Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Situ Shewanella Corynebacterium MR1 biyofilmler SALVI ve ToF-SIMS tarafından karakterizasyonu

Published: August 18, 2017 doi: 10.3791/55944
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 2, 1
1Earth and Biological Sciences Directorate, Pacific Northwest National Laboratory, 2Wiley Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory

Summary

Bu makale bir biyofilm in situ uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi sulu durumda, kimyasal eşleştirmesi bir mikrosıvısal reaktör, sıvı vakum arabirimi analiz için sistemi tarafından etkinleştirilmiş için için büyüyen bir yöntem sunar. Shewanella Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein ile bir model olarak kullanıldı.

Abstract

Bakteriyel biyofilmler onların kendi ürettiği ekstraselüler polimer maddeler (EPS) ve çevre Mikrobiyolojisi kendi rollerini anlamak için büyük ölçüde incelendiği yüzey ilişkili topluluklar vardır. Bu çalışmada biyofilm eki için analiz sıvı vakum arabirimi (SALVI) adlı sistemine yetiştirmek ve in situ kimyasal bir yaşam biyofilm eşlenmesinin uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi (ToF-SIMS) elde etmek için bir yöntem özetliyor. Bu bakteri ile bizim özel tertibat SALVI kanal içinde ve dışında kültür aracılığıyla yanı sıra biyofilm varlığı ve kalınlığı ToF-SIMS analiz önce tespit etmek için optik görüntüleme teknikleri aracılığıyla yapılır. Sonuçlarımız Shewanella biyofilm karakteristik doruklarına doğal sulu haliyle göstermek onun yerelleştirilmiş su küme ortamında, hem de EPS vurgulayarak aynı biyofilm'ın büyük ölçüde farklı olan parçaları, sıvı kaybı Devlet. Bu sonuçlar in situ biyofilm görüntüleme için bir vakum tabanlı kimyasal görüntüleme aletle sağlar SALVI atılım kapasitesini gösterir.

Introduction

Bakteriyel biyofilmler neyin hücreleri eklemek ve birçok olası ortamlarda hayatta edebiliyoruz olumsuz fiziksel ve mekanik uyaranlara değişen hayatta kalmak bakteri için bir savunma olarak zaman içinde geliştiğini yüzey ilişkili topluluklar vardır. 1 , 2 biyofilmler büyük ölçüde incelenmiştir ve Biyomedikal, Biyomedikal Mühendisliği, tarım ve endüstriyel araştırma ve geliştirme gibi birçok alanda uygulamaları vardır. 1 , 2 kimyasal eşleme onların kendi ürettiği ekstraselüler polimer madde (EPS) ve yerel su-küme çevreleri de dahil olmak üzere bu karmaşık mikrobiyal toplulukların anlama doğru kazanıyor esastır ve detaylı biyolojik faaliyetlerini tasviri. 2

Biyofilmler var ve çok sulu bir devlet içinde büyür. Bu vakum uçucu sıvılar eğitim zorluk nedeniyle uçuş zaman ikincil iyon kütle spektrometresi (ToF-SIMS) gibi vakum tabanlı yüzey analiz teknikleri kullanarak büyük bir meydan okuma sunuyor. Sonuç olarak, vakum tabanlı yüzey analiz teknikleri biyofilm örnekleri kurutulmuş durumlarına, neredeyse sadece eğitim için sınırlı olmuştur. Ancak, bir biyofilm kurutulmuş haliyle okuyan onun gerçek biyolojik microenvironment doğru incelenmesi engeller. Bu kez situ içinde sıvı çalışmaları için Kuru biyofilm kitle spektral sonuçları karşılaştırarak sonra gösterdi EPS bütünlüğü ve biyofilm Morfoloji, köklü değişikliklere neden olur. 3 , 4 bu makale biyofilmler onların doğal sulu devlet içinde bizim sistem kullanım analizi, sıvı vakum arabirimi (SALVI),5,6 mikrosıvısal reaktör için istihdam ederek eğitim için bir çözüm sunar bu Böylece hala bir vakum içinde sıvı matris yapısal bütünlüğünü koruyarak ikincil iyon sonda ışın doğrudan erişim sağlayan polydimethylsiloxane (PMDS), yapılan bir microchannel onun ince silikon Nitrür (günah) membran altında sıvı içerir odası. 7 , 8

S. Corynebacterium Bay-1 yeşil Floresans protein (GFP) hızlı mutasyona metabolik çok yönlülük ve dayanıyordu çevre ve uygulamalı Mikrobiyoloji içinde yaygın kullanımı nedeniyle bu biyofilm yordamı illüstrasyon için bir model organizma olarak seçildi ağır metal azaltma ve ekstraselüler elektron transferi için kendi benzersiz yeteneğini. 9 , 10 , 11 Ayrıca, GFP varlığı kolay sürekli biyofilm-Floresans mikroskobu ile izleme, floresein isothiocyanate (FITC) filtre kullanarak kalınlığı için izin. Bizim önceki çalışmalar bu bakteri operando içinde Floresans Imaging'i kullanma ilâ 100 mikrometre kalınlığında bir biyofilm büyümesi için günah penceresine ek lehine kanıt göstermiştir. 4 , 12 bu kağıt sadece onay Floresans mikroskobu aracılığıyla biyofilm'ın varlığının ele alınacak, SALVI süper çözünürlük gibi diğer optik görüntüleme yöntemleri ile uyumlu iken Floresans görüntüleme (yani, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu (SIM)9) ve confocal lazer mikroskobu (CLSM)4Imaging tarama). Optik görüntü biyofilm kalınlığını ölçmek için hizmet ve göründüğü kalınlığı ve onun eki günah penceresine onaylayan bir 3D görüntü, biyofilm şeklinde elde edilir. 9 iken GFP SIMS analizde kullanılan, Corynebacterium S. GFP olmadan büyüme eğrisi için optik yoğunluk bu tek gerekli ölçüyü kullanıldı ve floresan herhangi bir görüntüleme gerek yoktu. Genel olarak, GFP arasındaki farkı öğesini ve büyüme eğrisi etiketsiz türler önemsizdir. Ayrıca, bu iletişim kuralını yordamı açıklamak için bir model organizma S. Corynebacterium Bay-1 GFP kullanırken bu yordamı SALVI içinde ekimi için gerekli olabilir bakteriyel herhangi bir zorlanma için tasarlanmıştır. Rağmen bilgi gerekli bakteri baskı göz önüne alındığında, süresi, sıcaklık ve oksijen çevre gibi bazı büyüme koşullar kullanılmak üzere bakteri suşu içerecek şekilde değişiklik yapmanız gerekebilir. Büyüme orta için kültür için "nanowires" orta, tryptic soya suyu (TSB) dekstroz ve tryptic soya agar (TSA) dekstroz olmadan olmadan bu yordamı kullanır. "Nanowires" orta kompozisyon özel olarak büyüme ve membran uzantıları izleme için formüle edilmiştir ve küçük tel ve orta kompozisyon şekillenmeye görünen S. Corynebacterium periplasm oldu önceki araştırma içinde kurulan. 13 , 14

Situ üzerinde bizim önceki iletişim kuralı sıvı ToF-SIMS SALVI protein immobilizasyon ve günah, hem de detaylı bir protokol ToF-SIMS analiz ve veri azaltma eki için sunabileceği yarar resimli. 12 veri azaltma adımları yinelemek yerine, bu kağıt kurma ve biyofilmler bizim SALVI microchannel yanı sıra biyofilm varlığı ve kalınlığı önceden tespit etmek için görüntüleme adımları içinde yetiştirilmesi benzersiz bir yaklaşım yerine odaklanmak için görev yapacak ToF-SIMS analiz için. Biyofilmler daha önce örnekleri vakum tabanlı yüzey analitik teknikler TMMOB içinde sadece kurutulmuş için sınırlı sahip iken, canlı biyofilmler detaylı EPS ve biyofilm kimyasal eşleme şimdi in situ bu yeni özellik nedeniyle elde edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlık malzemeleri

