Summary
Nous présentons un protocole pour la caractérisation rapide des biomoléculaire pliage et contraignant les interactions avec les ligands thermolabiles utilisant la calorimétrie différentielle à balayage.
Abstract
Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une technique puissante pour quantifier les paramètres thermodynamiques régissant biomoléculaire pliage et les interactions de liaison. Cette information est essentielle dans la conception de nouveaux composés pharmaceutiques. Cependant, de nombreux ligands pharmaceutiquement pertinentes sont chimiquement instables aux températures élevées utilisées dans les analyses de DSC. Ainsi, mesurer les interactions de liaison est difficile parce que les concentrations de ligands et de produits thermiquement converties sont en constante évolution au sein de la cellule du calorimètre. Nous présentons ici un protocole utilisant des ligands thermolabiles et DSC pour obtenir rapidement des informations thermodynamiques et cinétiques sur le pliage, une liaison et ligand procédés de conversion. Nous avons appliqué notre méthode à l’ADN aptamère MN4 qui se lie à la cocaïne de ligand thermolabile. À l’aide d’une nouvelle analyse de montage global qui tient compte de la conversion de ligand thermolabile, l’ensemble complet de pliage et de liaison des paramètres sont prélevés sur une paire d’expériences de DSC. En outre, nous montrons que la constante de vitesse de conversion thermolabile ligand peut être obtenue avec un seul dataset supplémentaire de DSC. Les lignes directrices pour identifier et analyser les données provenant de plusieurs scénarios plus complexes sont présentés, y compris l’agrégation irréversible de la biomolécule pliage lent, liaison lente et rapide épuisement du ligand thermolabile.
Introduction
Calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est une méthode puissante pour quantifiant liaison biomoléculaire et pliage des interactions1,2,3. Les points forts de DSC incluent sa capacité d’élucider contraignant et pliage des mécanismes et à céder les paramètres thermodynamiques correspondantes2,3. En outre, DSC peut être effectuée en solution dans des conditions physiologiques près et ne nécessite pas de marquage de la biomolécule ou ligands, par exemple, avec des fluorophores, spin-étiquettes ou isotopes nucléaires4. L’instrument balaye de température, mesure de la quantité de chaleur nécessaire pour dénaturer la biomolécule en présence et en absence de ligand. Les thermogrammes qui en résultent sont utilisées pour extraire les paramètres thermodynamiques qui régissent le ligand binding et processus de pliage. Les informations fournies par DSC ou d’autres techniques thermodynamiques sont essentielles pour guider la conception des médicaments ciblant des biomolécules1,5,6,7,8. Cependant, l’analyse répétée à des températures élevées (~ 60-100 ° C) peut s’avérer problématique. Par exemple, de nombreux composés pharmaceutiquement importants subissent une transposition ou décomposition après exposition à des températures élevées9,10,11, c'est-à-dire, ils sont thermolabiles. Examen de liaison généralement les interactions par DSC exige des scans multiples avant et arrière afin de vérifier la reproductibilité de la thermogramme pour analyses thermodynamiques12. Conversion thermique d’un ligand initiale à une forme secondaire présentant des caractéristiques de liaison modifiée entraîne des différences marquées dans la forme et la position des thermogrammes successifs, car la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan tout en le produits de conversion thermique s’accumulent. Ces ensembles de données ne se prêtent pas aux analyses traditionnelles.
Nous avons récemment mis au point une méthode de lissage global datasets thermolabile ligand DSC qui cède l’ensemble complet des paramètres thermodynamiques qui régissent le pliage biomoléculaire et contraignant les interactions d’une seule expérience de ligand lié cité la thermogramme requise pour la biomolécule gratuit4. L’analyse réduit le temps expérimental et les échantillons requis par ~ 10 fois par rapport aux approches DSC standard. Nous avons représenté pour ligand conversion thermique en supposant que cela se passe pendant la phase de haute température de chaque balayage où le thermogramme ne dépend pas de la concentration de ligand. Par conséquent, la concentration de ligand est une constante dans la portion de la thermogramme qui est utilisé pour extraire des paramètres thermodynamiques. En outre, nous avons démontré comment la constante de vitesse pour la conversion thermique ligand peut être obtenue en effectuant une expérience supplémentaire avec une plus longue période d’équilibration de haute température. Pour les systèmes où la conversion thermique de ligand est moins dépendante de la température (c'est-à-diresurvenant de façon appréciable à toutes les températures), l’analyse peut être modifiée pour inclure des concentrations variables de ligand. Nous démontrons cette procédure pour l’ADN aptamère MN4 en présence de la cocaïne de ligand thermolabile, qui se transforme rapidement en benzoylecgonine à des températures élevées (> 60 ° C). La quinine est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand puisqu’il ne subit pas de conversion à ces températures expérimentales et lie également à MN4. Nous décrivons l’acquisition de ligand thermolabile DSC datasets et leur analyse, ce qui donne des paramètres thermodynamiques et cinétiques de la plier, une liaison et ligand des processus de conversion.
