In Situ Karakterisering av Shewanella oneidensis MR1 biofilmer av SALVI och ToF-SIMS

Summary

Denna artikel presenterar en metod för att odla en biofilm för i situ time-of-flight sekundära ion masspektrometri för kemiska mappning i dess hydrerade aktiveras med en mikroflödessystem reaktor, systemet för analys vid den flytande vakuum-gränssnitt. Den Shewanella oneidensis herr-1 med grön fluorescens protein användes som modell.

Abstract

Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som studeras kraftigt för att förstå deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras roller i miljömässiga mikrobiologi. Denna studie beskriver en metod för att odla biofilm fastsättning till systemet för analys vid den flytande vakuum gränssnitt (SALVI) och uppnå i situ kemiska kartläggning av en levande biofilm genom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS). Detta görs genom odling av bakterier både utanför och inom SALVI kanal med våra specialiserade setup samt optisk imaging tekniker att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek före ToF-SIMS analys. Våra resultat visar de karakteristiska topparna av de Shewanella biofilmen i dess naturliga hydrerad belysa vid dess lokaliserade vatten klustermiljö, liksom EPS fragment, som skiljer sig drastiskt från den samma biofilmen uttorkad tillstånd. Dessa resultat visar genombrott kapacitet SALVI som möjliggör i situ biofilm imaging med ett vakuum-baserade kemiska imaging instrument.

Introduction

Bakteriell biofilm är ytan-associerade samhällen som har utvecklats över tiden som ett försvar för bakterier att överleva olika negativa fysiska och mekaniska stimuli, vari celler är att bifoga och överleva i många möjliga miljöer. ^{1 , 2} biofilmer undersöks kraftigt och har tillämpningar inom många områden som biomedicin, medicinsk teknik, jordbruk, och industriell forskning och utveckling. ^{1 , 2} förstå kemiska mappningen av dessa komplexa mikrobiella samhällen, inklusive deras egenproducerade extracellulära polymera substanser (EPS) och deras lokala vatten-klustermiljö, är viktigt att få en korrekt och detaljerad skildringen av deras biologiska aktiviteter. ²

Biofilmer finns och växa inom en mycket hydrerad stat. Detta utgör en stor utmaning i att använda vakuum-baserade ytanalys tekniker såsom time-of-flight sekundära ion mass spectrometry (ToF-SIMS) på grund av svårigheten att studera flyktiga vätskor i vakuum. Som ett resultat, begränsats vakuum-baserade ytanalys tekniker nästan uteslutande till studera biofilm prover på endast deras torkat tillstånd. Dock hämmar studera en biofilm i torkat tillstånd korrekt utredning av dess sanna biologiska mikromiljö. Det orsakar ofta drastiska förändringar till EPS integritet och biofilm morfologi, vilket har visats efter jämföra torra biofilm massa spektrala resultat i situ flytande studier. ^{3 , 4} denna artikel presenterar en lösning för att studera biofilmer inom deras naturliga hydrerad tillstånd genom att anställa användning av vårt System för analys på flytande vakuum gränssnitt (SALVI),^5,6 en mikroflödessystem reaktor som innehåller vätska under dess tunna kiselnitrid (SiN) membran i en microchannel gjord av Polydimetylsiloxan (PMDS), vilket ger direkt tillgång till den sekundära ion sond strålen samtidigt bibehålla den strukturella integriteten av flytande matrisen inom ett vakuum kammaren. ^{7 , 8}

S. oneidensis MR-1 muterad uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) valdes som modellorganism för denna biofilm förfarande illustration på grund av dess metaboliska mångsidighet och gemensam användning i miljö- och tillämpad mikrobiologi, som byggde tungt på sin unika förmåga för minskning av metall och extracellulära elektronöverföring. ^{9 , 10 , 11} dessutom förekomsten av GFP möjliggjorde enkel kontinuerlig biofilm-tjocklek övervakning genom fluorescensmikroskopi, med fluorescein fluoresceinisothiocyanat (FITC) filter. Våra tidigare studier har påvisat detta bakterier som gynnar fastsättning till fönstret synd med i operando fluorescens imaging för biofilm tillväxt till en tjocklek på upp till 100 mikrometer. ^{4 , 12} medan detta papper kommer endast att diskutera bekräftelse av biofilm's närvaro genom fluorescensmikroskopi, SALVI är kompatibel med andra optisk imaging metoder såsom super-resolution fluorescens imaging (dvs. strukturerad belysning mikroskopi (SIM)⁹) och confocal microscopy (CLSM) imaging⁴för laserscanning). Optisk imaging kan tjäna till att mäta tjockleken biofilm och få en 3D-bild av, en form av biofilmen som det verkar, bekräftar dess tjocklek och dess fastsättning fönstret synd. ⁹ medan GFP användes i SIMS analysen, S. oneidensis utan GFP användes för tillväxtkurvan, som här bara krävs mätning av optiska densitet och krävde inte någon fluorescerande imaging. Allmänhet, skillnaden mellan GFP taggade och otaggade arter i tillväxtkurvan är obetydlig. Dessutom, medan detta protokoll använder S. oneidensis MR-1 GFP som modellorganism för att beskriva förfarandet, är proceduren avsedd för någon bakteriell stam som kan behövas för odling inom SALVI. Även om, ges kunskap om den bakteriestam som behövs, kan vissa tillväxt villkor såsom tid, temperatur och syre miljön behöva ändras för att rymma stammen av bakterier ska användas. För odlingsmedium använder den här proceduren ”nanotrådar” medium, tryptic soy buljong (TSB) utan dextros och tryptic soy agar (TSA) utan dextros för odling. Sammansättningen av ”nanotrådar” medium har blivit speciellt framtagen för tillväxten och för övervakning av förlängningar av membranet och periplasm av S. oneidensis som verkar ta formen av små trådar och medelstora sammansättning har varit etablerad inom tidigare forskning. ^{13 , 14}

Våra föregående protokoll på in situ flytande ToF-SIMS har illustrerat den förmån som SALVI har att erbjuda för protein immobilisering och fastsättning synd, liksom en detaljerad protokollet om minskning av ToF-SIMS analys och data. ¹² i stället för att upprepa data minskning steg, detta papper skall tjäna till att i stället fokusera på den unika strategin för att upprätta och odla biofilmer inom vår SALVI microchannel, liksom imaging stegen att upptäcka biofilm närvaro och tjocklek tidigare ToF-SIMS analys. Medan biofilmer har varit tidigare begränsat till endast torkade prover inom kammaren av vakuum-baserade ytan analytiska tekniker, kan detaljerade EPS och biofilm kemiska kartläggning av levande biofilmer nu erhållas i situ på grund av denna nya kapacitet.

