Summary
Das beschriebene hydroponische Kokultivierungssystem unterstützt intakte Pflanzen mit Metallgittersieb und kokultiviert sie mit Bakterien. Pflanzengewebe, Bakterien und sezernierte Moleküle können dann separat für nachgeschaltete Analysen geerntet werden, wobei gleichzeitig die molekularen Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der interagierenden Mikroben oder Mikrobiome untersucht werden können.
Abstract
Ein experimentelles Design, das natürliche Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen nachahmt, ist sehr wichtig, um die komplexen Plant-Microbe-Signalisierungsprozesse abzugrenzen. Arabidopsis thaliana - Agrobacterium tumefaciens Bietet ein hervorragendes Modellsystem zur Untersuchung bakterieller Pathogenese und Pflanzeninteraktionen. Frühere Untersuchungen von Pflanzen -Agrobacterium- Wechselwirkungen haben sich weitgehend auf Pflanzenzell-Suspensionskulturen, die künstliche Verwundung von Pflanzen oder die künstliche Induktion von mikrobiellen Virulenzfaktoren oder Pflanzenverteidigungen durch synthetische Chemikalien angewiesen. Allerdings unterscheiden sich diese Methoden von der natürlichen Signalisierung in Planta , wo Pflanzen und Mikroben in räumlichen und zeitlichen Manieren erkennen und reagieren. Diese Arbeit präsentiert ein hydroponisches Kokulturierungssystem, bei dem intakte Pflanzen von Metallgittersiebe gestützt und mit Agrobacterium kultiviert werden. In diesem Kokultivierungssystem wird kein synthetisches Phytohormon oder eine Chemikalie, die micr induziertObjektive Virulenz oder Pflanzenverteidigung wird ergänzt. Das hydroponische Kultivierungssystem ähnelt sehr starken Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen und signalisiert die Homöostase in Planta . Pflanzenwurzeln können aus dem Medium, das Agrobacterium enthält , getrennt werden, und die Signalisierung und Reaktionen sowohl der Pflanzenwirte als auch der wechselwirkenden Mikroben können gleichzeitig und systematisch untersucht werden. Zu jedem gegebenen Zeitpunkt / Intervall können Pflanzengewebe oder Bakterien separat für verschiedene "Omics" -Analysen geerntet werden, was die Leistungsfähigkeit und Wirksamkeit dieses Systems zeigt. Das Hydroponik-Kokulturierungssystem lässt sich leicht an das Studium anpassen: 1) die wechselseitige Signalisierung verschiedener Pflanzen-Mikroben-Systeme, 2) Signalisierung zwischen einem Pflanzenwirt und mehreren mikrobiellen Spezies ( dh mikrobielle Konsortien oder Mikrobiomen), 3) wie Nährstoffe und Chemikalien impliziert werden In der Pflanzenmikroben-Signalisierung und 4) wie die Mikroben mit Pflanzenwirten interagieren und zur Pflanzenverträglichkeit zur Biotik beitragenR abiotische Belastungen.
Introduction
Pflanzen-assoziierte Mikroben spielen eine wichtige Rolle im biogeochemischen Radfahren, Bioremediation, Klimaschutz, Pflanzenwachstum und Gesundheit sowie Pflanzenverträglichkeit gegenüber biotischen und abiotischen Belastungen. Mikroorganismen interagieren mit Pflanzen sowohl direkt durch den Pflanzenzellwandkontakt als auch indirekt über chemische Sekretion und Signalisierung 1 , 2 , 3 . Als sessile Organismen haben Pflanzen direkte und indirekte Mechanismen entwickelt, um einer Infektion durch Pathogene zu widerstehen. Direkte Abwehr umfasst strukturelle Abwehrkräfte und die Expression von Verteidigungsproteinen, während indirekte Verteidigungen sekundäre Pflanzenmetabolitproduktion und die Anziehung von Organismen antagonistisch gegenüber eindringenden Pathogenen 4 , 5 umfassen . Pflanzen-abgeleitete Wurzel-Exsudate, Sekrete, Schleime, Mucigel und Lysate verändern die physikalisch-chemischen Eigenschaften der Rhizosphäre zu gewinnen oder zu stoßenMikroben gegen ihre Gastgeber 6 . Die chemische Zusammensetzung der Wurzelsekretion ist speziesspezifisch und dient so als selektiver Filter, der es ermöglicht, dass bestimmte Mikroorganismen, die in der Lage sind, solche Verbindungen zu erkennen, in der Rhizosphäre 6 zu blühen. So können kompatible mikrobielle Spezies stimuliert werden, um ihre Assoziationen zu aktivieren und zu verstärken, entweder zum Nutzen oder zum Nachteil des Pflanzenwirts 1 .
Das Verständnis von Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen in der Rhizosphäre ist der Schlüssel zur Steigerung der Pflanzenproduktivität und des Ökosystems, da eine Mehrheit der mikrobiellen und chemischen Exposition an der Wurzelstruktur und der Boden-Luft-Grenzfläche 2 , 6 , 7 , 8 erfolgt . Allerdings ist die Untersuchung von unterirdischen Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen und wechselseitigen Reaktionen aufgrund ihrer faszinierenden Herausforderung eine Herausforderung Komplexe und dynamische Natur und der Mangel an geeigneten experimentellen Modellen mit natürlicher Wurzelstruktur und Pflanzenmorphologie unter streng kontrollierbaren Wachstumsbedingungen. Als einer der am stärksten untersuchten Phytopathogene infiziert Agrobacterium eine breite Palette von Pflanzen mit landwirtschaftlicher und gartenbaulicher Bedeutung, darunter Kirsche, Apfel, Birne, Traube und Rose 9 . Agrobacterium ist ein wichtiger Modellorganismus für das Verständnis von Pflanzen-Pathogen-Wechselwirkungen und ist ein leistungsfähiges Werkzeug in der Pflanzen-Transformation und Anlagentechnik 10 , 11 , 12 , 13 , 14 .
Molekulare Pflanzen- Agrobacterium- Wechselwirkungen wurden seit mehreren Jahrzehnten gut untersucht, und das aktuelle Verständnis der Agrobacterium- Pathogenität ist umfangreich 9 ,f "> 11, 15, 16. Agrobacterium Pathogenität in seine entwickelte Fähigkeiten des Wahrnehmens von Pflanzen abgeleiteten Signale weitgehend zurückgeführt, in der feine Modulation seiner Virulenz Programm und Zell-zu-Zell - Kommunikation führt, sogenannte quorum sensing 17. Der Das Agrobacterium- Virulenz-Programm wird durch mehrere in der Rhizosphäre verfügbare Signale reguliert und umfasst zwei Sätze von 2-Komponenten-Systemen, das ChvG / I-System und das VirA / G-System. Säurebedingungen in der Rhizosphäre aktivieren die Transkription von chvG / I , virA / G , Und mehrere andere Gene, die an der Agrobacterium- Pathogenität beteiligt sind, einschließlich virE0 , virE1 , virH1 , virH2 und Genen des Typ-VI-Sekretionssystems (T6SS) 18. Pflanzliche Phenolverbindungen, einschließlich Acetosyringon (4'-hydroxy-3 ', 5 '-Dimethoxyacetophenon), aktivieren Sie die V.IrA / G 2-Komponenten-System durch Phosphorylierungs-Signalisierungsmechanismen 19 . VirA / G aktiviert dann das gesamte vir- regulon, was zur Übertragung und Integration eines ~ 20 kb bakteriellen DNA-Fragments namens Transfer-DNA (T-DNA) aus seinem tumorinduzierenden (Ti) -Plasmid in den Pflanzenkern 16 führt . T-DNA trägt Gene, die für die Synthese der Pflanzenhormone Indol-3-essigsäure (IAA) ( iaaM und iaaH ) und Cytokinin ( ipt ) verantwortlich sind und einmal in Pflanzenzellen exprimiert werden, werden große Mengen dieser Phytohormone produziert. Dies führt zu einer abnormen Gewebevermehrung und Pflanzenentumorentwicklung, bekannt als Krone Gallenkrankheit, die ein chronisches und wiederauflebendes Problem für Pflanzen 9 , 11 , 20 ist . IAA wirkt auch gemeinsam mit Salicylsäure und Gamma-Aminobuttersäure, um Agrobacterium- Virulenz zu unterdrücken oder Agrobacteriu zu reduzieren M Quorum Sensing (QS) 17 , 21 , 22 . Um dieser Repression entgegenzuwirken, trägt T-DNA auch Gene für die Opin-Biosynthese, die Agrobacterium quorum-Sensing aktiviert, um die Agrobacterium- Pathogenität zu fördern und dient auch als Nährstoffquelle für den Pathogen 22 , 23 .
