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Biochemistry

मापने Thermolabile लाइगैंडों के साथ आणविक डीएससी प्रोफाइल तेजी से तह और बाध्यकारी बातचीत की विशेषता के लिए

Published: November 21, 2017 doi: 10.3791/55959

Summary

हम thermolabile लाइगैंडों के साथ एक आणविक तह और बाध्यकारी बातचीत के तेजी से लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत अंतर स्कैनिंग calorimetry का उपयोग कर ।

Abstract

अवकलन स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) एक शक्तिशाली तकनीक है जो कि आणविक तह और बाध्यकारी इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाले ऊष्मा मापदंडों को बढ़ाता है । यह जानकारी नई दवा यौगिकों के डिजाइन में महत्वपूर्ण है । हालांकि, डीएससी विश्लेषणों में प्रयुक्त उच्च तापमान पर कई भेषज प्रासंगिक लाइगैंडों रासायनिक रूप से अस्थिर हैं । इस प्रकार, बाध्यकारी बातचीत को मापने चुनौतीपूर्ण है क्योंकि लाइगैंडों और थर्मल में परिवर्तित उत्पादों की सांद्रता लगातार कैलोरीमीटर कोशिका के भीतर बदल रहे हैं । यहां, हम तेजी से तह, बाध्यकारी, और ligand रूपांतरण प्रक्रियाओं पर ऊष्मा और काइनेटिक जानकारी प्राप्त करने के लिए thermolabile लाइगैंडों और DSC का उपयोग कर एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम डीएनए aptamer MN4 है कि thermolabile ligand कोकीन को बांधने के लिए हमारे विधि लागू किया है । एक नई वैश्विक फिटिंग विश्लेषण है कि thermolabile ligand रूपांतरण के लिए खातों का उपयोग करना, तह और बाध्यकारी मापदंडों का पूरा सेट DSC प्रयोगों की एक जोड़ी से प्राप्त कर रहे हैं । इसके अलावा, हम बताते हैं कि thermolabile ligand रूपांतरण के लिए दर स्थिरांक केवल एक अनुपूरक डीएससी डेटासेट के साथ प्राप्त किया जा सकता है । कई जटिल परिदृश्यों से डेटा की पहचान करने और उनका विश्लेषण करने के लिए दिशानिर्देश प्रस्तुत किए जाते हैं, जिनमें thermolabile ligand का अपरिवर्तनीय एकीकरण, धीमे तह, धीमी बाइंडिंग और तीव्र गति से कमी शामिल है ।

Introduction

अवकलन स्कैनिंग calorimetry (डीएससी) quantitating आणविक बाइंडिंग और तह इंटरैक्शन1,2,3के लिए एक शक्तिशाली तरीका है । DSC की शक्तियों को बाध्यकारी और तह तंत्र स्पष्ट करने की क्षमता शामिल है, और इसी ऊष्मा मापदंडों2,3उपज । इसके अलावा, DSC निकट शारीरिक स्थितियों के तहत समाधान में प्रदर्शन किया जा सकता है और fluorophores, स्पिन-लेबल या परमाणु आइसोटोप4के साथ, उदा, ligand के लेबल की आवश्यकता नहीं है । साधन तापमान में स्कैन करता है, की उपस्थिति और ligand की अनुपस्थिति में इस अणु को विकृत करने के लिए आवश्यक गर्मी की मात्रा को मापने. परिणामस्वरूप thermograms ligand बाध्यकारी और तह प्रक्रियाओं को नियंत्रित करने के लिए ऊष्मा मापदंडों को निकालने के लिए उपयोग किया जाता है । DSC या अंय ऊष्मा तकनीकों द्वारा प्रदान की गई जानकारी1,5,6,7,8अणुओं को लक्षित दवाओं के डिजाइन मार्गदर्शक के लिए महत्वपूर्ण है । हालांकि, उच्च तापमान (~ ६०-१०० डिग्री सेल्सियस) करने के लिए दोहराया स्कैनिंग समस्याग्रस्त किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, कई फार्मास्यूटिकल्स महत्वपूर्ण यौगिकों उच्च तापमान9,10,11, यानीके लिए निरंतर प्रदर्शन पर पुनर्व्यवस्था या अपघटन से गुजरना, वे thermolabile हैं । DSC द्वारा बंधन बातचीत की परीक्षा आमतौर पर कई आगे और रिवर्स स्कैन की आवश्यकता है क्रम में ऊष्मा के विश्लेषण के लिए thermogram के reproducibility को सत्यापित करने के लिए12। बदल बाइंडिंग विशेषताओं के साथ एक माध्यमिक फार्म के लिए एक प्रारंभिक ligand के थर्मल रूपांतरण आकार और क्रमिक thermograms की स्थिति में स्पष्ट मतभेद की ओर जाता है, प्रारंभिक ligand की एकाग्रता के बाद से प्रत्येक स्कैन के साथ कम हो जाती है, जबकि थर्मल रूपांतरण उत्पादों जमा । ये डेटासेट पारंपरिक विश्लेषणों के लिए उत्तरदायी नहीं हैं.

