Summary
マイクロ流体リアクター、液体真空界面解析システムにより水和状態の化学マッピングのための in situ飛行時間二次イオン質量分析のためのバイオ フィルムの成長のための手法を提案します。緑色蛍光タンパク質を持つシェワネラ oneidensis氏 1 は、モデルとして使用されました。
Abstract
細菌バイオ フィルムの自主制作に細胞外高分子物質 (EPS) と環境微生物学での自分の役割を理解する研究が大幅に表面関連のコミュニティであります。本研究は、バイオ フィルムの添付ファイル分析液体真空インターフェイス (サルヴィ) でのシステムを開拓し、飛行時間二次イオン質量分析 (TOF-SIMS) によってその場で生きているバイオ フィルムの化学マッピングを実現する方法をについて説明します。これは外側と専門のセットアップでは、サルヴィ チャネル内の両方の細菌の培養と同様、バイオ フィルムの存在と TOF-SIMS 解析の前に厚さを検出する光イメージング技術です。我々 の結果は自然な水和状態でシェワネラバイオ フィルムの特徴的なピークを表示によってローカライズされた水クラスター環境、EPS の強調表示のフラグメントは、同じバイオ フィルムから大幅に異なって脱水状態です。これらの結果は、真空ベースの化学イメージング装置とその場観察バイオ イメージングは、サルヴィの画期的な機能を示しています。
Introduction
細菌バイオ フィルム細菌前記細胞が接続し、多くの可能な環境の中で生き残ることができる有害な物理的・機械的刺激の変化を生き残るためにための防衛として時間をかけて進化してきた表面関連のコミュニティであります。1,2バイオ フィルム大幅に調査した、生体臨床医学、医用生体工学、農業、産業の研究・開発など多くの分野のアプリケーションがあります。1,2セルフ プロデュースに細胞外高分子物質 (EPS) と、ローカル水クラスター環境などを含むこれらの複雑な微生物の化学マッピングを理解する正確を得る不可欠ですな彼らの生物学的活動の描写です。2
バイオ フィルムは存在し、高含水状態の内で育ちます。これは、揮発性液体の真空の勉強の難しさのため飛行時間二次イオン質量分析 (TOF-SIMS) など真空表面解析テクニックを使用して偉大な課題を提示します。その結果、真空ベースの表面分析技術は、乾燥状態だけでバイオ フィルム サンプルを勉強にほとんど専ら限られています。しかし、乾燥状態でバイオ フィルムを勉強して、真の生物学的微小環境の正確な調査を阻害します。それはしばしば、EPS の整合性とバイオ フィルム形態、その場で液体研究にバイオ フィルムの乾燥質量スペクトル結果を比較した後示されている抜本的な変更が発生します。3,4この記事分析液体真空インターフェイス (サルヴィ)、5,6マイクロ流体リアクターでの我々 のシステムの使用を採用することにより自然な水和状態内のバイオ フィルムを勉強するためのソリューションを提示します。したがって真空内液体マトリックスの構造の整合性を維持しながら二次イオンビーム プローブへの直接アクセスを提供するマイクロ ポリジメチルシロキサン (PMDS) の薄いシリコン窒化 (罪) 膜の下で液体が入っています。商工会議所。7,8
S. oneidensis氏 1 緑色蛍光タンパク質 (GFP) を表現する変異は、その代謝の多様性と環境、応用微生物学、基づいていたで一般的な使用のためこのバイオ フィルムの手順図のモデル生物として選ばれました。大きく上金属還元剤や細胞外の電子転送のための独自の機能。9,10,11また、GFP の存在は簡単連続バイオ フィルム厚蛍光顕微鏡による監視、フルオレセイン イソチオ シアン酸 (FITC) フィルターを使用しての許可。私たちの以前の研究では、最大 100 μ m の厚さにバイオ フィルムの成長のためoperando の蛍光イメージングを使用して罪ウィンドウに添付ファイルを好むこの細菌の証拠を示しています。4,12本稿が蛍光顕微鏡によるバイオ フィルムの存在の確認を説明するだけのサルヴィは超解像などその他の光学撮像方法と互換性のある蛍光イメージング (すなわち、構造化照明顕微鏡 (SIM)9) および共焦点レーザー走査顕微鏡 (CLSM) 画像4)。光イメージングは、バイオ フィルムの厚さを測定する機能し、それは、その厚さと罪ウィンドウへの付着を確認する表示されます、バイオ フィルムの形状の 3 D イメージを取得できます。9 GFP は、SIMS 分析で使用された、GFP なしS の oneidensisを成長曲線光学密度のこの唯一の必要な測定として使用され、任意の蛍光イメージングを必要としません。一般的に、タグ付きの GFP の違いと成長曲線のタグの付いていない種が重要ではありません。さらに、このプロトコルは、手順を記述するモデル生物としてs. oneidensis氏 1 GFP を使用して、この手順はサルヴィ内栽培のために必要とされるすべての菌株の設計されています。とはいえ、必要な細菌株の知識を与え、時間、温度、酸素環境など生育条件が使用される細菌の歪みに合わせて変更する必要があります。成長媒体のためこの手順は養殖で、ブドウ糖とブドウ糖なしトリプシン大豆寒天 (TSA) なし「ナノワイヤー」中, トリプシン大豆スープ (TSB) を使用します。成長のため、膜の拡張を監視するため、「ナノワイヤ」中の組成は、特別策定されていますと、細いワイヤと培地成分形を取るように見えるs. oneidensisのペリプラズムがされている以前の研究で確立。13,14
その場で当社の以前の議定書液体 TOF-SIMS サルヴィは、タンパク質の固定化と TOF-SIMS 解析およびデータ圧縮に関する詳細なプロトコルと同様に、罪に添付ファイルを提供している利点について説明しました。12データ削減の手順を繰り返しよりもむしろ本稿になる代わりにセットアップおよびバイオ フィルムの存在と事前の厚みを検出する画像処理の手順と同様に、私たちのサルヴィのマイクロ チャネル内のバイオ フィルムを育成のユニークなアプローチに焦点を当てるTOF-SIMS 解析。バイオ フィルムが以前のみ真空ベース表面分析技術のチャンバ内でサンプルを乾燥する限定されていました、ライブ バイオ フィルムの詳細な EPS とバイオ化学マッピング今入手できますその場でこの新しい機能であるためです。
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Protocol
1 材料準備
- ミディアム チューブの準備
- (バイオ フィルム文化と成長曲線ごとに必要な 3 つごとに必要な 1 つ) 血清ボトル
注: 前述の導入は、任意の成長で。このプロシージャの興味の細菌の緊張のために必要な栄養素を提供するために適切なメディアを利用できます。この場合、" ナノワイヤー " メディアとブドウ糖媒体なし TSB s. oneidensis 氏 1 GFP の成長のために使用されました。 13- 70 mL 血清一本に成長中の預金 20 mL ストッパーのキャップし、ボトルを圧着します。クリーンな滅菌アルミ箔の切れ端で上部をカバーします 。
- オートクレーブで 121 で 30 分の液体のサイクル ボトル ° c. その後、常温で滅菌血清ボトルを格納します 。
- 嫌気性培養管