Trotz eines insgesamt tiefen Verständnisses von Agrobacterium- Pflanzen-Wechselwirkungen und der resultierenden T-DNA-Übertragung in den Pflanzenwirt sind die komplexen Signalisierungsereignisse im Anfangsstadium der Interaktion weniger gut verstanden. Dies ist teilweise auf die Einschränkungen konventioneller Ansätze zur Untersuchung von Agrobacterium- Plant-Signalisierung zurückzuführen. Pflanzenzell-Suspensionskulturen und künstliche ortsspezifische Verwundungen werden häufig verwendet, um molekulare Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen zu untersuchen 24 ,Ef "> 26 , 27. Allerdings fehlen Zellsuspensionen einer typischen Pflanzenmorphologie, insbesondere haben Pflanzen-Suspensionszellen keine Wurzelstrukturen und Wurzel-Exsudate, die für die Aktivierung der mikrobiellen Chemotaxis und der Virulenz 28 , 29 sehr wichtig sind. Die Aufrechterhaltung der Pflanzenmorphologie Und die Wurzelstruktur wurde durch künstlich verwundete Pflanzen adressiert, was eine ortsspezifische Infektion erleichtert, was zum Nachweis von induzierten pflanzenverteidigungsbezogenen Genen in direkt infiziertem Pflanzengewebe 30 , 31 führt . Die künstliche Verwundung unterscheidet sich jedoch deutlich von der pathogenen Infektion in der Natur , Insbesondere wenn die Verwundung zu einer Jasmoninsäure (JA) -Akkumulation führt, die systemisch mit der natürlichen Anlagensignalisierung und -verteidigung in Einklang steht 26. Darüber hinaus werden synthetische Chemikalien typischerweise verwendet, um Pflanzenwirtsreaktionen künstlich zu induzierenOder pathogene Virulenz. Obwohl die Ergänzung solcher chemischen Verbindungen, die die Konzentrationen in Planta reflektieren, möglich ist, ist eine solche Ergänzung nicht die Diffusion von Wurzelausscheidungen allmählich in die umgebende Rhizosphäre, die einen von den Mikroben 28 , 32 erfaßten chemotaktischen Gradienten erzeugt. Angesichts der Einschränkungen herkömmlicher Ansätze zur Untersuchung von Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen können die Genauigkeit und Tiefe der erhaltenen Daten behindert und restriktiv sein und das aus den konventionellen Ansätzen erzeugte Wissen kann nicht direkt in Planta umgesetzt werden . Viele Aspekte der Pflanzen- Agrobacterium- Signalisierung sind noch nicht vollständig verstanden, besonders in der frühen Phase der Wechselwirkungen, wenn die Krankheitssymptome noch nicht entwickelt haben.
Um die Grenzen herkömmlicher Ansätze zu ändern, stellt diese Arbeit eine kostengünstige, streng kontrollierbare und flexible Hydroponik dar. COkultivierungssystem, das es Forschern ermöglicht, tiefer Einblicke in die komplexen Signalisierungs- und Reaktionswege im Anfangsstadium molekularer Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen zu gewinnen. Hydroponik wurde weithin verwendet, um Pflanzennährstoffe, Wurzel-Exsudate, Wachstumsbedingungen und die Auswirkungen der metallischen Toxizität auf Pflanzen 33 , 34 zu studieren. Es gibt mehrere Vorteile von hydroponischen Modellen, darunter die kleinen räumlichen Anforderungen, die Zugänglichkeit verschiedener Pflanzengewebe, die enge Kontrolle der Nährstoff- / Umweltbedingungen und die Schädlingsbekämpfung. Hydroponische Systeme sind auch weniger begrenzt auf Pflanzenwachstum im Vergleich zu Agar / Phytoagar-Beschichtung Techniken, die in der Regel beschränken Wachstum nach 2-3 Wochen. Wichtig ist, dass die Aufrechterhaltung von Ganzpflanzenstrukturen die für die mikrobielle Chemotaxis und die Virulenzinduktion notwendige natürliche Wurzelsekretion erleichtert 8 , 29 . Das System beschreibtBett hier ist einfacher und weniger arbeitsintensiv als die Alternativen 33 , 34 . Es nutzt weniger Teile und benötigt keine anderen Werkzeuge als Standardscheren. Es verwendet Metallgewebe (im Gegensatz zu Nylon 33 ) als eine starke Unterstützung für Pflanzenwachstum und eine einfache Methode der Belüftung unter sterilen Bedingungen durch Schütteln, um mikrobielles Wachstum zu unterstützen. Darüber hinaus kann das System Metallgewebe in verschiedenen Größen verwenden, um das Pflanzenwachstum zu unterstützen, das verschiedene Pflanzenarten aufnimmt, ohne die Breite ihrer Wurzeln zu beschränken.
In dem hier vorgestellten Hydroponik-Kokultur-System werden Pflanzen in einem sterilen Hydroponik-System angebaut, wo die Pflanzenwurzeln organische Verbindungen absondern, die das Wachstum von geimpften Bakterien unterstützen. In diesem Kokultivierungssystem werden keine künstlichen Chemikalien wie Pflanzenhormone, Verteidigungsauslöser oder virulenzinduzierende Chemikalien ergänzt, was die natürliche Zelle widerspiegelt-signale Homöostase bei Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen. Mit diesem hydroponischen Kokultivierungssystem war es möglich, die Genexpression in Arabidopsis thaliana Col-0 Wurzelgewebe bei der Infektion durch Agrobacterium sowie die Aktivierung von Agrobacterium- Genen bei der Kokultivierung mit Arabidopsis gleichzeitig zu bestimmen. Es wurde weiter gezeigt, dass dieses System geeignet ist, Agrobacterium- Anlagerung an Pflanzenwurzeln sowie das Pflanzenwurzel-Sekretariat-Profil, bei der Kokultivierung (Infektion) mit Agrobacterium ( Abbildung 1 ) zu untersuchen.
Abbildung 1: Überblick über das Hydroponic Cocultivation System mit Probenanalysen. Pflanzen werden oben auf dem Netz gezüchtet (schießt über dem Netz), wobei die Wurzeln in das hydroponische Medium eintauchen, das dann mit Bakterien geimpft wirdOder Kokultur. Pflanzengewebe und Bakterien werden dann für gleichzeitige Extraktionen und Analysen getrennt. Diese Zahl wurde aus Referenz 35 geändert.
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Protocol
1. Experimentelle Planung
- Bestimmen Sie die spezifischen Ziele des Experiments.
- Lesen Sie das gesamte Protokoll unten durch. Bestimmen Sie, welche Abschnitte für die spezifischen Ziele relevant sind und ob irgendwelche Änderungen vorgenommen werden müssen. Siehe unten für Beispiele.
- Überlegen Sie, ob die Experimente A. thaliana Pflanzen und A. tumefaciens Bakterium, wie unten, oder eine andere Pflanze-Mikroben-Kombination verwenden.
HINWEIS: Während verschiedene Pflanzenarten verwendet werden können, kann die Dicke der Pflanzenwurzeln ein unterschiedliches Gitter (Schritt 3.3) und die Wachstumsparameter (Schritte 3.10-3.11 und 4.4) und Hydroponische Tankgröße und Mediumvolumen (Schritt 4.2) kann auch eine Anpassung erfordern ( Abbildung 2 ). Mikroben können leicht als reine Kulturen, gemischte Spezies (Konsortien) oder aus Umweltproben (Mikrobiomen) inokuliert werden, aber jegliche Veränderungen können das Protokoll beeinflussen, insbesondere Schritt 4.5. - Bedenke dieArten von Experimenten, die zur Analyse der Proben verwendet werden.
HINWEIS: Die Fluoreszenzmikroskopie (Schritt 5) erfordert Organismen, die mit einem fluoreszierenden Reporterkonstrukt markiert sind.
- Überlegen Sie, ob die Experimente A. thaliana Pflanzen und A. tumefaciens Bakterium, wie unten, oder eine andere Pflanze-Mikroben-Kombination verwenden.
