermonster DI. Interpretatie van positieve spectra een vergelijkbare procedure volgen.

Figuur 1 A toont de schematische setup volgens dit protocol als het cultiveren van een biofilm in de microchannel SALVI. Op de top links, is de spuit gekoppeld aan een spuitpomp, die houdt van middellange stroomt met een constante snelheid in het hele systeem PFTE buizen en binnen de microchannel. De spuitpomp wordt geplaatst boven de drip kamer, die achteruit besmetting van de middellange reservoir om te voorkomen dat sporenvormende organismen voorkomt van stroomopwaarts zwemmen. Het medium vloeit voort uit het reservoir van de kamer infuus rechtstreeks in de PFTE-buis van de SALVI, die op zijn beurt door de microchannel en door de uitlaat slang tot een verzegelde outlet-fles. De stippellijnen wijs vanuit het venster zonde een afbeelding van een gerijpte S. oneidensis heer-1 GFP cellen gevangen genomen door fluorescentie microscopie, gedetailleerde in stap 3.1. Figuur 1 B ziet u een voorbeeld van een groeicurve vastgesteld aan de hand van de modelorganisme voor dit protocol, S. oneidensis heer-1. Uit de fase van de groei in deze grafiek, kan worden geconcludeerd dat de log-fase van groei tussen 15-32 h in de voorwaarden van deze specifieke teelt plaatsvindt. Meer informatie uit deze grafiek blijkt dat 0-15 h de fase van de vertraging van de groei is, en 33-105 h de stationaire fase van groei vertegenwoordigt. Figuur 1 C is een afbeelding verworven met fluorescentie microscopie tonen een voorbeeld van een biofilm gerijpt.

Figuur 2 A toont het negatieve massaspectra van een gehydrateerd S. oneidensis heer-1 biofilm binnen het microfluidic-kanaal, verkregen door in situ vloeistof ToF-SIMS. Deze grafiek toont een voorbeeld van de geselecteerde massa bereik (m/z 100-350) vergelijking tussen de biofilm van S.oneidensis heer-1 en DI-water, de laatste was verkregen als een systeemcontrole. Figuur 2 B toont een vergelijking van 2D-afbeeldingen van pieken van belang in de heer-1 biofilm en DI-water verkregen door ToF-SIMS. Zodra interessante m/z-waarden kunt worden geïdentificeerd van het bestuderen van de massaspectra, potentiële piek identificatie van m/z-waarden worden goed toegeschreven aan chemische fragmenten, wordt ondersteund door het IonToF SIMS software bibliotheek en literatuur-onderzoek. Pieken van belang in Figuur 2 opgenomen water clusters (dat wil zeggen, m/z 107 (H₂O)₅OH^-, 125 (H₂O)₆OH^-, 143 (H₂O)₇OH^-, 161 (H₂ O)₈OH^-, 179 (H₂O)₉OH^-, 197 (H₂O)₁₀OH^-, 215 (H₂O)₁₁OH^-, 233 (H₂O)₁₂OH^-, 251 (H₂O) ₁₃ OH^-, 269 (H₂O)₁₄OH^-, 287 (H₂O)₁₅OH^-, 323 (H₂O)₁₇OH^-, 341 (H₂O)₁₉OH^-))⁹, als aangeduid met rode lijnen boven de respectieve pieken, quorum sensing gerelateerde verbindingen biomarkers (dat wil zeggen, m/z 175 C₁₀H₉geen₂^-), EPS-bijproducten (m/z 123 C₂H₄PO₄^-, 159 P ₂ O₈H^-, 216 Cr₂O₇^-, 285 octadecanoethiols, 325 polaire verbindingen, C₁₂ Polar compounds)^15,16,18, en vetzuur keten fragmenten (d.w.z. m/z 127 [C₂H₃(CH₂)₃COO]^-, 255 C16:0 vetzuur, 279 linolzuur, C₁₈H₃₁O₂^-, 325 C₂₁H₄₀O₂ ^-, 341 oppervlakte lipiden, 18-MEA gebonden door thio-ester koppeling, stearinezuur C₁₈H₃₅O₂^-, ionen van monoacylglyceryls van palmitinezuur C₁₉H₁₇O₆ ^-). ^{16 , 19}