हमने हाल ही में thermolabile ligand डीएससी डेटासेट के लिए एक वैश्विक फिटिंग पद्धति विकसित की है जो कि एक एकल ligand-बाउंड प्रयोग से संदर्भित, गैर-आणविक तह और बाध्यकारी इंटरैक्शन को नियंत्रित करने वाली ऊष्मा मापदंडों का पूरा सेट पैदावार नि: शुल्क4अणु के लिए अपेक्षित thermogram । विश्लेषण प्रयोगात्मक समय और ~ 10 गुना मानक डीएससी दृष्टिकोण की तुलना में आवश्यक नमूना कम कर देता है । हम मानते हुए यह एक स्कैन के उच्च तापमान भाग जहां thermogram ligand एकाग्रता पर निर्भर नहीं करता है के दौरान होता है द्वारा ligand थर्मल रूपांतरण के लिए हिसाब है । इसलिए, ligand एकाग्रता ऊष्मा मापदंडों को निकालने के लिए प्रयोग किया जाता है कि thermogram के हिस्से के भीतर एक स्थिर है । हम इसके अतिरिक्त प्रदर्शन कैसे ligand थर्मल रूपांतरण के लिए लगातार दर एक लंबे समय तक उच्च तापमान equilibration अवधि के साथ एक अनुपूरक प्रयोग द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । सिस्टम के लिए जहां ligand थर्मल रूपांतरण कम तापमान निर्भर है (यानी, सभी तापमान पर होने वाली appreciably), विश्लेषण चर ligand सांद्रता शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । यहां हम thermolabile ligand कोकीन, जो तेजी से उच्च तापमान पर benzoylecgonine में धर्मांतरित (> 60 डिग्री सेल्सियस) की उपस्थिति में डीएनए aptamer MN4 के लिए इस प्रक्रिया का प्रदर्शन । कुनैन ligand thermolability के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है क्योंकि यह इन प्रयोगात्मक तापमान पर रूपांतरण से गुजरना नहीं करता है और भी MN4 को बांधता है । हम thermolabile ligand डीएससी डेटासेट के अधिग्रहण और उनके विश्लेषण के तह, बाध्यकारी और ligand रूपांतरण प्रक्रियाओं की ऊष्मा और काइनेटिक मापदंडों का वर्णन करते हैं.

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Protocol

1. नमूना तैयारी

  1. वांछित13अणु शुद्ध ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल का उपयोग करता है खरीद कोकीन-बाध्यकारी डीएनए aptamer MN4 के खिलाफ आदान प्रदान के बाद 2 एम NaCl तीन बार एक केंद्रापसारक फिल्टर का उपयोग कर एक 3 केडीए आणविक वजन कट-ऑफ झिल्ली के साथ के तीन दौर द्वारा पीछा किया ।
  2. संश्लेषित और शुद्ध, या वांछित thermolabile ligand13खरीद ।
    नोट: MN4 thermolabile ligand कोकीन बांधता है । MN4 भी कुनैन बांधता है, जो इन प्रायोगिक तापमान पर ligand thermolability के लिए एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है ।
  3. शुद्ध और लाइगैंडों (20 मिमी सोडियम फॉस्फेट और १४० mm NaCl बफर, पीएच ७.४, MN4 के लिए और यहां इस्तेमाल लाइगैंडों) के विघटन के डायलिसिस के लिए बफर तैयार करते हैं ।
  4. ०.५-१.० के साथ डायलिसिस टयूबिंग का उपयोग कर बफर के कम से 2 एल के खिलाफ Dialyze परमाणु
  5. अंतिम बफ़र (कार्य बफ़र के रूप में संदर्भित) के माध्यम से एक ०.२ µm फ़िल्टर जो पूरी तरह बफ़र के साथ equilibrated किया गया है फ़िल्टर करें ।
  6. बाहर लाइगैंडों के वांछित जनता तौलना और उंहें फ़िल्टर कार्य बफर में भंग । यदि वांछित ligand सांद्रता आम जनता है कि बहुत कम करने के लिए सही वजन की आवश्यकता होती है, एक केंद्रित ligand स्टॉक समाधान (उदाहरण के लिए 10x) बनाते हैं ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि सभी DSC प्रयोगों नमूना और ligand के लिए एक ही काम कर रहे बफर का उपयोग, यानी, कभी नहीं एक प्रयोग जहां ligand यह बफर कारण होगा के रूप में काम कर रहे बफर के एक अलग बैच में भंग कर रहा है डेटा में बेमेल कलाकृतियों ।
  7. एक ०.२ µm फिल्टर है कि अच्छी तरह से काम कर बफर के साथ equilibrated गया है के माध्यम से एक अणु स्टॉक समाधान फ़िल्टर ।
  8. अवशोषण माप (MN4 जैसे न्यूक्लिक एसिड के लिए २६० एनएम और प्रोटीन के लिए २८० एनएम के लिए) द्वारा एक परमाणु एकाग्रता का निर्धारण ।
  9. एक 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज (MN4 के लिए उपयुक्त है और यहां इस्तेमाल किया लाइगैंडों), या पर-20 या-८० ° c में तैयार की गई अणु और ligand की दुकान ठंड और लंबे समय तक भंडारण बर्दाश्त की आवश्यकता है, तो. Degas में एक तालिका के शीर्ष degasser ( सामग्री तालिकादेखें) में बफ़र, ligand और समाधान को डीएससी में लोड करने से पहले).
    नोट: Degassing उच्च तापमान पर DSC में बुलबुला गठन को रोकने में मदद करता है । बुलबुले के कारण संकेत कलाकृतियों कि अस्पष्ट DSC चोटी आकार और आधारभूत ।