- 空気ヘッド スペースと嫌気培養チューブに成長培地 5 mL を入金、ストッパーに配置してボトルを圧着します。滅菌箔で上部をカバーします 。
- (バイオ フィルム文化と成長曲線ごとに必要な 3 つごとに必要な 1 つ) 血清ボトル
- バブル トラップ管の準備
- 血清瓶のゴム栓に穴をパンチ 22 ゲージ針を使用して慎重にします 。
- 1/32 インチにカット 20 " ポリテトラフルオロ エチレン (PTFE) このようなかみそりでチューブ チューブのセグメントの一方の端は先の尖った 。
- スレッド ゴム栓の上の部分の穴に通して PTFE チューブの先の尖った端を使用しています。まで約 2 cm ストッパーは、平らな端を持っているかみそりで PTFE チューブの先の尖った端をカット、チューブを押し通す 。
- 5 mL シリンジのプランジャーを取り外し、注射器のオープン エンドにステップ 1.2.3 からゴム栓に合います。PTFE チューブの 2 cm の最後は、注射器のバレル内です。これはバブル トラップ 。
- ラップでステップ アルミ箔で 1.2.4 とオートクレーブ テープで固定したバブル トラップ (PTFE チューブ、ゴム栓と注射器) です。重力とチューブを滅菌する箔パッケージ サイクル 30 分のための 121 ° c のオートクレーブは、2.4 の段階で使用するための準備ができるまで室温でシール箔押しパッケージを格納します 。
- 細菌の成長曲線
注: このプロトコルはサルヴィのバイオ フィルムの成長のモデル生物として s. oneidensis 氏 1 GFP を使用します。ただし、この手順は他の細菌が好気的または嫌気を成長に合わせて適応することができます。ひずみの使用によって成長時間と環境は、それに応じて調整する必要があります
。 注:-80 ° C 細菌冷凍庫株式はブドウ糖とグリセリンなし TSB の 1:1 混合物から成っていた。成長曲線の例を 図 1 B に示すように覚悟がないブドウ糖、それぞれ 0.2 mL の量で 3 回 20 mL と 70 ml 血清に転送と TSB のスターター培養を用いた " ナノワイヤー" TSB のトレースを削除する媒体。ただし、このプロトコルは、1 つだけ成長培地を使用して、s. oneidensis のこれらの特定のメディア ソリューションで行われたこれとして、後続の転送、ない行われると想定しています。このプロトコルでは記載がない、このような余分な転送、推奨回復; 凍結細胞ができます当初豊富な TSB に細菌を堆積する 3 つの後続の転送 " ナノワイヤー " すべて TSB がなくなっていることと、典型的な成長ダイナミクスが発生していることを保証します。- -80 ° C のフリーザーから細菌のグリセロール ストックを削除し、できるだけ早く雪解けに手袋をはめた手で在庫をウォーム スターター文化
- を接種します。この冷凍庫ストックを生物学的安全キャビネット (BSC) に移動します 。
- BSC 内は、1.1.2 の手順で用意して、ないブドウ糖と成長培地 5 mL を含むキャップ、圧着の嫌気培養チューブに冷凍庫ストックの 0.1 mL を転送する添付 22 G 針を 1 mL の注射器を使用します。再度に凍結と適切な生物学的廃棄物コンテナー、残りの冷凍庫在庫処分衝撃を与えるセル 。
- は 150 回転/分 (rpm) で 30 ° C でのシェーカー/インキュベーターでスターター文化を孵化し、600 nm (外径 600) を読んで、使用の準備ができての光学密度を取るようにします。結果が再現可能なようにすべてのそれに続く使用のため、同じ時間で行うことができますように成長と OD 600 時間を記録します。例として、このスターター文化だった 15 h を成長すること、約 1.0 の OD 600 で使用します 。
- 接種培
- 1.1.1.2、文化、スターター 1.3.1.3 で準備準備した 3 つの血清ボトルを取るし、BSC に両方をもたらすします 。
- 内で、BSC、それぞれ 22 G 針各血清ボトルにスターター文化から転送溶液 0.1 mL、1 mL の滅菌注射器を使用しています 。
- 定置滅菌 70% 血清ボトルの上部エタノールと滅菌アルミ箔でカバー、適切なラベルし、インキュベーター内軌道シェーカーに転送。軌道のシェーカーを 150 rpm にセットし、インキュベーターを 30 に設定ステップ 1.3.3 内、° c. 加温まで最初の OD 600 データ ポイントを撮影します 。
- 取得外径 600 データ ポイント
- 滅菌キュベットに水フィルター滅菌蒸留脱イオン (DI) の 100 μ L 堆積によって空白を準備します。水は汚染されないようにプラスチック パラフィン フィルム上部にキュヴェットの周りをラップします。常温で保存します。キュベットを挿入し、キーを押して成長曲線の任意のデータ ポイントを取る前に紫外・可視分光光度計にこの空白を使用 " 空白 ".
注: すべて 48 h、新しい空白覚悟が必要不正確な読書を避けるために、空白を定期的に交換をお勧めします 。
- 外径 600 データ ポイントごとに滅菌 BSC にインキュベーターと転送からステップ 1.3.2.3 で血清ボトルを削除します。各血清ボトルからの預金を 3 つ個別に滅菌キュベットをラベルに接種した培地を 0.1 mL を取る 。
- ブランキング後、文化を含む紫外可視 (UV ・可視) 分光光度計のキュベットを挿入し、して、一度に 1 つ外径 600 を読む、その時点のすべての 3 つの測定値を記録します
。 注: s. oneidensis 氏-1, のデータ ポイントで撮影された 1、14、28、32、41、57、81、および 105 h 接種後。細菌が死の段階を完了したときは、拡張が完了です。特定の成長時間とこのプロトコルで使用される細菌の傾向に関する知識の不足がある場合、これらのポイントをそれに応じて調整する必要があります。成長傾向についての不確実性がある場合ポイントのデータ収集より頻繁に、例では、後続の 36 h、次の 100 h の 12 h 間隔でと最終的な 124, 24 時間間隔でのすべての 6 h、最初の 12 時間ごとの 3 h - 外径 600 を使って y 軸のデータ ポイントと時刻を x 軸としてグラフに標準偏差エラーバー グラフ作成ソフトウェアを使用して各時間ポイントで撮影した 3 つのポイントの平均値の曲線。S. oneidensis 氏-1 成長曲線は 図 1 B 代表結果] セクションに表示されます 。
- ログ相成長曲線部の期間を識別 1.3.3.4、準備したグラフを使用します。シェワネラ、これは成長の 12 と 33 h の間したがって推察される成長の 24 h で シェワネラ される成長の場合は、そのログ段階で同じメディアと成長曲線を用いて使用する前に治療を使用して細菌を培養することを想定しています 。
- 滅菌キュベットに水フィルター滅菌蒸留脱イオン (DI) の 100 μ L 堆積によって空白を準備します。水は汚染されないようにプラスチック パラフィン フィルム上部にキュヴェットの周りをラップします。常温で保存します。キュベットを挿入し、キーを押して成長曲線の任意のデータ ポイントを取る前に紫外・可視分光光度計にこの空白を使用 " 空白 ".