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Protocol
1. préparation de l’échantillon
- Purifier la biomolécule désiré13.
Remarque : Ce protocole utilise acheté cocaïne-liaison ADN aptamère MN4 après avoir échangé contre 2 M NaCl, trois fois suivie de trois cycles de l’eau déminéralisée en utilisant un filtre centrifuge avec une membrane de limite de poids moléculaire 3 kDa. - Synthétiser et purifier ou acheter le ligand thermolabile désiré13.
NOTE : MN4 lie la cocaïne ligand thermolabile. MN4 lie également la quinine, qui est utilisée comme contrôle négatif pour la thermolabilité de ligand à ces températures expérimentales. - Préparer les mémoires tampons pour dialyse de la biomolécule purifiée et dissolution des ligands (tampon de NaCl phosphate de sodium et 140 mM 20 mM, pH 7,4, MN4 et les ligands utilisés ici).
- Dialyser la biomolécule contre au moins 2 L de mémoire tampon, utilisez un tuyau de dialyse avec 0,5 - 1,0 coupure kDa.
- Filtrer sur un filtre de 0,2 µm qui a été soigneusement équilibré avec un tampon la dernière mémoire tampon (dénommée tampon de travail).
- Peser la masse désirée des ligands et dissoudre dans le tampon de travail filtrée. Si la concentration de ligand désirée besoin de masses qui sont trop petites pour peser avec précision, faire une solution concentrée de ligand (10 x par exemple).
Remarque : Il est essentiel que toutes les expériences de DSC utilisent le même tampon de travail pour l’échantillon et ligand, c'est-à-direne jamais effectuer une expérience où le ligand est dissous dans un lot différent de tampon de travail que la biomolécule car cela provoquerait le tampon artefacts de décalage dans les données. - Filtrer la solution mère de biomolécules à travers un filtre de 0,2 µm qui a été soigneusement équilibré avec tampon de travail.
- Déterminer la concentration de la biomolécule par mesures d’absorbance (260 nm pour les acides nucléiques comme MN4 et 280 nm pour les protéines).
- Stocker la biomolécule préparé et le ligand dans un réfrigérateur de 4 ° C (convient pour MN4 et les ligands utilisés ici), ou à -20 ou -80 ° C si la biomolécule et ligands tolèrent gel et longue durée de stockage est nécessaire. Degas, les solutions tampon, biomolécule et ligand dans un dessus de table dégazeur (voir Table des matières) avant le chargement dans le DSC.
NOTE : Dégazage contribue à prévenir la formation de bulles dans le DSC aux températures plus élevées. Bulles de causent des artefacts de signal qui obscurcissent DSC pic formes et lignes de base.
2. DSC préparation
- Dévisser la poignée de la pression de la DSC (voir Table des matières).
- Exécuter des tubes de silicium de la mémoire tampon de travail et l’attacher à la bride avant (métal ouverture) du capillaire de référence.
- Créer un pont entre les capillaires référence et exemple en connectant la bride référence arrière à la bride de l’échantillon avant.
- Fixez un morceau de tube de silicone à la bride arrière échantillon qui s’exécute dans une fiole de déchets avec une ligne de vide attachée.
- Tourner sur la ligne du vide pour vider le DSC avec 200 mL de tampon de travail.
- Charger le capillaire de référence de la DSC avec tampon de travail. Fixer environ 3-5 cm, les segments du tube de silicone sur les brides capillaire de référence.
- Insérer une pointe de pipette de 1 mL en tube de silicium de la bride arrière. Faire 0,8 mL de tampon de travail avec une pipette et enfiler l’embout de la pipette avec un tampon en tubes de silicone de la bride de référence avant.