- Entwerfen Sie entsprechende Kontrollen. Inklusive Hydroponische Tanks ohne Sämlinge, die mit Kontrollbakterien und Tanks mit Kontrollsämlingen geimpft werden, die nicht mit Bakterien inokuliert werden.
- Planen Sie die Versuche mit der entsprechenden Anzahl von Samen und Hydroponischen Tanks. Betrachten Sie Kontrollen, biologische Replikate (mindestens 3) und Mengen an Gewebe, die für alle Analysen erforderlich sind.
- Bestimmen Sie die geeignete Länge der Kultivierung für die experimentellen Ziele (Schritt 4.8).
- Überprüfen Sie nach Bedarf alle Schritte.
Abbildung 2. Beispiele für andere Pflanzen, die im Hydroponischen System kultiviert werden können, unterstützt durch ein P Latung von Metall Mesh. Kompatibilität eines Satzes von Metallgeweben für eine Vielzahl von Pflanzensamen und Anbau. ( A ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 3 × 3 Mesh × .047 "Dia-Draht für Vicia faba ( B ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 4 × 4 Mesh × .035" Dia Draht für Zea mays . ( C ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 4 × 4 Mesh × 0,032 "Dia-Draht für Glycine max (Sojabohne) ( D ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 6 × 6 Mesh × .047" Dia Draht für Raphanus sativus (Winter Rettich). ( E ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 6 × 6 Mesh × .047 "Dia Draht für Triticum spp. ( F ) Edelstahl-Typ 304 Schweißnaht 6 × 6 Mesh × 0,035" Dia Draht für Cucumis sativus . Diese Zahl wurde aus Referenz 35 geändert.955fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
2. Pflanzensamen Oberflächen-Sterilisation
- Vortex (bei hoher Geschwindigkeit) ca. 200 Samen von A. thaliana mit 500 μl deionisiertem Wasser in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Für Pflanzenarten mit größeren Samen, verwenden Sie ein großes Rohr, um die Oberflächen-Sterilisation zu erleichtern.
- Zentrifugieren Sie diese bei ca. 9.000 xg für 30 s in einer Tisch-Mikro-Zentrifuge. Das Wasser (Überstand) mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 300 μl 2% Natriumhypochlorit zu den Samen hinzu und verwirren Sie. Bei Raumtemperatur für 1 min ablassen. Bei Pflanzenarten mit größeren Samen verwenden Sie größere Mengen, um die Samen zu bedecken.
- Zentrifugieren bei etwa 9000 xg für 30 s in einer Tisch-Mikro-Zentrifuge. Die Natriumhypochloritlösung mit einer Pipette entfernen.
- Fügen Sie 500 μl steriles, deionisiertes Wasser zu den Samen hinzu und verwirren Sie. Zentrifuge bei ca. 9.000 xg für30 s und entfernen Sie das Wasser mit einer sterilen Pipette.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 zusätzlich 4 mal.
- Fügen Sie 500 μl 70% Ethanol zu den Samen hinzu und verwirren Sie. Bei Raumtemperatur für 1 min ablassen.
- Zentrifugieren bei etwa 9000 xg für 30 s in einer Tisch-Mikro-Zentrifuge. Das 70% ige Ethanol mit einer Pipette entfernen.
- Wiederholen Sie Schritt 2.5 zusätzlich 5 mal.
- Die sterilisierten Samen in 500 μl sterilem, hochreinem Wasser resuspendieren.
3. Samenkeimung und halbfeste Anpflanzung von Pflanzen
- Vorbereiten halbfeste Murashige und Skoog (MS) Medium: 2.165 g / L MS basale Salze; 10 g / l Saccharose; 0,25 g / l MES; Und 59 mL / L B5 Vitaminmischung, pH 5,75, mit 4 g / l Phytoagar.
- Autoklav das MS-Medium. Gießen Sie 25 ml davon in jede sterile tiefe Petrischale (100 x 25 mm 2 ).
- Für jede Petrischale schneiden Sie ein 90 x 90 mm großes Quadrat aus Edelstahl.
HINWEIS: Das empfohlene Netz für A. thaliana < / Em> hat eine Note von 304 (Standardgrad), Maschenzahl (Anzahl der Löcher pro linearem Zoll) von 40 x 40 und einen Drahtdurchmesser von 0,01 "(0,0254 cm). Für größere Hydropin-Tanks ist ein größeres Maschenquadrat erforderlich Oder höhere Plattformen. - Biegen Sie die Ecken jedes Quadratnetzes gerade genug, damit das Netz in die Petri-Platte passt. Biegen Sie die Ecken um einen 90 ° -Winkel in die Masse des Gitters, damit das Gitter von den Ecken gestützt werden kann, so dass genügend Platz für die Wurzelentwicklung bleibt ( Abbildung 3a ).
- Setzen Sie die geschnittenen Mesh-Quadrate in einen Becher, legen Sie sie mit Aluminiumfolie ab und sterilisieren Sie sie durch Autoklavieren mit einem 30-minütigen Trockenzyklus.
- Sobald sich das Medium in den Petrischalen verfestigt hat und das Netz steril ist, legen Sie jedes sterilisierte Mesh-Quadrat auf das halbfeste Medium, wobei die gebogenen Ecken nach unten zeigen.
- Schieben Sie das Netz so, dass die Ecken das Medium durchdringen und die Masse des Netzes die obere Oberfläche des Mediums berührt (> Fig. 3b).
- Verwenden Sie eine 200 μl Transferpipette, um einzelne oberflächen-sterilisierte A. thaliana Samen zu erstellen (Samen bleiben auf der Spitze der Pipette wegen Vakuumkraft) und übertragen Sie jeden Samen auf die Oberseite des Netzes. Setzen Sie die Samen so ein, dass sie für experimentelle Bedürfnisse ( z. B. 4 6 Samen / Platte) geeignet sind.
- Die Petrischalen mit Deckel abdichten und ein poröses chirurgisches Band um die Kanten legen.
- Stratifizieren Sie die Samen, indem Sie die gesamte Petrischale auf 4 ° C für 2 d in der Dunkelheit ( z. B. Wrap in Tinfoil, um Dunkelheit zu simulieren).
- Kultivieren Sie die Samen in der Petrischale bei 22-24 ° C mit einer 16 h Photoperiode für 10-14 Tage ( Abbildung 3c ).
Abbildung 3: Hydroponisches Pflanzen-Mikroben-Kokosierungssystem. Die linke paNel stellt ein Flussdiagramm dar, das die sechs wichtigsten Schritte bei der Montage und dem Betrieb des hydroponischen Co-Kultivierungssystems umreißt. Das rechte Panel zeigt die tatsächlichen experimentellen Materialien, Ausrüstung und Betriebsabläufe für das hydroponische Kokultivierungssystem bei der Untersuchung von Arabidopsis-Agrobacterium- Wechselwirkungen. Der Impfschritt und der abschließende Schritt für die pflanzliche oder bakterielle Probenahme werden nun gezeigt. Diese Zahl wurde aus Referenz 35 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
4. Hydroponic Cocultivation System
- Bereiten Sie flüssiges Murashige und Skoog (MS) Medium vor: 2.165 g / L MS basale Salze, 10 g / l Saccharose, 0,25 g / l MES und 59 mL / L B5 Vitaminmischung, pH 5,75.
- Autoklav das Medium. Gießen Sie 18 ml davon in jedes sterile zylindrische Glas oder klaren Plastikbehälter (kristallisierende Teller, 100 x 80 mm2) mit sterilen Deckeln.
HINWEIS: Prüfen Sie die Tanks und Deckel, indem Sie sie in Aluminiumfolie und Autoklavieren einwickeln. - In einer sterilisierten Strömungshaube verwenden Sie sterile Pinzetten, um jedes Mesh-Quadrat mit 10-14 Tage alten Sämlingen vorsichtig von dem halbfesten Medium zu einem hydroponischen zylindrischen Tank zu übertragen ( Abbildung 3d ). Die Deckel mit porösem Chirurgieband auf die Tanks abdichten.
- Kultivieren Sie die Sämlinge auf dem Netz im Tank für 72 h bei 22-24 ° C, mit einer 16 h Photoperiode und Schütteln bei 50 U / min für die Belüftung ( Abbildung 3e ).