Protocol

1. beredning av material

1. Beredning av Medium slangar
   1. Serum flaskor (en behövs per biofilm kultur och tre behövs per tillväxtkurvan)
      Obs: som nämnts i inledningen, någon tillväxt medium lämpar sig att tillhandahålla de näringsämnen som behövs för stammen av bakterier av intresse kan utnyttjas för detta förfarande; i det här fallet " nanotrådar " media och TSB utan dextros medium användes för tillväxten av S. oneidensis MR-1 GFP. ¹³
      1. insättning 20 mL odlingsmedium i en 70 mL serum flaska, cap proppen och crimp flaskan. Täck toppen med en bit av ren sterila aluminiumfolie.
      2. Autoklav flaskan med en flytande cykel under 30 minuter vid 121 ° C. undra, lagra steriliserad serum flaskan i rumstemperatur.
   2. Anaerob kultur rören
      1. insättning 5 mL odlingsmedium i en anaerob kultur rör med luft headspace, satte på proppen och crimp flaskan. Täck toppen med steril folie.
2. Förbereda bubbla fälla slangar
   1. noga med hjälp av en 22 gauge nål, slå ett hål genom en serum flaska gummipropp.
   2. Skär 20 i 1/32 " polytetrafluoreten (PTFE) slangar med ett rakblad så att ena änden av slangen segmentet är spetsigt.
   3. Med den spetsiga delen, tråd PTFE-slangen genom hålet i den övre delen av gummiproppen. Tryck röret tills ungefär 2 cm är genom proppen och skär den spetsiga ändan av PTFE-röret med en rakhyvel har en platta änden.
   4. Ta bort kolven i en 5 mL doseringsspruta och passar gummiproppen från steg 1.2.3 i den öppna änden av sprutan. 2 cm avslutas PTFE slangar inom fat av sprutan. Detta är bubbelfällan.
   5. Linda bubbelfällan (den PTFE slangar, gummipropp och spruta) gjort i steget 1.2.4 med aluminiumfolie och säkra med autoklav tejp. Autoklav folie paketet att sterilisera slangen med en gravity cykel vid 121 ° C i 30 min. förvaras förslutna folie paketet i rumstemperatur tills den för användning i steg 2,4.
3. Bakteriell tillväxtkurvan
   Obs: detta protokoll använder S. oneidensis MR-1 GFP som modellorganism för odling av biofilm i SALVI. Dock kan proceduren anpassas för att rymma andra bakterier växer aerobt eller anaerobt. Beroende på vilken stam används, tillväxt tid och miljö kan behöva justeras.
   Obs:-80 ° C bakteriell frys lagren bestod av en 1:1 blandning av TSB utan glukos och glycerol. Tillväxt kurva exemplet som visas i figur 1 B var beredd med en förrätt kultur av TSB med ingen dextros, överfört i respektive 0,2 mL kvantiteter tre gånger till 70 mL serum flaskor med 20 mL " nanotrådar " medium att avlägsna spår av TSB. Protokollet förutsätter dock att endast en odlingsmedium kommer att användas, och att efterföljande överföringar inte kommer att genomföras, eftersom detta var gjort med dessa särskilt medelstora lösningar för S. oneidensis. Även om inte anges i detta protokoll, rekommenderas extra överföringar såhär som initialt deponerar bakterierna till den rika TSB hjälper frysta cellerna återhämta sig; och tre efterföljande överföringar till " nanotrådar " säkerställer att alla TSB är borta och att typiska tillväxtdynamik inträffar.
   1. Ympning förrätt kultur
      1. ta bort bakteriell glycerol beståndet från-80 ° C frysen och värma beståndet med en behandskade hand Tina så snabbt som möjligt. Flytta denna frys lager till den biologiska säkerhetsskåp (BSC).
      2. Inom the BSC, Använd en 1 mL spruta med en 22G injektionsnål för att överföra 0,1 mL av frys lager till ett utjämnat och krusad anaerob kultur rör innehållande 5 mL odlingsmedium med ingen dextros, bereddes i steg 1.1.2. Kassera resterande frys lager i lämpligt biologiskt avfall behållare, som fryser igen kunde uppröra cellerna.
      3. Inkubera starter kulturen i en shaker/inkubator vid 30 ° C 150 varv per minut (rpm) och se till att ta en optisk densitet på 600 nm (OD ₆₀₀) läsning när du är redo för användning. Registrera tid av tillväxt och OD ₆₀₀ sådana att det kan göras vid samma tidpunkt för varje efterföljande användning, så att resultaten är reproducerbara. Som ett exempel, denna förrätt kultur var tillåts växa för 15 h och används på en OD ₆₀₀ ca 1.0.
   2. Ympning odlingsmedium
      1. ta tre serum flaskorna bereddes i steg 1.1.1.2 och starter kulturen beredd i 1.3.1.3, och föra både till BSC.
      2. Inom the BSC, med en steril 1 mL spruta med en 22G injektionsnål, överföring 0,1 mL av lösning från förrätt kultur till varje serum flaskor, respektive.
      3. Sterilize toppen av serum flaskorna med 70% etanol och täck med steriliserad aluminiumfolie, märk på lämpligt sätt, och överföra till orbitalskak inom en inkubator. Ange den roterande blandare för 150 rpm och ange inkubatorn till 30 ° C. Inkubera tills första OD ₆₀₀ data pekar tas, inom steg 1.3.3.
   3. Att erhålla OD ₆₀₀ datapunkter
      1. förbereda en tom av deponerar 100 µL av filter-steriliseras destillerat avjoniserat vatten (DI) vattnet i en steril kyvetten. Linda plast paraffin filma runt toppen av kyvetten så att vattnet inte kontamineras. Förvara i rumstemperatur. Använd detta Tom med UV/Vis spektrofotometer innan du tar alla datapunkter för tillväxtkurvan genom att infoga kyvetten och trycka på " tom ".
         Obs: Varje 48 h ny tomt bör vara beredda att undvika felaktiga läsning, som regelbundet byta en tom är bra praxis.
      2. För varje OD ₆₀₀ datapunkt, ta bort serum flaskorna bereddes i steg 1.3.2.3 från inkubator och överföring till en steriliserad BSC. Ta 0,1 mL av inokulerade medium från varje serum flaska och insättning i tre separat märkta sterila kyvetter.
      3. Efter blanking, infoga kyvetten som innehåller kultur i ultraviolett synligt (UV/Vis) spektrofotometern läsa OD ₆₀₀ en i taget och spela in alla tre behandlingar för att tidpunkt.
         Obs: För S. oneidensis MR-1, datapunkter togs på 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 och 105 h efter inympningen. Tillväxten är slutförd när bakterierna har avslutat fasen döden. Dessa punkter bör justeras om det finns brist på kunskap om viss tillväxt tid och tendensen av bakterier som används i detta protokoll. Om det råder osäkerhet om tillväxt tendensen, punkter bör vara insamlade oftare, till exempel, varje tre h för de första 12 h, varje sex h för efterföljande 36 h, med 12 timmars intervall för följande 100 h och vid 24 h intervall för den slutliga 124 h.
      4. Använder den OD ₆₀₀ datapunkter som y-axeln och tiden som x-axeln, diagram en kurva av genomsnittet av de tre punkter som tagits med standardavvikelse felstaplar för varje tidpunkt med hjälp av en grafritande programvara. S. oneidensis MR-1 tillväxtkurvan visas i figur 1 B i avsnittet representativa resultat.
      5. Med hjälp av den graf som bereddes i steg 1.3.3.4, identifiera tidsramen för avsnittet log-fas i tillväxtkurvan. För Shewanella är mellan 12 och 33 h för tillväxt. Det kan därför utläsas på 24 h tillväxt, Shewanella kommer att inom dess logg-fas av tillväxt, förutsatt att bakterierna kommer vara odlade med hjälp av samma media och behandling före användning som användes för tillväxtkurvan.