- Appuyez doucement sur le piston de la pipette vers le bas pour passer le tampon de travail à travers le tube de silicone avant dans le capillaire de référence et vers le haut de la bride arrière fixée de pipette. Enfoncer le piston de la pipette jusqu'à ce que le niveau de tampon de travail arrive juste au dessus du tube de silicone avant, puis relâchez le piston de la pipette jusqu'à ce que le niveau de tampon de travail atteint juste au-dessus de la tubulure de silicium arrière.
- Répéter en passant le tampon de travail en arrière pour purger le volume dans le capillaire de référence de bulles.
Remarque : 10 passes de la solution en arrière sont généralement suffisants pour éliminer toutes les bulles.
- Répéter en passant le tampon de travail en arrière pour purger le volume dans le capillaire de référence de bulles.
- Boucher l’embout de la pipette arrière avec le pouce et tirez doucement sur l’arrière de la pipette et la pipette avant de leur retirer les brides de référence avec le tube de silicone attaché.
- Charger le capillaire de l’échantillon avec le tampon de travail tout comme aux étapes de 2,6 à 2,9. Placer un capuchon en plastique noir sur la référence arrière et dégustez les brides, laissant les brides front découvert.
- Fixer la poignée de pression.
- Ouvrez le logiciel DSC (voir Table des matières) et pressuriser l’instrument en cliquant sur la flèche en haut de l’interface haut rouge une fois le relevé courant stabilisé ; la puissance de la DSC est indiquée dans une zone en haut à droite de l’interface ainsi que la température de l’instrument et la lecture de la pression.
NOTE : Moniteur le pouvoir lire comme le DSC est sous pression. Changements dans l’alimentation de plus de ~ 10 µW indiquent la formation de bulles dans les capillaires, ce qui peut causer des artefacts dans les données. Les solutions doivent être enlevées et dégazées supplémentaire avant de continuer. - Equilibrer le DSC avec tampon de travail en effectuant un balayage avant et arrière. Dans l’onglet « Méthode expérimentale » sur le côté gauche de l’écran, vérifiez que l’option « Analyse » est sélectionnée pour exécuter le DSC en mode d’analyse de la température.
Remarque : Les paramètres expérimentaux sont la température analyse gamme, vitesse de balayage, les temps d’équilibrage de basse et haute température et nombre d’analyses.- Dans l’encart « Paramètres de température » sous l’onglet « Méthode expérimentale », cliquez sur le bouton pour « Chauffage ». Saisissez 1 à 100 ° C pour les températures expérimentales inférieures et supérieures, 1 ° C/min pour la vitesse de balayage et 60 s pour la période de l’équilibration.
- Cliquez sur le bouton « Ajouter la série » sous le champ d’entrée pour la période de l’équilibration. Entrez 2 dans le champ « Étapes pour ajouter » dans la fenêtre pop-up (pour un chauffage et un refroidissement scan) et cochez la case « chauffage/refroidissement alternatif ». Cliquez sur « OK » ; les scans ajoutés apparaissent dans la partie inférieure de l’interface. Vérifiez que les paramètres pour chaque analyse sont comme désiré.
- Lancer le test en cliquant sur le bouton vert « jouer » en haut de l’interface. Naviguez jusqu’au dossier désiré et saisir un nom de fichier pour l’enregistrement de l’expérience dans la fenêtre pop-up. Afficher la progression de l’expérience en cliquant sur l’onglet « Données » à droite de l’onglet « Expérimenter la méthode ».
3. collecte de Ligand Thermolabile DSC Datasets
Remarque : La procédure minimale se compose de cinq expériences : expériences de référence avec et sans ligand de tampon (utilisé pour la soustraction de référence, voir la Discussion), expérimente la biomolécule gratuit, la biomolécule ligand lié, l’échantillon et la biomolécule ligand lié avec une plus longue période d’équilibration de haute température.
- Exécuter des expériences de référence pour la soustraction de la base de l’échantillon de données. Recharger le DSC avec tampon de travail dans les deux vaisseaux capillaires et recueillir des scans multiples avant et arrière sur une plage de température appropriée au 1 ° C min-1 avec un dessus (haute température) temps d’équilibrage de 120 s.
- Supprimer les prΘcΘdentes de l’équilibration du tampon de la partie inférieure de l’interface en sélectionnant chacun individuellement, puis en cliquant sur le X rouge au milieu à droite de l’interface. Ajouter les nouveaux scans en cliquant sur le bouton « Ajouter Series », saisissant 20 dans le domaine des « Étapes pour ajouter » et en cochant la case « autre chauffage/refroidissement ». Cliquez sur OK et lancer l’expérience en cliquant sur le bouton vert play comme ci-dessus.