  1. Hazırlık orta boru
    1. Serum şişeleri (bir biyofilm kültür ve üç büyüme eğrisi gerekli ücret gerekli)
      Not: giriş, herhangi bir büyüme belirtildiği gibi Orta bakteri ilgi zorlanma için gerekli besin sağlamak uygun-ebilmek var olmak kullanmak için bu yordamı; Bu durumda, " nanowires " medya ve TSB dekstroz orta olmadan S. Corynebacterium Bay-1 GFP büyümesi için kullanıldı. 13
      1. büyüme orta bir 70 mL serum şişesi, içine depozito 20 mL tıpa kap ve şişe sarılmış. Biteviye-in temiz steril alüminyum folyo ile üst kapak.
      2. Basınçlı kap sıvı döngüsü için 30 dk 121, şişeyle ° C. Afterward, mağaza oda sıcaklığında steril serum şişesi.
    2. Anaerobik kültür tüpleri
      1. 5 mL büyüme ortamının bir anaerobik kültür tüp hava headspace ile Emanet, stoper üzerinde koymak ve şişe sarılmış. Steril folyo ile üst kapak.
  2. Kabarcık tuzak boru hazırlanması
    1. 22 gauge iğne kullanarak dikkatli bir serum şişesi kauçuk tıpa bir delik yumruk.
    2. Kesmek 1/32 20 " politetrafloroetilin (PTFE) böyle bir usturayla boru boru parçasını o bir ucunu sivri.
    3. Sivri uç kullanarak iş parçacığı PTFE boru kauçuk tıpa üst kısmı delikten. Kadar yaklaşık 2 cm ile tıpa ve PTFE tüpün sivri sonunda düz bir son için jiletle kesti tüp itme.
    4. 5 mL şırınga pistonu çıkarın ve kauçuk tıpa 1.2.3. adımdaki şırınga açık uçlu sığacak. Şırınga varil içinde PTFE boru 2 cm bitti. Bu kabarcık tuzağı.
    5. Alüminyum folyo ile 1.2.4. adımda ve otoklav bandı ile güvenli kabarcık tuzak (PTFE boru, kauçuk tıpa ve şırınga) sarın. Tüp bir yerçekimi ile sterilize etmek için folyo paket döngüsü 30 dakika süreyle 121 ° C'de otoklav adım 2.4 kullanmak için hazır kadar mühürlü folyo paket oda sıcaklığında saklayın.
  3. Bakteriyel büyüme eğrisi
    Not: Bu protokol S. Corynebacterium Bay-1 GFP SALVI biyofilm yetiştirmek için bir model organizma kullanır. Ancak, bu yordamı diğer bakteri tükenmesiyle veya anaerobik büyüme karşılamak için adapte edilebilir. Hangi zorlanma kullanılmasına bağlı olarak, büyüme zaman ve ortam buna göre ayarlanması gerekebilir.
    Not:-80 ° C bakteriyel dondurucu stokları TSB 1:1 karışımı dekstroz ve gliserol olmadan oluşuyordu. şekil 1 ' de B gösterilen büyüme eğrisi örnek TSB starter kültürü ile ilgili 0.2 mL miktarlarda 70 mL serum şişeleri ile 20 mL üç kez transfer yok dekstroz kullanarak hazırlanan " nanowires " orta TSB izlerini kaldırmak için. Ancak, bu iletişim kuralı yalnızca bir büyüme orta kullanılır ve sonraki transferler, bu kadar yapılacaktır değil ki bu belirli orta çözümleri ile S. Corynebacterium için yapıldı varsayar. Başlangıçta zengin TSB için bakteri yatırma donmuş hücreleri kurtarmak yardımcı olarak her ne kadar bu protokol için ana hatlarıyla değil, bunun gibi ilave transferler tavsiye edilir; ve üç sonraki transferler için " nanowires " tüm TSB gitti ve tipik büyüme dinamikleri oluşmasını sağlar.
      1. Starter kültür aşı bakteriyel gliserol hisse senedi-80 ° C dondurucudan kaldırmak ve mümkün olduğunca çabuk çözülme eldivenli bir el ile stok sıcak. Bu dondurucu stok hareket biyolojik güvenliği için dolap (BSC).
      2. İçinde BSC, dondurucu stokunun 0.1 mL 5 mL büyüme orta ile 1.1.2 adımda hazırlanan yok dekstroz içeren bir kaplama ve bükük anaerobik kültür tüp transfer etmek için bağlı 22 G iğne ile 1 mL şırınga kullanın. Dispose tekrar donma olarak uygun biyolojik atık kapsayıcısında, kalan dondurucu stokunun hücreleri şok.
      3. Bir shaker/kuluçka (devir/dakika) dakikada 150 rotasyonlar, 30 ° C'de starter kültür kuluçkaya ve 600 nm (OD 600) okuma kullanım için hazır olduğunda, optik bir yoğunluk almak emin olun. Öyle ki her sonraki kullanım için aynı o zaman yapılabilir tekrarlanabilir sonuçlar vardır öyle ki büyüme ve OD 600 zamanını kaydetmek. Örnek olarak, bu starter kültür için 15 h büyümeye izin ve bir OD 600 yaklaşık 1.0 kullanılan.
    2. Aşı büyüme orta
      1. 1.1.1.2 ve 1.3.1.3 içinde hazırlanan starter kültür adımda hazırlanan üç serum şişeleri alın ve lisans için her ikisi de alın.
      2. İçinde steril 1 mL şırınga ile bağlı, 22 G iğne transfer 0.1 mL çözeltisi starter kültür her serum şişeleri, sırasıyla kullanarak BSC.
      3. Sterilize % 70 ile serum şişeleri üst etanol ve sterilize edilmiş alüminyum folyo ile kapatın uygun şekilde etiketleyin ve orbital Çalkalayıcı bir kuluçka içinde transfer. Orbital Çalkalayıcı 150 rpm ve kuluçka makinesi 30 ° c kadar ilk OD 600 veri noktası Incubate alınır, adım içinde 1.3.3.
    3. OD alma 600 veri noktaları
      1. boş bir filtre steril distile deiyonize (DI) yatırma 100 µL tarafından su steril bir küvet hazırlamak. Su değil kirlenmiş olabilir plastik parafin film üst kısmındaki küvet etrafında sarıyoruz. Oda sıcaklığında saklayın. Kullanım büyüme eğrisi için herhangi bir veri noktaları küvet ekleme ve tuşuna basarak çekmeden önce UV/Vis Spektrofotometre ile bu boş " boş ".
        Not: düzenli olarak boş bir yerine iyi bir uygulama olduğu gibi her 48 h boş yeni bir yanlış okuma önlemek hazır olmalıdır.
      2. Her OD 600 veri noktası için steril bir BSC adıma 1.3.2.3 kuluçka ve transfer hazırlanan serum şişeleri kaldır. İnoculated Orta 0.1 mL her serum şişesi ve mevduat üç ayrı ayrı steril cuvettes etiketli içine almak.
      3. Silme sonra kültür görünür ultraviyole (UV/Vis) Spektrofotometre içeren küvet Ekle ve OD 600 bir teker teker okumak ve o zaman noktası için tüm üç okumalar kayıt.
        Not: S. Corynebacterium Bay-1 için veri noktası 1, 14, 28, 32, 41, 57, 81 ve 105 h aşı sonra çekildi. Bakteri ne zaman ölüm faz büyüme tamamlanmıştır. Belirli büyüme zaman ve bu protokol için kullanılan bakterilerin eğilim bilgi eksikliği ise bu noktaları buna göre ayarlanmalıdır. Belirsizlik büyüme eğilimi hakkında ise, Puan-meli var olmak daha sık, örneğin, ilk 12 h, sonraki 36 h, şu 100 h 12 h aralıklarla ve son 124 h. için 24 saat aralıklarla her altı saat için her 3 h toplanan verileri
      4. OD 600 kullanarak veri noktaları olarak y ve x ekseni, olarak zaman grafiğini eğrisini standart sapma hata çubukları için bir grafik yazılımı kullanarak her zaman noktası ile çekilen üç puan ortalaması. S. Corynebacterium Bay-1 büyüme eğrisi şekil 1 B temsilcisi sonuçlar bölümünde görüntülenir.
      5. Adım 1.3.3.4, hazır grafik kullanarak büyüme eğrisi log fazı bölümünü süre belirleyin. Shewanella için bu büyüme 12 ve 33 h arasında. Bu nedenle bu büyüme 24 h Shewanella bakteri aynı medya ve tedavi için büyüme eğrisi kullanıldı kullanmadan önce kullanarak kültürlü varsayarak içinde büyüme, onun günlüğü-aşama olacaktır anlaşılmaktadır olabilir.