- -80 ° C のフリーザーから細菌のグリセロール ストックを削除し、できるだけ早く雪解けに手袋をはめた手で在庫をウォーム スターター文化
2。培養菌
- 初日: 寒天プレートを接種
注: プロシージャのこのセクションは、アガロース pla で使用されましたテ ・成長曲線の使用液体スターター文化ではなく、ログ段階で 1 つのコロニー形成単位 (CFU) を取る。これはというブドウ糖なし TSA が使用され、その後に転送されるため、同じ成長の条件を再現する仮定することができる " ナノワイヤー " 成長曲線のプロシージャ、および TSA の媒体が TSB を構成する成分と同じ。- 氷のバケツに-80 ° C のフリーザーから s. oneidensis 氏 1 GFPbacteria 株式を取り出して、滅菌 BSC 内このバケットを配置します 。
- 、BSC 内冷凍細菌株の表面をこすり、T 連勝、アガロース ・ プレートの表面にループを使用し滅菌 1 μ L 接種ループを使用します 。
- プラスチック パラフィン フィルム プレートの側面をシール後プレートを反転し、個々 のコロニーが表示されるまで 24 時間、30 ° C のインキュベーターで格納します 。
- 2 日目: 血清ボトルを接種
- インキュベーターからプレートを取り外し、BSC 内開きます 。
- ・ ディ ・水の 70% エタノール 1.1.1 手順から準備された血清ボトルのゴム栓の表面をきれいに、BSC 内 。
- 個々 の CFU 寒天プレートからと選択、滅菌注射器を用いた添付 22 ゲージの針、どんな近隣植民地に触れることがなく、プレートからコロニーを取り除くための十分な成長媒体を預金の先端で培地でコロニーをミックス針します
。 : メモ単独でコロニーを選択板の他の細菌から十分に離れて、その媒体を他のコロニーに触れることがなくそれに預けられる 。
- プレートの表面から液体を抽出同じ注射器を使用しています 。
- 注射器内の泡をタップした後血清ボトルに液体を注入し、30 ° C 24 時間の 150 rpm に設定内で軌道シェーカーに配置
注記: 注射器に泡をタップ実験条件を変更することができますボトルにより多くの酸素を導入と細菌の成長時間の間の一貫性を減らす血清ボトルにより多くの酸素を導入することを避けるために重要です 。
- 2 日目: サルヴィ マイクロ チャネルの滅菌
注: チューブ システムの無菌性を促進するために、BSC 内チューブと交換から新しい注射器と注射器をデタッチが必要な手順を行う必要があります。これを行うには、単に金属シリンジ ホルダーを外してシリンジ ポンプからシリンジを外し、滅菌 BSC に接続されているチューブと注射器を持って来る。接続されている配管手順では、言及することは、これは注射器の液体の貯水池、ポリエーテルエーテルケトン (PEEK) インジェクター付きフィッティング PEEK インジェクターは、点滴室に接続されている PTFE チューブに接続されているを含むを指します、サルヴィ インレット チューブ、サルヴィ アウトレット チューブに密封されるコンセント コンテナーだけでなく、です。- 新しいサルヴィ デバイスを使用して、ピーク継ぎ手とインジェクターを PTFE チューブの一方の端に接続します
。 注: サルヴィのデバイスは、デバイス作製の以前の研究と特許の詳細な各実験次の新鮮な準備されます。 5, 6, 8, 15 - 70% エタノール 2 mL を注射器に取るし、サルヴィのピーク継ぎ手に接続します。シリンジをシリンジ ポンプに接続すると、廃液ボトルに、サルヴィのコンセントを取り付ける、エタノール ・ ディ ・水ソリューションを 1.5 h. の 20 μ L/分でサルヴィによって実行をする
- 滅菌・ ディ ・取る 4 mL 注射器に水し、同じサルヴィのインレットに接続します。シリンジをシリンジ ポンプに接続すると、少なくとも 3 h の 20 μ L/分でサルヴィを介して実行するために水を許可
- 内で、BSC は 1.2.5 の手順で準備箔パケットを開き、5 mL シリンジと滅菌ピーク金具 TFE チューブの端の終わりにふさわしい滅菌 PEEK インジェクションを接続します。取る 〜 3 mL の注射器に生殖不能媒体の TFE チューブに取り付けます。5 mL の点滴器を反転し、1 mL の容量に達するまで、点滴室に成長培地を注入滅菌注射器を使用します 。
- 、サルヴィの入口に 5 mL シリンジ点滴室の端を接続します 。
- は成長培地 10 mL を滅菌注射器に考慮し、ドリップ チューブの入口へ接続します。シリンジをシリンジ ポンプに接続すると、12 時間 20 μ L/分でサルヴィを介して実行 (または夜通し) に許可します。これらの部分をセキュリティで保護するのにには、粘着テープを使用します。箔やほこりの粒子や媒体を汚染するそこに含まれる生物の確率を最小限に抑えるためのプラスチック パラフィン映画とアウトレット ボトルをカバーします。このセットアップ方法の詳細な描写は、 図 1 A で見つけることが。
- 意味するシリンジ ポンプが配置されます高い表面にドリップ チューブとテープとサルヴィ下平らな面にセキュリティで保護されたセキュリティで保護された、縦方向にドリップ チューブを許可します 。
- 実行中エタノールのすべてのトレースが削除されていることを確認する 12 h のサルヴィ マイクロと細菌を接種する前に、サルヴィのチューブから 。
- 付加保護のため維持滅菌シャーレ中でサルヴィ マイクロ室側面の入口と出口の管に合うようにカットします。また、SiN 膜およびイメージング解析の前にチャネルを保護するためにウィンドウに常にテープを維持します 。
- 新しいサルヴィ デバイスを使用して、ピーク継ぎ手とインジェクターを PTFE チューブの一方の端に接続します
- 3 日目: サルヴィ マイクロ チャネルの接種
- シリンジ ポンプから全体のチューブ システム (サルヴィ廃液ボトルに接続に接続されているチャンバーを点滴して注射器) を削除しにそれを持って、滅菌 BSC。また、インキュベーターからステップ 2.2.5 から血清バイアルを削除し、BSC に持参します 。
- 任意の汚染を防ぐために 70% エタノールで血清ボトル ストッパーの表面をきれいにし、ボトルから細菌の 4 mL を抽出する添付の滅菌 22 G 針、滅菌注射器を使用します 。
- は 5 mL 商工会議所点滴チューブからサルヴィをデタッチして、サルヴィの入口に直接接種培地で注射器を接続します。ドリップ チューブ滅菌アルミ箔パケット内または BSC のままにします 。
- サルヴィの内で含まれている液体の複数のボリュームの変更を可能にするために、サルヴィのチャネルを接種する 3 h の 20 μ L/分で実行するシリンジ ポンプにサルヴィとコンセントの瓶と注射器をアタッチします 。