- Répétez les étapes 3.1 - 3.1.1 avec tampon de travail contenant la concentration désirée du ligand dans les deux vaisseaux capillaires pour obtenir la référence expérimente pour le ligand (recueillir deux expériences distinctes à l’aide de 120 s et 600 s haute température équilibration fois respectivement, à utiliser dans l’acquisition de la constante de vitesse pour la conversion de ligand thermolabiles).
Remarque : La vitesse de balayage utilisée ici s’assure que la biomolécule dans des expériences ultérieures est à l’équilibre thermique dans les scans avant et arrière (voir Discussion). Analyse taux < 0,1-0,2 ° C min-1 conduisent à des thermogrammes bruyants et ne sont pas applicables dans les expériences de DSC. Les températures ne doivent dépasser de bien en dessous de la température de fusion de la biomolécule gratuit bien au-delà de la température de fusion du ligand saturé biomolécule (~ 20-80 ° C pour MN4). Vérifier la reproductibilité de l’analyse (par exemple, l’avant 10 et 10 scans inverses pour 20 total est suffisant). - Si vous utilisez plusieurs ligands (comme la cocaïne et la quinine), rincer la DSC avec 200 mL de tampon de travail (répétition de l’étape 2.5) entre les exécutions afin de retirer les capillaires de ligand et de prévenir la contamination croisée.
Remarque : Il est utile de réaliser une expérience réitérée sur la biomolécule libre après une course de ligand lié afin de vérifier si le ligand précédent est fortement adsorbé dans les parois capillaires et n’est pas supprimé correctement avec vidage de la mémoire tampon. Si les thermogrammes pour la biomolécule libre semblent être déplacé vers une plus grande ampleur et de la température de dénaturation élevée après la liaison ligand expérience, il est probable que le ligand précédent est encore présent dans le calorimètre après le rinçage. Supprimer le ligand adsorbé en incubant les capillaires avec 20 % Contrad-70 pendant 1 h à 60 ° C avec les bouchons en plastique et la poignée de pression. Dans le logiciel de DSC, passer du mode expérimental aux « Isotherme » sous l’onglet méthode expérimentale choisir 3 600 s pour la durée et 60 ° C pour la température isotherme, avec zéro est entré pour le temps d’équilibrage. Cliquez sur « Ajouter à la méthode expérimentale ». L’expérience isotherme apparaît dans la partie inférieure de l’écran. Après l’achèvement, rincer l’instrument à l’eau de 2 L eau désionisée et répétez l’étape 2.5.
- Exécuter des expériences modèles utilisant cette DSC chargement procédure et paramètres expérimentaux comme la référence scanne. Pour l’ensemble de données biomolécule libre, faire en sorte que le capillaire de référence contient le tampon de travail tandis que le capillaire de l’échantillon contient la biomolécule libre à la concentration voulue dans un tampon de travail.
- Pour les expériences de ligand lié, assurez-vous que le ligand est dans le tampon de travail dans le capillaire de référence, et la biomolécule plus ligand est en travail tampon non contrôlé dans le capillaire de l’échantillon. Vider le système entre les ajouts de différents ligands comme au point 2.5.
- Effectuer une expérience supplémentaire avec la biomolécule lié au ligand thermolabile où la période de l’équilibration de haute température est augmentée à 600 s et tous les autres paramètres expérimentaux sont les mêmes que l’étape 3.2.1.
Remarque : La durée de la période d’équilibration haute température pour l’expérience de la deuxième liaison ligand est simplement choisie pour s’assurer que le ligand est appauvri plus rapidement que l’expérience de temps court de l’équilibration. Si le ligand lié aux pics de la première experiment décomposition lentement en fonction du numéro d’analyse (par exemple, les différences entre les sommets successifs sont ≤ 0,5 ° C), estimer les augmentations de 10 à 20 fois dans la période d’équilibration haute température afin de adéquatement appauvrissent le ligand au cours de la seconde expérience. Le calcul exact de la constante de vitesse pour la conversion de ligand exige que la seconde expérience ait plus rapide épuisement du ligand par rapport à la première. Les concentrations du ligand extraites de l’analyse globale des deux expériences seront similaires et donc inutilisable si l’épuisement de ligand n’est pas suffisamment accéléré dans la seconde expérience.
4. traitement des données
- Ouvert le DSC expérimenter les fichiers dans le logiciel d’analyse de données DSC (voir Table des matières) et exportez les données de puissance brute comme des feuilles de calcul.