2. Odla bakterier

1. dag ett: ympning på agarplattan
   Obs: detta avsnitt av förfarandet användes med en agaros plate att ta en kolonibildande enhet (CFU) på logg-fas, i stället för flytande starter kulturen används för tillväxtkurvan. Detta kunde antas för att reproducera samma tillväxt villkor, på grund av att TSA utan dextros användes och därefter överföras till " nanotrådar " medium i tillväxt kurva förfarande och TSA har samma ingredienser som utgör TSB.
   1. Ta bort S. oneidensis MR-1 GFPbacteria lager från-80 ° C frys och plats i en ishink, placera denna hink inuti steriliserad BSC.
   2. Inom BSC, Använd en steril 1 µL inympning ögla att skrapa ytan av frysta bakterier beståndet och använda slingan till T-strimma ytan av en agaros plattan.
   3. Vänd plattan efter tätning sidorna av plattan med plast paraffin filma, och lagra i en 30 ° C inkubator för 24 h, tills enskilda kolonier visas.
2. Dag två: ympning Serum flaskan
   1. avlägsna plattan från inkubatorn och öppna inom BSC.
   2. Inom BSC, rengör ytan av gummiproppen på beredda serum flaska från steg 1.1.1 med 70% etanol i DI vatten.
   3. Välj en enskilda CFU på agarplatta och, med en steril spruta med en bifogad 22 gauge nål, sätta in tillräckligt Odlingsmedier för att rubba kolonin från plattan utan att vidröra någon angränsande kolonier och blanda kolonin med medellång med spets nålen.
      : Anmärkning ensamma koloni bör väljas som är tillräckligt långt borta från andra bakterier på plattan, så att medel kan deponeras på den utan att röra någon andra kolonier.
   4. Använder samma spruta, extrahera vätskan från ytan av plattan.
   5. Efter att trycka ut bubblor i sprutan, injicera vätskan i serum flaskan, och placera på orbitalskak inom 30 ° C till 150 rpm för 24 h.
      Obs: Knacka bubblorna ur sprutan är viktigt för att undvika att införa mer syre i serum flaskan, som att införa mer syre i flaskan kan ändra experimentella förhållanden och minska konsekvens mellan tillväxt gånger för bakterier.
3. Dag två: sterilisering av de SALVI Microchannel
   Obs: för att främja steriliteten hos rörsystem, steg som kräver ta loss sprutan från slangar och ersättning med en ny spruta bör ske inom BSC. För att göra detta, helt enkelt lossa sprutan från sprutpumpen genom att skruva loss hållaren metall spruta och ta sprutan med slang kopplad till en steril BSC. När rörsystem nämns i förfarandena, detta refererar till sprutan som innehåller flytande reservoaren, fäst med en polyetheretherketon (PEEK) spridare till PTFE-slangen, bifogas den droppkammare, som har en PEEK insprutare montering bifogas de SALVI inlopp slangar, samt behållaren outlet som SALVI outlet slangen är förseglade till.
   1. Använder en ny SALVI enhet och bifoga en PEEK montering och spridare till ena änden av en fluorplastslang.
      Obs: SALVI enheter är förberedda färska för varje experiment efter enhet tillverkning beskrivs i tidigare forskning och patent. ^{5 , 6 , 8 , 15}
   2. ta 2 mL 70%-ig etanol i en spruta och Anslut till tillbehöret PEEK på SALVI. Efter ansluta sprutan till en sprutpumpen och fästa SALVI utlopp till en avfallsflaskan, låt etanol DI vatten lösningen att köra igenom SALVI 20 µL/min för 1,5 h.
   3. Ta 4 mL steriliserat DI vatten i en spruta och ansluta till öppningen av den samma SALVI. Efter anslutning sprutan till en sprutpump, låta vattnet kör genom SALVI på 20 μL/min under minst 3 h.
   4. Inom en BSC, öppna folie paket bereddes i steg 1.2.5 och Anslut en steril PEEK injektion passande till slutet av 5 mL sprutan och sterila PEEK beslag till slutet av TFE slangen. Ta ~ 3 mL sterilt medium i en spruta och bifoga till TFE röret. Invertera 5 mL droppkammaren och, med en steril spruta, injicera odlingsmedium i droppkammaren tills den når en total volym om 1 mL.
   5. Ansluter i slutet av i 5 mL spruta droppkammaren till öppningen av SALVI.
   6. Ta 10 mL odlingsmedium i en steril spruta och ansluta till öppningen av den dropp slangen. Efter anslutning sprutan till en sprutpump, tillåta mediet att köra igenom SALVI 20 µL/min för 12 h (eller över natten). Använd tejp för att säkra dessa delar. Täcka outlet flaskan med aluminiumfolie eller plast paraffin filma att minimera sannolikheten för dammpartiklar och organismer som finns där för att förorena medium. En detaljerad skildring av hur denna konfiguration ska se återfinns i figur 1 A.
      1. Tillåta den dropp slangen vara vertikal, vilket innebär att sprutpumpen bör placeras på en upphöjd yta med dropp slangar säkra med tejp och den SALVI säkrade på en plan yta nedan.
      2. Köra medium genom SALVI för 12 h se till att alla spår av etanol har avlägsnats från microchannel och slangar av SALVI innan vaccinera med bakterier.
      3. För extra skydd, hålla SALVI microchannel kammaren inom en steriliserad petriskål, med sidorna skäras för att passa inlopp och utlopp slang. Dessutom hålla band alltid på fönstret för att skydda den synden membran och kanalen före imaging analys.
4. Dag tre: inokulering av den SALVI Microchannel
   1. ta bort den hela rörsystem (spruta ansluten till att droppa kammare ansluten till SALVI ansluten till avfallsflaskan) från sprutpumpen och föra den till en steriliserad BSC. Dessutom ska serum injektionsflaskan från steg 2.2.5 från inkubatorn och föra den till BSC.
   2. Rengör ytan av serum flaska gummiproppen med 70% etanol att förhindra kontaminering, och sedan använda en steril spruta med en fastsatt sterila 22G nål för att extrahera 4 mL bakterier från flaskan.
   3. Loss SALVI från 5 mL kammare dropp slangen och Anslut sprutan med inokulerade medium direkt till öppningen av SALVI. Lämna den dropp slangen inom en steril aluminiumfolie paket eller inom BSC.
   4. Koppla sprutan med SALVI och utlopp flaska till sprutpumpen att köra 20 µL/min för 3 h att Inokulera kanalen för SALVI, för att möjliggöra flera volymförändringar av vätskan inom SALVI.
   5. Efter inympningen, koppla bort sprutan med SALVI från sprutpumpen och föra till BSC. Efter fästa öppningen av SALVI tillbaka till 5 mL droppkammaren från steg 2.4.3, ta 20 mL odlingsmedium i en steril spruta och bifoga till öppningen av den dropp slangen.
   6. Slangen kopplad till SALVI från BSC till sprutpumpen och låt medlet att passera genom slangen med en hastighet av 2 µL/min sex till tio dagar, eller tills fluorescens imaging (beskrivs i steg 3) visar gynnsamma synliga biofilm tillväxt för ToF-SIMS analys. Fyll färskt medium enligt det löper ut inom BSC genom att fylla en ny steril spruta med 10mL odlingsmedium och bifoga till SALVI efter föregående odlingsmedium har tagit slut.
      Obs: Efter början inympning 2 µL/min, flödet bör aldrig ökas eller minskade, som att ändra flödet skulle skapa shear stress inom kanal och lossa biofilmen. Det är viktigt att detta flöde bör aldrig ändras; för att förbereda detta, ~ 24 h innan SIMS, iaktta slangen nära för att se till att det finns inga bubblor så att det finns ingen anledning att driva mer medium snabbare i hela slangen.
      1. Undvika bubblor i microchannel, som de kan driva biofilmen ur kanal. Det är viktigt att vara försiktig med bubblor i botten av 5 mL dropp slangar där den ansluter till SALVI slangen. Färsk medium kan injiceras i slutet av PEEK injektorn att säkerställa att ingen luft kommer att tvingas till SALVI.