HINWEIS: Damit können sich Pflanzen vor der Impfung (Kokultivierung) mit Mikroorganismen an die hydroponische Umgebung anpassen. Diese Wartezeit wird auch eine zufällige mikrobielle Kontamination vor der Inokulation sichtbar machen.- Beginnen Sie den nächsten Schritt am Tag vor dem Ende der Inkubationszeit.
- Wachsen A. tumefaciens in AB mittel(0,5% w / v Hefeextrakt, 0,5% w / v Trypton, 0,5% w / v Saccharose, 50 mM MgSO 4 , pH 7,0) bei 28 ° C unter Schütteln über Nacht, bis die Kultur eine endgültige optische Dichte von 1,0 bei 600 erreicht hat Nm (OD 600 ), gemessen mit einem Spektrophotometer, mit uninokuliertem AB-Medium als Rohling.
HINWEIS: Ein OD 600 von 1,0 entspricht etwa 10 9 Zellen / ml. - Waschen Sie die A. tumefaciens dreimal in einem gleichen Volumen von 0,85% NaCl. Resuspend in einem gleichen Volumen von sterilen doppelt destillierten Wasser.
- Vor der Impfung, prüfen Sie den Tank mit Sämlingen sorgfältig, um sicherzustellen, dass es keine Kontamination; Das Medium in den unberührten Tanks sollte klar und transparent sein.
- Verwerfen Sie jeden Tank mit trübe Flüssigkeit (Kontamination) und nummerieren den Rest der Tanks. Probieren Sie eine kleine Menge (20 μl) hydroponisches Medium aus jedem nummerierten Tank und legen Sie es auf eine Petrischale mit Luria Brühe (LB) gefüllt. InkubierenDie Schale bei 28 ° C.
- Sofort fügen Sie 50 μl der A. tumefaciens Suspension (ca. 5 x 10 7 Zellen, geschätzt aus der OD 600 ) in jeden nummerierten Hydropon-Tank. Die A. thaliana- Sämlinge und A. tumefaciens bei 22-24 ° C mit einer 16 h Photoperiode und Schütteln bei 50 U / min kultivieren ( Abbildung 3f ).
- Untersuche die gefleckte LB-Platte aus Schritt 4.7.1. Nach 12 und 28 h Inkubation zur Überprüfung der Sterilität der Tanks. Wenn es eine Kontamination gibt, verwenden Sie nicht den entsprechenden nummerierten Tank (inokuliert mit Bakterien) für weitere nachgeschaltete Assays.
- Wenn gewünscht, überwacht das Wachstum von A. tumefaciens in regelmäßigen Abständen durch Entfernen einer Probe von Medium aus dem Tank und Messen der OD 600 unter Verwendung eines Spektrophotometers mit Medium aus einer nicht geimpften Kontrolle als Leerzeichen ( Abbildung 4 ).
NEINTE: Pflanzenkrankheitssymptome sollten nach 7 d sichtbar sein ( Abbildung 5 ). - Getrennte A. thaliana Wurzeln aus der Bakterien Suspension durch Anheben der Mesh-Platte; Das Timing dieses Schrittes hängt von nachgelagerten Prozessen ab. Einzelheiten siehe Schritt 5-8.
- Bei der Verwendung von Wurzeln für nachfolgende Analysen, spülen Sie schnell die Wurzeln in doppelt destilliertem Wasser. Bei Verwendung von Blatt oder anderem Gewebe das Gewebe abschneiden. Für RNA-Analysen fahren Sie sofort mit Schritt 7.1 fort.
Abbildung 4: Agrobacterium Wachstum im Hydroponic Cocultivation System. Agrobacterium- Wachstum in Gegenwart oder Abwesenheit eines Pflanzenwirts ( Arabidopsis ) wurde alle 4 h überwacht. Agrobacterium- Zellen wurden in AB-Medium O / N gezüchtet, 3x mit 0,85% NaCl gewaschen und in das hydroponische System mit oder w geimpftOhne Arabidopsis -Kultivierung, von einer anfänglichen OD 600 von etwa 0,1. Die OD 600- Werte sind die Mittel von drei biologischen Replikaten mit Standardabweichungen ( OD 600 von 1,0 = 1 x 10 9 Zellen / ml).
Abbildung 5: Repräsentative Pflanzenphänotypen und beobachtbare Krankheitssymptome während der Kultivierung. Innerhalb von 4 d nach der Inokulation sind keine Krankheitssymptome sichtbar ( A ) im Vergleich zu nicht geimpften Pflanzen ( B ). Nach 7 d Cocultivation (Infektion) werden bei infizierten Pflanzen ( C ) Krankheitssymptome beobachtet, während nicht geimpfte Pflanzen gesund bleiben ( D ).
5. Fluoreszenzmikroskopie
- Verwenden Sie A. tumefaciens mit einem Reporter-Konstrukt für ein Autofluoreszenz-Protein fürDie Kokultivierung in Schritt 4.5 .
HINWEIS: Hier wird ein modifiziertes pJP2-Plasmid verwendet, das pCherry, ein Derivat von dsRed 36 , exprimiert. - Nach einer geeigneten Kultivierung ( zB 48 h) in Schritt 4.8, einzelne Sekundärwurzeln (Seitenäste der Hauptwurzel) mit steriler Schere trennen.
- Spülen Sie die Wurzeln in doppelt destilliertem Wasser, um lose gebundenes Material zu entfernen. Tauchen Sie jede Wurzel in 30 μl Wasser auf einem Objektträger und bedecken Sie mit einem Glasdeckel.
- Die Kanten des Deckglases mit Nagellack abdichten, um die Austrocknung der Wurzeln zu verhindern.
- Visualisierung der Anhaftung von A. tumefaciens an A. thaliana Wurzeln durch Fluoreszenzmikroskopie.
HINWEIS: Hier wird ein konfokales Mikroskop mit Anregung aus einem Helium-Neon (He-Ne) 543/594 nm Laser verwendet, um pCherry rote Fluoreszenz bei 590-630 nm unter einem invertierten 63X Wasserlinsenobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 (
Abbildung 6: Agrobacterium Root Attachment, bestimmt durch konfokale Mikroskopie. Das pCherry-Rot-Fluoreszenz-markierte Agrobacterium wurde bei 590-630 nm mit Anregung aus einem Helium-Neon (He-Ne) 543/594 nm Laser sichtbar gemacht. Die Visualisierung wurde unter einem invertierten 63X Wasserlinsenobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,4 durchgeführt. Maßstäbe = 11 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
6. Bakterien-Transkript-Analysen
- Nach einer geeigneten Co-Kultivierung ( zB 8 h) in Schritt 4.8, trennen Sie die Wurzeln aus dem hydroponischen Medium wie in Schritt 4.9. Übertragen Sie 1,5 ml des hydroponischen Mediums auf ein 1,5 mL MikroZentrifugenröhrchen zentrifugieren und bei 12.000 xg für 2 min zentrifugieren, um die Zellen zu pelletieren.
- Den Überstand entfernen. Übertragen Sie weitere 1,5 ml des hydroponischen Mediums auf das gleiche 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 12.000 g für 2 min, um die Zellen zu pelletieren.
- Den Überstand entfernen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier durch Einfrieren der Proben bei -80 ° C bis zum Gebrauch angehalten werden. - Extrahieren Sie die RNA aus den A. tumefaciens Zellen unter Verwendung von Standardmethoden 37 oder einem geeigneten kommerziellen RNA-Isolations- und Reinigungskit mit DNase-Behandlung, um DNA-Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier durch Einfrieren von Aliquots von RNA bei -80 ° C bis zur Verwendung pausiert werden. - Verwenden Sie die isolierte RNA für eine Vielzahl von Analysen unter Verwendung von Standardmethoden, einschließlich der folgenden.
- Verwenden Sie ein kommerzielles Mikroarray nach dem Protokoll des Herstellers, um Gensätze zu erkennen, die differentiell in der kokultivierten gegen die Kontrolle ausgedrückt werdenKultur.
- Verwenden Sie eine quantitative Real-Time-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR), um die Expression spezifischer Gene zu detektieren oder um Microarray-Daten zu validieren 38 .