2. डीएससी वडा

  1. डीएससी से प्रेशर हैंडल को अनक्रू ( सामग्री की तालिकादेखें) ।
  2. काम बफर से सिलिकॉन टयूबिंग भागो और संदर्भ केशिका के सामने निकला हुआ किनारा (धातु खोलने) को देते हैं ।
  3. सामने नमूना निकला हुआ किनारा करने के लिए पीछे संदर्भ निकला हुआ कनेक्ट करके संदर्भ और नमूना केशिकाओं के बीच एक पुल बनाएँ ।
  4. एक वैक्यूम लाइन संलग्न के साथ एक बेकार कुप्पी के लिए चलाता है कि रियर नमूना निकला हुआ किनारा के लिए सिलिकॉन टयूबिंग का एक टुकड़ा देते हैं ।
  5. कार्य बफ़र की २०० मिलीलीटर के साथ डीएससी को फ्लश करने के लिए वैक्यूम लाइन चालू करें ।
  6. वर्किंग बफ़र के साथ डीएससी की संदर्भ केशिका लोड । संदर्भ केशिका निकला हुआ किनारा करने के लिए सिलिकॉन टयूबिंग के मोटे तौर पर 3-5 सेमी वर्गों देते हैं ।
  7. रियर निकला हुआ किनारा है सिलिकॉन टयूबिंग में एक 1 मिलीलीटर पिपेट टिप डालें । एक पिपेट के साथ काम बफर के ०.८ मिलीलीटर ड्रा और सामने संदर्भ है निकला हुआ किनारा सिलिकॉन टयूबिंग में बफर के साथ पिपेट टिप डालें ।
  8. धीरे पिपेट सवार नीचे प्रेस संदर्भ केशिका में सामने सिलिकॉन टयूबिंग के माध्यम से काम कर रहे बफर पास और रियर निकला हुआ किनारा संलग्न पिपेट टिप में ऊपर । पिपेट सवार नीचे प्रेस जब तक काम बफर स्तर सिर्फ सामने सिलिकॉन टयूबिंग ऊपर तक पहुंच जाता है, तो पिपेट सवार जारी जब तक काम बफर स्तर सिर्फ पीछे सिलिकॉन टयूबिंग ऊपर तक पहुंचता है ।
    1. बुलबुले के संदर्भ केशिका में मात्रा को मिटाने के लिए आगे और पीछे काम बफर गुजर दोहराएँ ।
      नोट: आमतौर पर, समाधान के 10 गुजरता आगे और पीछे किसी भी बुलबुले स्पष्ट करने के लिए पर्याप्त हैं ।
  9. अंगूठे के साथ रियर पिपेट टिप कैप और धीरे रियर पिपेट टिप और सामने पिपेट पर खींचने के लिए उंहें सिलिकॉन संलग्न टयूबिंग के साथ संदर्भ निकला हुआ किनारा से हटा दें ।
  10. नमूना केशिका कार्य बफ़र के रूप में चरण २.६-२.९ के साथ लोड । रियर संदर्भ और नमूना निकला हुआ किनारा पर एक काला प्लास्टिक टोपी प्लेस, सामने निकला हुआ किनारा खुला जा रहा है ।
  11. दबाव हैंडल अनुलग्न करें ।
  12. DSC सॉफ़्टवेयर खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और पावर पठन को स्थिर करने के बाद इंटरफ़ेस के शीर्ष पर लाल ऊपर तीर क्लिक करके उपकरण दबाव; DSC पावर साधन तापमान और दबाव पढ़ने के साथ इंटरफेस के शीर्ष दाईं ओर एक बॉक्स में संकेत दिया है ।
    नोट: DSC pressurizes के रूप में पढ़ने की शक्ति की निगरानी । से अधिक की शक्ति में परिवर्तन ~ 10 µW केशिकाओं में बुलबुला गठन का संकेत है, जो डेटा में कलाकृतियों पैदा कर सकता है । समाधान निकालना होगा और आगे बढ़ने से पहले degassed ।
  13. Equilibrate एक आगे और रिवर्स स्कैन प्रदर्शन करके डीएससी कार्य बफ़र के साथ करें । स्क्रीन के बाईं ओर "प्रयोगात्मक विधि" टैब में, यह सुनिश्चित करें कि "स्कैनिंग" विकल्प को तापमान स्कैनिंग मोड में डीएससी को चलाने के लिए चुना गया है ।
    नोट: प्रयोगात्मक मापदंडों रेंज स्कैनिंग तापमान, स्कैन दर, कम और उच्च तापमान equilibration समय, और स्कैन की संख्या हैं.
    1. "प्रायोगिक विधि" टैब के अंतर्गत "तापमान पैरामीटर" इनसेट में, "हीटिंग" के लिए बटन पर क्लिक करें । निचले और ऊपरी प्रायोगिक तापमान के लिए 1 और १०० ° c दर्ज करें, स्कैन दर के लिए 1 ° c/मिनट, और equilibration अवधि के लिए ६० s ।
    2. equilibration अवधि के लिए इनपुट फ़ील्ड के अंतर्गत "श्रृंखला जोड़ें" बटन पर क्लिक करें । (एक हीटिंग और एक ठंडा स्कैन के लिए) पॉपअप विंडो में फ़ील्ड जोड़ने के लिए "चरणों में 2 दर्ज करें और" वैकल्पिक हीटिंग/ क्लिक करें "ठीक है"; जोड़ा स्कैन अंतरफलक के निचले हिस्से में दिखाई देते हैं । जांच करें कि प्रत्येक स्कैन के लिए पैरामीटर्स के रूप में वांछित हैं ।
    3. इंटरफ़ेस के शीर्ष पर हरे "प्ले" बटन पर क्लिक करके प्रयोग शुरू करें । वांछित फ़ोल्डर में नेविगेट और पॉपअप विंडो में प्रयोग को बचाने के लिए एक फ़ाइल नाम इनपुट । "प्रयोग विधि" टैब के दाईं ओर "डेटा" टैब पर क्लिक करके प्रयोग की प्रगति देखें.

3. एकत्रित Thermolabile Ligand डीएससी डेटासेट

नोट: न्यूनतम प्रक्रिया के पांच प्रयोग होते हैं: बफर संदर्भ प्रयोगों के साथ और बिना ligand (आधारभूत घटाव के लिए इस्तेमाल किया, चर्चादेखें), नि: शुल्क के साथ नमूना प्रयोगों, परमाणु ligand-बाध्य, और एक लंबे समय तक उच्च तापमान equilibration अवधि के साथ ligand-बाध्य-अणु ।