- Importer les feuilles de calcul contenant les données de puissance brute dans le logiciel pour montage des données.
- Référence soustraire les exemples de données en soustrayant les données pouvoir tampon de la liberté et de la biomolécule ligand lié aux expériences.
Remarque : Pour l’expérience de ligand thermolabile, la concentration de ligand initial diminue avec chaque scan. Il est donc idéal pour soustraire le scan de la mémoire tampon 1 de l’analyse de l’échantillon 1 et ainsi de suite. Nous avons trouvé que les scans de tampon avec la cocaïne ne changent pas sensiblement tant que la conversion de ligand produit et un balayage de mémoire tampon unique thermolabile ligand peut donc servir à soustraire toutes les données de liaison ligand thermolabiles. - Convertir les exemples soustraite à la base de données de puissance capacité calorifique.
Remarque : La conversion nécessite de volume spécifique partiel de la biomolécule, qui peut être estimée14,15,16. L’équation de conversion d’énergie capacité calorifique a été décrit précédemment17.
5. analyse
- Dans le monde fit l’équilibration court temps thermolabile capacité calorifique de ligand lié aux dataset avec un ensemble unique de base, la concentration de ligand, pliage et liaison de paramètres, comme décrit plus haut4ligands.
- Répétez que le global s’adapter pour le dataset de temps d’équilibration long afin de calculer la constante de vitesse pour la conversion de ligand thermolabiles comme décrit plus haut4.
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Representative Results
Des données représentatives pour le ligand thermolabile DSC sont indiquées à la Figure 1. La position et la hauteur du pic de ligand lié aux thermolabile successivement se déplace vers le bas vers celui de la biomolécule indépendant comme le ligand thermolabile est épuisé avec chaque scan (Figure 1 a). Le profil de dénaturation libre est utilisé comme référence pour le point de terminaison de la conversion de ligand thermolabile (Figure 1 b). Les données pour MN4 lié à la quinine apparaissent comme témoin négatif pour la conversion de ligand thermolabile (Figure 1 b). Les scans de ligand thermolabile final ont des milieux de transition légèrement plus élevé et les hauteurs des pics par rapport à l’indépendant MN4, indiquant que le produit de conversion de ligand thermolabile (benzoylecgonine) a une affinité faible pour MN4. Les paramètres thermodynamiques résultant d’une analyse globale des ensembles de données à la Figure 1 sont énumérés au tableau 1. Les paramètres de pliage pour MN4 en présence de cocaïne ou de quinine sont identiques au sein de l’erreur, comme prévu puisque diluées petites molécules ne devraient pas perturber la thermodynamique pliante de la biomolécule gratuit. Les paramètres de liaison sont en bon accord avec celles de l’isotherme de titration calorimétrique (ITC)18 et révèlent que la préférence de MN4 pour la quinine sur la cocaïne est entraînée par une enthalpie de liaison plus favorable. Dans la Figure 2, augmentant le délai d’équilibration haute température génère plus prononcé des réductions de la concentration de ligand thermolabile avec chaque scan par rapport au dataset équilibration courte période. En utilisant les paramètres de concentration ajustement global optimisé de deux séries de données, la constante de vitesse pour la conversion de ligand à la température élevée de l’équilibration est calculée à partir de la pente de la droite dans l’encart de la Figure 2 .