Aangezien de biofilm wordt gehydrateerd, is het niet verwonderlijk dat sommige pieken in de biofilm monster gezien vergelijkbaar met die gevonden in DI water zijn. Deze water cluster pieken zijn gemarkeerd met een rode lijn boven elke piek in Figuur 2A, met inbegrip van m/z 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, en 341 en correspondeert met de (H₂O)₅OH^- (H₂O) ₆ OH^- (H₂O)₇OH^- (H₂O)₈OH^- (H₂O)₉OH^- (H₂O)₁₀OH^- (H₂ O)₁₁OH^- (H₂O)₁₂OH^- (H₂O)₁₃OH^- (H₂O)₁₄OH^- (H₂O)₁₅OH^- (H₂O)₁₇OH^- (H₂O)₁₉OH^-, respectievelijk. ⁹ want er is een prevalentie van vele karakteristieke water clusters in deze massaspectrum, biedt deze resultaten een sterk bewijs van het chemische cluster watermilieu aanwezig in een gehydrateerd biofilm. Bovendien, gerelateerde niet-water cluster pieken waargenomen in beide spectra kunnen meestal worden toegeschreven als inmenging pieken, meestal van het PDMS, een onderdeel van het microfluidic-kanaal. Bijvoorbeeld, is een gemeenschappelijk bekende interferentie piek van PDMS de m/z 137 in de negatieve ion-modus.

Bij het vergelijken van de biofilm SIMS massa spectra met die van DI water, zoals weergegeven in Figuur 2, sommige toppen zijn niet aanwezig in het DI-water, maar ze verschijnen in de biofilm. Bijvoorbeeld, de piek op m/z 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinezuur) is aanwezig op hoge intensiteit in de biofilm steekproef, maar helemaal niet in het watermonster DI. Dit zou suggereren dat de c signalenOme van de biofilm, waarschijnlijk de biofilm en/of haar self-generated EPS. Veel interessante pieken werden geïdentificeerd in Figuur 2. Bijvoorbeeld EPS gerelateerde pieken omvatten m/z 123^-, vastgesteld dat C₂H₄PO₄^-, 159 (P₂O₈H^-), 216 (Cr₂O7^-), 285 (octadecanoethiols), en 325 (polaire verbindingen, C ₁₂ Polar compounds). ^{17 , 18 , 20} pieken gekoppeld aan vetzuren bleken 127 ([C₂H₃(CH₂)₃COO]^-), 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinezuur), 279 ([CH₃ (CH₂)₁₅COO]^-, linolzuur), 317 (C₂₁H₃₃O₂^-), 325 (C₂₁H₄₀O₂^-) en 341 (oppervlakte lipiden, 18-MEA gebonden door Thio-ester koppeling, stearinezuur C₁₈H₃₅O₂^-, ionen van monoacylglyceryls van palmitinezuur C₁₉H₁₇O₆^-). ^{16 , 19} tot slot een quinolone signaal quorum sensing signaal gerelateerde piek voor C₁₀H₉geen₂^- werd waargenomen op 175 m/z.

Figuur 2 B weergegeven 2D afbeeldingen van de verdeling van vier verschillende interessante ionen tussen de S. oneidensis heer-1 biofilm (bovenste rij) en DI-water (onderste rij). De m/z-waarde 107 ((H₂O)₅van OH^-) ziet u een water-cluster voor belangrijke intensiteit binnen de monsters, de m/z-waarde 175 (C₁₀H₉geen₂^-) toont een quorum sensing verwante signaal, m/z 255 is een vetzuur ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinezuur), en m/z 341, lid C₂₁H₄₁O₂^-kunnen vertegenwoordigen beide lipide fragmenten en water clusters als gevolg van de massale nauwkeurigheid van 1 amu. ⁹ helderder regio's van de 2D foto's geven een hogere telling van het molecuulion aanwezig in de afbeelding. Zoals verwacht, signalen voor de QS samengestelde en lipiden waren veel groter in aantal binnen de biofilm monster. Terwijl het signaal voor het water cluster (m/z 107) sterker in de biofilm steekproef was, was het ook aanwezig in het monster DI water, zoals verwacht. Tot slot is het signaal op m/z 341 bleek te zijn homogene binnen de biofilm steekproef, maar zeer zwak binnen het watermonster DI. Terwijl m/z 341 een water cluster piek was, was het ook representatief voor verschillende verschillende vetzuur en oppervlakte lipiden. ¹⁶ zijn sterkere aanwezigheid binnen de biofilm monster na normalisatie van gegevens suggereert dat de aanwezigheid van lipide fragmenten veel zwaarder weegt dan de aanwezigheid van water clusters.