  1. नमूना डेटा के आधार रेखा घटाव के लिए संदर्भ प्रयोग चलाएं । दोनों केशिकाओं में काम कर रहे बफर के साथ DSC पुनः लोड और एक उपयुक्त तापमान की सीमा पर एक से अधिक आगे और रिवर्स स्कैन इकट्ठा 1 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊपरी (उच्च तापमान) १२० एस के equilibration समय के साथ-1
    1. प्रत्येक व्यक्तिगत रूप से हाइलाइट कर रहा है और इंटरफ़ेस के मध्य दाईं ओर लाल X क्लिक करके पिछले बफ़र equilibration स्कैन इंटरफ़ेस के निचले भाग से हटा दें । "श्रृंखला जोड़ें" बटन पर क्लिक करके नए स्कैन जोड़ें, "जोड़ने के लिए कदम" के लिए क्षेत्र में 20 में प्रवेश, और "वैकल्पिक हीटिंग/ ठीक क्लिक करें और ऊपर के रूप में ग्रीन प्ले बटन पर क्लिक करके प्रयोग चलाएं ।
    2. ligand के लिए संदर्भ प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए दोनों केशिकाओं में ligand की वांछित एकाग्रता युक्त कार्य बफर के साथ ३.१-3.1.1 चरणों को दोहराएँ (१२० एस और ६०० s उच्च तापमान equilibration बार का उपयोग कर दो अलग प्रयोगों को इकट्ठा क्रमशः, thermolabile ligand रूपांतरण के लिए दर निरंतर प्राप्त करने में इस्तेमाल किया जा करने के लिए).
      ध्यान दें: स्कैन दर यहां इस्तेमाल किया कि बाद में प्रयोगों में है कि आगे और रिवर्स स्कैन में थर्मल संतुलन पर है ( चर्चादेखें) सुनिश्चित करता है । स्कैन दर < ०.१-०.२ ° c min-1 लीड शोर thermograms करने के लिए और DSC प्रयोगों में लागू नहीं होते हैं । तापमान अच्छी तरह से ligand के पिघलने तापमान-संतृप्त (~ 20-80 डिग्री सेल्सियस MN4 के लिए) से ऊपर मुक्त करने के लिए एक अणु के पिघलने तापमान से नीचे का विस्तार करना चाहिए । स्कैन की reproducibility सत्यापित करें (उदाहरण के लिए, 10 आगे और 10 रिवर्स स्कैन के लिए 20 कुल पर्याप्त है) ।
    3. यदि एकाधिक लाइगैंडों (जैसे कोकीन और कुनैन) का उपयोग कर, ligand केशिकाओं से हटाने और पार संक्रमण को रोकने के लिए रन के बीच काम बफर की २०० मिलीलीटर (चरण २.५ से दोहराएँ) के साथ DSC फ्लश ।
      नोट: यह एक ligand-बाध्य चलाने के क्रम में यदि पिछले ligand केशिका दीवारों को दृढ़ता से adsorbs और पर्याप्त रूप से बफ़र फ्लशिंग के साथ नहीं हटा दिया जाता है की जांच करने के बाद एक मुक्त करने के लिए एक दोहराने प्रयोग पर कार्य करने के लिए उपयोगी है । यदि thermograms के लिए मुक्त करने के लिए एक बड़ा परिमाण और उच्च विकार तापमान ligand-बाध्य प्रयोग के बाद स्थानांतरित करने के लिए दिखाई देते हैं, यह संभावना है कि पिछले ligand अभी भी कैलोरीमीटर निस्तब्धता के बाद में मौजूद है । प्लास्टिक टोपियां और दबाव बंद संभाल के साथ ६० डिग्री सेल्सियस पर 20% के लिए पारं-७० के साथ केशिकाओं मशीन द्वारा adsorbed ligand निकालें । DSC सॉफ़्टवेयर में प्रयोगात्मक मोड "इज़ोटेर्माल" करने के लिए प्रायोगिक विधि टैब के अंतर्गत परिवर्तित करें इज़ोटेर्माल तापमान के लिए अवधि और ६० ° c के लिए ३,६०० s चुनें शूंय के साथ equilibration समय के लिए दर्ज की गई । "प्रायोगिक विधि में जोड़ें" पर क्लिक करें । इज़ोटेर्माल प्रयोग स्क्रीन के निचले हिस्से में दिखाई देता है । पूरा होने के बाद, 2 L के साथ साधन फ्लश पानी और कदम २.५ से दोहराने ।
  2. एक ही DSC लोडिंग प्रक्रिया और संदर्भ स्कैन के रूप में प्रयोगात्मक मापदंडों का उपयोग नमूना प्रयोगों भागो. नि: शुल्क के लिए परमाणु डेटा सेट, सुनिश्चित करें कि संदर्भ केशिका काम कर रहे बफर शामिल है जबकि नमूना केशिका काम बफर में वांछित एकाग्रता पर मुक्त करने के लिए अणु शामिल हैं ।
    1. ligand-बाउंड प्रयोगों के लिए, यह सुनिश्चित करें कि ligand संदर्भ केशिका में काम कर रहे बफर में है, और ligand से अधिक अणु नमूना केशिका में काम कर रहे बफर में हैं । चरण २.५ में के रूप में भिंन लाइगैंडों के अतिरिक्त के बीच सिस्टम फ़्लश ।
  3. thermolabile ligand जहां उच्च तापमान equilibration अवधि ६०० s करने के लिए बढ़ जाता है और अन्य सभी प्रयोगात्मक पैरामीटर चरण 3.2.1 के रूप में ही कर रहे हैं के लिए बाध्य के साथ एक अतिरिक्त प्रयोग करते हैं ।
    नोट: द्वितीय ligand-बाध्य प्रयोग के लिए उच्च तापमान equilibration अवधि की अवधि बस ligand कम equilibration समय प्रयोग से अधिक तेजी से समाप्त हो गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए चुना जाता है. यदि ligand-बाउंड चोटियों से पहले प्रयोग क्षय स्कैन संख्या के एक समारोह के रूप में (उदा., क्रमिक पीक maxima में अंतर ≤ ०.५ ° c हैं), अनुमान 10-to 20-गुना वृद्धि में उच्च तापमान equilibration अवधि के क्रम में ligand को दूसरे प्रयोग के दौरान पर्याप्त रूप से गिरेगा । ligand रूपांतरण के लिए लगातार दर की सटीक गणना की आवश्यकता है कि दूसरा प्रयोग पहले के सापेक्ष ligand की स्विफ्ट घट गई है । ligand दो प्रयोगों के वैश्विक विश्लेषण से निकाले गए सांद्रता समान और इसलिए अनुपयोगी हो जाएगा यदि ligand घट रहा है दूसरे प्रयोग में पर्याप्त तेजी नहीं है ।