3. Optisk Imaging av biofilmen inom den SALVI Microchannel

1. Fluorescence mikroskopi Imaging
   Obs: den Shewanella används som modellorganism inom detta protokoll är muterad uttrycka GFP; som sådana, det kräver inte färgning. Om bakterier kräver färgning, bör detta alltid göras vid det samma flödet (t.ex., 2 µL/min) att undvika biofilm avlossning. Dessutom, när celler går utan näringsämnen tillgänglighet, kommer de loss. Därför krävs någon ytterligare färgning, injiceras fläcken till odlingsmedium snarare än vatten innan du levererar för att färga cellerna.
   1. Lossa SALVI från dropp slangar inuti BSC och Stäng SALVI genom att skruva PEEK beslag för att skruva i unionens PEEK.
   2. Tejpa slangen av SALVI microchannel kammaren säkert på en glasskiva, så att fönstret är helt platt och vänd uppåt. Ta bort skyddstejpen från fönstret. Klämma i bilden på scenen av mikroskopet genom att placera en glasskiva mellan scenen klämmorna på plattformen.
   3. Lägre scenen av mikroskopet så att toppen av SALVI är placerad nära nog till slutet av syftet för 10 X, där justering av fokus inte kommer att orsaka linsen röra fönstret.
   4. Switch på bakgrundsbelysning och hitta kanalen med 10 x Mikroskop mål genom att justera fokus. Vid denna tid, kontrollera förekomst av bakteriell anknytning till fönstret synden i SALVI framgår i jämförelse med fönstret i en Kontrollkanal med inga inokulerade bakterier. För närmare imaging av celler, växla till syftet 20 x. Jämfört med en tom SALVI kanal, förekomsten av bakterier som bifogas fönstret bör ha en stark grön fluorescens.
   5. Stänger av bakgrundsbelysningen och slå på mikroskopet kvicksilver källan. Vänta 2-3 min och växla till FITC filtret inställt på mikroskopet se och fånga bilder av den biofilm som bifogas fönstret. Som ett exempel på vad den mognade biofilmen ser ut när du är klar, se figur 1 C.
   6. Turn off kvicksilver källan och lossa SALVI från bilden. Om det behövs, fäst 2 µL/min medelflöde återigen för att möjliggöra mer tillväxt före imaging igen, eller överföra SALVI till sekundär inneslutning användning för ToF-SIMS analys. Detta behövs om biofilm tjocklek sluts inte vara tillräckligt tjock, och mer tid för tillväxt krävs innan ToF-SIMS analys. Om du vill bifoga medelflöde återigen, se steg 2.3.6.
      Obs: Om sätta tillbaka under medelflöde, fluorescens imaging ske igen innan ToF-SIMS analys.
      1. Ge biofilmen odlingsmedium att mata den tills ToF-SIMS analysen kan göras. Medan rekommenderas inte, om det behövs, den slutna SALVI kan lagras inom 4 ° C över natten, men får värmas upp till rumstemperatur innan du sätter till vakuum avdelningen av ToF-SIMS. Dock analysera biofilmen omedelbart efter lossnat från medelflöde att minska biofilm avlossning.