Figure 1. Thermolabile ligand DSC. (un) thermogrammes de MN4 (83 µM) liés à la cocaïne (concentration initiale 778 µM). Premiers et derniers scans de MN4 en présence de ligands apparaissent comme des cernes rouges et bleues tandis que les ajustements correspondants sont affichés sous forme de lignes colorées. (b) thermogrammes de MN4 gratuit (83 cercles µM, noir) et balayages successifs liés à la quinine (880 µM, cercles de couleur). Convient pour les ensembles de données libre et lié à la quinine est affichés sous forme de lignes noires et colorées, respectivement. Reproduit de référence4 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Mesurer la constante de vitesse pour la Conversion de Ligand Thermolabile. (a) définit des thermogrammes pour MN4 lié à la cocaïne à court (120 s, rouge foncé) et l’équilibration du long (600 s, bleu foncé) fois à 80 ° C, respectivement. (b) les Concentrations de cocaïne extraite d’une analyse globale des données (un) en fonction du nombre de scan. Points expérimentaux et ajustements exponentiels sont donnés en lignes et cercles colorés respectivement. L’encart montre un ajustement linéaire au 19 EQ. supplémentaire décrite précédemment de Harkness et coll. utilisant les concentrations de cocaïne ajustement global optimisé pour les deux ensembles de données4. La constante de vitesse pour la conversion thermique de ligand à 80 ° C est calculée comme étant la pente de la ligne. L’erreur à la constante de vitesse pour la conversion de ligand thermolabile est administré par ± 2 écarts-types. Reproduit de référence4 avec la permission de la Royal Society of Chemistry. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Ajustement des paramètres | Cocaïne ajouté | Quinine ajoutée |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| un∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| un∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| un∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| un∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| un∆HB2F | -33.7±1.8 | - |
| un∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆CpB2F | -2.2±0.1 | - |
| un∆GB2F | -18.6±0.3 | - |
Tableau 1. Paramètres thermodynamiques extraites de l’analyse globale des données DSC MN4 utilisant des Ligands de Quinine et de la cocaïne. Paramètres ont été calculés à 30 ° C. B1F correspond aux États pliées de cocaïne - ou la quinine-bound et B2F désigne l’état plié benzoylecgonine lié. ΔH et ΔG sont exprimées en kJ/mol, ΔS est exprimée en J/mol/K et ΔCp est exprimée en kJ/mol/K. erreurs ont été calculées selon la variance/co-variance méthode19.
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Discussion
Modifications et dépannage
Les détails de l’analyse du montage global utilisé dans la Figure 1 et Figure 2 ont été décrites précédemment4. Ici, nous exposons les aspects pratiques de la scène et analyse des expériences de liaison DSC avec des ligands thermolabiles. Notez qu’une ligne de base de DSC obtenues pour le ligand thermolabile seul est soustraite de ligand + biomolécule dataset, annulant efficacement la chaleur libérée ou absorbée par la conversion thermique du processus lui-même. L’analyse du montage global standard ligand thermolabile (Figure 1 et Figure 2) suppose que le système est en équilibre thermodynamique tout au long de l’analyse de la température et que la concentration de ligand thermolabile est constante tout au long de chaque thermogramme, diminuant exclusivement pendant la période d’équilibration de haute température. Nous avons déjà montré que cette hypothèse s’applique à la cocaïne-bondissent MN4 et devrait tenir pour n’importe quel système de ligand/biomolécule thermolabile avec une cinétique semblables à ceux-ci.
Il y a, cependant, certaines situations dans lesquelles le système ne peuvent pas être considérés comme étant à l’équilibre thermodynamique ou la concentration de ligand ne peut être considérée constante tout au long d’un seul balayage. Il s’agit de i) quand le ligand thermiquement convertit rapidement par rapport à la vitesse de balayage de température, ii) lorsque la biomolécule subit une agrégation irréversible à haute température, iii) lorsque le taux de pliage/dépliage est lents par rapport à la vitesse de balayage, et iv). le taux d’association/dissociation ligand lent par rapport à la vitesse de balayage. Dans ces cas, le système est sous contrôle cinétique, plutôt que de thermodynamique et strictement impossible d’appliquer l’analyse donné en référence 4. Données peuvent être simulées quantitativement à la suite de la Figure 3, tel que décrit dans le fichier complémentaire 1. En principe, ces calculs cinétique pourraient être utilisés pour ajuster données DSC de non-équilibre, rendement potentiellement les données thermodynamiques et cinétiques, cependant, cette analyse est abordée dans cet article. Au lieu de cela, nous présentons des données représentatives de la DSC simulées afin d’aider le lecteur à identifier des situations hors de l’équilibre.