4. डाटा प्रोसेसिंग

  1. डीएससी डेटा विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में डीएससी प्रयोग फ़ाइलें खोलें ( सामग्री की तालिकादेखें) और रॉ पावर डेटा को स्प्रेडशीट के रूप में निर्यात करें ।
  2. डेटा फिटिंग के लिए सॉफ्टवेयर में रॉ पावर डेटा युक्त स्प्रेडशीट आयात करें ।
  3. आधार रेखा से मुक्त और ligand-बाउंड-अणु प्रयोगों से बफ़र पॉवर डेटा घटा कर नमूना डेटा घटाएँ.
    नोट: thermolabile ligand प्रयोग के लिए, प्रारंभिक ligand की एकाग्रता प्रत्येक स्कैन के साथ घटते है । इसलिए, यह बफ़र स्कैन 1 से नमूना 1 स्कैन, और इतने पर घटाना करने के लिए आदर्श है । हमने पाया है कि बफर स्कैन कोकीन के साथ ligand रूपांतरण आय के रूप में appreciably बदल नहीं है और इसलिए एक एकल thermolabile ligand बफर स्कैन thermolabile ligand-बाउंड डेटा के सभी घटाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
  4. आधारभूत-घटाई नमूना पावर डेटा ताप क्षमता करने के लिए कनवर्ट करें ।
    नोट: रूपांतरण की आवश्यकता है, जो कि14,15,16का अनुमान लगाया जा सकता है । शक्ति को ताप क्षमता में परिवर्तित करने के लिए समीकरण को पहले१७बताया गया है.

5. डेटा विश्लेषण

  1. वैश्विक रूप से कम equilibration समय thermolabile ligand-बाउंड हीट क्षमता dataset आधारभूत, ligand एकाग्रता, तह, और ligand बाइंडिंग पैरामीटर्स का एक एकल सेट के साथ पहले4वर्णित के रूप में फ़िट करें ।
  2. पहले4के रूप में वर्णित thermolabile ligand कनवर्ज़न के लिए दर स्थिरांक परिकलित करने के लिए, लंबे equilibration समय dataset के लिए वैश्विक फ़िट को दोहराएँ ।

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Representative Results

thermolabile ligand डीएससी के लिए प्रतिनिधि डेटा आरेख 1में दिखाए जाते हैं । स्थिति और thermolabile ligand की ऊंचाई-बाउंड पीक क्रमिक नीचे की ओर खिसक जाता है कि असीम के रूप में thermolabile ligand प्रत्येक स्कैन (चित्र 1a) के साथ समाप्त हो गया है अणु । मुक्त विकार प्रोफ़ाइल thermolabile ligand रूपांतरण (चित्र 1b) के समापन बिंदु के लिए एक संदर्भ के रूप में उपयोग किया जाता है. कुनैन से बाउंड MN4 के लिए डेटा thermolabile ligand रूपांतरण (चित्र 1b) के लिए ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में दिखाया जाता है । अंतिम thermolabile ligand स्कैन में थोड़ा अधिक संक्रमण midpoints और पीक हाइट्स है जो कि असीम MN4 के सापेक्ष है, thermolabile ligand रूपांतरण उत्पाद (benzoylecgonine) MN4 के लिए कमज़ोर अपनत्व का संकेत है । आरेख 1 में डेटासेट के वैश्विक विश्लेषण से उत्पंन होने वाले ऊष्मा पैरामीटर तालिका 1में सूचीबद्ध होते हैं । कोकीन या कुनैन की उपस्थिति में MN4 के लिए तह मापदंडों त्रुटि के भीतर समान हैं, के रूप में पतला छोटे अणुओं की उंमीद नहीं कर रहे है के बाद से मुक्त करने के लिए perturb के तह ऊष्मा । बाध्यकारी पैरामीटर इज़ोटेर्माल अनुमापन calorimetry (आईटीसी)18 से उन लोगों के साथ अच्छे समझौते में है और पता चलता है कि कोकीन पर कुनैन के लिए MN4's वरीयता एक और अधिक अनुकूल बाध्यकारी धारिता द्वारा संचालित है । चित्रा 2में, उच्च तापमान equilibration अवधि में वृद्धि thermolabile ligand एकाग्रता की अधिक स्पष्ट कटौती कम equilibration अवधि के लिए संबंधित के साथ प्रत्येक स्कैन dataset. दो डेटासेट से अनुकूलित वैश्विक फिट एकाग्रता मापदंडों का उपयोग कर, उच्च equilibration तापमान पर ligand रूपांतरण के लिए दर स्थिर चित्रा 2 इनसेट में लाइन की ढलान से गणना की है.

Figure 1
चित्र 1. Thermolabile ligand डीएससी. () Thermograms ऑफ MN4 (८३ µ एम) कोकीन (आरंभिक एकाग्रता ७७८ µ मीटर) से आबद्ध. ligand की उपस्थिति में MN4 की पहली और अंतिम स्कैन गहरे लाल और नीले घेरे के रूप में दिखाए जाते हैं, जबकि इसी फिट रंगीन लाइनों के रूप में दिखाए जाते हैं । () Thermograms मुक्त MN4 (८३ µ मीटर, काले घेरे) और कुनैन (८८० µ मीटर, रंगीन हलकों) से बाउंड क्रमिक स्कैन । फ़िट करने के लिए स्वतंत्र और कुनैन-बाउंड datasets क्रमशः काले और रंगीन रेखाओं के रूप में दिखाए जाते हैं । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ संदर्भ4 से reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. Thermolabile Ligand रूपांतरण के लिए लगातार दर को मापने. () MN4 के लिए thermograms के सेट कम (१२० एस, काले लाल) और लंबे समय के साथ कोकीन के लिए बाध्य (६०० एस, गहरे नीले) equilibration बार ८० डिग्री सेल्सियस पर, क्रमशः । () कोकीन के वैश्विक विश्लेषण से निकाले गए () में डेटासेट के एक समारोह के रूप में स्कैन संख्या की सांद्रता । प्रयोगात्मक अंक और घातीय फिट क्रमशः रंगीन हलकों और लाइनों के रूप में दिखाया जाता है । इनसेट पहले वर्णित अनुपूरक Eq के लिए एक रैखिक फिट दिखाता है. 19 Harkness एट अल से दो डेटासेट के लिए अनुकूलित वैश्विक फिट कोकीन सांद्रता का उपयोग4। ८० डिग्री सेल्सियस पर ligand थर्मल रूपांतरण के लिए दर लगातार लाइन की ढलान के रूप में गणना की है । thermolabile ligand रूपांतरण के लिए दर लगातार के लिए त्रुटि ± दो मानक विचलन के रूप में दिया जाता है । रसायन विज्ञान के रॉयल सोसायटी से अनुमति के साथ संदर्भ4 से reproduced । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पैरामीटर्स फ़िट करना कोकीन जोड़ा कुनैन जोड़ा गया
∆ Hउफ़ 271.3 ± 1.8 272.5 ± 4.0
एसउफ़ 824.4 ± 5.1 827.9 ± 10.9
एकGउफ़ 21.6 ± 0.2 21.6 ± 0.9
B1F -75.2 ± 1.6 -101.0 ± 4.0
SB1F -154.2 ± 5.0 -213.7 ± 12.0
सीपीB1F -1.5 ± 0.1 -1.2 ± 0.1
GB1F -28.5 ± 0.2 -36.2 ± 0.7
B2F -33.7 ± 1.8 -
SB2F -49.9 ± 5.2 -
सीB2F -2.2 ± 0.1 -
GB2F -18.6 ± 0.3 -