Figuur 1 : Experimentele schematische. (A) wordt weergegeven de experimentele schematische voorstelling van de biofilm setup als het voorkomt in het laboratorium. Vanaf de bovenkant links, middellange stromen uit de spuit (1), die is aangesloten op de-spuitpomp (2), controle van het tempo die vloeibare bewegingen door. Pijlen geven de stroomrichting in het hele systeem. De spuit (1) is aangesloten via een PEEK injector montage (3) op de TFE buis (4). Gemiddeld stroomt door een infuus kamer (5) om verontreiniging te voorkomen en uiteindelijk doorloopt de SALVI (6) naar de verzegelde outlet container (7). De spuitpomp is gepositioneerd op een verhoogde oppervlak (9) zodanig dat het infuus kamer (5) loodrecht op de vlakke ondergrond (8) dat de SALVI (6 worden kan) wordt geplaatst op. (B) groei curve voor Shewanella oneidensis, heer-1 in "nanowires" medium. Tijd 0-15 h vertegenwoordigt lag fase, tijd 15-33 h log fase vertegenwoordigt, tijd 33-105 h stationaire fase, en tijd 105 h vertegenwoordigt of vertegenwoordigt meer dood fase. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie. (C) A foto van een gerijpte biofilm verworven met fluorescentie microscopie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2 : Vergelijkingen van ToF-SIMS negatieve spectra van de gehydrateerde Shewanella oneidensis biofilm en MIJNHEER-1 medium in de microchannel SALVI. (A) de m/z SIMS massaspectra van de Shewanella oneidensis biofilm in heer-1 medium en DI-water. De laatste werd gebruikt als een besturingselement. Rode lijnen geeft de locatie aan van karakteristieke water cluster pieken. (B) de vergelijking van de 2D-afbeelding van pieken van belang tussen de biofilm en DI-water. Afbeeldingen weergegeven van links naar rechts, een cluster van water (m/z 107 (H₂O)₅OH^-), een quorum sensing/hormoon signaal (175 m/z, C₁₀H₉geen₂^-), een vetzuur (m/z 255, [CH₃(CH ₂)₁₄COO]^-, palmitinezuur), en de oppervlakte van lipiden/EPS-fragmenten (m/z 341, 18-MEA, C₂₁H₄₁O₂^-). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Discussion

Na het enten in log-fase, is het belangrijk om te testen het aantal dagen en temperatuur waartegen de biofilm groeien moet voordat het is gezond en dik genoeg voor beeldvorming, zoals beschreven in stap 3.1. Deze procedure specifiek betrekking heeft op het kweken van een S. oneidensis MR1 biofilm bij kamertemperatuur; verschillende kamer temperaturen kunnen echter het tempo van de groei beïnvloeden. Daarom is het cruciaal voor optische imaging gebruiken om te begrijpen of de biofilm klaar voordat u verdergaat naar de ToF-SIMS analyse is. Verschillende stammen van bacteriën vereisen ook verschillende groei omstandigheden en lengte om een wenselijk dikte voor analyse. Terwijl de groeicurve in figuur 1b log fase 200 van de bacteriën beeldt als 12-32 h, en dit werd gebruikt op 24 h gedurende de hele procedure, is het belangrijk op te merken dat deze keer niet bruikbaar als log-fase voor andere stammen van bacteriën zonder tot oprichting van de groeicurve onafhankelijk van elkaar. Terwijl de log-fase tussen de 12 en 33 h van groei voor S. oneidensis was, werd 24 h gekozen wijten aan het feit dat het was in het gedeelte van de groei waar zuurstof was beginnen te beperken van de groei van het organisme, tegen het einde van de log-fase. Experimenten is gebleken dat dit de tijd cellen was begon te produceren nanowires, aldus primer aan formulier succesvol biofilms die in omgevingen met weinig zuurstof overleven kon. ^{3 , 13} daarom, de tijd gekozen gebruiken de bacteriën tijdens de fase van het logboek moet worden beïnvloed door onderzoek ervaring en kennis opgedaan uit de literatuur op experimentele studie van de bacteriën wordt bestudeerd. Bovendien moet een aparte groeicurve komen te begrijpen van de log-fase voor alle verschillende stammen van bacteriën, die zal worden gebruikt voor de groei van de biofilm met behulp van deze aanpak. Het groeitempo op jaarbasis van 2 µL/min was berekend dus in niet te hoger zijn dan de maximale groei-S. oneidensis heer-1, en de totale tijd die werd gekozen om een volwassen biofilm die was niet overwoekerd en naar voren gebogen aan het losmaken. Deze tarieven kunnen worden aangepast aan de kennis van verschillende bacteriën worden gebruikt met deze opstelling.