- , 接種後シリンジ ポンプからサルヴィと注射器を外し、BSC にもたらします。2.4.3 のステップから 5 mL 点滴室に戻って、サルヴィの入口をアタッチした後成長培地 20 mL の滅菌注射器を考慮し、ドリップ チューブの入口にアタッチします 。
- は、シリンジ ポンプに BSC から、サルヴィに接続されているチューブを持って、2 μ L/分の速度で 6 から 10 日間、または蛍光イメージング (手順 3 で説明します) を示す良好な表示のバイオ フィルムの成長までのチューブの通過を許可します。TOF-SIMS 分析。それが成長培地 10 ml 滅菌シリンジを充填して以前の成長培地実行した後、サルヴィにアタッチする BSC 内なくなると新鮮な媒体を補充します
。 注: 2 μ L/分で接種を開始した後流量増量することや減少、流量が変わりとしてだろうチャネル内でせん断応力を作成するバイオ フィルムをデタッチします。それは重要なこと、この流量は変更しないでください。『 ザシムズ 』 の前にこの、~ 24 h の準備をする密接に多くのメディアをプッシュする必要はありませんので、気泡がないかどうかを確認するチューブを観察します。チューブを通して速いペース。- 回避は、チャネルからバイオ フィルムをプッシュ彼らとしてのマイクロ泡します。サルヴィのチューブに接続している 5 mL 点滴チューブの底内の泡の慎重に重要です。新鮮な媒体は、空気は、サルヴィに余儀なくされることを確保するためのぞき見インジェクターの終わりに注入すること 。
3。サルヴィ マイクロ チャネル内バイオ フィルムのイメージング光学
- 蛍光顕微鏡イメージング
注: このプロトコルではモデル生物として使用される シェワネラ GFP を表現する変異; などは必要ありません染色。細菌は、染色を必要とする場合これ常に (例えば、2 μ L/分) バイオ フィルムの剥離を避けるために同じ流量で行ってください。さらに、細胞は栄養アベイラビリティなく行けばとき、彼らがデタッチします。したがって、任意の追加の染色が必要な場合細胞を染色する供給する前に、水ではなく、成長媒体に汚れを注入する必要があります。- BSC 内チューブ点滴からサルヴィを外し、指-ユニオンをピークにピーク継手をねじ込んで、サルヴィを閉じます 。
- は、ウィンドウが完全にフラットと直面して上向きになるよう、スライド ガラスの上にしっかりとサルヴィ マイクロ室のチューブをテープします。窓から保護テープをはがします。プラットフォームの段階クランプ間スライド ガラスを配置することで顕微鏡のステージにスライドをクランプします 。
- 低い顕微鏡のステージ、サルヴィの上部が表示されるように十分に近いフォーカスの調整がウィンドウに触れるレンズを引き起こさない、10 × 対物の終わり 。
- スイッチのバックライトとフォーカスを調整することにより対物レンズ × 10 を使用してチャネルを見つける。この時点で、サルヴィの罪ウィンドウへの細菌付着の有無がない接種菌をコントロール チャネルのウィンドウと比較すると明らかなを確認します。セルの近いイメージングは、20 × 対物に切り替えます。空のサルヴィ チャネルと比較して、ウィンドウに接続されている細菌の存在が強い緑色蛍光を持つ必要があります 。
- はバックライトを切り顕微鏡水銀ソースを入れます。2-3 分待って、FITC フィルター ウィンドウに接続されているバイオ フィルムのビューとキャプチャ画像に顕微鏡をセットに切り替えます。準備ができたら、 図 1 C を参照のように成熟したバイオ フィルムが見えるものの例としてします 。
- ターン水銀ソースとスライドからサルヴィをデタッチします。必要に応じて再び、イメージングの前にさらなる飛躍をできるようにもう一度 2 μ L/min の中型の流れに添付または二次封じ込め TOF-SIMS 解析用に、サルヴィを転送します。これは、バイオ フィルムの厚さは厚が十分にできないと判断された、TOF-SIMS 解析の前に成長のためのより多くの時間が必要な場合に必要です。もう一度、中型の流れを添付する手順 2.3.6 を参照してください
。 注: かどうか中型の流れを元に戻す、蛍光イメージングされるべき TOF-SIMS 解析の前にもう一度。- 与えるバイオ培 TOF-SIMS 解析を行うことができるまでそれを供給します。推奨されません、ために必要な場合、閉じたサルヴィは、一晩、4 ° C 内に格納が ToF シムズの真空チャンバーに挿入する前に部屋の温度を暖かくべきでいます。しかし、バイオ フィルムのバイオ フィルムの剥離を減らすために中型の流れから切り離された直後後を分析します 。
4。TOF-SIMS データ集録
注: このセクションの概要については、として機能し、吸着タンパク質分子液体 SIMS 分析を記述する私達の以前のプロトコル内でさらに詳しく説明します 。12
- インストール サルヴィ TOF-SIMS ロードロック室に
注: すべての回ときサルヴィ デバイスを処理、TOF-SIMS にインストールするステージと表面の中に潜在的な汚染を避けるために手袋を着用するべき解析。- マウント サルヴィ ステージにし、数本のネジで固定します。罪ウィンドウがフラットで調整ネジの堅さと挿入シリコンウエハ PDMS マイクロ室の下部に作品であることを確認します。ウィンドウで、保護テープを削除し、TOF-SIMS ロードロック室にステージを読み込む 。
- 、TOF-SIMS ロードロックを開く、保持し積載荷台で水平方向にステージを設定し、ロードロック ドアを閉じます。真空ポンプを開始し、適切な真空に達することを確認するまで待機します 。
- 1 x 10 -7 mbar に真空が安定したら、サルヴィを主室に移動します 。
- 深さ方向分析および収集データ ポイント
- 搭載 TOF-SIMS 光学顕微鏡を用いたマイクロ流路を見つける 。
- は、データ取得の前に正または負のモードを選択します。使用、25 keV Bi 3 + はすべての測定で一次イオンビームとしてビームし、すべての測定におけるチャージングを中和するために電子洪水銃を使用します 。
- スキャン 150 ns パルス Bi 3 + 梁幅 64 ピクセル × 64 ピクセルの解像度で 〜 2 μ m の直径の円形区域。100 nm 罪窓から打ち抜き加工後別の 150 のスキャンを続行 s 用高強度データを収集します。パンチスルー後、カウントは、深さ領域内に大幅に増加されます。、安定化した後この参照できます高輝度領域と。 良い質量分解能のスペクトルを取得するためのデータ コレクションの
- 低減パルス幅 50 ns。別の 200 についてのこの買収を続ける s.