7. Plant Transcript Analysen
- Nach einer geeigneten Kokultivierung ( z. B. 8 h) in Schritt 4.8, trennen Sie die Wurzeln aus dem hydroponischen Medium, wie in Schritt 4.9, oder trennen Sie andere Gewebe nach Bedarf. Sofort ca. 150 mg Wurzeln oder anderes Pflanzengewebe in flüssigen Stickstoff stellen.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier durch Einfrieren der Proben bei -80 ° C bis zum Gebrauch angehalten werden. - Die gefrorenen Proben mit einem Mörser und einer Pistille zu einem Pulver in flüssigem Stickstoff schleifen.
- Extrahieren Sie RNA aus dem Pulver unter Verwendung von Standardmethoden 39 oder einem geeigneten kommerziellen RNA-Isolations- und Reinigungskit mit DNase-Behandlung, um DNA-Kontamination zu vermeiden.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier durch Einfrieren von Aliquots von RNA an pausiert werden-80 ° C bis zum Gebrauch. - Verwenden Sie die isolierte RNA für eine Vielzahl von Analysen unter Verwendung von Standardmethoden, einschließlich der folgenden.
- Verwenden Sie ein kommerzielles Mikroarray nach dem Protokoll des Herstellers, um Gensätze zu detektieren, die in co-kultivierten versus Kontrollpflanzen unterschiedlich exprimiert werden.
- Verwenden Sie qRT-PCR, um die differentielle Expression spezifischer Gene zu erkennen oder um Microarray-Daten zu validieren 38 .
8. Secretome Profiling
- Nach einer geeigneten Kultivierung ( zB 72 h) in Schritt 4.8 trennen Sie die Wurzeln aus dem hydroponischen Medium wie in Schritt 4.9. Sterilisieren Sie das 18 ml hydroponische Medium, indem Sie es durch einen 0,2 μm Porenfilter in 50 ml konische Röhrchen geben.
- Einfrieren der Proben bei -80 ° CO / N.
- Lösen Sie die Kappen an den 50 mL konischen Rohren und legen Sie sie 36 h in eine Gefriertrocknungsmaschine. Gehen Sie vor, um die Proben zu speichern oder zu verarbeiten (asUnten beschrieben) für HPLC-Analyse und Compound-Erkennung.
HINWEIS: Das Protokoll kann hier pausiert werden. - Jede Probe wird in 5 ml doppelt destilliertem Wasser in einem abdichtbaren Reagenzglas resuspendiert.
- 5 ml Ethylacetat zugeben und durch mehrmaliges Umkehren des Röhrchens mischen.
- Lassen Sie die Phasen bei Raumtemperatur für 5 min abtrennen.
- Übertragen Sie die obere (organische Phase) durch Pipettieren in einen neuen Behälter. Bei Bedarf mehrere organische Fraktionen bündeln.
- Trocken unter einem sanften Strom von Stickstoffgas (~ 45 min).
- Die Probe in einer geeigneten Lösung für HPLC ( z. B. 100% Methanol) erneut suspendieren.
- HPLC nach Standardmethoden durchführen 40 .
- Erkennung von Verbindungen mit geeigneten Mitteln.
HINWEIS: Hier wird eine Elektrospray-Ionisations-Time-of-Flight-Massenspektrometrie (ESI-TOF-MS) 40 verwendet.
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Representative Results
Wachstum im hydroponischen Kultivierungssystem
Die Wachstumskurve von A. tumefaciens C58 zeigte eine signifikante Verzögerungsphase in der anfänglichen 16-h-Kokultivierung, gefolgt von einem sehr stabilen Wachstum bei der Co-Kultivierung mit A. thaliana Col-0 bis zu einer maximalen OD 600 von etwa 0,9 beginnend bei 48 h postinokulation Im Gegensatz dazu wurde im wesentlichen kein Bakterienwachstum in der Kontrollkultur ohne A. thaliana beobachtet ( Abbildung 4 ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ohne zusätzliche Nährstoffe, die künstlich geliefert werden, Pflanzenwurzel-sezernierte chemische Verbindungen in der Lage sind, Agrobacterium- Wachstum im Hydroponik-Kokultivierungssystem zu unterstützen. Die signifikante Verzögerungsphase während der anfänglichen 16 h der Kokultivierung kann der eher komplexen Wirtswahrnehmung und der allmählichen Wurzelsekretion bei der Kokultur mit dem Erreger zugeschrieben werden/ P>
Cocultivated A. thaliana Pflanzen zeigten keine Krankheitssymptome während der ersten 3 Tage, relativ zu Kontrollpflanzen, die in Abwesenheit von A. tumefaciens gezüchtet wurden ( Abbildung 5a , 5b ). Doch nach 5 Tagen Kokultur wurden Unterschiede allmählich sichtbar und die mockbehandelten Kontrollpflanzen waren grüner und gesünder. Nach 7 Tagen Kokultivierung mit Agrobacterium zeigte das Pflanzengewebe eine Chlorose und Nekrose sowie eine frühzeitige Blüte ( Abbildung 5 c, 5 d ). Die frühe Blüte in Arabidopsis ist eine allgemeine Folge der Infektion durch eine Reihe von phylogenetisch disparaten Pathogenen 41 , 42 .
Mikroskopische Visualisierung von Agrobacterium- Attachment an Pflanzenwurzeln
A. tumefaciens, die mit pCherry-Rot-Fluoreszenz markiert wurden, mit einer typischen stab- oder filamentösen Form auf die Pflanzenwurzelstruktur lokalisiert 0,5 μm Breite und Länge von 3-5 μm ( Abbildung 6 ). Die meisten Bakterienzellen wurden vertikal an die Oberfläche der Wurzelzellwand gebunden, in Übereinstimmung mit früheren Befunden, die Agrobacterium an die Zellwand in einer polaren Weise 32 bindet.
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das hydroponische Kokultivierungssystem verwendet werden kann, um die Bakteriendynamik in Planta , wie die Anbindung an die Wurzelstruktur und den Infektionsprozess, in Echtzeit zu untersuchen. In der Tat, in Abwesenheit von anderen Mikroben, bietet dieses Kokultivierungssystem eine rauschfreie Plattform für die direkte Beobachtung der Bakterien-Pflanze-Anlage in Planta . Aktivierung von Agrobacterium virulence transcripts
Nach 8 h Cokultivierung wurden A. tumefaciens- Zellen zur RNA-Isolierung geerntet und die Transkriptionsniveaus der repräsentativen Virulenzgene wurden durch qRT-PCR ausgewertet ( Abbildung 7 ). Die Expression der Virulenzgene ropB, virA, virD1, virH1, virE0 und chvG wurde bei der Co-Kultivierung mit dem Pflanzenwirt im Vergleich zur Kontrolle ohne A. thaliana signifikant hochreguliert. Speziell erhöhte sich die HGs von mRNA um 100% für chvG , um 70% für virD1 , um 94% für virA , um 40% für virE0 , um 330% für ropB und um 48% für virH1 .
Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass ohne ErgänzungMit synthetischen Virulenz-induzierenden Chemikalien, Pflanzen, die Chemikalien im hydroponischen Kokultivierungssystem sezernieren, können Agrobacterium virulence programming aktivieren. Die Induktion von Agrobacterium- Virulenzgenen deutet auf die Agrobakterienreaktion auf pflanzliche Signale im hydroponischen Kokultivierungssystem hin. Es ist sehr interessant, dass Agrobacterium ropB und chvG bei der Kokultivierung mit Arabidopsis induziert werden , wie bisherige Studien gezeigt haben, dass diese Gene durch saure Bedingungen 18 induziert werden, aber nicht durch Acetosyringon, eine bekannte virulenzinduzierende Verbindung 19 . Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass nicht identifizierte Verbindungen aus Arabidopsis- Wurzeln in der Lage sind, die ropB- und chvG- Expression zu induzieren. Allerdings müssen solche Virulenz-induzierenden Chemikalien weiter identifiziert werden.
Abbildung 7. Aktivierung von Agrobacterium Virulenz im Hydroponic Cocultivation System. Die mRNA-Spiegel von sechs Agrobacterium- Virulenzfaktoren wurden quantitativ durch qRT-PCR gemessen. Die Fülle von Virulenzfaktor-Transkripten wurde auf die der 16S-rRNA-Transkripte normalisiert. Die Daten repräsentieren die Mittelwerte ± Standardabweichung (Fehlerbalken) von 3 biologischen Replikaten, wobei P- Werte durch den t-Test des Schülers erhalten wurden.