Enkele beperkingen voor het gebruik van SALVI biofilm groeimogelijkheden omvatten antifouling binnen het kanaal, evenals de kans op bacteriën hechten aan de vlakke muren van het kanaal. Ondanks de groei met een constante snelheid, aanbevolen als 2 µL/min binnen dit protocol, kan de antifouling nog optreden als de biofilm is toegestaan om te groeien te lang. In een dergelijk geval kan zonder waarschuwing, de biofilm loskoppelen van het venster en sluit de SALVI aan het indammen van de uitlaat. Antifouling kan ook optreden gewoon door het toevoegen van mechanische kracht (dat wil zeggen, verhuizen) de SALVI, die niet kan worden voorkomen. Echter, dit kan worden in toom gehouden door de gehechtheid van de biofilm aan het venster van de zonde voor ToF-SIMS analyse onder een lichte Microscoop te bekijken. Een andere beperking omvat ook de gladheid van de PDMS microchannel waardoor het moeilijk voor sommige bacteriën hechten. Dit kan echter worden gewijzigd in het ontwerp van de SALVI om aan te passen door het creëren van geribbelde randen aan het kanaal, als bijlage van de bacteriën een probleem. Tot slot kunnen de cellen in plaats van OD₆₀₀ lezingen voor groei curve bepaling worden gedaan. Bijvoorbeeld, hebben studies aangetoond direct en consistente correlatie van de graven van de cel OD₆₀₀ lezingen. ²¹ daarom, OD₆₀₀ wordt geacht voldoende bij de evaluatie van biofilm groei.

Beperkingen met betrekking tot deze techniek zijn enkele, zoals de SALVI in wezen als een cultuur-schotel die veel veelzijdigheid voor gebruik in vele toepassingen fungeert, zoals anaëroob binnen een handschoenenkastje, of binnen een temperatuurgevoelig milieu kamer heeft. Enkele kleine beperkingen omvatten oncontroleerbare kamer voorwaarden zoals temperatuur, relatieve vochtigheid, plaatsing in de buurt van zonlicht, die nog steeds mogelijk om voor elke specifieke bacteriën optimale groei omstandigheden voor, worden ondergebracht. Bovendien, kan sommige van deze technische uitdagingen met een broedmachine met temperatuur of relatieve vochtigheid bemiddeling functies in de biofilm setup worden overwonnen.