Un exemple idéal de contrôle thermodynamique est illustré à la Figure 4 ab. Thermogrammes DSC de la biomolécule libre sont superposables (Figure 4 a) et scans avec le ligand thermolabile ne montrent pas d’hystérésis, telle que la température de fusion observée sur le haut-scan correspond à la température de pliage de la précédente (down-scan Figure 4 b). Quand le ligand thermolabile convertit rapidement par rapport à la vitesse de balayage, grandes distorsions apparaissent dans le thermogramme et les équations thermodynamiques ne tiennent pas compte de la forme de pic, tel qu’illustré en Figure 4 c, d. Cela peut être quelque peu atténués en augmentant la vitesse de balayage. Lorsque les agrégats de la biomolécule de façon dépendante de la température, traces de DSC pour le spectacle gratuit biomolécule successifs diminue en amplitude (Figure 4e), tandis que l’addition de ligand thermolabile produit un motif de diminution de rouelibre thermique comme dans le cas idéal, mais à l’échelle de la concentration de biomolécule décroissant (Figure 4f). Quand le pliage/dépliage de cinétique sont lents par rapport à la vitesse de balayage, hystérésis est apparente dans les traces de DSC de la biomolécule libre telle que la température de dénaturation apparent sur le haut-scan est supérieure à la température de renaturation apparent sur le balayage vers le bas ( Figure 4 g). L’addition d’un ligand thermolabile mène au modèle familier décroissant de rouelibre thermique, en particulier pour les haut-scans (Figure 4 h). Enfin, les systèmes avec pliage rapide et liaison lente produisent exempte d’hystérésis des thermogrammes DSC pour la biomolécule libre (Figure 4i), cependant les données avec le ligand thermolabile montrent hystérésis où la température de fusion apparente du up-scan est supérieure à la température apparente pliante du bas-scan précédent (Figure 4j). Néanmoins, le modèle typique de diminuant rouelibre thermique sont apparentes en haut-scans et bas-scans. Comportement non équilibré dans le cas de la lente de pliage ou de lier la cinétique peut être quelque peu allégée en diminuant la vitesse de balayage, bien que cela risque de conversion thermique de ligand non négligeable qui se produisent tout au long de l’analyse. Dans la pratique, la température d’équilibration scan taux et supérieur est réglable manuellement pour obtenir des données ressemblant à la Figure 4 a, b.
Limites de la technique
Notre analyse thermodynamique pour DSC contraignant des expériences avec des ligands thermolabiles exige que le pliage et le processus de liaison sont relativement rapides et que la conversion de ligand thermolabile est lente avant la partie haute température de chaque balayage. Lorsque la durée de vie de l’état plié et/ou lié est supérieure à environ 30 s (koff, ku < 0,03 s-1), hystérésis devient discernable dans les analyses effectuées à 1 ° C min-1. En outre, lorsque la constante de vitesse de conversion de ligand est supérieur à kc = 10-4 s-1 avant la transition de dénaturation, il peut y avoir épuisement significatif du ligand au cours d’un seul balayage. Application de notre analyse est inappropriée lorsque l’agrégation irréversible se produit. Dans ces cas, une modélisation plus avancés pourrait être appliquée aux données. Aucune information d’affinité n’est disponible si la conversion de ligand est si rapide qu’il atteigne achèvement avant la première transition de dénaturation.
Signification en ce qui concerne les méthodes existantes
Notre méthode pour la première fois permet de DSC qui serviront à mesurer la thermodynamique de la liaison de haute affinité ligands thermolabiles. En effectuant une analyse globale et simultanée de tous les scans, les paramètres thermodynamiques sont extraites avec grande précision20. Un autre avantage est que l’ensemble complet de données peuvent être collectées dans aussi peu qu’une expérience si le produit de conversion thermique n’a aucune affinité pour la biomolécule gratuit. En revanche, produit une série de DSC expérimentale typique pour un ligand non-thermolabile requiert ~ 7-10 expériences totales.
Applications futures
Cette approche a des applications directes pour caractériser les inhibiteurs thermolabiles serrés dans les campagnes de découverte de médicaments. Plusieurs composés thérapeutiques tels que les antibiotiques et les benzodiazépines sont connues comme étant thermolabile, subir une hydrolyse rapide à ou près de pH physiologique et des températures de ~ 60-70 ° C11. Cette méthode de DSC est bien placée pour identifier et caractériser les beaucoup d’autres. Ainsi, modification du protocole raccord pour tenir compte des systèmes sous contrôle cinétique, plutôt que de thermodynamique, tel que discuté ci-dessus, a le potentiel d’ouvrir la porte à de nombreux systèmes plus de pertinence biologique.
Étapes critiques au sein du protocole
Une des procédures expérimentales plus importants à considérer est la dialyse ou l’échange de la biomolécule et ligand en solutions de tampon de travail identiques (pas de protocole 1.3 à 1.6). Incompatibilité de tampon entre les ligand et biomolécule solutions peut conduire à gros artefacts dans les scans de base et l’échantillon qui masquent complètement les données pertinentes de pliage. En outre, il est essentiel que la lecture de la puissance se stabilise avant le DSC est sous pression pour qu’il soit contrôlable pendant la pressurisation (étape 2.3 du protocole). Si la lecture de la puissance change par plus de ~ 10 µW pendant la pressurisation, les bulles se sont probablement formés dans les capillaires et peut causer des artefacts de grandes dans les données. Dans ce cas, les solutions doivent être dégazée de manière plus approfondie.