- は、少なくとも 3 つの肯定的な 3 つの負のデータ ポイントを収集するための手順を繰り返します
。 注: 必ず罪ウィンドウは中断されません、ウィンドウの整合性が危険にさらさから真空の部屋に漏れ、パンチスルー領域をスペースします 。
5。TOF-SIMS 分析
- IonToF ソフトウェアによる質量校正 の TOF-SIMS (測定エクスプ ローラー) の解析ソフトウェアを開きをクリックして、" プロファイル "、" スペクトル " と " 画像 " ボタン、プロセスの深さプロファイル、m/z スペクトル、および image データをそれぞれします 。
- オープン TOF-SIMS データ集録中にデータ ファイルが得られる 。
- 深さ関心のあるデータを選択し、深さプロファイル時系列に従ってスペクトルを再構築します 。
- プレス " F3 " を開く、" 質量校正 " ウィンドウ。特定のサンプル中に存在すると予想される化学化合物に基づく校正用ピークを選択します 。
- ピークの関心選択
- かピーク選択はサンプルの解析に必要な文献または他の前の調査結果によるとサンプルの特徴的なピークを調べます。M/z スペクトルへの関心のピークの強度を比較します。必要に応じて、新たなピークを追加または干渉のピーク ピーク ・ リストを削除します 。
- をクリックして、ピーク時に左下のウィンドウで赤い線を見つけます。全体のピークを囲む赤い線を移動します 。
- 主なスペクトル ウィンドウで化学式と一致するピークを選択し、クリックして、、" ピークを追加 " ウィンドウの上ボタン
- 質量校正データのエクスポート
- でピーク ・ リストをエクスポートするのには、" ピーク ・ リスト " メニュー、選択 " 保存 … " でピーク ・ リスト、" itmil " 形式 。
- の深さプロファイルをエクスポートするのには、" プロファイル " ウィンドウをクリック、" ファイル "] メニューの [を選択 " エクスポート "、し、選択 " を付けて "、" .txt " ファイル 。
- で、m/z スペクトル ファイルをエクスポートする、" スペクトル " ウィンドウをクリック、" ファイル "] メニューの [を選択 " エクスポート "、し、選択 " を付けて "、" .txt " ファイル 。
- でイメージ ファイルをエクスポートするのには、" 画像 " ウィンドウ、画面を印刷し、画像ファイルとして保存します 。
6。TOF-SIMS データ プロットおよびプレゼンテーション
- グラフィック ツールを使用して、データをインポートします 。
- は、再建されたスペクトルを表示する y 軸として x 軸とピーク強度として m/z を使用してプロットを作る。例は 図 2 A で指定します 。
- 結合が異なる m/z とフォームいずれかの正または負のイオンのマッピングを表示するマトリックスの 2 次元 (2 D) 画像を再構築。例は 図 2 B で指定します 。
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Representative Results
これらの代表的な結果は、TOF-SIMS を通じて得られた添付のバイオ フィルムの化学物質のプロファイルを識別して、解釈方法を示すのに役立ちます。質量スペクトル TOF-SIMS データ集録、簡潔に手順セクションで強調表示を印刷後各それぞれ m/z 値識別情報を割り当てるためにピークの同定を実施しなければなりません。これは、細菌や様々 な水のクラスター、脂肪酸、蛋白質のフラグメントなどを学び、細菌内に存在すると予想される特定の化学断片の質量に関する広範な文献レビューを通じて行うことができます。16,17,18,19,20これらの代表的な結果は、 s. oneidensis氏-1 バイオ フィルムと DI 水サンプルによって得られた、負の質量スペクトルをのみ表示されます。肯定的なスペクトルの解釈と同様の手順に従ってください。
図 1サルヴィ マイクロ チャンネル内のバイオ フィルムを耕す時にAがこのプロトコルによると回路図のセットアップを示しています。左上の注射器は一定速度 PFTE チューブ システム全体と、マイクロ チャネル内中流れるを保つシリンジ ポンプに添付されます。シリンジ ポンプは、後方アップ ストリームを泳ぐことで運動性生物を防ぐために中規模貯留層への汚染を防ぐ点滴室上配置されます。媒体はマイクロとアウトレット チューブを通して封印された出口のボトルに通るサルヴィの PFTE チューブに直接点滴室池から流れます。点線は成熟したs. oneidensisのイメージを罪の] ウィンドウからポイント氏 1 GFP の細胞 3.1 の手順で詳細な蛍光顕微鏡で撮影しました。図 1Bは、このプロトコルでは、 s. oneidensis氏 1 のモデル有機体を使用して確立される成長曲線の例を示します。このグラフの成長段階からこれらの特定の栽培条件で 15-32 h の間成長のログ段階が発生することを判断できます。このグラフからの追加情報は、0-15 h は、成長の遅れ位相 33 105 h 成長の固定相を表すであることを示しています。図 1Cは、成熟バイオ フィルムの例を示す蛍光顕微鏡で取得したイメージです。
図 2A水和のs. oneidensisの負の質量スペクトルを示しています氏 1 バイオ フィルムとしてその場で液体 TOF-SIMS によるマイクロ チャネル内。このグラフは、 S.oneidensis氏 1、DI 水のバイオ フィルムの選択した質量範囲 (100-350 m/z) 比較の例を示します求めたシステム制御。図 2B氏 1、バイオ フィルムと TOF-SIMS による純水の関心のピークの 2 D 画像の比較が表示されます。一度 m/z 値を面白いは、質量スペクトルを勉強してから識別することができます、m/z 値の潜在的なピーク同定適切に起因している化学の断片 IonToF シムズ ソフトウェア ライブラリおよび文献調査でサポートされています。図 2Aに興味のピークは、水のクラスター (すなわち、m/z 107 (H2O)5オハイオ州-、125 (H2O)6オハイオ州-, 143 (H2O)7ああ-、161 (H2O)8オハイオ州-、179 (H2O)9あ-、197 (H2O)10ああ-、215 (H2O)11オハイオ州-、233 (H2O)12あ-、251(H2O)13あ-、269 (H2O)14オハイオ州-、287 (H2O)15ああ-、323 (H2O)17あ-、341 (H2O)19ああ-))9、として化合物バイオ マーカー関連クオラムセンシングのそれぞれのピークの上の赤い線で示される (すなわち、m/z 175 C10H92-)、EPS の副産物 (m/z 123 C2H4PO4-、159 P2O8H-、216 Cr2O7-、285 octadecanoethiols、325 の極性化合物、C12極化合物)15,16,18、および脂肪酸鎖フラグメント (すなわち m/z 127 [C2H3(2CH)3COO]-、255 C16:0 脂肪酸, 279 リノール酸、C18H31O2-, 325 C21H40O2-、341 表面脂質、18 MEA チオエステル結合、ステアリン酸 C18H35O2-、パルミチン酸 C19H17O6の monoacylglyceryls のイオンを通じてバインド-).16,19
バイオ フィルムを水和すると、以降はバイオ フィルムのサンプルに見られるいくつかのピークが DI 水で見つけられるそれらに類似している驚くべきことです。107, 125, 143、161、179、197、215、233、251, 269, 287, 323、341 と (H2O)5オハイオ州-に対応するこれらの水クラスターのピークは図 2Am/z を含む各ピークの上の赤い線が付いています(H2O)6ああ- (H2O)7ああ- (H2O)8オハイオ州- (H2O)9オハイオ州- (H2O)10ああ- (H2O)11ああ- (H2O)12ああ- (H2O)13ああ- (H2O)14ああ- (H2O)15- オハイオ州(H2O)17OH- (H2O)19ああ-、それぞれ。9この質量スペクトルの多くの特徴的な水クラスターの有病率があり、この結果は水和したバイオ フィルムに存在化学水クラスター環境の強力な証拠を提供します。さらに、非水クラスター関連 PDMS、マイクロ流路のコンポーネントから通常、両方のスペクトル ピークの妨害ピークとして帰することが一般的。たとえば、PDMS の中から 1 つの共通知らしめピークはマイナス イオン モードで m/z 137 です。
シムズ バイオ フィルムを比較するガスの質量スペクトル、純水を図 2Aに示すように、いくつかのピークが存在しない DI 水でまだバイオ フィルムに表示されます。たとえば、m/z 255 でピーク ([CH3(2CH)14COO]-、パルミチン酸) がバイオ フィルム サンプルがすべてではない・ ディ ・水サンプルの高強度であります。これはそれをお勧めしたい信号 cバイオ フィルム、最も可能性の高いバイオ フィルムや、自己生成された EPS から青梅。多くの興味深いピークは、図 2Aで識別されました。たとえば、EPS 関連のピークは、m/z 123-、C2H4PO4-、159 (P2O8H-)、216 をことが判明 (Cr2O7-)、(octadecanoethiols)、285、325 (極性化合物、C12極化合物)。17,18,20脂肪酸に関連付けられたピークは 127 をことがわかった ([C2H3(2CH)3COO]-)、255 ([CH3(2CH)14COO]-、パルミチン酸)、279 ([CH3(CH2)15COO]-、リノール酸)、341 (表面脂質、18 MEA をバインド、325 (C21H40O2-)、317 (C21H33O2-)チオエステル結合、ステアリン酸 C18H35O2-、パルミチン酸 C19H17O6-の monoacylglyceryls のイオン)。16,19最後に、キノロン信号クォーラム検出信号関連 C ピーク10H9m/z 1752-認められなかった。