SALVI is een vacuüm-compatibele microfluidic interface. In dit werk werd een 200 x 300 µL microfluidic kanaal gebruikt om de cultuur van biofilms volgde met optische en vloeibare SIMS imaging. Vloeistoffen vormen een technische uitdaging om te studeren met behulp van vacuüm op basis technieken, omdat ze zijn volatiel en moeilijk te behouden in de vloeibare fase in vacuüm. Vacuüm technieken zoals ToF-SIMS geweest dus traditioneel beperkt tot alleen droge en cryogene monsters. ²² bovendien SALVI kan worden gebruikt voor uiteenlopende beeldvorming en spectroscopie met behulp van een verscheidenheid van technieken voor microscopie en spectroscopie. ^{4 , 9} onze fractie heeft gewerkt aan diverse SALVI toepassingen in de in situ analyse van vloeistoffen en vaste stof-vloeistof interfaces voortdurend uit te breiden. ^{15 , 23 , 24} onze meest recente poging is effectief gebleken bacteriën gehechtheid aan het membraan van de zonde. ⁹ na eerste bijlage, voortdurende stroom van medium na verloop van tijd heeft aangetoond dat met succes het cultiveren van een biofilm rechtstreeks in het venster van de zonde van de SALVI. Tijdens ToF-SIMS, wordt de primaire ion beam gebruikt voor het bombarderen van gaten van 2 µm in diameter. Deze dimensie is vergelijkbaar met de lengte van de cel van de biofilm gekoppeld aan het venster van de zonde, waardoor een chemische Profiel van de biofilm in haar natuurlijk gehydrateerd communicatie. Dit is zeer belangrijk als gevolg van het verschil van de chemische identiteit van een biofilm, aanwezigheid van EPS- en water-clusteromgeving bij het vergelijken van de biofilms in haar gehydrateerd staat met gedroogde monsters. ⁹ zonder het gebruik van SALVI, ToF-SIMS kan alleen plaatsvinden op droog en cryogene monsters, verstrekken van chemische toewijzing die ontoereikend is op het chemisch profiel van een monster in zijn natuurlijke gehydrateerd staat.

Zoals blijkt uit Figuur 1A, is het belangrijk dat de spuitpomp boven de buis druppelen zodat de drip buis moet loodrecht op de SALVI microchannel. Bovendien zullen bubbels minder waarschijnlijk worden gevangen in de buis van het apparaat, indien de uitlaat PFTE-buis (binnen de outlet fles) lager dan de inlaat buis is (verbonden aan het infuus kamer). Een andere kritische stap in het cultiveren van bacteriën voor SALVI groei is eerst het verkrijgen van een groeicurve van de stam van bepaalde bacteriën die zal worden gebruikt, zoals beschreven in stap 1.3. Dit kan gebeuren door het verkrijgen van de groeikrommes met extinctie metingen. Een groeicurve, is zoals weergegeven in Figuur 1B, belangrijk voor het begrijpen van de termijn waartegen bacteriën in de log-fase van groei, worden zullen wanneer kan worden aangenomen dat de bacteriën gezondste zijn. Met behulp van bacteriën in deze fase van de groei faciliteert de oprichting van een gezonde biofilm communicatie en zorgt ervoor dat de biofilm zijn verwachte tempo zal groeien. De microchannel SALVI is gesteriliseerd bij kamertemperatuur met 70% ethanol en DI-water, als het kan niet gesteriliseerde met autoclaaf voor sterilisatie voorafgaand aan het gebruiken met ToF-SIMS. Dit is de wijten aan het feit dat autoclaaf kan zowel het venster van de SALVI beschadigen en waterdamp kennismaken met het kanaal. Na enkele dagen van de groei, moet de microchannel met fluorescentie microscopie voor het valideren van bacteriële bijlage worden gecontroleerd. Een voorbeeld vindt u in Figuur 1C, dit beeld werd genomen om te laten zien een gerijpte biofilm. Als gevolg van het pad van de stroom van het medium, de bacteriën meer gunstig hecht en groeit langs de randen van de microchannel, aangezien deze locatie waar stroom en schuintrekken-krachten lowes zijnt.

Kortom is SALVI een uitstekende methode voor die aan cultuur en studie biofilms gebruik in situ -chemische toewijzing, omdat het zorgt voor het verstrekken van de levende biofilm in zijn natuurlijke gehydrateerd staat aan de vacuüm gebaseerde imaging massaspectrometer. Deze unieke aanpak kan meer informatie geven over van een biofilm water cluster communicatie, alsook over het krijgen van een dieper begrip van de bijproducten van de EPS. Deze informatie kan worden gebruikt om het begrijpen van de biologische activiteit van een biofilm, en kan worden gebruikt in verschillende toepassingen zoals in biologie, biomedische technologie, landbouw, en industrieel onderzoek en ontwikkeling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}