2. Bakteri kültürü

  1. bir gün: Agar plaka aşı
    Not: Bu bölümde yordam bir özel pla ile kullanılante log fazı, büyüme eğrisi için kullanılan sıvı starter kültür yerine bir koloni oluşturan birim (CFU) atın. Bu TSA dekstroz olmadan kullanılmış ve daha sonra transfer nedeniyle aslında bu aynı büyüme koşulları yeniden kabul " nanowires " orta büyüme eğrisi yordam ve TSA TSB oluşturan aynı maddeler vardır.
    1. Kaldırmak S. Corynebacterium Bay-1 GFPbacteria hisse senedi-80 ° C dondurucu ve yer buz kovası, bu kova içinde sterilize BSC yerleştirin.
    2. BSC içinde donmuş bakteriler hisse senedi yüzeyini kazımak ve döngü T-çizgi bir özel plaka yüzeyi için kullanmak için bir steril 1 µL aşılama döngü kullanın.
    3. Plastik parafin film ile tabak kenarlarında mühürleme sonra plaka ters çevir ve bireysel kolonileri görününceye kadar saklamak için 24 h, 30 ° C kuluçka.
  2. Gün iki: Serum şişe aşı
    1. kuluçka makinesi plaka kaldırmak ve BSC içinde açmak.
    2. BSC içinde adım 1.1.1 DI suda % 70 etanol ile hazırlanan serum şişesini kauçuk tıpa yüzeyinden temizlemek.
    3. Bireysel bir CFU agar plaka seçin ve steril bir ekli 22 ile kullanarak iğne ölçmek, herhangi bir komşu kolonileri dokunmadan koloni plaka çıkarmak için yeterli büyüme medya mevduat ve koloni orta ucu ile karıştırın iğneyi.
      : Not tek başına koloni diğer bakteri plaka üzerinde yeteri kadar uzak olan seçili gerekir öyle ki Orta yatırılır üzerine herhangi bir diğer kolonilere dokunmadan.
    4. Aynı Ģırınga kullanarak plaka yüzeyinden sıvı ayıklamak.
    5. Dokunarak dışarı kabarcıklar içinde belgili tanımlık tenkıye sonra sıvı serum şişe içine enjekte ve yer bir orbital Çalkalayıcı 30 ° C 24 h için 150 rpm'de ayarla içinde üzerine
      Not: şırınga dışarı kabarcıklar dokunarak daha fazla oksijen biberondan tanıtımı deneysel koşullar değiştirebilir ve bakteri büyüme saatleri arasında tutarlılığı azaltmak gibi serum şişesi için daha fazla oksijen tanıtımı önlemek için önemlidir.
  3. Gün iki: SALVI Microchannel sterilizasyon
    Not: kısırlık tüp sistemi tanıtmak için yeni bir şırınga ile boru ve yedek şırıngadan ayırma gerektiren adımları BSC içinde yapılmalıdır. Bunu yapmak için sadece metal tenkıye tutucusu gevşeterek tarafından şırınga pompa şırıngadan ayırmak ve şırınga steril bir BSC bağlı boru ile getir. Ne zaman tüp sistemi anlatılan yordamlar, bu ifade eder bir polyetheretherketon (göz) enjektör ile uygun bir göz enjektör damla odasına bağlı PTFE tüp bağlı sıvı depo, içeren şırınga için bağlı SALVI çıkış boru için kapalı çıkış konteyner yanı sıra boru SALVI giriş.
    1. Yeni bir SALVI aygıtı kullanın ve bir göz montaj ve enjektör PTFE boru bir ucunu takın.
      Not: SALVI aygıtları taze cihaz imalat ayrıntılı önceki araştırma ve patent her deney takip için hazırlanır. 5 , 6 , 8 , 15
    2. 2 mL % 70 etanol bir şırınga al ve PEEK uygun SALVI üzerinde bağlanmak. Bir şırınga pompa enjektör bağlanma ve SALVI çıkış atık biberondan ekleme sonra 20 µL/dk için 1,5 h. SALVI aracılığıyla çalıştırmak için etanol DI su solüsyonu izin
    3. Al 4 mL steril DI bir şırınga su ve aynı SALVI koya bağlayın. Bir şırınga pompa enjektör bağladıktan sonra su 20 μL/dk için en az 3 h. SALVI aracılığıyla çalıştırmak izin
    4. İçinde bir BSC 1.2.5 adımda hazırlanan folyo paket açın ve 5 mL şırınga ve steril göz parçaları TFE hortumunun sonuna sonu için uygun bir steril göz enjeksiyon bağlanın. Al ~ 3 mL steril orta içine bir şırınga ve TFE tüp takın. 5 mL damla odası ters çevir ve steril bir Ģırınga kullanarak, büyüme orta 1 mL toplam hacmi ulaşıncaya kadar damla odanın içine enjekte.
    5. 5 mL şırınga damla odası SALVI koya ucunu.
    6. Büyüme ortamının 10 mL steril enjektör almak ve damlama boru koya bağlayın. Bir şırınga pompa enjektör bağladıktan sonra orta koşmak-den geçerek SALVI 20 µL/dk 12 h için (veya bir gece için) olanak sağlar. Yapışkan bant buralarda güvenliğini sağlamak için kullanın. Folyo veya plastik parafin film toz parçacıkları ve orada bulunan orta kirletmek organizmalar olasılığını en aza indirmek için çıkış şişe kapağı. Bu kurulum görünmelidir nasıl ayrıntılı bir gösterimi şekil 1 içinde A bulunabilir.
      1. Şırınga pompa yükseltilmiş bir yüzeye boru damlalıkla bant ile ve bir düz yüzeye güvenli SALVI ile güvenli yerleştirilmesi gerektiğini anlamına gelen dikey olmak damlama boru izin.
      2. Orta etanol bütün izlerini kaldırıldı emin olmak için 12 h için SALVI çalıştırmak microchannel ve bakteri ile aşı önce SALVI tüp.
      3. Ek koruma için giriş ve çıkış boru sığacak şekilde kesilmiş etraf ile SALVI microchannel odası steril Petri kabına içinde tutmak. Ayrıca, her zaman penceresinde günah membran ve kanal analiz görüntüleme önce korumak için kaset kalacak.
  4. Üçüncü gün: SALVI Microchannel aşılama
    1. tüm boru sistemi (şırınga atık biberondan bağlı SALVI bağlı odası damlamaya bağlı) şırınga pompa çıkarmak ve getirmek bir steril BSC. Ayrıca, kuluçka makinesi 2.2.5 adımından serum şişe kaldırmak ve lisans için getirmek.
    2. Serum şişesi tıpa herhangi bir kontaminasyonu önlemek için % 70 etanol ile yüzeyi temiz ve steril enjektör bakterilerin 4 mL şişe ayıklamak için ekli bir steril 22 G iğne ile kullanın.
    3. Damla boru 5 mL TMMOB üzerinden SALVI bağlantısını kesin ve şırınga ile aşılanmış orta SALVI giriş olarak doğrudan bağlamak. Damlama boru steril alüminyum folyo paket veya BSC içinde bırakın.
    4. 20 µL/dk SALVI kanal birden çok birim değişikliği SALVI içinde bulunan sıvı için izin vermek için aşılamak 3 h için çalıştırmak için şırınga pompa SALVI ve çıkış şişe şırınga iliştirin.
    5. Aşı sonra SALVI şırınga şırınga pompa çıkarın ve lisans için getir. SALVI giriş adımından 2.4.3 geri 5 mL damla odasına bağlama sonra büyüme orta 20 mL steril enjektör almak ve damlama boru koya iliştirin.
    6. BSC şırınga pompa SALVI için ekli boru getirmek ve orta (Adım 3'te ele) floresan görüntüleme için olumlu görünür biyofilm büyüme gösterir kadar veya altı ila on gün için 2 µL/dk hızında boru geçmesine izin ver ToF-SIMS analizi. BSC içinde yeni steril enjektör büyüme orta 10 mL ile doldurma ve önceki büyüme orta çalıştıktan sonra SALVI için ekleme tarafından çalışırken taze orta dolum.
      Not: Aşı 2 µL/dk başlayan sonra akış hızı asla artırılmalıdır veya azalma, akış oranını değiştirmek kesme-stres kanal içinde oluşturup biyofilm bağlantısını kesin. Bu akış hızı asla değiştirilmesi gereken çok önemlidir; Bu, ~ 24 h önce SIMS için hazırlamak için yakından böylece daha fazla orta İtmene gerek yok hava kabarcığı yok olduğundan emin olmak için tüp gözlemlemek boru boyunca daha hızlı bir oranda. Onlar biyofilm kanal dışına itme gibi
      1. kaçının microchannel kabarcıklar. Baloncuklar içinde nerede SALVI tüp bağlayan 5 mL damla boru alt karşı dikkatli olmanız önemlidir. Taze orta hava SALVI zorunlu olacak emin olmak için göz enjektör ucunu enjekte.