तालिका 1. MN4 DSC के वैश्विक विश्लेषण से निकाले गए ऊष्मा पैरामीटर कोकीन और कुनैन लाइगैंडों का उपयोग कर डेटासेट । पैरामीटर्स की गणना 30 डिग्री सेल्सियस पर की गई । B1F कोकीन-या कुनैन-बाउंड जोड़ राज्यों और B2F को संदर्भित करता है benzoylecgonine-बाउंड जोड़ राज्य को संदर्भित करता है । Δ और Δजी में व्यक्त कर रहे है kJ/मॉल, ΔS में व्यक्त किया है J/मोल/कश्मीर और Δसीपी में व्यक्त किया जाता है kJ/सह-प्रसरण विधि19के अनुसार त्रुटियों की गणना की गई ।

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Discussion

संशोधन और समस्या निवारण

चित्रा 1 और चित्रा 2 में इस्तेमाल किया वैश्विक फिटिंग विश्लेषण का ब्यौरा पहले से4बताया गया है. यहां, हम प्रदर्शन और thermolabile लाइगैंडों के साथ डीएससी बाध्यकारी प्रयोगों का विश्लेषण करने के व्यावहारिक पहलुओं की रूपरेखा । ध्यान दें कि एक डीएससी आधार रेखा अकेले thermolabile ligand के लिए प्राप्त ligand + अणु डेटासेट से घटाया है, प्रभावी ढंग से जारी गर्मी बाहर रद्द या थर्मल रूपांतरण प्रक्रिया ही द्वारा अवशोषित । मानक thermolabile ligand ग्लोबल फिटिंग विश्लेषण (चित्रा 1 और चित्रा 2) मानता है कि प्रणाली तापमान स्कैन भर में ऊष्मा संतुलन पर है और यह कि thermolabile ligand एकाग्रता स्थिर है प्रत्येक thermogram भर में, विशेष रूप से उच्च तापमान equilibration अवधि के दौरान घटते । हमने पहले दिखाया है कि यह धारणा कोकीन-बाउंड MN4 पर लागू होती है और इन के समान कैनेटीक्स के साथ किसी भी thermolabile ligand/

वहां रहे हैं, तथापि, कुछ स्थितियों में जो प्रणाली को ऊष्मा संतुलन और/या ligand की एकाग्रता पर नहीं माना जा सकता है एक स्कैन भर में लगातार विचार नहीं किया जा सकता है । ये मैं शामिल है) जब ligand थर्मल तापमान स्कैन दर के सापेक्ष तेजी से धर्मांतरित, द्वितीय) जब उच्च तापमान पर अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण, iii) जब तह/खुलासा दर स्कैन दर की तुलना में धीमा कर रहे हैं, और iv) जब ligand संघ/पृथक्करण दरें स्कैन दर की तुलना में धीमी हैं । इन मामलों में, प्रणाली काइनेटिक के तहत है बजाय ऊष्मा नियंत्रण और संदर्भ 4 में दिए गए विश्लेषण कड़ाई से लागू नहीं किया जा सकता है । अनुपूरक फ़ाइल 1में वर्णित के रूप में डेटा मात्रात्मक रूप से चित्रा 3के बाद अनुकरणीय हो सकता है । सिद्धांत रूप में, इन कैनेटीक्स आधारित गणना गैर संतुलन DSC डेटा फिट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, संभवतः दोनों काइनेटिक और ऊष्मा डेटा उपज, लेकिन इस विश्लेषण इस कागज के दायरे से बाहर है । इसके बजाय, हम गैर-संतुलन स्थितियों की पहचान करने में पाठक की सहायता करने के लिए कुछ प्रतिनिधि नकली डीएससी डेटा प्रस्तुत करते हैं ।