4. ToF-SIMS Data Acquisition

Obs: detta avsnitt fungerar som en översikt och diskuteras mer i detalj inom vårt tidigare protokoll som beskriver adsorberade protein molekyl flytande SIMS analys. ¹²

1. Installera SALVI in i ToF-SIMS Loadlock kammaren
   Obs: Handskar bör bäras i alla tider när hanterar SALVI enheten och installera det på ToF-SIMS skede för att undvika potentiella föroreningar under ytan analys.
   1. Mount SALVI på scenen och fixa det med flera skruvar. Kontrollera att fönstret synd är platta genom att justera skruvåtdragningen och infoga kisel wafer bitar på botten av PDMS microchannel kammaren. Ta bort skyddstejpen från fönstret och sedan läsa in scenen i ToF-SIMS loadlock kammaren.
   2. Öppna den ToF-SIMS loadlock, håll upp vågrätt på lastning plattformen och Stäng luckan till loadlock. Initiera vakuumpumpen och vänta med att se till att lämplig vakuum uppnås.
   3. Flytta SALVI in i huvudsakliga kammaren när dammsugaren är stabiliserad 1 x 10 ^-7 mbar.
2. Djup profilering och samla datapunkter
   1. hitta kanalen simuleras med hjälp av det optiska mikroskopet utrustade i ToF-SIMS.
   2. Välj positiva eller negativa läge innan datainsamling. Användning 25 keV Bi ₃ ⁺ balk som den primära ion beam i alla mätningar och använda electron översvämning kanon för att neutralisera ytan laddning vid alla mätningar.
   3. Scan Bi ₃ ⁺ balken med 150 ns pulse bredd på ett runt område med en diameter på ~ 2 µm med 64 x 64 pixlar. Efter stansning genom fönstret 100 nm synd, fortsätter att söka efter ytterligare 150 s hög intensitet datainsamling för avbildning. Efter punch-through, kommer att räkningarna öka avsevärt inom djupet profilering regionen. Efter stabiliserande, detta kan betecknas som regionen högintensiva.
   4. Minska pulsbredd 50 ns datainsamling ska förvärva spectra med bättre massa upplösning. Fortsätter detta förvärv för om ytterligare 200 s.
   5. Upprepa dessa steg för att samla in minst tre positiva och tre negativa datapunkterna.
      Obs: Glöm inte att utrymme punch-through områdena så att fönstret synd inte kommer att bryta och läcka in i kammaren av vakuum från äventyras fönster integritet.

5. ToF-SIMS dataanalys

1. massa kalibrering med IonToF programvara
   1. Öppna programvaran analys av ToF-SIMS (mätning Explorer) och klicka sedan på den " profiler ", " spectra " och " bild " knappar, respektive att processen djup profil, m/z spektrum och bilddata.
   2. Öppna datafilerna erhållits under hela ToF-SIMS dataförvärv.
   3. Välj djup profilering data av intresse och rekonstruera spektra enligt den djup profil temporal serien.
   4. Press " F3 " att öppna den " massa kalibrering " fönster. Välja toppar för kalibrering baserat på kemiska föreningar som förväntas finnas i särskilda provet.
2. Toppar av intresse markering
   1. peak urval är nödvändig för provanalys, bestämma karakteristiska topparna i provet enligt litteratur eller andra tidigare fynd, om någon. Jämföra intensiteten i topparna av intresset för m/z spektra. Om det behövs, lägga till nya toppar eller ta bort störningar toppar i topp listan.
   2. Klicka på en topp, hitta de röda linjerna på nedre vänstra fönstret. Flytta de röda linjerna att omsluta hela toppen.
   3. Välj en topp på den kemiska formeln i fönstret huvudsakliga spektrum och sedan klicka på den " lägga till peak " knappen ovanför fönstret. < /Li >
3. Exportera massa kalibrerad Data
   1. att exportera en topp lista, i den " topp lista " menyn, Välj " Spara … " topp listan i den " itmil " format.
   2. Att exportera en djup profil, i den " profil " fönster, klicka på den " fil " menyn, välj sedan " exportera ", och välj sedan " Spara som " en " .txt " filen.
   3. Att exportera en m/z spektrum fil, i den " Spectra " fönster, klicka på den " fil " menyn, välj sedan " exportera ", och välj sedan " Spara som " en " .txt " filen.
   4. Att exportera en bildfil, i den " bilden " fönster, skriva ut skärmen och Spara som en bildfil.

6. ToF-SIMS Data plottning och Presentation

1. använda ett grafiskt verktyg för att importera data.
2. Gör en tomt som använder m/z som x-axeln och peak intensiteten som y-axeln för att visa det rekonstruerade spektrumet. Ett exempel ges i figur 2 en.
3. Kombinera rekonstruerade tvådimensionella (2D) bilder av olika m/z och bildar en matris för att visa antingen positiv eller negativ jon mappning. Ett exempel ges i figur 2 B.

Representative Results

Dessa representativa resultat tjäna för att visa hur den kemiska profilen av den bifogade biofilmen kan identifieras och tolkas, som erhållits genom ToF-SIMS. Efter plottning masspektra från ToF-SIMS datainsamling, belyst kort i avsnittet förfaranden bör peak identifiering utföras för att tilldela varje respektive m/z-värde identiteter. Detta kan göras genom omfattande litteraturstudie på masspektrometri på bakterier och specifika kemiska fragment som förväntas vara närvarande inom de bakterier som studeras, till exempel olika vatten kluster, fettsyror och protein fragment. ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} dessa representativa resultat visar endast de negativa masspektra som erhålls genom de S. oneidensis MR-1 biofilmen och DI vattenprov. Tolkning av positiva spectra följer ett liknande förfarande.

Figur 1 A visar schematiskt installationen enligt detta protokoll när odla en biofilm i den SALVI microchannel. Längst upp till vänster, bifogas sprutan en sprutpump, som håller medium flyter med en konstant hastighet under hela systemets PFTE slangar och inuti microchannel. Sprutpumpen är placerad ovanför droppkammaren, vilket förhindrar bakåt kontaminering av medelstora reservoaren att förhindra motila organismer från simning uppströms. Medlet rinner från reservoaren kammaren dropp direkt ut PFTE slangen av den SALVI, som passerar genom microchannel och genom outlet slangen till en förseglad outlet flaska. De streckade linjerna pekar från fönstret synd på en bild av en mognade S. oneidensis MR-1 GFP celler fångas av fluorescensmikroskopi, detaljerad i steg 3.1. Figur 1 B visar ett exempel på en tillväxtkurva som fastställts enligt modell organismen för detta protokoll, S. oneidensis MR-1. Från tillväxt faserna i denna graf, kan slutsatsen dras att den logg-fasen av tillväxt sker mellan 15-32 h i dessa specifika odling villkor. Ytterligare information från denna graf visar att 0-15 h är den eftersläpning fasen av tillväxt, och 33-105 h representerar den stationära fasen av tillväxt. Figur 1 C är en bild som förvärvats med fluorescensmikroskopi visar ett exempel på en mognade biofilm.