3. Optik biyofilm SALVI Microchannel içinde görüntüleme

  1. Floresan mikroskopi Imaging
    Not: Bu protokol içinde bir model organizma olarak kullanılan Shewanella GFP hızlı mutasyona; bu nedenle, o does değil istemek boyama. Bakterileri boyama gerektiriyorsa, bu her zaman aynı Debisi (örneğin, 2 µL/dk) biyofilm dekolmanı önlemek için yapılmalıdır. Ayrıca, hücreleri besin kullanılabilirlik gidince ayırmak. Herhangi bir ek boyama gerekiyorsa, bu nedenle, leke büyüme orta yerine su hücreleri leke için tedarik önce enjekte.
    1. BSC içinde boru damla dan SALVI ayırmak ve parmak sıkın-gözetleme birliği PEEK bağlantı parçaları vidalama ile SALVI kapatın.
      2. Öyle ki pencere yukarı tamamen düz ve karşılıklı
    2. SALVI microchannel odası güvenli bir cam slayt üzerine boru bant. Koruyucu bandı penceresinden çıkarın. Cam slayt platformunda sahne kelepçeler arasında yerleştirerek mikroskop sahneye slayt kelepçe.
    3. Daha düşük mikroskop aşaması SALVI tepesine yerleştirilmiş öyle ki yeterince yakın nerede odak ayarlama-ecek değil neden pencere dokunmak objektif 10 X amaç sonu.
    4. Anahtarı arka ışık ve bul 10 x mikroskop objektif odak noktası ayarlayarak kullanarak kanal. Şu anda SALVI bakteriyel ek günah penceresine varlığı ile karşılaştırıldığında bir denetim kanalı inoculated bakteri ile pencere görünür olduğundan emin olun. Hücreleri daha yakın görüntüleme için 20 x amaç geçin. Boş bir SALVI kanalına karşılaştırıldığında, pencereye bağlı bakteri varlığı güçlü yeşil Floresans olmalıdır.
    5. Arka ışık ve mikroskop Merkür kaynağında açın. 2-3 dakika bekleyin ve pencereye bağlı biyofilm görünümü ve yakalama görüntüleri mikroskobunun ayarlamak FITC filtre geçin. Hazır olduğunuzda, şekil 1 ' e C bakın gibi olgunlaştı biyofilm görüneceği konusunda bir örnek olarak.
    6. Dönüş Merkür kaynak kapalı ve slayttan SALVI bağlantısını kesin. Gerekirse, bir kez daha tekrar Imaging önce daha fazla büyüme için izin vermek için 2 µL/dk orta akış bağlayın veya ikincil çevreleme kullanım ToF-SIMS analiz için SALVI aktarmak. Bu biyofilm kalınlığı yeterince kalın olmak değil sonucuna vardı ve büyüme için daha fazla zaman önce ToF-SIMS analizi gerekiyorsa gereklidir. Orta akış için bir kez daha eklemek için adım 2.3.6 bakın.
      Not: Orta Akış altında koy, Floresans görüntüleme daha önce ToF-SIMS analizi yapılmalıdır. ToF-SIMS analizi yapılabilir kadar onu beslemek için büyüme orta
      1. vermek biyofilm. Tavsiye edilmez, gerekirse süre kapalı SALVI 4 ° C içinde gecede saklanabilir ama ToF-SIMS vakum odasına eklemeden önce oda sıcaklığına kadar ısıtmak için izin verilmelidir. Ancak, hemen biyofilm dekolmanı azaltmak için Orta Akış ilişkisi kesildi sonra biyofilm çözümlemek.

4. ToF-SIMS veri toplama

Not: Bu bölüm genel hizmet vermektedir ve adsorbe protein molekülü sıvı SIMS analiz açıklayan bizim önceki iletişim kuralına daha ayrıntılı olarak tartışılmaktadır. 12

  1. Yüklemek SALVI ToF-SIMS Loadlock odasına
    Not: eldiven-var giymiş her zaman ne zaman SALVI aygıt işleme ve ToF-SIMS yükleme sırasında yüzey potansiyel contaminations önlemek için sahne analiz.
    1. Dağı SALVI Sahne Alanı'na ve birkaç vida ile düzeltebilirim. Günah pencere adet PDMS microchannel odasının altındaki ayar vidası gerginlik ve ekleme silikon gofret düz olduğundan emin olun. Pencereden koruyucu bandı çıkarın ve sahne ToF-SIMS loadlock odasına yükleyin.
    2. ToF-SIMS loadlock açın, tutun ve yükleme platformu üzerine yatay olarak sahne ve loadlock kapıyı kapat. Vakum pompası başlatmak ve uygun Bu vakum ulaşıldığında emin olmak için bekleyin.
    3. Vakum 1 x 10 -7 mbar için stabil bir kez SALVI Ana odanın içine hareket.
  2. Derinlik profil oluşturma ve toplama veri noktaları
    1. ToF-SIMS donatılmış optik mikroskop kullanarak mikrosıvısal kanalını bulmak.
    2. Veri toplama önce pozitif veya negatif modu seçin. Kullanım 25 keV BI 3 + ışınla tüm ölçümlerde birincil iyon demeti olarak ve tüm ölçümler sırasında şarj yüzey nötralize etmek için elektron sel silahı kullan.
    3. Tarama BI 3 + ışını ile 150 ns darbe genişliği 64 piksel x 64 piksel çözünürlük ile ~ 2 µm çapında yuvarlak bir alan üzerinde. Devam etmek için başka bir 150 taramak 100 nm günah pencereden Delme sonra görüntüleme için yüksek yoğunluklu veri toplamak için s. Punch-aracılığıyla sonra sayar bölge profil oluşturma derinliği içinde önemli ölçüde artacaktır. Sabitleme sonra bunun için yoğun bölgesi olarak belirtilebilir.
    4. Azaltın darbe genişliği 50 ns spectra ile daha iyi kitle kararlılık elde etmek veri toplama için. Bu satın alma için başka bir 200 hakkında devam s.
    5. En az üç pozitif ve üç olumsuz veri noktaları toplamak için bu adımları yineleyin.
      Not: öyle ki günah pencere kırmayacak ve vakum odası bir sızıntıya pencere bütünlüğü tehlikeye yumruk aracılığıyla alanlarda yer emin olun.

