Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner

Published: November 21, 2017 doi: 10.3791/55959
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, McGill University, 2Department of Chemistry, York University

Summary

Vi præsenterer en protokol for hurtig karakterisering af Biomolekylær foldning og bindende interaktioner med termolabile ligander bruger differential scanning kalorimetri.

Abstract

Differential scanning kalorimetri (DSC) er en kraftfuld teknik til kvantificering af termodynamiske parametre vedrørende Biomolekylær foldning og bindende interaktioner. Disse oplysninger er afgørende i udformningen af nye lægemiddelsammensætninger. Men mange farmaceutisk relevant ligander er kemisk ustabile ved høje temperaturer bruges i DSC analyser. Således måler bindende interaktioner udfordrende fordi koncentrationerne af ligander og termisk konverteret produkter er under konstant forandring inden for cellen NA48. Vi præsenterer her, en protokol, benytter termolabile ligander og DSC for hurtigt at opnå termodynamisk og kinetisk oplysninger på folde, bindende og ligand konverteringsprocesser. Vi har anvendt vores metode til DNA aptamer MN4, der binder termolabile ligand kokain. Ved hjælp af en ny global montering analyse, der tegner sig for termolabile ligand konvertering, det komplette sæt af foldning og bindingsparametrene er fremstillet af et par af DSC eksperimenter. Derudover viser vi, at konstanten for termolabile ligand konvertering kan opnås med kun ét supplerende DSC datasæt. Retningslinjer for at identificere og analysere data fra flere mere komplicerede scenarier præsenteres, herunder irreversibel sammenlægning af den biomolekyle, langsom folde, langsom bindende og hurtig nedbrydning af den termolabile ligand.

Introduction

Differential scanning kalorimetri (DSC) er en kraftfuld metode til quantitating Biomolekylær bindende og folde interaktioner1,2,3. Styrkerne ved DSC omfatter dens evne til at belyse bindende og folde mekanismer og udbytte de tilsvarende termodynamiske parametre2,3. Derudover DSC kan udføres i løsningen nær fysiologiske betingelser og kræver ikke mærkning af biomolekyle eller ligand, fxmed fluorophores, spin-etiketter eller nukleare isotoper4. Instrumentet scanner i temperatur, måle mængden af varme, der kræves til at denaturere biomolekyle i tilstedeværelse og fravær af ligand. De resulterende thermograms bruges til at udtrække de termodynamiske parametre vedrørende ligand bindende og folde processer. Oplysninger fra DSC eller andre termodynamiske teknikker er kritisk at vejlede design af narkotika målretning biomolekyler1,5,6,7,8. Men den gentagne scanning til høje temperaturer (~ 60-100 ° C) kan være problematisk. For eksempel, mange farmaceutisk vigtige forbindelser undergår omlægning eller nedbrydning ved vedvarende udsættelse for høje temperaturer9,10,11, dvs., de er termolabile. Undersøgelse af bindende interaktioner ved DSC typisk kræver flere frem og bak scanninger for at kontrollere Termogram for termodynamiske analyser12reproducerbarhed. Termisk konvertering af en indledende ligand til en sekundær form med ændrede bindende egenskaber fører til udtalte forskelle i formen og placeringen af successive thermograms, da koncentrationen af den oprindelige ligand falder med hver scanning mens den termisk konvertering produkter ophobes. Disse datasæt er ikke indstillet til traditionelle analyser.