Figur 2 A visar de negativa masspektra av en hydrerad S. oneidensis MR-1 biofilm inom mikroflödessystem kanal, som erhållits genom i situ vätska ToF-SIMS. Denna graf visar ett exempel på massa urval (m/z 100-350) jämförelsen mellan biofilmen av S.oneidensis MR-1 och DI vatten, den senare erhölls som en systemkontroll. Figur 2 B visar en jämförelse av 2D-bilder av topparna av intresse för MR-1 biofilm och DI vatten erhålls genom ToF-SIMS. När intressant m/z-värden kan identifieras från att studera masspektrum, potentiella peak identifiering av m/z-värden korrekt tillskrivs kemiska fragment, som stöds av undersökningen IonToF SIMS programvara bibliotek och litteratur. Toppar av intresse i figur 2A omfatta vatten kluster (dvs m/z 107 (H₂O)₅OH^–, 125 (H₂O)₆OH^–, 143 (H₂O)₇OH^-, 161 (H₂ O) 179 (H₂O)₉OH^–, 215 (H₂O)₁₁OH^–, 197 (H₂O)₁₀OH^–,₈OH^–, 233 (H₂O)₁₂OH^-, 251 (H₂O) ₁₃ OH^–, 269 (H₂O)₁₄OH^–, 287 (H₂O)₁₅OH^–, 323 (H₂O)₁₇OH^-, 341 (H₂O)₁₉OH^–))⁹, som betecknas med röda linjer ovanför respektive toppar, quorum sensing relaterade föreningar biomarkörer (dvs m/z 175 C₁₀H₉nr₂^–), EPS biprodukter (m/z 123 C₂H₄PO₄^-, 159 P ₂ O₈H^–, 216 Cr₂O₇^–, 285 octadecanoethiols, 325 polära föreningar, C₁₂ polära föreningar)^15,16,18, och fettsyra kedja fragment (dvs m/z 127 [C₂H₃(CH₂)₃COO]^-, 255 C16:0 fettsyra, 279 linolsyra, C₁₈H₃₁O₂^–, 325 C₂₁H₄₀O₂ ^-, 341 yta lipider, 18-MEA bunden genom thioester länkage, stearinsyra C₁₈H₃₅O₂^–, joner av monoacylglyceryls av palmitinsyra C₁₉H₁₇O₆ ^-). ^{16 , 19}

Eftersom biofilmen är hydratiserade, är det inte förvånande att några toppar som sett i biofilm provet är liknande de som finns i DI-vatten. Dessa vatten kluster toppar är markerade med en röd linje ovanför varje topp i figur 2A, inklusive m/z 107 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323, och 341 och motsvarande till (H₂O)₅OH^– (H₂O) ₆ Åh^– (H₂O)₇OH^– (H₂O)₈OH^– (H₂O)₉OH^– (H₂O)₁₀OH^– (H₂ O)₁₁OH^– (H₂O)₁₂OH^– (H₂O)₁₃OH^– (H₂O)₁₄OH^– (H₂O)₁₅OH^- (H₂O)₁₇OH^– (H₂O)₁₉OH^-, respektive. ⁹ eftersom det är prevalensen av många karakteristiska vatten kluster i denna masspektrum, detta resultat ger en stark bevis på den kemiska vatten cluster-miljön finns i en hydrerad biofilm. Dessutom relaterade icke-vatten kluster toppar observerades i båda spektra kan vanligen hänföras som störningar toppar, vanligtvis från PDMS, en komponent i ultrakalla kanalen. Till exempel är en gemensam kända störningar peak från PDMS m/z 137 i negativ jon-läge.

När jämföra biofilmen SIMS massa spectra som DI vatten, som visas i figur 2A, några toppar finns inte i det DI-vattnet, men de visas i biofilmen. Till exempel toppen vid m/z 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinsyra) är närvarande vid hög intensitet i biofilm provet, men inte alls i DI vatten provet. Detta tyder på att de signaler come från biofilmen, troligen biofilmen och/eller dess självgenererade EPS. Många intressanta toppar identifierades i figur 2A. Till exempel EPS relaterade toppar är m/z 123^-, befunnits vara C₂H₄PO₄^-, 159 P₂O₈H^–, 216 (Cr₂O7^–), 285 (octadecanoethiols), och 325 (polära föreningar, C ₁₂ polära föreningar). ^{17 , 18 , 20} toppar som är associerad med fettsyror befanns vara 127 ([C₂H₃(CH₂)₃COO]^–), 255 ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinsyra), 279 ([CH₃ (CH₂)₁₅COO]^-, linolsyra), 317 (C₂₁H₃₃O₂^–), 325 (C₂₁H₄₀O₂^–) och 341 (Surface lipider, 18-MEA bundna genom Thioester länkage, stearinsyra C₁₈H₃₅O₂^-, joner av monoacylglyceryls av palmitinsyra C₁₉H₁₇O₆^–med flera). ^{16 , 19} slutligen en kinolon signal quorum sensing signal med topp av C₁₀H₉nr₂^– observerades vid m/z 175.

Figur 2 B visar 2D-bilder av fördelningen av fyra olika intressanta joner mellan S. oneidensis MR-1 biofilm (översta raden) och DI-vatten (nedersta raden). M/z värdet 107 ((H₂O)₅OH^–) visar ett vatten kluster av betydande intensitet inom proverna, m/z värdet 175 (C₁₀H₉nr₂^–) skildrar en quorum sensing relaterade signal, m/z 255 är en fettsyra ([CH₃(CH₂)₁₄COO]^-, palmitinsyra), och m/z 341 (C₂₁H₄₁O₂^–) kan representera både lipid fragment och vatten kluster på grund av 1 amu massa noggrannhet. ⁹ ljusare regioner 2D bilder indikerar en högre räkna av den molekylära jonen som finns i bilden. Som förväntat, signaler för QS sammansatta, och lipider var mycket större i kvantitet inom biofilm provet. Signalen för vatten klustret (m/z 107) var starkare i hela biofilm provet, var det också i DI vatten provet, som förväntat. Slutligen, signalen på m/z 341 befanns vara homogen inom biofilm provet, men mycket svagt inom DI vatten provet. Medan m/z 341 var en vatten kluster topp, var det också företrädare för flera olika fettsyror och ytan lipider. ¹⁶ sin starkare närvaro inom biofilm provet efter normalisering av data tyder på att förekomsten av lipid fragment långt uppväger förekomsten av vatten kluster.