5. ToF-SIMS veri analizi

    1. IonToF yazılım kitle ayarı'nı kullanarak analiz yazılımı ToF-Sims (ölçüm Explorer) açıp'ı " profilleri ", " spectra " ve " görüntü " düğmeleri, sırasıyla, işlem derinlik profil, m/z spektrum ve resim veri için.
    2. Veri dosyaları elde ToF-SIMS veri toplama açık.
    3. İlgi veri profil oluşturma derinliğini seçin ve spectra derinlik profil zamansal dizisine göre yeniden.
    4. Basın " F3 " açmak için " kitle kalibrasyon " pencere. Tepeler belirli örnekte bulunması beklenen kimyasal bileşikler dayalı kalibrasyonunun seçin.
  2. Faiz seçimi doruklarına
    1. tepe seçimi örnek analiz için gerekli olduğu gibi edebiyat veya diğer önceki bulgular göre örnek karakteristik doruklarına varsa belirlemek. M/z spectra ilgi doruklarına yoğunluğunu karşılaştırın. Gerekirse, yeni zirveleri ekleme veya silme girişim pik pik listesinde.
    2. Tıklama bir tepe üzerinde kırmızı çizgiler vasıl belgili tanımlık sol alt pencere bul. Tüm tepe içine kırmızı çizgiler hareket.
    3. Ana spektrum penceresinde, kimyasal formülü eşleşen bir tepe seçin ve sonra tıklatın için " tepe ekleyin " button penceresinin üstünde. < /li >
  3. Kitle kalibre veri
    1. içinde en yüksek liste vermek için " tepe listesi " yemek listesi, seçme " kurtarmak … " en yüksek listesinde " itmil " biçimi.
    2. İçindeki derinliği profili vermek için " profil " pencere, tıkırtı üstünde " dosya " menü, sonra seçin " verme " ve o zaman seçme " olarak kaydedin " bir " .txt " dosya.
    3. Olarak bir m/z spektrum dosyayı vermek " Spectra " pencere, tıkırtı üstünde " dosya " menü, seçeneini " verme " ve o zaman seçme " olarak kaydedin " bir " .txt " dosya.
    4. Bir görüntü dosyası olarak dışa aktarmak için " görüntü " pencere, yazdırma ekran ve resim dosyası olarak kaydedin.

6. ToF-SIMS veri çizme ve sunum

  1. verileri almak için bir grafik aracı kullanın.
  2. M/z y ekseni olarak x ekseni ve en yüksek yoğunluk olarak yeniden oluşturulan spektrum göstermek için kullanarak bir komplo yapmak. Bir örnek Şekil 2 içinde A verilir.
  3. Birleştirmek farklı m/z ve formu her iki pozitif veya negatif iyon eşleme göstermek için matris iki boyutlu (2D) görüntüleri yeniden. Bir örnek Şekil 2 ' de B verilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Temsilcisi bu sonuçları nasıl ekli biyofilm kimyasal profil tespit edilebilir ve yorumlanır, ToF-SIMS elde gibi göstermek için hizmet. ToF-SIMS veri toplama, kısaca yordamlar bölümünde vurgulanan gelen kitle spectra komplo sonra en yüksek kimlik kimlikler her ilgili m/z değeri atamak için yapılmalıdır. Bu bakteri ve okudu, çeşitli su kümeleri, yağ asitleri ve protein parçaları gibi bakteri içinde bulunması beklenen belirli kimyasal parçaları üzerinde kütle spektrometresi üzerinde geniş literatür ile yapılabilir. 16 , 17 , 18 , 19 , 20 temsilcisi bu sonuçlar yalnızca S. Corynebacterium Bay-1 biyofilm ve DI su örneği tarafından elde gibi olumsuz kitle spectra göster. Pozitif spectra yorumlanması benzer bir yordamı izleyin.

Resim 1 A gösterir şematik kurulumuna göre bu iletişim kuralı bir biyofilm SALVI microchannel içinde yetiştirilmesi zaman. Sol üstte şırınga orta akan PFTE boru sistem boyunca ve microchannel içinde sabit bir hızda devam ediyor bir şırınga pompa bağlı olduğu. Enjektör pompa geriye doğru yukarı-stream yüzme dan bağımsız organizmalar önlemek için orta rezervuar için kirlenme engeller damla odası yukarıda yer alıyor. Orta damla odası rezervuar doğrudan microchannel ve çıkış boru aracılığıyla mühürlü çıkış biberondan geçer SALVI PFTE tüp içine akar. Noktalı çizgiler üzerine gelin günah penceresinden olgunlaştı S. Corynebacterium görüntüye Bay-1 GFP hücreleri floresan mikroskopisi, adım 3.1 ayrıntılı tarafından yakalanan. Resim 1 B model organizma için bu iletişim kuralı, S. Corynebacterium Bay-1 kullanarak kurulan bir büyüme eğrisi bir örneği gösterilir. Bu grafik büyüme aşamalarında büyüme log fazı arasında 15-32 h bu belirli yetiştirme koşullarında oluştuğunu söylenebilir. Bu grafik üzerinden ek bilgi 0-15 h büyüme gecikme aşamasıdır ve 33-105 h durağan faz büyüme gösterir gösterir. Resim 1 C olgunlaşmış bir biyofilm örneği gösteren Floresans mikroskobu ile alınan bir görüntüdür.

Resim 2 A sulu S. Corynebacterium olumsuz kitle spectra gösterir Bay-1 biyofilm situ içinde sıvı ToF-SIMS tarafından elde gibi mikrosıvısal kanal içinde. Bu grafik, su, S.oneidensis Bay-1 ve DI biyofilm arasında seçili kütle aralığı (100-350 m/z) karşılaştırma örneği gösterir ikinci bir sistem denetimi olarak elde edildi. Resim 2 B a karşılaştırma-in ilgi Bay-1 biyofilm ve DI su ToF-SIMS tarafından elde edilen doruklarına 2D görüntüleri görüntüler. M/z değerleri ilginç kitle spectra eğitim belirlenebilir sonra olası en yüksek kimlik m/z değerleri düzgün atfedilen kimyasal parçaları, IonToF SIMS yazılım Kütüphane ve edebiyat survey tarafından desteklenen olarak. Şekil 2A ilgi doruklarına su kümeleri (m/z 107 (H2O)5OH-, 125 (H2O)6OH-, 143 (H2O)7OH-, 161 (H2 içerir O)8OH-, 179 (H2O)9OH-, 197 (H2O)10OH-, 215 (H2O)11OH-, 233 (H2O)12OH-, 251 (H2O) 13 OH-, 269 (H2O)14OH-, 287 (H2O)15OH-, 323 (H2O)17OH-, 341 (H2O)19OH-))9, olarak Yukarıda anılan sıraya göre doruklarına kırmızı çizgilerle gösterilir, çekirdek algılama ile ilgili bileşikler biyolojik (yani, m/z 175 C10H9NO2-), EPS yan (m/z 123 C2H4PO4-, 159 P 2 O8H-, 216 Cr2O7-, 285 octadecanoethiols, 325 kutup bileşikleri, C12 kutup bileşikleri)15,16,18ve yağ asit zinciri parçaları (yani m/z 127 [C2H3(CH2)3COO]-, 255 C16:0 yağ asidi, 279 linoleik asit, C18H31O2-, 325 C21H40O2 -, 341 lipidler, 18-MEA bağlı thioester bağlantı, Stearik asit C18H35O2-, palmitik asit C19H17O6 monoacylglyceryls iyonları ile yüzey. -). 16 , 19

Biyofilm sulu beri biyofilm örnekte görülen bazı doruklarına DI suda bulunan şaşırtıcı değil. Bu su küme tepeler her tepe Şekil 2Am/z de dahil olmak üzere, üzerinde kırmızı bir çizgi ile işaretlenmiş 107, 125, 143, 161, 179, 197, 215, 233, 251, 269, 287, 323 ve 341 ve karşılık gelen (H2O)5OH- (H2O) 6 Ah- (H2O)7OH- (H2O)8OH- (H2O)9OH- (H2O)10OH- (H2 O)11OH- (H2O)12OH- (H2O)13OH- (H2O)14OH- (H2O)15OH- (H2O)17OH- (H2O)19OH-, anılan sıraya göre. 9 kitle bu yelpazenin birçok karakteristik su kümelerde yaygınlığı olduğundan, bu sonuçlar sağlar kimyasal su küme ortamını sulu bir biyofilm mevcut güçlü bir kanıtı. Ayrıca, su küme her iki spectra gözlenen doruklarına sık müdahale tepeler genellikle PDMS bir bileşeni mikrosıvısal kanalının bağlanabilir ilgili. Örneğin, bir ortak bilinen girişime PDMS dan m/z 137 negatif iyon modu tepedir.