Ausdruck von Pflanzen-Transkripten
Die qRT-PCR-Analyse wurde für fünf Gene durchgeführt, die zuvor in A. thaliana (unveröffentlichte Daten) unterschiedlich exprimiert wurden. Wie erwartet, bestätigte qRT-PCR, dass AGP 30 (AT2G33790) und NAS 1 (AT5G04950) herunterreguliert wurden (um 97 & 89%), während HSP21 (AT4G27670), PGIP 1 (AT5G06860) und ELIP 1 (AT3G22840) wurden in jedem der 3 Replikate gegenüber den Kontrollen (um 3.800, 540 und 510%) hochreguliert ( Abbildung 8 ).
Abbildung 8: qRT-PCR von A. thaliana Root Transcripts. Die Häufigkeit jedes mRNA-Transkripts wurde auf die von ACTIN II-Transkripten normalisiert. Die Daten sind die Mittelwerte von 3 biologischen Replikaten ± die Standardabweichung (Fehlerbalken), wobei P- Werte durch den T-Test des Schülers erhalten wurden.
Änderungen an Host-Sekretionsprofilen
Wurzel-abgeleitete Verbindungen haben sich gezeigt, dass sie sich weitgehend zwischen den Pflanzenarten 6 , 8 unterscheiden . RoAus Exsudaten gehören molekulare Signale, die verschiedene Signalisierungsreaktionen während der Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen 1 , 43 hervorrufen. Jedoch progressive Unterschiede in Wirt Sekretion Profile über die Zeit nach Mikrobe Wechselwirkung sind weit weniger verstanden, mit der Ausnahme , dass die Wurzel-sekretierte Verbindungen zwingend notwendig , um die Anziehung von nützlichen Bakterien 29 sind. Nach 72 h Cocultivation mit A. tumefaciens C58 wurden Unterschiede in A. thaliana Col-0-Sekretomenprofilen unter Verwendung einer positiven Ionen-LC-MS-Analyse und Vergleiche mit nicht-inokuliertem A. thaliana Col-0 ( dh in Abwesenheit von Agrobacterium) festgestellt ). Es wurde eine deutliche Verschiebung des Geheimnisses beobachtet, wobei neue Verbindungen als Folge der Agrobacterium- Inokulation auftraten ( Abbildung 9 ). Insgesamt wurden 35 Verbindungen im Geheimnis des Agrobacterium- inokulierten Plans vergleichsweise verbessertTs, während 76 im Geheimnis der nicht geimpften Pflanzen verstärkt wurden ( Abbildung 9 ). Die letzteren repräsentieren wahrscheinlich Verbindungen, die A. tumefaciens C58 vor der Infektion begegnen würde. Obwohl diese Verbindungen nicht identifiziert wurden und die differentielle Sekretion von spezifischen Wurzel-abgeleiteten Verbindungen im Rahmen dieser Studie nicht bestimmt wurde, zeigte die Secretome-Analyse nachweisbare Unterschiede in den Wirtssekretionsprofilen unter Verwendung dieses Hydroponik-Kokultivierungssystems.
Abbildung 9: A. Thaliana Col-0 Root Secretome Analyse. Die Analyse von A. thaliana Col-0-Sekretomenprofilen wurde in dreifacher Ausfertigung für mock-inokulierte und inokulierte Proben abgeschlossen. Peakflächen für die 138 einzigartigen Massensignale (Verbindungen), die in den Sekretionsprofilen in jeder Behandlungsgruppe gefunden wurden, wurden gemittelt undDie Durchschnittswerte wurden verwendet, um den Unterschied in der Häufigkeit jeder Verbindung (mock-inokuliert minus inokuliert) zu berechnen, um Unterschiede in nachweisbaren Verbindungen zu visualisieren. Zusammensetzungen mit großen negativen Differenzwerten waren im Geheimnis der inokulierten Pflanzen reichlicher, während jene mit großen positiven Unterschieden im Geheimnis der mock-inokulierten Pflanzen reichlich vorhanden waren.
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Discussion
Angesichts der allmählichen Beschaffenheit der Wurzelsekretion erfolgt die Konzentration der in Planta produzierten Virulenz-induzierenden Chemikalien und deren Auswirkungen auf dynamische Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen in räumlichen und zeitlichen Gradienten. In diesem hydroponischen Co-Kultivierungssystem wird kein synthetisches Phytohormon oder eine Chemikalie, die mikrobielle Virulenz oder Pflanzenverteidigung induziert, ergänzt. Im Gegensatz dazu, mit konventionellen Ansätzen, die Zugabe von synthetischen Chemikalien, wie Acetosyringon, schafft eine plötzliche, künstliche Spitze in Konzentrationen. Daher ist dieses hydroponische Kokultivierungssystem die natürliche Umgebung genauer imitiert, wo Mikroben und Wirtspflanzen in räumlicher und zeitlicher Weise erkennen und reagieren.
Hier konnte gezeigt werden, dass Agrobacterium- Virulenzgene bei der Co-Kultivierung mit Arabidopsis aktiviert wurden. Dies deutet darauf hin, dass natürliche pflanzliche Chemikalien Agrobacterium Virulenz induzieren. Zukunft eFfort wird benötigt, um diese Chemikalien zu identifizieren und zu überprüfen, ob die virulenzinduzierende Verbindung Acetosyringon unter ihnen ist oder nicht. Darüber hinaus wurden bei der Kokultivierung mit Agrobacterium signifikante Veränderungen in der Arabidopsis- Wurzel-Genexpression und Sekretome-Profile beobachtet, die das Potential des hydroponischen Kokultivierungssystems zeigen, Pflanzenwirtsreaktionen und Sekretionsprofile während der Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen zu untersuchen. In der Tat können unter Verwendung der hydroponischen Kokultivierungsmethode die Genexpression und die Geheimhaltungsprofile von Pflanzenwirten in jedem Stadium untersucht werden, das zu und nach einer mikrobiellen Interaktion führt, was dazu beitragen wird, wie diese transkriptionellen oder sekretorischen Veränderungen die nachfolgenden Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen erleichtern oder abschrecken .
Neben dem Studium der Arabidopsis - Agrobacterium- Signalisierung kann das hydroponische Kokultivierungssystem angepasst werden, um andere wichtige Anlagen-Mikroben-Systeme zu untersuchen. Es kann verwendet werdenAufklärung von Pflanzenreaktionen auf eine Vielzahl von pathogenen oder nützlichen Mikroorganismen, die einzeln oder gemeinsam wirken und mikrobielle Anlagerung und Reaktionen auf verschiedene Pflanzenwirte in relativ "natürlichen" Bedingungen untersuchen. Die Aufrechterhaltung der typischen Sämlingsmorphologie ist wichtig für die Klärung molekularer Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen. Im Falle von anderen Bakterien, Pilzen oder pflanzenfressenden Pathogenen können zusätzliche Nährstoffe ergänzt werden, um das mikrobielle Wachstum während der Kokultur zu unterstützen.
Für die Kokulturierung mit verschiedenen Anlagen-Mikroben-Systemen sind jedoch einige Parameter zu berücksichtigen. Abhängig von der Saatgutgröße und der Wurzelmorphologie können Metallgitter mit größeren Löchern und einem größeren Wachstumsbehälter für größere Samen und Sämlinge erforderlich sein, um sicherzustellen, dass sich die Wurzelstrukturen unterhalb der Maschenoberfläche vollständig entwickeln und die Gewebe oben wecken. Das Setup kann auch geändert werden, um eine höhere Plattform zu umfassen. Dies könnte erreicht werden bY schneidet ein größeres Quadrat von Mesh und biegt es weiter von den Ecken, um die Maschenoberfläche höher aus dem Boden des Behälters zu erhöhen, oder indem man das Gitter in Form eines griechischen Kreuzes schneidet und jede Klappe an den Vertiefungen biegt. Natürlich gibt es Einschränkungen für jedes System, und das hier vorgestellte wird nicht für größere Pflanzen nützlich sein, die für längere Zeiträume ( zB reifer Mais) angebaut werden. Darüber hinaus können einige Organismen mehr Belüftung erfordern als durch Schütteln bei der Verwendung dieses Systems.
Zugegebenermaßen ist es sehr schwierig oder sogar unmöglich, ein System in einem Labor zu entwerfen, das die dynamischen Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen, die in der Natur vorkommen, genau und perfekt repliziert. Obwohl die hydroponische Kokultivierung die natürlichen Zustände in der Rhizosphäre, zumindest begrifflich, mit intakten Wurzelstrukturen und Pflanzenmorphologie genauer darstellt, gibt es keine Boden- oder Bodenmikroorganismen im System. Dieses System kann jedoch angepasst werdenUm unterschiedliche Bedürfnisse zu erfüllen, um Mikrobiome in einer kontrollierbaren Umgebung zu untersuchen und zu erfahren, wie Pflanzen oder Mikroben auf unterschiedliche biotische oder abiotische Reize reagieren und darauf reagieren. Dieses hydroponische Kokultivierungssystem kann auch das Verständnis von Mikrobiomen und deren Funktionen in Hydroponik oder Ökosystemen erleichtern. Dies ist sehr wichtig für das Krankheitsmanagement und die Pflanzengesundheit für die Hydroponische Gewächshausindustrie oder für die aquatische Ökologie von Pflanzen und Mikroben.
Darüber hinaus kann dieses hydroponische Kokultivierungssystem angepasst werden, um die Bioremediation zu untersuchen und die relevanten Stoffwechselprozesse und regulatorischen Wege in Mikroben oder Pflanzen aufzuklären. Darüber hinaus erleichtert dieses hydroponische Kokultivierungssystem die Untersuchung der Wirkungen von bereits vorhandenen (Allelochemikalien) und / oder angewandten (synthetischen) Nährstoffen und chemischen Signalen / Verbindungen auf Mikroben oder Pflanzenwirten 44 . Die Verfügbarkeit von indirekt betroffenen Pflanzengeweben ( dh0; Blatt, schießen) im hydroponischen Kultivierungssystem bietet die Möglichkeit, andere pflanzenverteidigende Prozesse, wie z. B. Pflanzenvorbereitung, zu erforschen und wie diese Signale transduziert werden.
Der wichtigste Teil dieses Kultivierungssystems ist die Vermeidung von Kontaminationen. Insbesondere muss die Übertragung von Pflanzen aus dem halbfesten Medium in den Tank sehr sorgfältig durchgeführt werden, um die Kontamination des hydropischen Mediums zu verhindern. Es ist daher notwendig, dass dieser experimentelle Schritt unter sterilen Bedingungen in einem Bio-Sicherheitsschrank durchgeführt wird und Experimentatoren 2-3 Tage nach der Übertragung warten müssen, bevor irgendwelche Mikroorganismen für das Experiment inokuliert werden.
Zusammenfassend lindert das hydroponische Kokultivierungssystem verschiedene Einschränkungen herkömmlicher Ansätze, indem es die typische Pflanzenmorphologie und die Integrität der Pflanzenwurzelstrukturen während des gesamten experimentellen Prozesses beibehält. Darüber hinaus vermeidet das System die ErgänzungVon synthetischen Chemikalien, wie Pflanzenhormone oder Verteidigung / Virulenz-induzierende Chemikalien. So wird die natürliche Umgebung, in der Mikroben und Wirtspflanzen in räumlichen und zeitlichen Manieren erkennen und reagieren, genauer nachgeahmt. Dieses Kultivierungssystem kann angepasst werden, um verschiedene Pflanzen-Mikroben-Systeme in mehr "natürlichen" und überschaubaren Bedingungen, einschließlich mit endophytischen oder epiphytischen Mikroben zu studieren. Verschiedene Aspekte von Wechselwirkungen in Planta , wie Pathogenese, Symbiose oder Pflanzenwachstumsförderung, können untersucht werden. Das hydroponische Kultivierungssystem bietet neue Einblicke in die physiologischen, biochemischen und molekularen Reaktionen von Pflanzen und Mikroben. Zu jedem gegebenen Zeitpunkt / Intervall oder Wachstumsstadium können Bakterien oder Pflanzen, die im hydroponischen Kokultivierungssystem wachsen, separat für verschiedene "omics" -Analysen, einschließlich pflanzlicher und mikrobieller Transkriptomik, pflanzlicher und mikrobieller Metabolomik, pflanzliches und mikrobielles Sekretom und Bioremediati, abgetastet werdenauf. Darüber hinaus kann dieses hydroponische Co-Kultivierungssystem angepasst werden, um die Wechselwirkungen zwischen Pflanzenwirten und Mikrobiomen in einer kontrollierbaren Umgebung zu untersuchen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Vorteile der hydroponischen Kokultur ein überlegenes System zur Freisetzung von molekularen Mikroben-Interaktion und Signalisierung darstellen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Brian Weselowski und Alexander W. Eastman für ihre Hilfe und nützliche Diskussion. Wir danken auch Drs. Eugene W. Nester, Lingrui Zhang, Haitao Shen, Yuhai Cui und Greg Thorn für ihre Hilfe, nützliche Diskussionen und kritische Lektüre des Manuskripts. Diese Forschung wurde gefördert durch Landwirtschaft und Agri-Food Kanada, wachsende Forward-AgriFlex (RBPI Nummer 2555) und Growing Forward II Projekt Nummer 1670, durchgeführt von den Autoren als Teil ihrer Aufgaben. Diese Studie wurde auch teilweise von der Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften Council of Canada (NSERC) Discovery Grant RGPIN-2015-06052 an ZC Yuan vergeben finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| plant seeds (Arabidopsis thaliana Col-0) | Arabidopsis Biological Resource Centre | CS7000 | https://abrc.osu.edu/order-stocks |
| bacteria (Agrobacterium tumefaciens C58) | University of Washington | N/A | |
| labeled bacteria | in-house | optional, depends on downstream analyses | |
| vortex | (various) | ||
| microcentrifuge tubes | (various) | ||
| microcentrifuge | (various) | ||
| 5% sodium hypochlorite | (various) | ||
| double distilled water | (various) | ||
| autoclave | (various) | ||
| micropipette | (various) | ||
| 70% ethanol | (various) | ||
| Murashige and Skoog (MS) basal salts | Sigma-Aldrich | M5524 | |
| sucrose | (various) | ||
| MES | (various) | ||
| B5 vitamin mix | Sigma-Aldrich | G1019 | |
| phytoagar | (various) | ||
| Deep Petri dishes | (various) | ||
| stainless steel mesh | Ferrier Wire Goods Company Ltd | N/A | grade: 304; mesh count: 40 × 40; wire DIA: 0.01 |
| micropore tape, 1" | 3M | 1530-1 | |
| diurnal growth chamber | (various) | ||
| cylindrical glass tanks, 100 × 80 mm | Pyrex | 3250 | other sizes can be used, in which case liquid content may need adjustment |
| flow hood | (various) | ||
| forcepts | (various) | ||
| yeast extract | (various) | ||
| tryptone | (various) | ||
| MgSO4 | (various) | ||
| shaking incubator | (various) | ||
| spectrophotometer | (various) | ||
| NaCl | (various) | ||
| shaker | (various) | ||
| scissors | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| fluorescence microscope | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| microscope slides and cover slips | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nail polish | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| Bacterial RNA extraction kit | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| plant RNA extraction kit (RNeasy Plant Mini Kit) | Qiagen | 74903 or 74904 | optional, depends on downstream analyses |
| material and equipment for qRT-PCR | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for microarray analysis | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| liquid nitrogen | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| mortar and pestle | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 0.2 µm pore filter | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| 50 mL conical tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| freeze dryer | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| sealable test tubes | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| ethyl acetate | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| nitrogen gas | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for HPLC | (various) | optional, depends on downstream analyses | |
| material and equipment for ESI-TOF-MS | (various) | optional, depends on downstream analyses |
References
- Lambers, H., Mougel, C., Jaillard, B., Hinsinger, P. Plant-microbe-soil interactions in the rhizosphere: An evolutionary perspective. Plant Soil. 321 (1), 83-115 (2009).
- Philippot, L., Raaijmakers, J. M., Lemanceau, P., vander Putten, W. H. Going back to the roots: The microbial ecology of the rhizosphere. Nat. Rev. Microbiol. 11 (11), 789-799 (2013).
- Somers, E., Vanderleyden, J., Srinivasan, M. Rhizosphere bacterial signalling: A Love Parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30 (4), 205-240 (2004).