Vi har for nylig udviklet en global montering metode for termolabile ligand DSC datasæt, der giver det komplette sæt af termodynamiske parametre vedrørende Biomolekylær foldning og bindende interaktioner fra en enkelt ligand-bundet eksperiment refereres til den nødvendige Termogram for gratis biomolekyle4. Analysen reducerer den eksperimentelle tid og prøve kræves af ~ 10-fold sammenlignet med standard DSC tilgange. Vi har tegnede sig for ligand termisk konvertering ved at påtage sig dette sker under høj temperatur-delen af hver scanning hvor Termogram ikke afhænger ligand koncentration. Ligand koncentrationen er derfor en konstant inden for del af den Termogram, som bruges til at udtrække termodynamiske parametre. Vi viste desuden, hvordan konstanten for ligand termisk konvertering kan opnås ved at udføre en supplerende eksperiment med høj temperatur ækvilibrering længere. For systemer hvor ligand termisk konvertering er mindre temperatur-afhængige (dvs.forekommer mærkbart ved alle temperaturer), analysen kan ændres til at omfatte variable ligand koncentrationer. Her vi demonstrere denne procedure for DNA aptamer MN4 i nærværelse af den termolabile ligand kokain, der hurtigt konverterer til benzoylecgonine ved høje temperaturer (> 60 ° C). Kinin er brugt som en negativ kontrol for ligand thermolability da det ikke undergår konvertering ved disse eksperimenterende temperaturer og også binder sig til MN4. Vi beskriver erhvervelse af termolabile ligand DSC datasæt og deres analyse giver termodynamisk og kinetisk parametre af folde, bindende og ligand konverteringsprocesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Prøvetilberedning

  1. Rense ønskede biomolekyle13.
    Bemærk: Denne protokol bruger købte kokain-bindende DNA aptamer MN4 efter at have udvekslet mod 2 M NaCl tre gange efterfulgt af tre runder af deioniseret vand ved hjælp af en centrifugal filter med en 3 kDa molekylvægt cut-off membran.
  2. Syntetisere og rense, eller købe den ønskede termolabile ligand13.
    Bemærk: MN4 binder termolabile ligand kokain. MN4 binder også kinin, der bruges som en negativ kontrol for ligand thermolability ved disse eksperimenterende temperaturer.
  3. Forberede buffere for dialyse af de oprensede biomolekyle og opløsning af ligander (20 mM natrium fosfat og 140 mM NaCl buffer, pH 7,4, for MN4 og ligander bruges her).
  4. Dialyze biomolekyle mod mindst 2 L buffer ved hjælp af dialyse slanger med 0,5 - 1,0 kDa cut-off.
  5. Filtrere den endelige buffer (benævnt arbejder buffer) gennem en 0,2 µm filter, der har været grundigt ekvilibreres med buffer.
  6. Afvejes ønskede masserne af ligander og opløse dem i filtreret arbejder buffer. Hvis den ønskede ligand koncentration kræver masserne, der er for små til at præcist veje, gøre en koncentreret ligand stamopløsning (10 x for eksempel).
    Bemærk: Det er afgørende, at alle DSC eksperimenter udnytte den samme arbejdsgruppe buffer for prøven og ligand, dvs, aldrig udføre et eksperiment, hvor liganden er opløst i en anden batch af arbejde buffer end biomolekyle som dette vil forårsage buffer mismatch artefakter i dataene.
  7. Biomolekyle stock Opløsningen filtreres gennem et 0,2 µm filter, der har været grundigt ekvilibreres med arbejdende buffer.
  8. Bestemme biomolekyle koncentration af absorbans målinger (260 nm for nukleinsyrer som MN4 og 280 nm for proteiner).
  9. Opbevar rede biomolekyle og ligand i 4 ° C køleskab (velegnet til MN4 og ligander bruges her), eller ved -20 eller-80 ° C Hvis biomolekyle og ligander tåle frysning og langsigtet lagring er påkrævet. Degas buffer, biomolekyle og ligand løsningerne i en bordplade degasser (Se Tabel af materialer) før pålæsningen i DSC.
    Bemærk: Afgasning hjælper med at forhindre boble dannelse i DSC ved højere temperaturer. Bobler forårsage signal artefakter, obskure DSC peak figurer og basislinjer.