Biyofilm SIMS karşılaştırma kitle ne zaman spectra bu DI su, Şekil 2içindeAgösterildiği gibi bazı doruklarına DI suda mevcut değildir, henüz biyofilm içinde göründükleri. Örneğin, m/z 255 zirve ([CH3(CH2)14COO]-, palmitik asit) yüksek yoğunlukta biyofilm örnek, ama hiç de DI su örneği mevcuttur. Bu-cekti önermek bu sinyalleri cbiyofilm, büyük olasılıkla biyofilm ve/veya onun Self-generated EPS ome üzerinden. Birçok ilginç doruklarına Şekil 2içindeAtespit edilmiştir. Örneğin, EPS doruklarına dahil m/z C2H4PO4-, 159 (P2O8H-), 216 bulundu 123-, ilgili (Cr2O7-), 285 (octadecanoethiols) ve 325 (polar bileşenleri, C 12 kutup bileşikleri). 17 , 18 , 20 yağ asitleri ile ilişkili doruklarına 127 bulunmuştur ([C2H3(CH2)3COO]-), 255 ([CH3(CH2)14COO]-, palmitik asit), 279 ([CH3 (CH2)15COO]-, linoleik asit), 317 (C21H33O2-), 325 (C21H40O2-) ve 341 (yüzey lipidler, 18-MEA aracılığıyla bağlı thioester bağlantı, Stearik asit C18H35O2-, palmitik asit C19H17O6-monoacylglyceryls iyonları). 16 , 19 son olarak, C tepe10H9NO2- m/z 175 gözlenen bir kinolon sinyal çekirdek algılama sinyali ile ilgili.

Resim 2 B dört farklı ilginç iyonları Corynebacterium S. Bay-1 biyofilm (üst satır) ve DI su (alt satır) arasındaki dağılımı 2B görüntüleri görüntüler. 107 m/z değeri ((H2O)5OH-) su küme örnekleri, 175 m/z değeri içinde önemli yoğunluk göstermektedir (C10H9NO2-) ilgili sinyal, m/z 255 algılama bir çekirdek gösteriyor bir yağ asidi olan ([CH3(CH2)14COO]-, palmitik asit), ve m/z 341 (C21H41O2-) her iki lipid parçaları temsil ve su kümeleri nedeniyle 1 amu kitle doğruluk. 9 2D resim parlak bölgeler daha yüksek moleküler iyon görüntüde mevcut sayısını gösterir. Beklendiği gibi sinyalleri QS için Bileşik ve lipidler çok daha büyük miktarda biyofilm örnek içinde. Su kümenin (107 m/z) sinyal biyofilm örnek güçlü iken, bu da beklendiği gibi DI su örneği mevcut. Son olarak, m/z 341 sinyal biyofilm örnek içinde homojen ama çok zayıf DI su örneği içinde bulundu. M/z 341 su küme en yüksek iken, aynı zamanda birkaç farklı yağ asidi ve yüzey lipidler temsilcisi oldu. 16 daha güçlü varlığını lipid parçaları varlığı çok su varlığı daha ağır basar ki veri normalleştirme öneriyor sonra biyofilm örnek içinde kümeleri.

Figure 1
Resim 1 : Deneysel şematik. (A)görüntüler deneysel şematik olarak biyofilm kurulumunun laboratuvar içinde görünür. Sol, üst orta akar (1) şırıngadan başlayarak, hangi boyunca sıvı hangi hareket eder, hızını denetleme şırınga pompa (2), bağlı olduğu. Oklar sistem akış yönünü gösterir. Şırınga (1) TFE boru (4) (3) uygun bir göz enjektör üzerinden bağlanan. Orta kirlenmesini önlemek için bir damla ile odaya (5) akar ve sonunda SALVI (6) mühürlü çıkış konteyner (7) taşır. Öyle ki damla Odası (5) (6) SALVI üzerine yerleştirilir düz yüzeye (8) dik olabilir şırınga pompa yükseltilmiş bir yüzeye (9) yer alıyor. (B) büyüme eğrisi Shewanella Corynebacterium Bay-1 "nanowires" orta için. Süresi 0-15 saat gecikme faz temsil eder, zaman 15-33 h log fazı temsil eder, zaman 33-105 h durağan faz ve saat 105 h temsil eder veya ölüm faz temsil. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. (C) A resim olgunlaşmış bir biyofilm Floresans mikroskobu ile satın aldı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : ToF-SIMS karşılaştırmalar negatif spectra, sulu Shewanella Corynebacterium biyofilm ve SALVI microchannel ortamda Bay-1. (A) m/z SIMS Bay-1 orta ve DI su Shewanella Corynebacterium biyofilm kitle spectra. İkinci bir denetim olarak kullanıldı. Kırmızı çizgiler, karakteristik su küme doruklarına yerlerini gösteriyor. (B) 2B görüntü faiz biyofilm ve DI su arasında doruklarına karşılaştırılması. Soldan sağa, ekran görüntüleri bir su küme (m/z 107 (H2O)5OH-), bir çekirdek algılama/hormon sinyal (m/z 175, C10H9NO2-), bir yağ asidi (m/z 255, [CH3(CH 2)14COO]-, palmitik asit) ve yüzey lipidler/EPS parçaları (m/z 341, 18-MEA, C21H41O2-). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Günlük-aşamasında aşı sonra gün ve 3.1 adımda anlatıldığı gibi sağlıklı ve görüntüleme için kalın önce hangi biyofilm büyümesini sıcaklık test etmek önemlidir. Bu yordam özellikle S. Corynebacterium MR1 biyofilm oda sıcaklığında kültür kapsar; ancak farklı oda sıcaklığında büyüme oranının etkisi altına alabiliyor. Bu nedenle, bu biyofilm ToF-SIMS analize devam etmeden önce hazır olup olmadığını anlamak için optik görüntüleme kullanmak önemlidir. Benzer şekilde, farklı bakteri suşları farklı büyüme koşulları ve analiz için arzu edilen bir kalınlık elde etmek için uzunluğu gerektirir. Log fazı 200 12-32 h olmak bakterilerin büyüme eğrisi Şekil 1b gösteriyor ve bu prosedür boyunca 24 h kullanılan iken, bu kez günlük fazlı diğer suşların bakteri büyüme eğrisi oluşturmadan kullanılamamasını unutmamak gerekir bağımsız olarak. Log fazı 12 ve 33 h S. Corynebacterium için büyüme arasında iken, gerçeğini nerede oksijen akşamüstü belgili tanımlık son log fazı organizmanın büyüme hızını sınırlamak için başlangıç oldu büyüme kısmında öyleydi nedeniyle 24 h seçildi. Bu zaman hücreleri olduğunu gösterdi deneyler nanowires, böylece düşük oksijen ortamlarda hayatta kalabilen form başarılı biyofilmler için astarlanmalıdır üretmeye başladı. 3 , 13 sonuç olarak, bakterileri log fazı sırasında kullanmak için seçilen zaman araştırma tarafından etkilendiği deneyim ve bilgi elde edebiyat okudu bakteri deneysel çalışma üzerinde. Ayrıca, bu yaklaşımı kullanarak biyofilm büyüme için kullanılacak olan bakterilerin tüm farklı suşları için log fazı anlamak için bir ayrı büyüme eğrisi oluşturulmalıdır. 2 µL/dk büyüme hızının S. Corynebacterium en yüksek büyüme oranını aşmayacak şekilde Bay-1 ve toplam süre seçildi gibi değil aşırı büyümüş bir olgun biyofilm almak için çok hesaplanan ve ayırma eğilimli. Bu oranlar buna göre ayarlanabilir bilgi bu Kur ile kullanılmak üzere farklı bakteri için.