ऊष्मा नियंत्रण का एक आदर्श उदाहरण चित्रा 4a, बी में दिखाया गया है नि: शुल्क superimposable के डीएससी thermograms (चित्रा 4a) और thermolabile ligand के साथ स्कैन कर रहे हैं हिस्टैरिसीस नहीं दिखा, ऐसी है कि पिघलने तापमान अप पर मनाया-स्कैन पिछले नीचे के तह तापमान से मेल खाता स्कैन ( चित्रा 4b). जब thermolabile ligand स्कैन दर की तुलना में तेजी से धर्मांतरित, बड़े विकृतियों thermogram में दिखाई देते हैं और ऊष्मा समीकरण पीक आकार के लिए नहीं खाते हैं, जैसा कि चित्र 4c, dमें दिखाया गया है । इस स्कैन दर में वृद्धि के द्वारा कुछ हद तक समाप्त किया जा सकता है । जब एक तापमान पर निर्भर तरीके में एक अणु समुच्चय, नि: शुल्क के लिए DSC अंश के लिए एक परमाणु शो उत्तराधिकारी के परिमाण में कम हो जाती है (चित्रा 4e), जबकि thermolabile ligand के अलावा थर्मल ऊपर कम की एक पद्धति का उत्पादन आदर्श मामले के समान है, लेकिन घटते हुए अणु एकाग्रता (चित्रा 4f) द्वारा स्केल । जब तह/खुलासा कैनेटीक्स स्कैन दर की तुलना में धीमी गति से कर रहे हैं, हिस्टैरिसीस मुक्त के DSC अंश में स्पष्ट है कि इस तरह के ऊपर से स्पष्ट विकार तापमान-स्कैन नीचे पर स्पष्ट renaturation तापमान से अधिक है स्कैन ( चित्रा 4g). एक thermolabile ligand के अलावा थर्मल बदलाव, विशेष रूप से अप-स्कैन (चित्रा 4h) के लिए घटते के परिचित पैटर्न की ओर जाता है । अंत में, तेजी से तह और धीमी बाध्यकारी उत्पादन के साथ प्रणालियों मुक्त हिस्टैरिसीस (चित्रा 4i) के लिए नि: शुल्क DSC thermograms, तथापि thermolabile ligand शो हिस्टैरिसीस के साथ डेटा जहां अप के स्पष्ट पिघलने तापमान स्कैन है पिछले नीचे के स्पष्ट तह तापमान से अधिक-स्कैन (चित्रा 4j) । फिर भी, थर्मल बदलाव कम के ठेठ पैटर्न दोनों अप में स्पष्ट है स्कैन और नीचे स्कैन । धीमी गति से तह या बाध्यकारी कैनेटीक्स के मामले में गैर संतुलन व्यवहार कुछ हद तक स्कैन दर कम करके समाप्त किया जा सकता है, हालांकि इस स्कैन भर में होने वाली गैर नगण्य ligand थर्मल रूपांतरण के जोखिम को चलाता है । व्यवहार में, स्कैन दर और ऊपरी equilibration तापमान मैन्युअल रूप से चित्र 4a, बीजैसी डेटा प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है.

तकनीक की सीमाएं

thermolabile लाइगैंडों के साथ DSC बाइंडिंग प्रयोगों के लिए हमारे ऊष्मा विश्लेषण की आवश्यकता है कि तह और बाध्यकारी प्रक्रियाओं अपेक्षाकृत तेजी से कर रहे है और कि thermolabile ligand रूपांतरण प्रत्येक स्कैन के उच्च तापमान भाग से पहले धीमी है । जब जोड़ और/या बाध्य राज्य के जीवनकाल के बारे में 30 s (koff, ku < ०.०३ s-1) से अधिक है, तो हिस्टैरिसीस 1 ° c मिनट-1पर निष्पादित स्कैन में समझदार हो जाता है । इसके अतिरिक्त, जब ligand रूपांतरण दर लगातार लगभग kc = 10-4 s-1 विकार संक्रमण से पहले से ऊपर है, वहां एक स्कैन के दौरान ligand की महत्वपूर्ण कमी हो सकती है । हमारे विश्लेषण के आवेदन भी अनुपयुक्त है जब अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण होता है । इन मामलों में, डेटा पर अधिक उंनत मॉडलिंग लागू की जा सकती है । कोई संबध जानकारी उपलब्ध नहीं है अगर ligand रूपांतरण इतनी तेजी से है कि यह पहले विकार संक्रमण से पहले पूरा पहुंच जाता है ।

मौजूदा तरीकों के संबंध में महत्व

पहली बार के लिए हमारी विधि DSC उच्च अपनत्व, thermolabile लाइगैंडों की बाध्यकारी ऊष्मा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा करने के लिए अनुमति देता है । सभी स्कैन का एक साथ एक वैश्विक विश्लेषण प्रदर्शन करके, ऊष्मा मापदंडों उच्च सटीकता के साथ20निकाले जाते हैं । एक अतिरिक्त लाभ यह है कि पूर्ण डेटासेट में एक प्रयोग के रूप में कम के रूप में एकत्र किया जा सकता है अगर थर्मल रूपांतरण उत्पाद मुक्त परमाणु के लिए कोई समानता है । इसके विपरीत, एक गैर के लिए एक विशिष्ट प्रयोगात्मक DSC श्रृंखला उत्पादन thermolabile ligand ~ 7-10 कुल प्रयोगों की आवश्यकता है ।

भविष्य अनुप्रयोगों

इस दृष्टिकोण निस्र्पक तंग, दवा खोज अभियानों में thermolabile अवरोधकों के लिए सीधे आवेदन किया है । ऐसे एंटीबायोटिक दवाओं और benzodiazepines के रूप में कई चिकित्सीय यौगिकों thermolabile हो जाना जाता है, पर या शारीरिक पीएच और ~ 60-70 डिग्री सेल्सियस के तापमान के पास तेजी से hydrolysis के दौर से गुजर11। यह डीएससी विधि अच्छी तरह से पहचानने और कई और अधिक विशेषता के लिए तैनात है । के रूप में अच्छी तरह से, फिटिंग प्रोटोकॉल के संशोधन के तहत सिस्टम के लिए खाते में काइनेटिक के बजाय ऊष्मा नियंत्रण, के रूप में ऊपर चर्चा की, जैविक प्रासंगिकता के कई और अधिक प्रणालियों के लिए दरवाजे खोलने की क्षमता है ।

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण चरणों

सबसे महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं में से एक पर विचार करने के लिए डायलिसिस या समान काम बफर समाधान (प्रोटोकॉल 1.3-1.6) कदम में ligand के आदान प्रदान है । ligand और परमाणु समाधान के बीच बफर बेमेल आधारभूत और नमूना स्कैन जो पूरी तरह से प्रासंगिक तह डेटा अस्पष्ट में बड़ी कलाकृतियों के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । इसके अतिरिक्त, यह आवश्यक है कि बिजली पढ़ने से पहले DSC दबाव है ताकि यह प्रणा (प्रोटोकॉल चरण २.३) के दौरान निगरानी की जा सकती है स्थिर है । यदि प्रणा के दौरान अधिक से अधिक ~ 10 µW द्वारा बिजली पढ़ने परिवर्तन, बुलबुले की संभावना केशिकाओं में गठन किया है और डेटा में बड़ी कलाकृतियों पैदा कर सकता है । इस मामले में, समाधान के लिए और अधिक अच्छी तरह से degassed होने की जरूरत है ।