Figur 1 : Experimentell Schematisk. (A) visar den experimentella schematiskt av biofilm installationen som det visas i laboratoriet. Start överst till vänster, medellång flödena från sprutan (1), som är knuten till sprutpumpen (2), kontroll av takt med vilken vätska flyttar sig igenom. Pilarna anger flödesriktningen i hela systemet. Sprutan (1) är ansluten via en PEEK insprutare montering (3) till TFE slangen (4). Medium flyter genom en droppkammare (5) för att undvika kontaminering, och så småningom flyttar genom SALVI (6) till behållaren förseglade utlopp (7). Sprutpumpen är placerad på en upphöjd yta (9) sådana att droppkammaren (5) kan vara vinkelrät mot den plana ytan (8) som SALVI (6) är placerad på. (B) tillväxt kurvan för Shewanella oneidensis MR-1 i ”nanotrådar” medium. Tid 0-15 h representerar eftersläpning fas, tid 15-33 h representerar log fas, tid 33-105 h representerar stationär fas och tid 105 h eller längre representerar död fas. Felstaplar representera standardavvikelse. (C), en bild av en mognade biofilm som förvärvats med fluorescensmikroskopi. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Jämförelser av ToF-SIMS negativa spektra av den hydrerade Shewanella oneidensis biofilm och MR-1 medium i den SALVI microchannel. (A), m/z SIMS masspektra av den Shewanella oneidensis biofilmen i MR-1 medium och DI-vatten. Den sistnämnda användes som kontroll. Röda linjerna indikerar platser karakteristiska vatten kluster toppar. (B) 2D-bild jämförelse av topparna i intresse mellan biofilm och DI-vatten. Från vänster till höger, bilder visas ett vatten kluster (m/z 107 (H₂O)₅OH^–), en quorum sensing/hormon signal (m/z 175, C₁₀H₉nr₂^–), en fettsyra (m/z 255, [CH₃(CH ₂)₁₄COO]^-, palmitinsyra), och surface lipider och EP fragment (m/z 341, 18-MEA, C₂₁H₄₁O₂^–). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Efter ympning på logg-fas, är det viktigt att testa antalet dagar och temperatur vid vilken biofilmen bör växa innan det är hälsosamt och tjock nog för imaging, som beskrivs i steg 3.1. Proceduren omfattar särskilt odling en S. oneidensis MR1 biofilm i rumstemperatur; men olika rum temperaturer kan påverka tillväxten. Därför är det viktigt att använda optisk imaging för att förstå om biofilmen är redo innan du fortsätter till ToF-SIMS analys. Likaså kräver olika bakteriestammar olika odlingsbetingelser och längd för att uppnå en önskvärd tjocklek för analys. Medan tillväxtkurvan i figur 1b skildrar log fas 200 av bakterier vara 12-32 h, och detta användes på 24 h under hela förfarandet, är det viktigt att notera att denna tid inte kan användas som log-fas för andra stammar av bakterier utan att etablera tillväxtkurvan självständigt. Medan den logg fasen var mellan 12 och 33 h tillväxt för S. oneidensis, valdes 24 h på grund av att det var i delen av tillväxt där syre började begränsa ökningstakt av skadegöraren, mot slutet av loggen-fas. Experiment visade att detta var tid cellerna började producera nanotrådar, därmed primas till formuläret framgångsrika biofilm som kunde överleva i låg syrehalt miljöer. ^{3 , 13} följaktligen tiden valt att använda bakterier under log fas bör påverkas av forskning erfarenhet och kunskap vunnits från litteratur på experimentell studie av bakterier som studeras. Dessutom måste en separat tillväxtkurvan fastställas för att förstå den logg-fasen för alla olika stammar av bakterier som kommer att användas för biofilm tillväxt med hjälp av denna metod. 2 µL/min var tillväxt beräknas så som att inte överstiga den högsta tillväxttakten av S. oneidensis MR-1, och den totala tiden valdes för att få en mogen biofilm som inte var igenväxt och benägna att ta loss. Dessa priser kan justeras till kunskap om olika bakterier som ska användas med denna setup.

Vissa begränsningar med SALVI för biofilm tillväxt inkluderar biofouling inom kanalen samt sannolikheten för bakterier att fästa på plana väggar av kanalen. Trots tillväxten med en konstant hastighet, rekommenderas att vara 2 µL/min inom detta protokoll, kan biofouling fortfarande förekomma om biofilmen tillåts växa alltför länge. I ett sådant fall kan utan varning, biofilmen lossna från fönstret och avsluta SALVI till outlet inneslutning. Biofouling kan också uppstå helt enkelt genom att lägga till mekanisk kraft (dvs., flytta) den SALVI, som inte kan undvikas. Dock kan detta hållas i schack genom att Visa fastsättandet av biofilmen på fönstret synd innan ToF-SIMS analys enligt ett ljusmikroskop. En annan begränsning omfattar den PDMS microchannel vilket kan göra det svårt för vissa bakterier att fästa jämnhet. Detta kan dock ändras i utformningen av SALVI att rymma genom att skapa ribbade kanter till kanal, om fastsättning av bakterier är ett problem. Slutligen, blodkroppar kan göras i stället för OD₆₀₀ mätvärden för tillväxt kurva bestämning. Studier har exempelvis visat direkt och konsekvent korrelation av blodbilden till OD₆₀₀ läsningar. ²¹ därför OD₆₀₀ anses tillräcklig utvärdera biofilm tillväxt.

Begränsningar av denna teknik är några, som SALVI fungerar i huvudsak som en kultur maträtt som har mycket mångsidighet för användning i många tillämpningar, såsom anaerobt inom ett handskfacket eller inom någon temperatur-kontrollerade klimatkammare. Vissa smärre begränsningar inkluderar okontrollerbara rummets förutsättningar såsom relativ luftfuktighet, temperatur, placering nära solljus, som fortfarande är möjliga att hysas för, för varje specifik bakteriernas optimal tillväxt villkorar. Dessutom kan några av dessa tekniska utmaningar övervinnas med en inkubator med temperatur eller RH medling funktioner i biofilm setup.