SALVI biyofilm büyüme için kullanarak bazı sınırlamalar biofouling içinde kanal yanı sıra kanal düz duvarlara takmak için bakteri olasılığını içerir. Biyofilm uzun süre büyümeye izin büyüme 2 µL/dk içinde bu protokol için önerilen bir sabit hızda rağmen biofouling hala oluşabilir. Böyle bir durumda ve uyarı olmadan biyofilm penceresinden ayırmak ve SALVI çıkış çevreleme için çıkın. Biofouling da sadece mekanik kuvvet ekleyerek oluşabilir (Yani, hareketli) kaçınamayız SALVI. Ancak, bu check-in biyofilm bağlanma ToF-SIMS analiz hafif bir mikroskop altında önce günah penceresini görüntüleyerek tutulabilir. Başka bir kısıtlama eklemek bazı bakteriler için zorlaştırabilir PDMS microchannel düzgünlüğünü içerir. Ancak, bu ek bakterilerin bir sorunu olsa kanala, nervürlü kenarları oluşturarak karşılamak için SALVI tasarımında değiştirilebilir. Son olarak, OD600 okuma büyüme eğrisi tayini için yerine hücre sayımları yapılabilir. Örneğin, çalışmalar hücre sayımları OD600 okumalar doğrudan ve tutarlı korelasyon göstermiştir. 21 bu nedenle, OD600 biyofilm büyüme değerlendirilmesinde yeterli sayılır.

SALVI esas olan birçok uygulamalarda kullanmak çok yönlülük gibi anaerobik bir torpido veya herhangi bir ısı kontrollü çevre odası içinde bir kültür çanak olarak eylemler olarak bu teknik sınırlamalar birkaçıdır. Küçük bazı sınırlamalar için her belirli bakteri optimal büyüme koşulları için ağırladı mümkün bağıl nem, sıcaklık, güneş ışığı, Yakındaki yerleşim gibi kontrol edilemeyen Oda koşulları içerir. Buna ek olarak, bazı bu teknik sorunları bir kuluçka sıcaklık veya RH arabuluculuk özellikleri biyofilm Kur ile üstesinden gelebilir.

SALVI vakum uyumlu mikrosıvısal arabirimidir. Bu çalışmada, 200 x 300 µL mikrosıvısal kanal optik ve sıvı SIMS Imaging takip biyofilmler kültür için kullanıldı. Sıvı uçucu ve sıvı aşamasında boşlukta korumak zor oldukları için vakum tabanlı teknikler kullanarak eğitim için teknik bir sorun mevcut. Böylece ToF-SIMS gibi vakum teknikleri geleneksel olarak sadece kuru ve kriyojenik örnekleri için sınırlı olmuştur. 22 Ayrıca, SALVI çeşitli görüntüleme ve mikroskobu ve spektroskopi teknikleri kullanarak spektroskopisi için kullanılabilir. 4 , 9 grubumuz sürekli olarak çeşitli SALVI uygulamalarında in situ analiz sıvı ve katı-sıvı arabirimleri genişletmeye çalıştı. 15 , 23 , 24 eki günah membran için bizim en son yapılan çalışma etkili bakteri göstermiştir. 9 ilk eki sonra orta zaman içinde sürekli akışı başarıyla SALVI günah pencerenin üzerinde doğrudan bir biyofilm yetiştirmek olduğu gösterilmiştir. ToF-SIMS sırasında birincil iyon ışın çapı 2 µm delik bombalamak için kullanılır. Bu boyut, böylece onun doğal sulu microenvironment biyofilm kimyasal bir profil sağlayan günah pencereye bağlı biyofilm hücre uzunluğu benzer. Bu kurutulmuş örnekleri ile sulu haliyle biyofilmler karşılaştırırken son derece fark bir biyofilm'ın kimyasal kimlik, EPS ve su küme ortamında varlığı nedeniyle önemlidir. 9 SALVI kullanmadan, ToF-SIMS yalnızca kuru ve kriyojenik örnekleri üzerinde kimyasal profil örneği doğal sulu durumunda yakalamak için başarısız kimyasal eşleme sağlayan yürütülen.

Şekil 1içindeAgösterildiği gibi SALVI microchannel dikey olmak damlama boru için izin vermek için damlama boru yukarıda şırınga pompa tutmanız önemlidir. Ayrıca, çıkış PFTE boru (içinde çıkış şişe) (damla odasına bağlı) giriş boru daha düşük ise kabarcıklar cihazın, boru içinde tuzak haline olasılığı daha az olacaktır. SALVI büyüme için bakteri yetiştirilmesi başka bir önemli adım ilk adım 1.3 içinde açıklandığı gibi bir büyüme eğrisi kullanılacak, belirli bakteri baskı elde etmektir. Bu büyüme eğrileri ile optik yoğunluk ölçümleri alarak yapılabilir. Bir büyüme eğrisi şekil 1' deB, gösterildiği gibi bakteri sağlıklı kabul edilebilir ne zaman hangi bakteri büyüme, log fazı içinde-ecek var olmak süre anlamak için önemlidir. Bakteri büyüme bu evre içinde kullanan sağlıklı biyofilm microenvironment oluşturulmasını kolaylaştırır ve biyofilm beklenen oranda artacağı sağlar. Sterilizasyon ToF-SIMS ile kullanmak için önceden için autoclaved olamaz gibi SALVI microchannel % 70 etanol ve DI su, oda sıcaklığında steril edilmektedir. Isıyla hem SALVI pencere zarar verebilir ve su buharı kanala tanıtmak nedeniyle gerçeğini bu. Büyüme birkaç gün sonra microchannel bakteriyel eki doğrulamak için Floresans mikroskobu ile kontrol edilmelidir. Bir örnek şekil 1' deCbulunabilir, bu görüntü olgunlaşmış bir biyofilm göstermek için çekildi. Orta Akış yolunu, nedeniyle bakteri daha olumlu ekler ve bu konumu olduğu için akış ve kesme Kuvvetleri lowes nerede microchannel kenarları boyunca yetişirt.