Figure 3
चित्र 3. आणविक तह, एक Thermolabile Ligand के लिए बाध्यकारी, और अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण. thermolabile ligand (एल) उत्पाद में धर्मांतरित (X) एक दर के साथ लगातार कश्मीरc। एक्स के लिए कोई समानता के अणु है । समयबद्ध राज्य (बी) मुक्त जोड़ राज्य (एफ) के साथ दर लगातार कश्मीरबंद और कश्मीरपरके साथ परमाणु आदान प्रदान की । एफ एक्सचेंजों के साथ सामने आया राज्य (यू) दर स्थिरांकों के साथ ku और kf. U अचल दर स्थिरांक kaggके साथ समेकित स्थिति में कनवर्ट करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. कंप्यूटर संतुलन और काइनेटिक के अभाव और एक Thermolabile Ligand की उपस्थिति में नियंत्रित DSC प्रयोगों का अनुकरण । () संतुलन आणविक तह. () संतुलन तह, thermolabile ligand बंधनकारक, आणि स्लो thermolabile ligand रुपांतर. () संतुलन आणविक तह. () संतुलन तह, thermolabile ligand बंधन, और तेज thermolabile ligand रूपांतरण । () संतुलन आणविक तह और धीमी गति से अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण । () संतुलन तह, बाध्यकारी, धीमी thermolabile ligand रूपांतरण, और धीमी गति से अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण । () धीमी आणविक तह. () धीमी तह, संतुलन बंधन, और धीमी गति से thermolabile ligand रूपांतरण । (i) संतुलन आणविक तह. () संतुलन तह, स्लो thermolabile ligand बंधनकारक, आणि स्लो thermolabile ligand रुपांतर. सभी पैनलों में, क्रमश: पहले और अंतिम नकली स्कैन गहरे लाल और गहरे नीले रंग के होते हैं । पैनलों है कि केवल प्रकाश और गहरे नीले thermograms दिखाने के संकेत मिलता है कि सभी नकली स्कैन ओवरले, और केवल पिछले दो भूखंड में दिखाई दे रहे हैं । DSC प्रयोगों के साथ नकली थे 20 स्कैन (10 पिघलने और 10 एनीलिंग) पर 1 ° c न्यूनतम-1 स्कैन दर, 0-80 डिग्री सेल्सियस की एक तापमान रेंज के साथ. कुछ पैनलों सिमुलेशन प्रवृत्तियों के बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए संकरा तापमान पर्वतमाला प्रदर्शित करते हैं । सिमुलेशन में ligand सांद्रता और २०० µ मीटर और 10 मिमी, क्रमशः थे । प्रत्येक प्रयोग स्कैनिंग से पहले 0 ° c पर एक ६०० s equilibration समय के साथ अनुकरणीय था और बाद के स्कैन में से प्रत्येक के बीच एक ६० s equilibration समय. संतुलन बाध्यकारी और तह के लिए Arrhenius पैरामीटर एकपर थे = 5 x 10-1 एम-1 एस-1, एकबंद = 1 x 1019 s-1, eAon =-20 kJ मॉल-1, eA बंद = १२० kJ मॉल-1, एक गुना = 1 x 10-14 एस-1, एकखुलासा = 5 x 1018,एकगुना =-८० kJ मॉल-1, और ई= १२० kJ मॉल-1 . Arrhenius मानकों के लिए काइनेटिक नियंत्रित बाध्यकारी और तह एकपर थे = 5 x 10-3 एम-1 एस-1, एकबंद = 1 x 1016 एस-1, ईपर =-20 kJ मॉल-1, ई एक बंद = १२० kJ मॉल-1 , एकगुना = 1 x 10-16 एस-1, एकखुलासा = 5 x 1016, ईएकगुना =-८० kJ मॉल-1, और ई= १२० kJ मॉल-1 . धीमी गति से और तेजी से thermolabile ligand रूपांतरण के लिए Arrhenius पैरामीटर एकधीमी = ७.५०९ x 1010 एस-1, ईएकधीमी = ९४.६५ kJ मॉल-1, और एकतेज = 1 एस-1, ई व्रत = 10 kJ मॉल-1. धीमी अपरिवर्तनीय एकत्रीकरण के लिए Arrhenius पैरामीटर एकagg. = 5 x 107 एस-1 और ईएकagg. = ८० kJ मॉल-1। अतिरिक्त गर्मी क्षमताओं ΔHउफ़ (खुलासा), ΔHBF (बंधन), और ΔHवायुसेना (एकत्रीकरण) = २००,-१४०, और ५० kJ मॉल-1, क्रमशः के साथ गणना की गई । इन सिमुलेशन (और आवश्यक मापदंडों) के प्रदर्शन के लिए thermolabile लाइगैंडों और स्क्रिप्ट के साथ काइनेटिक नियंत्रित DSC प्रयोगों के सैद्धांतिक विवरण अनुपूरक फ़ाइल 1 में उपलब्ध हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव की घोषणा ।

Acknowledgments

आर. डब्ल्यू. एच. वी. मैकगिल नेचुरल साइंसेज और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (NSERC) Bionanomachines में प्रशिक्षण कार्यक्रम का समर्थन किया था. ए. के. एम. और पी. ई. जे. NSERC अनुदान 327028-09 (ए. के. एम.) और २३८५६२ (पी. ई. जे.) द्वारा समर्थित थे.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Chem Impex #00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71502
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9763
Deioinized water for molecular biology Millipore H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters VWR CA28145-477
3 kDa centrifugal filters Millipore UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff Spectrum Laboratories 131048
Silicon tubing VWR 89068-474
Plastic DSC flange caps TA Instruments 6111
DNA aptamer MN4 Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine Sigma Aldrich C008
Quinine Sigma Aldrich 22620
NanoDSC-III microcalorimeter TA Instruments http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70 VWR 89233-152

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References

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Harkness V, R. W., Johnson, P. E.,More

Harkness V, R. W., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. J. Vis. Exp. (129), e55959, doi:10.3791/55959 (2017).

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