図 2Bは、 S の oneidensis氏 1 バイオ フィルム (上の行) と純水 (下の行) の 4 つの異なる興味深いイオン分布の 2次元画像を表示します。M/z 値 107 ((H2O)5オハイオ州-) は、サンプル、m/z 値 175 内重要な強度の水クラスターを示しています (C10H92-) クオラムセンシング関連信号、m/z 255 を示しています脂肪酸は、([CH3(2CH)14COO]-、パルミチン酸)、341 (C21H41O2-)/z は m が両方の脂質のフラグメントを表すし、1 amu の質量精度によるクラスター水します。9 2D 画像の明るい領域は、イメージにある分子イオンの高い数を示します。予想通り、QS の信号が化合物、脂質バイオ フィルム サンプル内の数量ではるかに大きかった。バイオ フィルム サンプルでは、水のクラスター (m/z 107) の信号が強かった、だったまた DI 水サンプルで現在予想通り。最後に、バイオ フィルム サンプル内で均一が、DI 水サンプルの内で非常に弱く 341/z は m で信号が見つかりました。M/z 341 だった水クラスターのピークが、またいくつかの異なる脂肪酸組成と表面脂質の代表だった。16脂質のフラグメントの存在が水のクラスターの存在をはるかに上回るデータの正規化を示唆した後のバイオ フィルム サンプルでの強力な存在。
図 1: 実験概略図。(A) 研究室内バイオ フィルム設定の実験模式図が表示されますが表示されます。左上を起点として (1) シリンジからミディアム フロー、を介して移動する液体の速度を制御するシリンジ ポンプ (2) に接続されています。矢印は、システム全体のフローの方向を示します。シリンジ (1) は、TFE チューブ (4) に (3) をフィッティング PEEK インジェクターを介して接続されます。媒体は、汚染を避けるために点滴室 (5) を通過し、最終的にサルヴィ (6) 封印された出口のコンテナー (7) に移動します。シリンジ ポンプは、点滴室 (5) はサルヴィ (6) に置かれる平らな表面 (8) に垂直にすることができますように高い表面 (9) に配置されます。(B) 成長曲線「ナノワイヤー」中シェワネラ oneidensis 氏 1。時間 0-15 時間遅れフェーズを表します、時間 15-33 h ログ フェーズを表します、時間 33 105 h 固定相を表し、時間 105 時間またはもはや死フェーズを表します。エラーバーは標準偏差を表します。蛍光顕微鏡で取得した成熟バイオ フィルムの (C) の画像。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 負の水和のスペクトルの TOF-SIMS の比較シェワネラ oneidensisバイオ フィルムとサルヴィ マイクロ氏 1 媒体。(A) m/z シムズ氏 1 中、DI 水シェワネラ oneidensis生物膜の質量スペクトル。後者は、コントロールとして使用されました。赤い線は、特性水クラスターのピークの位置を示します。(B) バイオ フィルムと純水と利益の峰の 2D イメージ比較。左から右へ、画像表示 (m/z 107 (H2O)5オハイオ州-)、水クラスター クォーラム センシング/ホルモン信号 (175 m/z, C10H92-)、脂肪酸 (m/z 255、[CH3(CH2)14COO]-、パルミチン酸)、脂質/EPS フラグメント (341 m/z、18 MEA、C21H41O2-) の表面と。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ログ段階で接種後数日とバイオ フィルムが 3.1 の手順で説明するよう健康とイメージングのため十分な厚さだ前に拡大する温度をテストすることが重要です。S. oneidensis 室温; MR1 バイオ フィルムを養殖具体的手順します。しかし別の部屋の温度の成長率に影響を与えます。したがって、バイオ フィルムは TOF-SIMS 解析に進む前に準備ができているかどうかを理解する光イメージング技術を使用する重要です。同様に、異なった緊張細菌の生育条件と解析のための望ましい厚さを達成するために長さが必要です。図 1 b の成長曲線がログ 12-32 h をする細菌相 200 を示し、これはプロシージャ全体で 24 h で使用されていた、それは今回使えないというログ相として細菌の他の株の成長曲線を確立せずに注意してくださいすることが重要 独立。ログ相は、12 と 33 h s. oneidensis の成長の間でしたが、24 h は酸素がログ フェーズの終わりに、有機体の成長速度制限始めていた成長の部分にだったという事実のために選ばれました。これが時間の細胞であることを示した実験はナノワイヤー、こうして低酸素環境で生き残ることができるフォーム成功したバイオ フィルムにプライミングを生成し始めた。3,13したがって、ログ フェーズ中に細菌を使用する選択した時刻研究によって影響されるべきである経験と知識を研究されている細菌に関する実験的研究文献から得た。さらに、このアプローチを使用してバイオ フィルムの成長に使用される細菌のすべての異なった緊張のログ相を理解する別の成長曲線が確立されなければなりません。2 μ L/分の成長率だったので s. oneidensis の最大成長率を超えないように氏-1、および時間の合計はない草に覆われた成熟したバイオ フィルムを得るため選ばれた計算と着脱しやすい。これらの料金をそれに応じて調整することができますこのセットアップで使用されるさまざまな細菌の知識に。
サルヴィを用いたバイオ フィルムの成長にいくつかの制限には、チャネルの平らな壁にアタッチする細菌の確率と同様に、チャネル内の生物付着が含まれます。このプロトコルでは 2 μ L/分を推奨、一定の速度で成長にもかかわらず生物付着はまだバイオ フィルムが余りに長くのために成長する許可されて場合発生します。このような場合、警告なし、バイオ フィルムはウィンドウからデタッチし、コンセント格納容器に、サルヴィの終了できます。生物付着は単に機械的な力を追加することによっても発生することが (すなわち、移動) サルヴィは、避けられない。しかし、これは、バイオ フィルムの光学顕微鏡下で TOF-SIMS 解析の前に罪のウィンドウに添付ファイルを表示することによってチェックで保つことができます。他の 1 つの制限には、いくつかの細菌を添付が難しくことができますを PDMS マイクロ チャネルの滑らかさが含まれています。ただし、これは細菌の付着が問題ならチャネルにリブのエッジを作成することによって対応するために、サルヴィの設計で変更できます。最後に、成長曲線を決定するため外径600測定値の代わりにセルのカウントを行うことができます。たとえば、研究では、外径600朗読する細胞数の直接および一貫した相関関係を示しています。21したがって、外径600とみなされるバイオ フィルムの成長を評価するのに十分です。
この手法に制限が少なく、サルヴィは本質的に嫌気グローブ ボックス内または任意の環境チャンバーの温度制御など多くのアプリケーションで使用するための多くの汎用性を持つ培養皿として機能。いくつかの制限は、それぞれ特定の細菌の最適な成長条件で対応することは可能である相対湿度、温度、日光、近く配置など手に負えない部屋条件を含んでいます。さらに、これらの技術的な課題のいくつかは、温度やバイオ フィルムのセットアップに RH の仲介機能とインキュベーターで克服できます。
サルヴィは、真空対応マイクロ流体のインターフェイスです。この作品で、200 x 300 μ L マイクロ流路文化バイオ イメージング光学および液体のシムズと続いていました。液体は揮発性および真空の液相を保持することは困難であるため真空ベースの技術を使用して研究する技術的な課題を提示します。こうして TOF-SIMS など真空技術は、伝統的のみ乾燥と低温のサンプルに制限されています。22また、サルヴィ使用できます多様なイメージングおよびさまざまな顕微鏡および分光手法を用いた分光法のため。4,9当社グループは液体・固体-液体界面の場観察における様々 なサルヴィ アプリケーションを継続的に展開してきました。15,23,24私たちの最も最近の努力を示した細菌 SiN 膜への愛着。9初期取付後時間をかけて中の継続的な流れは正常に育成、サルヴィの罪ウィンドウに直接バイオ フィルムを示されています。TOF-SIMS では、一次イオンビーム直径 2 μ m の穴を攻めに使用されます。このディメンションは、その自然水和微小環境でバイオ フィルムの化学プロフィールを提供罪ウィンドウにアタッチされるバイオ フィルムのセルの長さと同様です。乾燥されたサンプルの水和状態でバイオ フィルムを比較するとき、これはバイオ フィルムの化学的アイデンティティの違い、EPS、および水クラスター環境の存在のために非常に重要。9サルヴィを使わず、TOF-SIMS でしたのみ行われる乾燥・低温サンプル自然な水和状態でサンプルの化学物質のプロファイルをキャプチャに失敗した化学のマッピングを提供します。