SALVI är ett vakuum-kompatibel mikroflödessystem gränssnitt. I detta arbete användes en 200 x 300 µL mikroflödessystem kanal till kultur biofilmer som följt med optiska och flytande SIMS imaging. Vätskor utgör en teknisk utmaning att studera med hjälp av vakuum baserade tekniker, eftersom de är flyktiga och svårt att behålla i den flytande fasen i vakuum. Således har vakuum tekniker såsom ToF-SIMS varit traditionellt begränsad till endast torr och kryogena prover. ²² dessutom SALVI kan användas för olika imaging och spektroskopi med hjälp av olika tekniker för mikroskopi och spektroskopi. ^{4 , 9} vår grupp har arbetat för att ständigt expandera olika SALVI applikationer i situ analys av vätskor och fast-flytande gränssnitt. ^{15 , 23 , 24} våra senaste insatser effektivt visat bakterier fäster synd membranet. ⁹ efter inledande fastsättning, kontinuerligt flöde av medium över tid visat sig framgångsrikt odla en biofilm direkt i fönstret synden i SALVI. Under ToF-SIMS används den primära ion beam att bombardera hål 2 µm i diameter. Denna dimension är liknande till cell längden av den biofilm som bifogas synd fönstret, vilket ger en kemisk profil av biofilmen i dess naturligt återfuktad mikromiljö. Detta är mycket viktigt på grund av den skillnaden av en biofilm kemiska identiteten, förekomsten av EPS- och vatten-klustermiljö när man jämför biofilmer i dess hydratiserade med torkade prover. ⁹ utan användning av SALVI, ToF-SIMS kan endast utföras på torr och kryogena prover, tillhandahåller kemiska kartläggning som misslyckas att fånga den kemiska profilen av ett prov i dess naturliga hydrerad tillstånd.

Som visas i figur 1A, är det viktigt att hålla sprutpumpen ovan dropp slangar för att möjliggöra den dropp slangen vara vinkelrät mot den SALVI microchannel. Dessutom blir bubblor mindre benägna att fastna i slangen för enheten, om outlet PFTE slangen (inom outlet flaskan) är lägre än inlopp slangen (bifogas droppkammaren). En annan avgörande steg att odla bakterier för SALVI tillväxt är att först få en tillväxtkurva av särskilda bakterier stammen som ska användas, enligt beskrivningen i steg 1.3. Detta kan göras genom att erhålla tillväxtkurvor med optisk densitet mätningar. En tillväxtkurva, är som visas i figur 1B, viktigt för att förstå den tidsramen där bakterier kommer att inom den logg-fasen av tillväxt, när det kan antas att bakterierna är hälsosamma. Utnyttja bakterier inom denna fas av tillväxt underlättar skapandet av en hälsosam biofilm närmiljön och säkerställer att biofilmen kommer att växa med dess beräknade hastighet. Den SALVI microchannel steriliseras i rumstemperatur med 70% etanol och DI vatten, eftersom det inte kan autoklaveras för sterilisering före användning med ToF-SIMS. Detta är på grund av att autoklavering kan både skada fönstret i SALVI och införa vattenånga till kanalen. Efter flera dagar av tillväxt, bör microchannel kontrolleras med fluorescensmikroskopi att validera bakteriell fastsättning. Ett exempel kan hittas i figur 1C, denna bild togs för att visa en mognade biofilm. På grund av flödet sökvägen till mediet, bakterierna gynnsamt fäster och växer längs kanterna av microchannel, som denna plats är där flödet och skjuvning-krafter är lowest.

Sammanfattningsvis är SALVI en utmärkt metod som att kultur och studie biofilmer använder i situ kemiska kartläggning, eftersom det tillåter för att ge den levande biofilmen i dess naturliga hydrerad tillstånd till det vakuum-baserat imaging masspektrometer. Denna unika metod kan ge mer information om en biofilm vatten kluster närmiljön, samt att få en djupare förståelse av dess EPS biprodukter. Denna information kan användas för att förstå en biofilm biologiska aktiviteter, och kan användas i olika applikationer såsom i biomedicin, medicinsk teknik, jordbruk, och industriell forskning och utveckling.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ToF-SIMS	IONTOF	TOF.SIMS 5	Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI)	Pacific Northwest National Laboratory	N/A	SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer	New Brunswick Scientific	N/A	U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator	BioCold Scientific	N/A	COLDBOX1
Orbital Shaker	New Brunswick Scientific	N/A	Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump	Cole-Parmer	EW-74905-02	Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator	Barnstead International	LT1465X3	Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave	Getinge	533LS	Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	4001-000	GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet	Thermo Fisher Scientific	1385	1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope	Nikon	N/A	Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter	Mettler Toledo	51302803	Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union	Valco	ZU1TPK	For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage	IONTOF	N/A	Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System	Thermo Fisher Scientific	D11921	ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette	Thermo Fisher Scientific	21-377-821	Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip	Neptune	2112.96.BS	1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle	Stanley	N/A	Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe	BD	309659	1 mL
Syringe	BD	309657	3 mL
Syringe	BD	309646	5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe	BD	309604	10 mL
Syringe	BD	302830	20 mL
Disposable Pipette	Thermo Fisher Scientific	13-678-11	25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler	Pipet-aid	P-57260	Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle	Sigma	33109-U	Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube	VWR	89167-178	Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper	Sigma	27235-U	Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum)	Sigma	27227-U	Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper	Wheaton	224307	30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing	Supelco	58697-U	1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes	GMBH	759085D	1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle	BD	303015	22G; used for serum bottle injection.
Needle	BD	305120	23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP	N/A	N/A	Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94.
Ethanol	Thermo Fisher Scientific	S25310A	95% Denatured
TSA	BD	212305	Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer	Sigma	P-1851	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide	Sigma	S-5881	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride	Sigma	A-5666	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride	Sigma	P-4504	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma	S-9638	Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride	Thermo Fisher Scientific	S271-3	Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate	Sigma	L-1375	60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate	Sigma	S-5761	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt	Sigma	N-0253	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride	Sigma	451649	Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate	Sigma	208094	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate	Sigma	M-7634	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate	Sigma	215422	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate	Sigma	223506	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride	Sigma	60818	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride	Sigma	229997	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate	Sigma	C-8027	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate	Sigma	237086	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid	Sigma	B-6768	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate	Sigma	331058	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride	Sigma	339350	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate	Sigma	14304	Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin	Sigma	47868	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid	Sigma	F-7876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride	Sigma	P-9755	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2)	Sigma	47861	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride	Sigma	T-4625	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid	Sigma	N4126	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt	Sigma	21210	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12	Sigma	V-2876	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid	Sigma	A-9878	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid	Sigma	T-1395	Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}