Bu vakum tabanlı görüntüleme Kütle Spektrometre için doğal sulu haliyle yaşam biyofilm sağlamak için Özetle, SALVI kendisi için mükemmel bir yöntem kullanarak in situ kimyasal eşleme, kültür ve eğitim biyofilmler için önemlidir. Bu benzersiz bir yaklaşım, EPS yan daha derin bir anlayış kazandırmak bir biyofilm'ın su küme microenvironment üzerinde de daha fazla bilgi sağlayabilir. Bu bilgiler bir biyofilm'ın biyolojik aktiviteleri anlamak için kullanılabilir ve Biyomedikal, Biyomedikal Mühendisliği, tarım ve endüstriyel araştırma ve geliştirme gibi çeşitli uygulamalarda kullanılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Destek için Pacific Northwest Ulusal Laboratuvarı (PNNL) toprak ve Biyolojik Bilimler (EBD) misyonu tohum laboratuvar yönelik araştırma ve geliştirme (LDRD) Fonu için sana şükrediyoruz. Enstrümantal erişim bir W. R. Wiley çevre moleküler Bilimleri Laboratuvarı (EMSL) genel kullanıcı öneri ile sağlandı. EMSL sponsor tarafından Office biyolojik ve çevresel araştırma (BER) PNNL adlı bir Ulusal Bilimsel kullanıcı tesisidir. Yazarlar Dr Yuanzhao Ding el yazması okuma ve yararlı geribildirim sağlama ispat için teşekkür ederiz. PNNL için sözleşme DE-AC05-76RL01830 altında DOE Battelle tarafından işletilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ToF-SIMS IONTOF TOF.SIMS 5 Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution
System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) Pacific Northwest National Laboratory N/A SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level.
-80°C Freezer New Brunswick Scientific N/A U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer
4°C Refrigerator BioCold Scientific N/A COLDBOX1
Orbital Shaker New Brunswick Scientific N/A Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm.
Syringe Pump Cole-Parmer EW-74905-02 Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate.
Incubator Barnstead International LT1465X3 Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing.
Autoclave Getinge 533LS Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific 4001-000 GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves.
Biological Safety Cabinet Thermo Fisher Scientific 1385 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet
Fluorescence Microscope Nikon N/A Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply.
pH Meter Mettler Toledo 51302803 Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving.
PEEK Union Valco ZU1TPK For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system.
5 Axes Sample Stage IONTOF N/A Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS.
Barnstead Nanopure Water Purification System Thermo Fisher Scientific D11921 ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716)
Pipette Thermo Fisher Scientific 21-377-821 Range: 100 to 1,000 µL.
Pipette Tip Neptune 2112.96.BS 1,000 µL pipette tips
Razor Blade Handle Stanley N/A Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing
Syringe BD 309659 1 mL
Syringe BD 309657 3 mL
Syringe BD 309646 5 mL; Used for making the drip chamber
Syringe BD 309604 10 mL
Syringe BD 302830 20 mL
Disposable Pipette Thermo Fisher Scientific 13-678-11 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles.
Electric Pipette Filler Pipet-aid P-57260 Vacuum pressure electric serological pipette filler
Serum Bottle Sigma 33109-U Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle.
Anaerobic Culture Tube VWR 89167-178 Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal.
Rubber Stopper Sigma 27235-U Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber.
Aluminum Crimp Seal (without septum) Sigma 27227-U Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper.
Serum Bottle Aluminum Seal Crimper Wheaton 224307 30 mm crimper with standard seal.
PTFE Tubing Supelco 58697-U 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system.
Disposable Cuvettes GMBH 759085D 1.5 Ml for use with spectrophotometer.
Needle BD 303015 22G; used for serum bottle injection.
Needle BD 305120 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system.
Shewanella oneidensis MR-1 with GFP N/A N/A Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. 
Ethanol Thermo Fisher Scientific  S25310A 95% Denatured
TSA BD 212305 Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol
PIPES Buffer Sigma P-1851 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Hydroxide Sigma S-5881 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Ammonium Chloride Sigma A-5666 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Potassium Chloride Sigma P-4504 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Phosphate Monobasic Sigma S-9638 Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific S271-3 Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium lactate Sigma L-1375 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Bicarbonate Sigma S-5761 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt Sigma N-0253 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron (III) Chloride Sigma 451649 Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Magnesium Sulfate Sigma 208094 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Manganese (II) Sulfate Monohydrate Sigma M-7634 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Iron(II) Sulfate Heptahydrate Sigma 215422 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Calcium Chloride Dihydrate Sigma 223506 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Cobalt(II) Chloride Sigma 60818 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Zinc Chloride Sigma 229997 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Copper(II) Sulfate Pentahydrate Sigma C-8027 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate Sigma 237086 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Boric Acid Sigma B-6768 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Molybdate Dihydrate Sigma 331058 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nickel(II) Chloride Sigma 339350 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Sodium Tungstate Dihydrate Sigma 14304 Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Biotin Sigma 47868 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Folic Acid Sigma F-7876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Pyridoxine Hydrochloride Sigma P-9755 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Riboflavin (B2) Sigma 47861 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thiamine Hydrochloride Sigma T-4625 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Nicotinic Acid Sigma N4126 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt Sigma 21210 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Vitamin B12 Sigma V-2876 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
4-Aminobenzoic Acid Sigma A-9878 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}
Thioctic Acid Sigma T-1395 Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007}

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Renner, L. D., Weibel, D. B. Physicochemical regulation of biofilm formation. MRS Bull. 36 (5), 347-355 (2011).
  2. Flemming, H. C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 623-633 (2010).
  3. Aldeek, F., et al. Patterned hydrophobic domains in the exopolymer matrix of Shewanella oneidensis MR-1 biofilms. Appl Environ Microbiol. 79 (4), 1400-1402 (2013).
  4. Hua, X., et al. In situ molecular imaging of a hydrated biofilm in a microfluidic reactor by ToF-SIMS. Analyst. 139 (7), 1609-1613 (2014).
  5. Yu, X. Y., Yang, L., Cowin, J. P., Iedema, M., Zhu, Z. Systems and methods for analyzing liquids under vacuum. US Patent. , (2013).
  6. Yu, X. Y., Liu, B., Yang, L., Zhu, Z., Marshall, M. J. Microfluidic electrochemical device and process for chemical imaging and electrochemical analysis at the electrode-liquid interface in situ. US Patent. , (2014).
  7. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Thevuthasan, T., Cowin, J. P. Making a hybrid microfluidic platform compatible for in situ imaging by vacuum-based techniques. J Vac Sci Technol A. 29 (6), (2011).
  8. Yang, L., Yu, X. Y., Zhu, Z. H., Iedema, M. J., Cowin, J. P. Probing liquid surfaces under vacuum using SEM and ToF-SIMS. Lab Chip. 11 (15), 2481-2484 (2011).
  9. Ding, Y., et al. In Situ Molecular Imaging of the Biofilm and Its Matrix. Anal Chem. , (2016).
  10. Yang, J., Ghobadian, S., Montazami, R., Hashemi, N. Proceedings of the Asme 11th Fuel Cell Science, Engineering, and Technology Conference, 2013. , (2013).
  11. Yu, F., Wang, C. X., Ma, J. Applications of Graphene-Modified Electrodes in Microbial Fuel Cells. Materials. 9 (10), (2016).
  12. Yu, J., Zhou, Y., Hua, X., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Hydrated Proteins in Water by SALVI and ToF-SIMS. J Vis Exp. (108), e53708 (2016).
  13. Hill, E. A. Effects of Electron-Transport-System Impairment on Hydrogen Gas Production by the Bacterium Shewanella oneidensis MR-1. , Washington State University. Master's thesis (2007).
  14. McCormick, A. J., et al. Biophotovoltaics: oxygenic photosynthetic organisms in the world of bioelectrochemical systems. Energy Environ Sci. 8 (4), 1092-1109 (2015).
  15. Liu, B., et al. In situ chemical probing of the electrode-electrolyte interface by ToF-SIMS. Lab Chip. 14, 855-859 (2014).
  16. Keune, K., Hoogland, F., Boon, J. J., Peggie, D., Higgitt, C. Evaluation of the "added value" of SIMS: A mass spectrometric and spectroscopic study of an unusual Naples yellow oil paint reconstruction. Int J mass Spectrom. 284 (1-3), 22-34 (2009).
  17. Lee, M. Mass Spectrometry Handbook. , John Wiley & Sons Inc. 988 (2012).
  18. Petrovic, M., Barcelo, D. Determination of anionic and nonionic surfactants, their degradation products, and endocrine-disrupting compounds in sewage sludge by liquid chromatography/mass spectrometry. Anal Chem. 72 (19), 4560-4567 (2000).
  19. Vickerman, J. C. Molecular Imaging and Depth Profiling by Mass Spectrometry--Sims, MALDI or DESI. Analyst. 136 (11), (2011).
  20. Weng, L. T., Bertrand, P., Stonemasui, J. H., Stone, W. E. E. Tof Sims Study of the Desorption of Emulsifiers from Polystyrene Latexes. Surf Interface Anal. 21 (6-7), 387-394 (1994).
  21. Peñuelas-Urquides, K., et al. Measuring of Mycobacterium tuberculosis crowth. A correlation of the optical measurements with colony forming units. Braz J Microbiol. 44 (1), 287-289 (2013).
  22. Dohnalkova, A. C., et al. Imaging hydrated microbial extracellular polymers: comparative analysis by electron microscopy. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1254-1262 (2011).
  23. Yang, L., et al. In situ SEM and ToF-SIMS analysis of IgG conjugated gold nanoparticles at aqueous surfaces. Surf Interface Anal. 46, 224-228 (2013).
  24. Yu, J. C., et al. Capturing the transient species at the electrode-electrolyte interface by in situ dynamic molecular imaging. Chem Commun. 52 (73), 10952-10955 (2016).

Tags

Kimya sorunu 126 SALVI ToF-SIMS biyofilm in situ moleküler görüntüleme havacilik
<em>Situ</em> <em>Shewanella Corynebacterium</em> MR1 biyofilmler SALVI ve ToF-SIMS tarafından karakterizasyonu
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill,… More

Komorek, R., Wei, W., Yu, X., Hill, E., Yao, J., Zhu, Z., Yu, X. Y. In Situ Characterization of Shewanella oneidensis MR1 Biofilms by SALVI and ToF-SIMS. J. Vis. Exp. (126), e55944, doi:10.3791/55944 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter