Summary
선물이 바이오 폴딩 및 바인딩 차동 스캐닝 열 량 측정을 사용 하 여 thermolabile ligands와의 상호 작용의 신속한 특성화에 대 한 프로토콜.
Abstract
차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) 바이오 폴딩 및 바인딩 상호 작용을 경 세 하는 열역학 매개 변수 측정을 위한 강력한 기술입니다. 이 정보는 새로운 약 제 화합물의 설계에 중요 합니다. 그러나, 많은 약물 관련 ligands 않습니다 화학적으로 안정 된 DSC 분석에 사용 된 높은 온도에. 따라서, 바인딩 상호 작용을 측정 ligands 및 열 변환 제품의 농도 열 셀 내에서 끊임없이 변화 하기 때문에 도전 이다. 여기, 우리 thermolabile ligands 및 DSC를 사용 하 여 빠르게 변환 프로세스 접는, 바인딩 및 리간드에 열역학 및 운동 정보를 얻기 위해 프로토콜을 제시. 우리는 DNA aptamer MN4 thermolabile ligand 코카인을를 우리의 메서드를 적용 했습니다. 계정에 thermolabile ligand 변환에 대 한 새로운 글로벌 피팅 분석을 사용 하 여 매개 변수 바인딩 및 접는의 완전 한 세트 DSC 실험의 쌍에서 가져옵니다. 또한, 우리는 하나의 보조 DSC 데이터 집합으로 thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 얻을 수 있습니다 보여줍니다. 식별 하 고 몇 가지 더 복잡 한 시나리오에서 데이터 분석에 대 한 지침, biomolecule, 천천히 접는, 느린 바인딩 및 thermolabile ligand의 급속 한 소모의 돌이킬 수 없는 집계를 포함 하 여 제공 됩니다.
Introduction
차동 스캐닝 열 량 측정 (DSC) quantitating 바이오 바인딩 및 접는 상호 작용1,2,3에 대 한 강력한 방법입니다. DSC의 강점 바인딩 및 접는 메커니즘, 명료 하 고 해당 열역학 매개 변수2,3를 생성 하는 능력을 포함 합니다. 또한, DSC 솔루션 근처 생리 적 조건 하에서 수행할 수 있습니다 그리고는 biomolecule 또는 ligand, 예를 들어, fluorophores, 스핀-레이블 또는 핵 동위4의 라벨 필요 하지 않습니다. 악기는 존재에 ligand의 부재는 biomolecule 변성 하는 데 필요한 열의 양을 측정 온도 검색 합니다. 결과 thermograms ligand 바인딩 및 프로세스를 접는 통치 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 됩니다. DSC 또는 다른 열역학 기술을 제공 하는 정보가 쓰이므로1,5,6,,78을 대상으로 약물의 디자인 지도 중요 합니다. 그러나, 높은 온도에 반복 검사 (~ 60-100 ° C) 문제가 될 수 있습니다. 예를 들어 많은 약물 중요 한 화합물 받아야 재배치 또는 높은 온도9,,1011, 즉지속적인된 노출 시 분해, 그들은 thermolabile. DSC에 의해 상호 작용을 일반적으로 바인딩 시험 열역학 분석12열상의 재현성을 확인 하려면 여러 개의 앞으로 역 검사를 필요 합니다. 초기 ligand의 농도 감소 하면서 각 검색 이후 변경 된 바인딩 특성을 가진 보조 형태로 초기 ligand의 열 변환 형태와 연속 thermograms의 위치에서 발음된 차이에 리드는 열 변환 제품 축적. 이러한 데이터 세트는 전통적인 분석 의무가 없습니다.
우리는 최근 열역학 매개 변수 바이오 접는 통치 및 바인딩 참조는 단일 ligand 바인딩 실험에서 상호 작용의 완전 한 집합을 생성 하는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합에 대 한 글로벌 피팅 방법 개발에 무료 biomolecule4에 대 한 필요한 열상. 분석에 필요한 샘플 및 실험 시간 감소 ~ 표준 DSC 접근 방식에 비해 10 배. 우리가 차지 하 고 이것을 가정 하 여 열 변환은 열상 ligand 농도에 의존 하지 않는 각 스캔의 고온 부분 중 발생 하는 리간드에 대 한. 따라서, ligand 농도 열상 열역학 매개 변수를 추출 하는 데 사용 되는의 부분 내에서 상수 이다. 우리는 또한 어떻게 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수 장기간 높은 온도 평형 한 보충 실험을 수행 하 여 얻어질 수 있다 설명 했다. Ligand 열 변환 덜 온도 따른 시스템에 대 한 (즉, 모든 온도에서 분명 발생), 분석 변수 ligand 농도 포함 하도록 수정할 수 있습니다. 여기 우리 DNA aptamer MN4 benzoylecgonine 높은 온도에서 빠르게 변환 thermolabile ligand 코카인의 존재에 대 한이 절차 설명 (> 60 ° C). 말라리아 이후 이러한 실험적인 온도에서 변환 받아야 하지 않습니다 또한 MN4 바인딩 ligand thermolability에 대 한 부정적인 컨트롤로 사용 됩니다. 우리는 thermolabile ligand DSC 데이터 집합 및 그들의 분석 저조한 접는, 바인딩 및 리간드의 열역학 및 운동 매개 변수 변환 프로세스의 인수를 설명 합니다.
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Protocol
1. 샘플 준비
- 원하는 biomolecule13정화.
참고:이 프로토콜 사용 하 여 구입 코카인 바인딩 DNA aptamer MN4 세 번 뒤 3 kDa 분자량 차단 막으로 원심 필터를 사용 하 여 이온된 수의 3 라운드 2 M NaCl에 대 한 교환 후. - 합성 및 정화, 또는 원하는 thermolabile ligand13를 구입.
참고: MN4 thermolabile ligand 코카인을 바인딩합니다. MN4 또한 이러한 실험 온도에서 ligand thermolability에 대 한 부정적인 제어로 사용 되는 말라리아를 바인딩합니다. - 순화 biomolecule의 투 석 및 ligands (20 m m 인산 나트륨 및 140 m m NaCl 버퍼, pH 7.4, MN4와 여기에 사용 되는 ligands)의 해산에 대 한 버퍼를 준비 합니다.
- 투 석 튜브를 사용 하 여 버퍼의 적어도 2 L에 대하여 biomolecule dialyze-0.5와 1.0 kDa 잘라.
- 0.2 µ m 필터를 철저 하 게 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 최종 버퍼 (작업 버퍼 라고도 함)를 필터링 합니다.
- 그리고 무게는 ligands의 원하는 대 중에 밖으로 필터링된 작업 버퍼에 그들을 해산. 원하는 ligand 농도 대 중 정확 하 게 무게를 너무 작은 경우, 집중된 ligand 재고 솔루션 (예: 10 배)를 확인 합니다.
참고: 그것은 중요 한 모든 DSC 실험 활용 샘플에 대 한 동일한 작업 버퍼와 리간드, 즉, 적이 버퍼를 일으킬 것입니다로 ligand는 biomolecule 보다 작업 버퍼의 다른 배치에 녹아은 실험 수행 데이터에서 불일치 유물입니다. - 0.2 µ m 필터를 철저 하 게 작업 버퍼 equilibrated 되었습니다 통해 biomolecule 재고 솔루션을 필터링 합니다.
- 흡 광도 측정에 의해 biomolecule 농도 결정 (260 nm MN4 280 같은 핵 산에 대 한 단백질에 대 한 nm).
- 4 ° C 냉장고 (MN4와 여기에 사용 되는 ligands에 적합), 또는-20 준비 biomolecule 및 리간드를 저장 또는-80 ° C 경우 biomolecule 및 ligands 고정 및 장기 저장이 필요. 드가 테이블 상단에 버퍼, biomolecule, ligand 솔루션 degasser ( 재료의 표참조) DSC에 로드 하기 전에.
참고: Degassing 더 높은 온도에서 DSC에 거품 형성을 방지 도움이 됩니다. 거품 발생 신호 아티팩트 DSC 피크 모양 및 베이스 라인 애매.
2. DSC 준비
- DSC에서 압력 손잡이 나사 ( 재료의 표참조).
- 작업 버퍼에서 실리콘 튜브를 실행 하 고 참조 모 세관의 전면 플랜지 (금속 오프닝)에 연결 합니다.
- 앞 예제 플랜지에 후방 참조 플랜지를 연결 하 여 참조 및 샘플 모세 혈관 사이 다리를 만듭니다.
- 폐기물 플라스 크에 연결 된 진공 라인으로 실행 되는 후면 샘플 플랜지 실리콘 튜브의 조각을 연결 합니다.
- 작업 버퍼의 200 mL와 함께 DSC를 진공 라인을 켭니다.
- 작업 버퍼와 DSC의 참조 모 세관을 로드 합니다. 약 참조 모 세관 플랜지에 실리콘 튜브의 3-5 cm 섹션을 연결 합니다.
- 후면 플랜지의 실리콘 튜브에 1 mL 피 펫 팁을 삽입 합니다. 작업 버퍼는 피 펫의 0.8 mL 그리고 전면 참조 플랜지의 실리콘 튜브에 버퍼 피 펫 팁을 삽입.
- 부드럽게 통과 전면 실리콘 튜브를 통해 작업 버퍼 참조 모 세관으로 아래로 피 펫 플런저를 누르고 후면 플랜지로 최대 피 펫 팁 첨부. 작업 버퍼 레벨에 바로 앞 실리콘 튜브 위에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 누르십시오 다음 작업 버퍼 수준 바로 위에 후면 실리콘 튜브에 도달할 때까지 피 펫 플런저를 놓습니다.
- 반복 앞뒤로 거품의 참조 모 세관에서 볼륨을 제거 하는 작업 버퍼를 전달 합니다.
참고: 일반적으로, 앞뒤로 솔루션의 10 단계는 모든 거품을 취소 하기에 충분 한 있습니다.
- 반복 앞뒤로 거품의 참조 모 세관에서 볼륨을 제거 하는 작업 버퍼를 전달 합니다.
- 엄지손가락으로 뒤쪽 피 펫 팁을 뚜껑을 부드럽게 후면 피 펫 팁에서에서 그들을 제거 참조 플랜지 연결 된 실리콘 튜브와 전면 피 펫에 잡아당깁니다.
- 로드 단계 2.6 2.9에서 작업 버퍼 샘플 모 세관. 후면 참조에 검은 플라스틱 캡을 놓고 떠나 발견 전면 플랜지 플랜지를 샘플 합니다.
- 압력 핸들을 첨부 합니다.
- DSC 소프트웨어를 열고 ( 재료의 표참조) 파워 독서는 안정; 되 면 빨강 위쪽 인터페이스의 상단에 화살표를 클릭 하 여 악기를 기 압 및 DSC 전원 상단에 있는 상자에 표시 됩니다 악기 온도 및 압력 읽기 인터페이스의 오른쪽.
참고: 모니터 전원 DSC로 읽는 속도가 힘에 변화 보다 더 ~ 10 µW 데이터에서 아티팩트를 일으킬 수 있는 모 세관에 거품 형성을 나타냅니다. 솔루션 제거 되어야 하며 degassed 계속 하기 전에 추가. - 정방향 및 역방향 검색을 수행 하 여 작업 버퍼와 DSC를 equilibrate. 화면 왼쪽에 "실험적인 방법" 탭에서 "검색" 옵션을 DSC 온도 스캐닝 모드에서 실행 되도록 선택 확인 합니다.
참고: 실험적인 매개 변수는 검색 범위, 스캔 속도, 낮은 및 높은 온도 평형 시간, 및 검사의 수 온도.- "온도 매개 변수" 삽입 "실험적인 방법" 탭 아래에서 "난방"에 대 한 버튼을 클릭 합니다. 하위 및 상위 실험 온도, 1 ° C/min 스캔 속도와 60에 대 한 1 및 100 ° C를 입력 평형 기간에 대 한 s.
- 재래식 기간에 대 한 입력된 필드 아래의 "추가 시리즈" 단추를 클릭 합니다. (대 한 한 난방 및 냉각 한 스캔) 팝업 창에서 "추가 하는 단계" 필드에 2를 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 확인란을. "클릭"; 추가 스캔 인터페이스의 아래 부분에 나타납니다. 각 검색에 대 한 매개 변수를 확인 원하는.
- 인터페이스의 상단에 녹색 "재생" 버튼을 클릭 하 여 실험을 시작 합니다. 원하는 폴더에 이동한 실험 팝업 창에서 저장할 파일 이름을 입력 합니다. "실험 방법" 탭의 오른쪽에 "데이터" 탭을 클릭 하 여 실험 진행 상황 보기
3. Thermolabile Ligand DSC 데이터 집합 수집
참고: 최소한의 절차 5 실험의 구성: 버퍼와 ligand 없이 참조 실험 (기준선 빼기 사용 내용참조), 샘플 무료 biomolecule ligand 바인딩 biomolecule 실험 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 장기간 높은 온도 평형으로.
- 샘플 데이터의 초기 빼기에 대 한 참조 실험을 실행 합니다. 작업 버퍼 모두 모세 혈관에서 DSC를 다시 로드 하 고 1 ° C min-1 위 (높은 온도)에 적당 한 온도 범위에 걸쳐 여러 개의 앞으로 역 검사를 수집 120 평형 시간 s.
- 개별적으로 각을 강조 하 고 인터페이스의 오른쪽 중간에 빨간색 X를 클릭 하 여 인터페이스의 아래 부분에서 이전 버퍼 평형 검사를 삭제 합니다. "시리즈 추가" 버튼을 클릭 "추가 하는 단계", 필드에 20을 입력 하 고 "대체 난방/냉각" 상자를 검사 하 여 새로운 검사를 추가 합니다. 확인을 클릭 하 고 위와 같이 녹색 재생 버튼을 클릭 하 여 실험을 실행.
- 반복 단계 3.1-3.1.1 작업 버퍼 참조를 모두 모세 혈관에 ligand의 원하는 농도 포함 하는 리간드에 대 한 실험 (120을 사용 하 여 두 개의 별도 실험을 수집 s 및 600 s 높은 온도 평형 시간 각각, thermolabile 리간드 변환에 대 한 속도 상수 인수에 사용할 수).
참고: 여기에 사용 되는 스캔 속도 통해 후속 실험에서 biomolecule 정방향 및 역방향 검색 ( 내용참조)에서 열 평형에. 스캔 속도 < 0.1-0.2 ° C min-1 시끄러운 thermograms 이어질 DSC 실험에 적용 되지 않습니다. 온도 무료 biomolecule ligand 포화 biomolecule의 녹는 온도 이상 잘의 녹는 온도 아래 우물에서 연장 해야 합니다 (~ MN4 20-80 ° C). (예, 앞으로 10 및 20 총 10 역 검사는 충분 한)에 대 한 검사의 재현성을 확인 합니다. - (코카인, 말라리아) 등 여러 개의 ligands를 사용 하는 경우는 모세 혈관에서 리간드를 제거 하 고 교차 오염을 방지 하기 위해 실행 사이의 작업 버퍼 (반복 단계 2.5에서에서)의 200 mL와 함께 DSC를 플러시.
참고: 이전 ligand 모 세관 벽에 강하게 adsorbs 버퍼 플러시를 적절 하 게 제거 되지 않습니다 있는지 확인 하려면 ligand 바인딩 실행 후 무료 biomolecule에 복제 실험을 수행 하기 위해 도움이 됩니다. 무료 biomolecule 위한 thermograms ligand 바인딩 실험 후 더 큰 규모와 높은 변성 온도에 이동 될 경우, 그것은 이전 ligand는 여전히 홍 조 후 열 량 계에 존재. 20%를 가진 모 세관을 배양 하 여 흡착된 ligand를 제거 플라스틱 모자와 압력 핸들에서 60 ° C에서 1 시간에 대 한 Contrad-70. DSC 소프트웨어에서 실험 모드를 "등온선" 기간 및 등온선 온도 대 한 60 ° C에 대 한 실험 방법 탭 선택 3600 s 아래 0 평형 시간에 대 한 입력으로 변경. "실험적인 방법에 추가"를 클릭 합니다. 등온 실험 화면 아래 부분에 나타납니다. 완료 후, 2 L 이온된 물으로 악기를 플러시 하 고 단계 2.5에서에서 반복 합니다.
- 샘플 실험 같은 로드 절차 및 실험적인 매개 변수는 참조를 검색 하는 DSC를 사용 하 여 실행 합니다. 무료 biomolecule 데이터 집합에 대 한 샘플 모 세관 작업 버퍼에 원하는 농도에서 무료 biomolecule 포함 하는 동안 참조 모 세관 작업 버퍼를 포함 되어 있는지 확인 합니다.
- Ligand 바인딩 실험에 대 한 확인 참조 모 세관에 작업 버퍼에는 ligand biomolecule 플러스 ligand 샘플 모 세관에서 작업 버퍼에는. 2.5 단계 에서처럼 다른 ligands의 추가 사이 시스템을 플러시.
- 수행 추가 실험은 biomolecule와 높은 온도 평형 기간 600 증가 thermolabile ligand에 바인딩된 s 및 다른 실험적인 매개 변수는 단계 3.2.1 동일.
참고: 두 번째 ligand 바인딩 실험에 대 한 높은 온도 평형 기간의 기간 단순히는 ligand 짧은 평형 시간 실험 보다 더 빠르게 고갈 되도록 선택 됩니다. 첫 번째에서 ligand 바인딩 봉우리 검색 번호의 기능으로 천천히 부패 실험 하는 경우 (예를 들어, 연속 피크 맥시 마의 차이 인 ≤ 0.5 ° C)에 높은 온도 평형에 10-을 20 배 증가 예상 두 번째 실험 동안에 ligand를 고갈 적절 하 게 합니다. Ligand 변환 속도 상수의 정확한 계산 하려면 두 번째 실험 첫 번째 기준으로 리간드의 신속한 고갈에 합니다. 두 실험의 글로벌 분석에서 추출 된 ligand 농도 유사 하 고 따라서 ligand 고갈 두 번째 실험에서 충분히 가속 되지 경우 사용할 수 없게 될 것입니다.
4입니다. 데이터 처리
- 오픈 DSC 실험 DSC 데이터 분석 소프트웨어에서 파일 ( 재료의 표참조) 및 스프레드시트도 원시 전원 데이터 내보내기.
- 피팅 하는 데이터에 대 한 소프트웨어에 원시 전원 데이터를 포함 하는 스프레드시트를 가져옵니다.
- 초기 자유에서 버퍼 전원 데이터 그리고 ligand 바인딩 biomolecule 실험을 빼서 샘플 데이터를 뺍니다.
참고: thermolabile ligand 실험에 대 한 초기 ligand의 농도 각 스캔 감소 됩니다. 따라서, 샘플 검사 1에서 버퍼 스캔 1 빼기 위해 이상적 이다. 우리는 ligand 변환 진행 하 고 따라서 단일 thermolabile ligand 버퍼 스캔의 모든 thermolabile ligand 바인딩 데이터를 사용할 수 있는 버퍼 스캔 코카인을 분명 변경 되지 않습니다 나타났습니다. - 열 용량 기준 뺀 샘플 전원 데이터를 변환 합니다.
참고: 변환 예상된14,,1516수 biomolecule의 부분 특정 볼륨을 필요 합니다. 열 용량 전력 변환에 대 한 방정식 되었습니다17위에서 설명한.
5. 데이터 분석
- 세계적으로 초기 계획, ligand 농도, 폴딩, 및4에서 설명한 대로 매개 변수를 바인딩 ligand의 단일 세트와 함께 짧은 평형 시간 thermolabile ligand 바인딩 열 용량 데이터 집합에 맞게.
- 앞에서 설명한4thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수를 계산 하려면 긴 평형 시간 데이터 집합에 대 한 글로벌 맞는 반복 합니다.
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Representative Results
Thermolabile ligand 기무사에 대 한 대표적인 데이터는 그림 1에 나와 있습니다. 위치 및 thermolabile ligand 바인딩 피크의 높이 연속적으로 이동 언바운드 biomolecule 그쪽으로 thermolabile ligand 각 스캔 (그림 1a)와 고갈로 합니다. 무료 변성 프로필 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)의 끝점에 대 한 참조로 사용 됩니다. MN4 말라리아에 바인딩된에 대 한 데이터는 thermolabile ligand 변환 (그림 1b)에 대 한 부정적인 컨트롤로 표시 됩니다. 마지막 thermolabile ligand 검사 약간 높은 전환 중간점 및 thermolabile ligand 변환 제품 (benzoylecgonine)에 MN4에 대 한 약한 선호도 나타내는 언바운드 MN4 상대적인 피크 높이 있다. 그림 1에서 데이터 집합의 글로벌 분석에서 결과 열역학 매개 변수는 표 1에 나열 됩니다. 코카인 이나 말라리아 존재 MN4 접는 매개 변수는 희석 작은 분자 무료 biomolecule의 접는 열역학 교란 것은 이후 예상 대로 오류를 내에서 동일 합니다. 바인딩 매개 변수 등온선 적정 열 량 측정 (ITC)18 에서 그와 좋은 계약에 있고 공개 MN4의 코카인에 말라리아에 대 한 선호는 더 유리한 바인딩 엔 탈피에 의해 구동 됩니다. 그림 2, 짧은 평형 기간 데이터 집합을 기준으로 각 스캔 thermolabile ligand 농도의 더 뚜렷한 감소 수익률 높은 온도 평형 기간을 증가. 두 데이터 집합에서 최적화 된 글로벌 맞는 농도 매개 변수를 사용 하 여 높은 평형 온도에 ligand 변환에 대 한 속도 상수는 그림 2 인세트에 선의 기울기에서 계산 됩니다.
그림 1입니다. Thermolabile ligand DSC. 코카인 (초기 농도 778 µ M)을 (를) Thermograms MN4 (83 µ M) 바인딩 되었다고 합니다. Ligand의 존재 MN4의 처음과 마지막 검사 해당 맞는 색된 선으로 표시 됩니다 동안 어두운 빨간색과 파란색 원으로 표시 됩니다. (b) 무료 MN4 Thermograms (83 µ M, 블랙 서클) 연속 스캔 말라리아 (880 µ M, 원 컬러)에 바인딩됩니다. 자유롭고 말라리아 바인딩된 데이터 집합에 맞는 각각 검정과 색 선으로 표시 됩니다. 화학의 왕 사회 허가 기준4 에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Thermolabile Ligand 변환에 대 한 속도 상수를 측정. (한) 집합이 thermograms MN4에 대 한 짧은 (120 s, 진한 빨강색)와 장기 (600 s, 진한 파란색) 평형 코카인에 바인딩된 각각 80 ° C에서 시간. (b) 검색 번호의 기능으로 (a)에서 데이터 집합의 글로벌 분석에서 추출한 코카인의 농도. 실험과 지 수 맞는 색 원과 선으로 각각 표시 됩니다. 삽입 Harkness 외. 4두 개의 데이터 집합 대 한 최적화 된 글로벌 맞춤된 코카인 농도 사용 하 여에서 앞에서 설명한 보충 식 19에 선형 맞는 보여줍니다. 80 ° C에서 ligand 열 변환에 대 한 속도 상수는 선의 기울기로 계산 됩니다. Thermolabile ligand 변환에 대 한 속도 상수에 대 한 오차는 ± 2 표준 편차로 주어 집니다. 화학의 왕 사회 허가 기준4 에서 재현. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 맞춤된 매개 변수 | 추가 하는 코카인 | 추가 하는 말라리아 |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| ∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| ∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| ∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| ∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| ∆Hb 2 층 | -33.7±1.8 | - |
| ∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆Cpb 2 층 | -2.2±0.1 | - |
| ∆Gb 2 층 | -18.6±0.3 | - |
표 1입니다. 열역학 매개 변수는 Ligands MN4 DSC 데이터 집합을 사용 하 여 코카인과 말라리아의 글로벌 분석에서 추출. 매개 변수는 30 ° c.에 계산 된 B1F 코카인 또는 말라리아 바인딩 접힌된 상태를 참조 하며 지 하 2 층 benzoylecgonine 바인딩된 접힌된 상태를 말합니다. ΔH 와 ΔG kJ/mol에 표현 된다, ΔS 표현 된다 J/mol/K와 ΔCp kJ/mol/k.에서 표현 된다 오류 분산/공동 variance 방법19계산 했다.
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Discussion
수정 및 문제 해결
그림 1 그림 2 에 사용 되는 글로벌 피팅 분석의 세부 되었습니다4위에서 설명한. 여기, 우리가 수행 하 고 thermolabile ligands와 DSC 바인딩 실험 분석의 실용적인 측면을 설명 합니다. DSC 기준선에 혼자 thermolabile ligand는 ligand에서 뺍니다 얻은 주의 + biomolecule dataset, 효과적으로 또는 열 변환에 의해 흡수 열을 밖으로 취소 자체 처리. (그림 1 및 그림 2) 표준 thermolabile ligand 글로벌 피팅 분석 가정 시스템 온도 스캔을 통해 열역학 평형에 있으며 thermolabile ligand 농도 일정 걸쳐 각 열상, 고온 평형 기간 동안 독점적으로 감소. 우리는 이전이 가정 코카인 바인딩된 MN4에 적용 하 고 기다려 어떤 thermolabile 리간드/biomolecule 시스템 속도와이 비슷한 것으로 예상 된다 나타났습니다.
그러나, 어떤 경우는 시스템 열역학 평형에서 것으로 간주 수 없습니다 또는 ligand의 농도 일정 한 검사를 통해 간주 되지 않을 수 있습니다. I) 때는 ligand 열 급속 하 게 온도 스캔 속도 기준 ii) 때는 biomolecule 겪 습 높은 온도에, 돌이킬 수 없는 집계 iii) 접이식/전개 속도 느린 스캔 속도에 비해 포함 됩니다 및 iv) ligand 협회/분리 요금은 때 스캔 속도에 비해 느린. 이러한 경우에 시스템은 운동 보다는 열역학적 제어 그리고 참조 4에에서 주어진 분석은 엄격 하 게 적용 될 수 없습니다. 데이터 있습니다 수 시뮬레이션 양적 그림 3, 다음 보조 파일 1에 설명 된 대로. 그러나 원칙적으로, 이러한 활동을 기반으로 계산이 분석은이 문서의 범위를 넘어 잠재적으로 운동 및 열역학 데이터를 열매를 산출 하는 비 평형 DSC 데이터에 맞게 사용 될 수 있습니다. 대신, 우리는 비 평형 상황 파악에 리더를 돕기 위해 몇 가지 대표적인 시뮬레이션 된 DSC 데이터를 제시.
그림 4ab.에 열역학적 제어의 이상적인 예 나와 무료 biomolecule의 DSC thermograms superimposable (그림 4a)와 thermolabile ligand와 스캔 히스테리시스를 보여주지 않는다, 최대 스캔 이전 다운 스캔 (접는 온도 일치는 용융 온도에 관찰 그림 4b)입니다. 때 thermolabile ligand 빠르게 스캔 속도에 비해 큰 왜곡은 열상에 나타나고 그림 4 c, d와 같이 열역학 방정식 피크 모양에 대 한 계정을 하지 않습니다. 이 될 수 있습니다 스캔 속도 증가 다소 완화. 온도 따른 방식에서 biomolecule 집계, 연속 무료 biomolecule 쇼 DSC 추적 감소 크기 (그림 4e)의 추가 하면서 thermolabile ligand 감소 하는 열 upshifts의 패턴 생성 (그림 4 층) 감소 biomolecule 농도 의해 축소 하지만 이상적인 경우와 비슷합니다. 때 접는/전개 속도 느린에 비해 스캔 속도 히스테리시스 무료 biomolecule의 DSC 흔적에 없었던 이유는 최대 스캔에 명백한 변성 온도 다운 스캔 (에 명백한 renaturation 온도 보다 높은 되도록 그림 4 g)입니다. Thermolabile ligand의 추가 감소 하는 특히 최대 스캔 (그림 4 h)에 대 한 열 upshifts의 익숙한 패턴으로 이어집니다. 그러나 마지막으로, 빠른 폴딩 및 느린 바인딩 시스템 제작 (그림 4i), 무료 biomolecule의 DSC thermograms 히스테리시스 무료 thermolabile ligand와 데이터 표시 히스테리시스 최대 스캔의 명백한 용융 온도 이전 다운 스캔 (그림 4j)의 명백한 접는 온도 보다는 높이. 그럼에도 불구 하 고, 열 upshifts 감소의 일반적인 패턴까지 검색 및 다운 검사에서 명백 하다. 비 평형 동작 느린 접는 또는 활동 바인딩 수이 비 무시할 ligand 열 변환 스캔에 걸쳐 발생의 위험을 실행 스캔 속도 감소 하 여 다소 완화. 실제로, 스캔 속도 위 평형 온도 닮은 그림 4a, b데이터를 얻기 위해 수동으로 조정할 수 있습니다.
기술의 한계
DSC는 바인딩 thermolabile ligands와 실험에 대 한 우리의 열역학 분석 접는 및 바인딩 프로세스는 상대적으로 빠른 thermolabile ligand 변환 각 스캔의 고온 부분 이전 느립니다 해야 합니다. 접힌 및 바인딩된 상태 수명은 약 30 보다 큰 s (k에서ku 0.03 < s-1), 히스테리시스 뚜렷한에서 1 ° C min-1에서 수행 된다. 또한 때 약 kc ligand 변환 속도 상수는 10-4의 -1 = 변성 전환 하기 전에 단일 검색의 과정 동안에 ligand의 상당한 소모 될 수 있습니다. 우리의 분석의 적용 적합 하지 않다 또한 돌이킬 수 없는 집계 경우. 이러한 경우 고급 모델링 데이터에 적용 수 있습니다. 없음 선호도 정보는 ligand 변환이 너무 빠른 첫 번째 변성 전환 이전 완료에 도달 하는 경우 사용할 수 있습니다.
기존의 방법에 관하여 의미
처음으로 우리의 메서드 DSC를 높은 선호도, thermolabile ligands의 바인딩은 열역학을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. 모든 검사의 글로벌 동시 분석을 수행 하 여 열역학 매개 변수는 높은 정확도20추출 됩니다. 추가적인 혜택은 열 변환 제품 무료 biomolecule 대 아무 선호도가지고 하는 경우 전체 데이터 집합 조금 한 실험에서 수집 될 수 있습니다. 반면, 필요 비 thermolabile 리간드에 대 한 전형적인 실험 DSC 시리즈 생산 ~ 7-10 총 실험.
미래의 응용 프로그램
이 방법은, thermolabile 억제제 약물 발견 캠페인에 특성화를 직접 응용 프로그램 있다. 항생제와 benzodiazepines 등 여러 치료 화합물 thermolabile, 또는 생리 적 pH와 온도의 빠른 가수분해를 받은 것으로 알려져 있습니다 ~ 60-70 ° C11. 이 DSC 메서드를 식별 하 여 많은 특성화 잘 배치 됩니다. 뿐만 아니라, 운동 보다는 오히려 열역학 통제 시스템에 대 한 계정에 피팅 프로토콜의 수정, 위에서 설명한 대로 생물학 관련성의 많은 더 많은 시스템에 문을 열 가능성이 있다.
프로토콜 내에서 중요 한 단계
투 석 또는 동일한 작업 버퍼 솔루션 (프로토콜 단계 1.3-1.6)으로 biomolecule 및 리간드의 교환을 고려해 야 할 가장 중요 한 실험 절차 중 하나입니다. Ligand 및 biomolecule 솔루션 사이의 버퍼 불일치는 완전히 무명 관련 접는 데이터 기준선 및 샘플 검사에 큰 유물 발생할 수 있습니다. 또한, 전원 읽기 전에 가압 (프로토콜 단계 2.3) 동안 모니터링할 수 있도록 DSC 압력 안정화 필수적 이다. 전원 읽기로 변경 하는 경우 보다 더 ~ 가압 중 10 µW, 거품 가능성이 모세 혈관에서 형성 하 고 데이터에 큰 부작용을 일으킬 수 있습니다. 이 경우 솔루션은 더 철저 하 게 degassed 필요가 있다.
그림 3입니다. 폴딩, Thermolabile Ligand 그리고 돌이킬 수 없는 집계에 바인딩 바이오. Thermolabile ligand (L) 속도 상수 kc(X) 제품으로 변환합니다. X는 biomolecule에 대 한 아무 선호도. 자유와 biomolecule 교류 바인딩된 상태 (B) 상태 (F) 속도 상수 k오프 와 k에에접혀. 속도 상수 ku 와 kf펼친된 상태 (U)와 F 교류 레스터 Uagg의 속도 상수 k 함께 집계 된 상태 (A)으로 변환합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 평형 및 운동 제어 DSC의 컴퓨터 시뮬레이션 실험 Thermolabile Ligand의 존재와 부재에. (a) 평형 바이오 접는입니다. (b) 평형 접는, thermolabile ligand 바인딩 및 느린 thermolabile ligand 변환. (c) 평형 바이오 접는입니다. (d) 평형 접는, thermolabile ligand 바인딩 및 빠른 thermolabile ligand 변환. (e) 평형 바이오 접는 하 고 느린 돌이킬 수 없는 집계. (f) 평형 접는, 바인딩, 느리게 thermolabile ligand 변환 및 느린 돌이킬 수 없는 집계. (g) 슬로우 바이오 접는입니다. (h) 슬로우 접는, 평형 바인딩 및 느린 thermolabile ligand 변환. (나) 평형 바이오 접는입니다. (j) 평형 접는, 느린 thermolabile ligand 바인딩 및 느린 thermolabile ligand 변환. 모든 패널에서 첫 번째 및 마지막 시뮬레이트된 스캔은 진한 빨간색과 진한 파란색, 각각. 패널만 빛과 어두운 파란색 thermograms을 보여 주는 모든 시뮬레이션된 검사 오버레이, 마지막 2 줄거리에서 볼 수 있습니다 나타냅니다. DSC 실험은 1 ° C min-1 스캔 속도, 0-80 ° C의 온도 범위에서 20 스캔 (10 용 해 및 어 닐 링 10) 시뮬레이션 특정 패널 시뮬레이션 동향의 더 나은 시각화 수 있도록 좁은 온도 범위를 표시 합니다. 시뮬레이션에서 biomolecule 및 리간드 농도 200 µ M와 10mm, 각각 있었다. 각 실험을 스캔 하기 전에 0 ° C에서 600 s 평형 시간 및 후속 검사의 사이 60 평형 시간 시뮬레이션 했다. Arrhenius 매개 변수 바인딩 및 접는 평형 대는에 있었다 5 x 10-1 M-1의 -1는떨어져 = = 1 x 1019의 -1, E는 -20 kJ mol-1, 전자는는 = 오프 120 kJ mol-1배 = 1 x 10-14의 -1는전개 = = 5 × 1018, E는접어 -80 kJ mol-1및 E는전개 = = 120 kJ mol-1 . Arrhenius 매개 변수 바인딩 및 접는 운동 제어는에 했다 5 x 10-3 M-1의 -1는떨어져 = = 1 x 1016의 -1, E는 -20 kJ mol-1, E = 는 오프 120 kJ mol-1배 = 1 x 10-16의 -1는전개 = = 5 x 1016, E는접어 -80 kJ mol-1및 E는전개 = = 120 kJ mol-1 . Arrhenius 느리고 빠른 thermolabile ligand 변환에 대 한 매개 변수는느린 했다 1010의 -1, 전자는천천히 x 7.509 = = 94.65 kJ mol-1, 그리고는빠른 = 1 s-1E는a 빠른 10 kJ mol-1=. Arrhenius 매개 변수 느린 돌이킬 수 없는 집계 했다는agg. 5 x 107의 -1 와 E는agg. = 80 kJ mol-1=. 초과 열 용량 ΔHUF (전개), ΔHBF (바인딩), 및 ΔHAF (집계) 계산 = 200,-140, 및 50 kJ mol-1, 각각. 운동 제어 DSC의 이론적 설명 thermolabile ligands와 실험 및 이러한 시뮬레이션 (및 필요한 매개 변수)을 수행 하기 위한 스크립트에서 사용할 수 있습니다 보조 파일 1. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Disclosures
저자는 관심 없음 충돌 선언합니다.
Acknowledgments
R. W. H. V 맥 길 자연 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC) 교육 프로그램 Bionanomachines에 의해 지원 되었다. A. K. M. 및 P. E. J. NSERC 보조금 327028-09 (A. K. M) 및 238562 (P. E. J.)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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