- Barah, P., Winge, P., Kusnierczyk, A., Tran, D. H., Bones, A. M. Molecular signatures in Arabidopsis thaliana in response to insect attack and bacterial infection. PLoS ONE. 8 (3), (2013).
- Zhang, J., Zhou, J. -M. Plant immunity triggered by microbial molecular signatures. Mol. Plant. 3 (5), 783-793 (2010).
- Paterson, E., Gebbing, T., Abel, C., Sim, A., Telfer, G. Rhizodeposition shapes rhizosphere microbial community structure in organic soil. New Phytol. 173 (3), 600-610 (2006).
- Hartmann, A., Schmid, M., van Tuinen, D., Berg, G. Plant-driven selection of microbes. Plant Soil. 321 (1-2), 235-257 (2008).
- Micallef, S. A., Shiaris, M. P., Colon-Carmona, A. Influence of Arabidopsis thaliana accessions on rhizobacterial communities and natural variation in root exudates. J. Exp. Bot. 60 (6), 1729-1742 (2009).
- Burr, T., Otten, L. Crown gall of grape: Biology and disease management. Annu. Rev. Phytopathol. 37, 53-80 (2001).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: A simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Binns, A. N., Costantino, P. The Agrobacterium oncogenes. The Rhizobiaceae. Spaink, H. P., Kondorosi, A., Hooykaas, P. J. J. , Springer International Publishing AG. Cham, Switzerland. (1998).
- Gheysen, G., Angenon, G., Van Montagu, M. Agrobacterium-mediated plant transformation: a scientifically intriguing story with significant applications. Transgenic Plant Research. Lindsey, K. , Harwood Academic. Amsterdam, Netherlands. (1998).
- Valvekens, D., Von Montagu, M. V., Van Lijsebettens, M. Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana root explants by using kanamycin selection. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85 (15), 5536-5540 (1988).
- Krysan, P. J., Young, J. C., Sussman, M. R. T-DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis. Plant Cell. 11 (12), 2283 (1999).
- Chilton, M. D., et al. Stable incorporation of plasmid DNA into higher plant cells: The molecular basis of crown gall tumorigenesis. Cell. 11 (2), 263-271 (1977).
- Gelvin, S. B. Agrobacterium in the genomics age. Plant Physiol. 150 (4), 1665-1676 (2009).
- Subramoni, S., Nathoo, N., Klimov, E., Yuan, Z. -C. Agrobacterium tumefaciens responses to plant-derived signaling molecules. Front. Plant Sci. 5, 322 (2014).
- Yuan, Z., Liu, P., Saenkham, P., Kerr, K., Nester, E. W. Transcriptome profiling and functional analysis of Agrobacterium tumefaciens reveals a general conserved response to acidic conditions (pH 5.5) and a complex acid-mediated signaling involved in Agrobacterium-plant interactions. J. Bacteriol. 190 (2), 494-507 (2008).
- Stachel, S. E., Messens, E., Van Montagu, M., Zambryski, P. Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells that activate T-DNA transfer in Agrobacterium tumefaciens. Nature. 318 (6047), 624-629 (1985).
- Memelink, J., de Pater, B. S., Hoge, J. H. C., Schilperoort, R. A. T-DNA hormone biosynthetic genes: Phytohormones and gene expression in plants. Dev. Genet. 8 (5-6), 321-337 (1987).
- Yuan, Z. -C., et al. The plant signal salicylic acid shuts down expression of the vir regulon and activates quormone-quenching genes in Agrobacterium. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 104 (28), 11790-11795 (2007).
- Yuan, Z. -C., Haudecoeur, E., Faure, D., Kerr, K. F., Nester, E. W. Comparative transcriptome analysis of Agrobacterium tumefaciens in response to plant signal salicylic acid, indole-3-acetic acid and γ-amino butyric acid reveals signalling cross-talk and Agrobacterium-plant co-evolution. Cell. Microbiol. 10 (11), 2339-2354 (2008).
- Li, P. L., Farrand, S. K. The replicator of the nopaline-type Ti plasmid pTiC58 is a member of the repABC family and is influenced by the TraR-dependent quorum-sensing regulatory system. J. Bacteriol. 182 (1), 179-188 (2000).
- Atkinson, M. M., Huang, J., Knopp, J. A. Hypersensitivity of suspension-cultured tobacco cells to pathogenic bacteria. Phytopathology. 75 (11), 1270-1274 (1985).
- Veena,, Jiang, H., Doerge, R. W., Gelvin, S. B. Transfer of T-DNA and Vir proteins to plant cells by Agrobacterium tumefaciens induces expression of host genes involved in mediating transformation and suppresses host defense gene expression. Plant J. 35 (2), 219-236 (2003).
- León, J., Rojo, E., Sanchez-Serrano, J. J. Wound signalling in plants. J. Exp. Bot. 52 (354), 1-9 (2001).
- Ditt, R. F., Kerr, K. F., de Figueiredo, P., Delrow, J., Comai, L., Nester, E. W. The Arabidopsis thaliana transcriptome in response to Agrobacterium tumefaciens. Mol. Plant Microbe In. 19 (6), 665-681 (2006).
- Mandimba, G., Heulin, T., Bally, R., Guckert, A., Balandreau, J. Chemotaxis of free-living nitrogen-fixing bacteria towards maize mucilage. Plant Soil. 90 (1-3), 129-139 (1986).
- Rudrappa, T., Czymmek, K. J., Pare, P. W., Bais, H. P. Root-secreted malic acid recruits beneficial soil bacteria. Plant Physiol. 148 (3), 1547-1556 (2008).
- Lee, C. W., et al. Agrobacterium tumefaciens promotes tumor induction by modulating pathogen defense in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 21 (9), 2948-2962 (2009).
- Reymond, P., Weber, H., Damond, M., Farmer, E. E. Differential gene expression in response to mechanical wounding and insect feeding in Arabidopsis. Plant Cell. 12 (5), 707-720 (2000).
- Matthysse, A. G. Attachment of Agrobacterium to plant surfaces. Front. Plant Sci. 5, 252 (2014).
- Alatorre-Cobos, F., et al. An improved, low-cost, hydroponic system for growing Arabidopsis and other plant species under aseptic conditions. BMC Plant Biol. 14 (1), 69 (2014).
- Conn, S. J., et al. Protocol: Optimising hydroponic growth systems for nutritional and physiological analysis of Arabidopsis thaliana and other plants. Plant Methods. 9 (1), 4 (2013).
- Nathoo, N. Identification of putative plant defense genes using a novel hydroponic co-cultivation technique for studying plant-pathogen interaction. , University of Western Ontario. (2015).
- Shaner, N. C., Campbell, R. E., Steinbach, P. A., Giepmans, B. N., Palmer, A. E., Tsien, R. Y. Improved monomeric red, orange and yellow fluorescent proteins derived from Discosoma sp. red fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1567-1572 (2004).
- Wise, A. A., Liu, H., Binns, A. N. Nucleic acid extraction from Agrobacterium strains. Methods Mol. Bio. 343, 67-76 (2006).
- Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat. Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
- Salter, M. G., Conlon, H. E. Extraction of plant RNA. Methods Mol. Bio. 362, 309-314 (2007).
- Bao, Y., Wang, S., Yang, X., Li, T., Xia, Y., Meng, X. Metabolomic study of the intervention effects of Shuihonghuazi Formula, a Traditional Chinese Medicinal formulae, on hepatocellular carcinoma (HCC) rats using performance HPLC/ESI-TOF-MS. J. Ethnopharmacol. 198, 468-478 (2017).
- Korves, T. M., Bergelson, J. A developmental response to pathogen infection in Arabidopsis. Plant Physiol. 133 (1), 339-347 (2003).
- Lyons, R., Rusu, A., Stiller, J., Powell, J., Manners, J. M., Kazan, K. Investigating the association between flowering time and defense in the Arabidopsis thaliana-Fusarium oxysporum interaction. PLoS ONE. 10 (6), e0127699 (2015).
- Badri, D. V., Weir, T. L., vander Lelie, D., Vivanco, J. M. Rhizosphere chemical dialogues: Plant-microbe interactions. Curr. Opin. Biotechnol. 20 (6), 642-650 (2009).
- Baerson, S. R., et al. Detoxification and transcriptome response in Arabidopsis seedlings exposed to the allelochemical benzoxazolin-2(3H)-one. J. Biol. Chem. 280 (23), 21867-21881 (2005).