図 1Aのように、サルヴィ マイクロに対して垂直にドリップ チューブを可能にするために上記のドリップ チューブ シリンジ ポンプを保つことが重要です。さらに、泡 (内コンセント ボトル) アウトレット PFTE チューブ (点滴室に添付) インレット チューブよりも低い場合にデバイスのチューブ内に閉じ込めになる可能性は低くなります。サルヴィの成長のための細菌の育成の別の重要なステップは、1.3 のステップに記載されているを使用する特定の細菌株の成長曲線を取得します。これは光学濃度測定と成長曲線を取得することによって行うことができます。成長曲線図 1Bに示すように細菌される成長のログ段階で細菌が健康であることが想定される期間を理解することにとって重要です。成長のこの段階で細菌を利用した健康バイオ フィルムの微小環境の作成を容易、確実にバイオ フィルムがその期待の率で成長します。TOF-SIMS で使用前に滅菌用オートクレーブできません、サルヴィ マイクロは 70% のエタノールと純水、常温で殺菌します。これは、オートクレーブ両方、サルヴィの窓が損傷し、チャネルに水蒸気を導入するという事実によるものです。成長の数日後細菌付着を検証する蛍光顕微鏡によるマイクロをチェック必要があります。図 1Cの例を見つけることができます、このイメージは、成熟したバイオ フィルムを取られました。媒体の流路のため細菌がもっと好意的アタッチし、マイクロ チャネルのエッジに沿ってにつれて、この場所は、流れとせん断力がローズt。
要約すると、サルヴィは文化研究バイオ フィルムの in situ化学マッピングを使用するための優れた方法、真空ベースのイメージング質量分析に自然な水和状態の生きているバイオ フィルムを提供することができます。このユニークなアプローチは、バイオ フィルムの水クラスター微小同様その EPS 副産物のより深い理解を得るためにより多くの情報を提供できます。この情報は、バイオ フィルムの生物学的活動を理解する使用することができる、生体臨床医学、医用生体工学、農業、産業の研究・開発など、様々 なアプリケーションで利用することができます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
太平洋の北西国立研究所 (なり) 地球と生物科学 (EBD) ミッション種監督研究と開発 (LDRD) 基金へのサポート感謝しております。インストゥルメンタル アクセスが w. r. ワイリー環境分子科学研究所 (EMSL) 一般ユーザーの提案書を提供されました。EMSL はオフィスの生物と環境研究 (BER) なりで主催国立科学ユーザー施設です。著者は博士 『 鼎の証拠、原稿を読んで、有用なフィードバックを提供することをありがちましょう。バテル契約 DE AC05 76RL01830 下 DOE のなりが運営しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ToF-SIMS | IONTOF | TOF.SIMS 5 | Resolution:>10,000 m/Δm for mass resolution;>4,000 m/Δm for high spatial resolution |
| System for Analysis at the Liquid Vacuum Interface (SALVI) | Pacific Northwest National Laboratory | N/A | SALVI is a unique, self-contained, portable analytical tool that, for the first time, enables vacuum based scientific instruments such as time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS) to analyze liquid surfaces in their natural state at the molecular level. |
| -80°C Freezer | New Brunswick Scientific | N/A | U410 Premium Energy Efficient Ultra-Low Temperature Freezer |
| 4°C Refrigerator | BioCold Scientific | N/A | COLDBOX1 |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scientific | N/A | Innova 4900 Multi-Tier Environmental Shaker, set at 30 degrees Celsius for serum bottle and flask culturing, set at 150rpm. |
| Syringe Pump | Cole-Parmer | EW-74905-02 | Cole-Parmer Syringe Pump, Infusion Only, Touchscreen Control 74905-02, used for injecting liquid into the tubing system and SALVI at a constant flowrate. |
| Incubator | Barnstead International | LT1465X3 | Lab-Line incubator, set at 30 degrees Celsius for plate culturing. |
| Autoclave | Getinge | 533LS | Used to sterilize PEEK fittings, tubing systems, serum vials, and medium. Model 533LS Vacuum Steam Sterilizer |
| Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | 4001-000 | GENESYS 20 spectrophotometer for OD600 readings of cuvettes for growth curves. |
| Biological Safety Cabinet | Thermo Fisher Scientific | 1385 | 1300 Series AZ Biological Safety Cabinet |
| Fluorescence Microscope | Nikon | N/A | Nikon OPTIPHOT-2 fluorescence microscope with camera and super high pressure mercury lamp power supply. |
| pH Meter | Mettler Toledo | 51302803 | Used to test the pH of the “nanowires” medium after finished and before autoclaving. |
| PEEK Union | Valco | ZU1TPK | For connecting the inlet and outlet of SALVI, the syringe to the tubing system, and the inlet of the SALVI to the drip chamber of the tubing system. |
| 5 Axes Sample Stage | IONTOF | N/A | Stage is self-made for mounting SALVI in ToF-SIMS. |
| Barnstead Nanopure Water Purification System | Thermo Fisher Scientific | D11921 | ROpure LP Reverse Osmosis filtration module (D2716) |
| Pipette | Thermo Fisher Scientific | 21-377-821 | Range: 100 to 1,000 µL. |
| Pipette Tip | Neptune | 2112.96.BS | 1,000 µL pipette tips |
| Razor Blade Handle | Stanley | N/A | Stanley Bostitch Razor Blade Scraper with 5 Single-Edge Blades, used for cutting PTFE tubing |
| Syringe | BD | 309659 | 1 mL |
| Syringe | BD | 309657 | 3 mL |
| Syringe | BD | 309646 | 5 mL; Used for making the drip chamber |
| Syringe | BD | 309604 | 10 mL |
| Syringe | BD | 302830 | 20 mL |
| Disposable Pipette | Thermo Fisher Scientific | 13-678-11 | 25 mL Fisherbrand™ Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets with Magnifier Stripe, for filling serum bottles. |
| Electric Pipette Filler | Pipet-aid | P-57260 | Vacuum pressure electric serological pipette filler |
| Serum Bottle | Sigma | 33109-U | Holds approximately 69 mL of liquid for culture growth, optimum for use of 20mL culture per bottle. |
| Anaerobic Culture Tube | VWR | 89167-178 | Anaerobic Tubes, 18 x 150 mm, Supplied with 20 mm Blue Butyl Rubber Stopper and Aluminum Seal. |