Figure 3. Biomoléculaires pliage, liaison d’un Ligand Thermolabile et agrégation irréversible. Le ligand thermolabile (L) convertit en produit (X) avec un taux constant de kc. X n’a aucune affinité pour la biomolécule. L’État lié (B) des échanges avec le libre biomolécule plié État (F) avec taux constantes koff et ksur. Échanges avec l’état non plié (U) avec taux constantes ku et kfF. U irréversiblement convertit l’état agrégé (A) avec le taux constant de kagg. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Des expériences de Simulation par ordinateur d’équilibre et de contrôle cinétique DSC en Absence et en présence d’un Ligand Thermolabile. (un) équilibre biomoléculaire pliage. (b) équilibre pliage, liaison du ligand thermolabile et conversion lente ligand thermolabile. (c) équilibre biomoléculaire pliant. (d) équilibre pliage, liaison du ligand thermolabile et conversion rapide thermolabile ligand. (e) équilibre biomoléculaire pliage et lente agrégation irréversible. (f) équilibre pliage, reliure, ralentir la conversion de ligand thermolabile et lente agrégation irréversible. (g), Slow biomoléculaire pliant. pliage (h), Slow, attache d’équilibre et la conversion lente ligand thermolabile. (j’ai) équilibre biomoléculaire pliant. pliage (j), équilibre, liaison du ligand thermolabile lent et conversion lente ligand thermolabile. Dans tous les panneaux, les premiers et derniers scans simulés sont foncé rouge et bleu foncé, respectivement. Les panneaux qui indiquent seulement lumière et l’obscurité des thermogrammes bleus indiquent que tous les scans simulés de superposition, et seulement les deux derniers sont visibles dans l’intrigue. Expériences de DSC ont été simulés avec 20 scans (10 fonte et 10 recuit) au taux de balayage de-1 de min 1 ° C, avec une plage de température de 0 à 80 ° C. Certains panneaux d’affichage plus étroites plages de température pour permettre la meilleure visualisation de l’évolution de la simulation. Les concentrations biomolécule et ligand dans les simulations ont été de 200 µM et 10 mM, respectivement. Chaque expérience a été simulé avec un temps d’équilibrage 600 s à 0 ° C avant de les numériser et un temps d’équilibrage s 60 entre toutes les analyses ultérieures. Paramètres d’Arrhénius pour équilibre contraignant et pliage étaient unesur = 5 x 10-1 M-1 s-1, unoff = s19 1 x 10-1, Eunsur =-20 kJ mol-1, Eun off = 120 kJ mol-1, unpli = 1 x 10-14 s-1, unse déroulent = 5 x 1018, Eunpli =-80 kJ mol-1et Eundéplier = 120 kJ mol-1 . Paramètres d’Arrhénius pour contrôle cinétique contraignant et le pliage étaient unesur = 5 x 10-3 M-1 s-1, unoff = s16 1 x 10-1, Eunsur =-20 kJ mol-1, E un off = 120 kJ mol-1, unpli = 1 x 10-16 s-1, unse déroulent = 5 x 1016, Eunpli =-80 kJ mol-1et Eundéplier = 120 kJ mol-1 . Paramètres d’Arrhénius pour conversion de ligand thermolabile lents et rapides ont été unelente = 7.509 x 1010 s-1, Eunlent = 94.65 kJ mol-1et unrapide = 1 s-1, Eun rapide = 10 kJ mol-1. Paramètres d’Arrhénius pour lente agrégation irréversible ont été uneagg. = 5 × 10-7 s-1 et Euneagg. = 80 kJ mol-1. Capacités calorifiques en excès ont été calculées avec ΔHUF (déroulement), ΔHBF (liaison) et ΔHAF (agrégation) = 200, -140 et 50 kJ mol-1, respectivement. La description théorique de l’ASN contrôle cinétique des expériences avec des ligands thermolabiles et script pour effectuer ces simulations (et les paramètres nécessaires) sont disponibles dans supplémentaire 1 fichier. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt.
Acknowledgments
R. W. H. V était soutenue par les Sciences naturelles de McGill et le programme de formation de génie conseil recherche du Canada (CRSNG) en Bionanomachines. A. K. M. et P. E. J. appuyés par des subventions du CRSNG 327028-09 (A. K. M) et 238562 (E. J.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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