| Rubber Stopper | Sigma | 27235-U | Silicone stopper, used for sealing serum bottles and for creating the tubing system/drip chamber. |
| Aluminum Crimp Seal (without septum) | Sigma | 27227-U | Aluminum seal for top of serum bottle for use with serum bottle crimper. |
| Serum Bottle Aluminum Seal Crimper | Wheaton | 224307 | 30 mm crimper with standard seal. |
| PTFE Tubing | Supelco | 58697-U | 1.58 mm OD x 0.5 mm ID 50 ft. PTFE Teflon tubing, used for creating the tubing system. |
| Disposable Cuvettes | GMBH | 759085D | 1.5 Ml for use with spectrophotometer. |
| Needle | BD | 303015 | 22G; used for serum bottle injection. |
| Needle | BD | 305120 | 23G; used for punching-through rubber stopper to create drip tubing system. |
| Shewanella oneidensis MR-1 with GFP | N/A | N/A | Matthysse AG, Stretton S, Dandie C, McClure NC, & Goodman AE (1996) Construction of GFP vectors for use in Gram-negative bacteria other than Escherichia coli. FEMS Microbiol Lett 145(1):87-94. |
| Ethanol | Thermo Fisher Scientific | S25310A | 95% Denatured |
| TSA | BD | 212305 | Tryptic soy agar for culturing the model organism (S. oneidensis) used in this protocol |
| PIPES Buffer | Sigma | P-1851 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Hydroxide | Sigma | S-5881 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Ammonium Chloride | Sigma | A-5666 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Potassium Chloride | Sigma | P-4504 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma | S-9638 | Used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Chloride | Thermo Fisher Scientific | S271-3 | Used for “nanowires” medium, and used to make mineral solution used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium lactate | Sigma | L-1375 | 60%(w/w) syrup @ 98% pure, d=1.3 g/mL, 7M, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S-5761 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nitrilotriacetic Acid Trisodium Salt | Sigma | N-0253 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Iron (III) Chloride | Sigma | 451649 | Used to make ferric NTA solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Magnesium Sulfate | Sigma | 208094 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Manganese (II) Sulfate Monohydrate | Sigma | M-7634 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Iron(II) Sulfate Heptahydrate | Sigma | 215422 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Calcium Chloride Dihydrate | Sigma | 223506 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Cobalt(II) Chloride | Sigma | 60818 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Zinc Chloride | Sigma | 229997 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Copper(II) Sulfate Pentahydrate | Sigma | C-8027 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Aluminum Potassium Sulfate Dodecahydrate | Sigma | 237086 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Boric Acid | Sigma | B-6768 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Molybdate Dihydrate | Sigma | 331058 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nickel(II) Chloride | Sigma | 339350 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Sodium Tungstate Dihydrate | Sigma | 14304 | Used to make minerals solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| D-Biotin | Sigma | 47868 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Folic Acid | Sigma | F-7876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Pyridoxine Hydrochloride | Sigma | P-9755 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Riboflavin (B2) | Sigma | 47861 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Thiamine Hydrochloride | Sigma | T-4625 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Nicotinic Acid | Sigma | N4126 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| D-Pantothenic Acid Hemicalcium Salt | Sigma | 21210 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Vitamin B12 | Sigma | V-2876 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| 4-Aminobenzoic Acid | Sigma | A-9878 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
| Thioctic Acid | Sigma | T-1395 | Used to make vitamin solution, used for “nanowires” medium {Hill, E.A. 2007} |
References
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