2. DSC forberedelse

  1. Skru Tryk håndtaget fra DSC (Se Tabel af materialer).
  2. Køre silicium slangen fra arbejde buffer og tillægger den forreste flange (metal åbning) af reference kapillær.
  3. Oprette en bro mellem reference- og prøveopløsningerne kapillærerne ved at forbinde den bageste reference flange til front prøve flange.
  4. Tillægge den bageste prøve flange, der kører til en affald kolbe med en vakuum linje knyttet et stykke silicium slanger.
  5. Drej på linjen vakuum til at skylle DSC med 200 mL af arbejdende buffer.
  6. Indlæse reference kapillær af DSC med arbejdende buffer. Vedhæfte ca 3-5 cm sektioner af silicium slangen til reference kapillær flanger.
  7. Indsætte en 1 mL pipette spids i den bageste flange silikone slanger. Tegne 0,8 mL arbejder buffer med en pipette og indsætte pipette tip med buffer i front reference flange silikone slanger.
  8. Tryk forsigtigt pipette stemplet ned til pass arbejder buffer gennem den forreste silikone slanger i reference kapillær og op til den bageste flange knyttet pipette tip. Tryk ned pipette stemplet indtil buffer arbejdsniveau når lige over den forreste silikone slanger, slip derefter pipette stemplet indtil buffer arbejdsniveau når lige over den bageste silikone slanger.
    1. Gentag passerer arbejder buffer frem og tilbage for at udluftet volumen i reference kapillær af bobler.
      Bemærk: Normalt 10 gennemkørsler af løsning frem og tilbage er tilstrækkelige til at fjerne eventuelle bobler.
  9. Cap de bageste pipette tip med tommelfingeren og træk forsigtigt på den bageste pipette tip og front pipette til at fjerne dem fra reference flanger med silicium slangen knyttet.
  10. Læg prøven kapillær med arbejdende buffer som i trin 2.6-2.9. Placer en sort plastik hætte på den bageste reference og prøve flanger, forlader de forreste flanger afdækket.
  11. Lægger Tryk håndtaget.
  12. Åbn DSC-softwaren (Se Tabel af materialer) og presse instrumentet ved at klikke på røde pil øverst i grænsefladen op, når power læsning har stabiliseret; DSC magt er angivet i en boks øverst højre hjørne af grænsefladen instrument temperatur og trykmåling.
    Bemærk: Monitoren magt læsning som DSC pressurizes. Ændringer i kraft af mere end ~ 10 µW angive boble dannelse i kapillærer, som kan forårsage artefakter i dataene. Løsningerne skal være fjernet og afgasses yderligere før du fortsætter.
  13. Reagensglasset DSC med arbejdende buffer ved at udføre en forward og reverse scanning. I fanen "Eksperimentelle metode" i venstre side af skærmen sikre, at indstillingen "Scanning" er valgt at køre DSC i temperatur scannetilstand.
    Bemærk: Eksperimenterende parametre er temperaturen scanning rækkevidde, scan rate, lav og høj temperatur ekvilibreringstid og antal scanninger.
    1. Klik på knappen til "Varme" indsatser "Temperatur parametre" under fanen "Eksperimentelle metode". Indtast 1 og 100 ° C for de nedre og øvre eksperimentelle temperaturer, 1 ° C/min. til søgehastigheden og 60 s for perioden ækvilibrering.
    2. Klik på knappen "Tilføj serie" under input feltet for perioden ækvilibrering. Angiv 2 i feltet "Trin for at tilføje" i pop-up-vinduet (for en varme og en kølende scanning) og markere feltet "alternativ opvarmning/køling". Klik på "OK"; de ekstra scanninger vises i den nederste del af grænsefladen. Kontroller, at parametrene for hver scanning er som ønsket.
    3. Begynde eksperimentet ved at klikke på den grønne "play" knappen øverst på grænsefladen. Navigere til den ønskede mappe og angive et filnavn for at gemme eksperimentet i pop-up-vinduet. Se eksperiment fremskridt ved at klikke på fanen "Data" til højre for fanen "Eksperimentere metode".

3. indsamling termolabile Ligand DSC datasæt

Bemærk: Minimal proceduren består af fem eksperimenter: buffer reference eksperimenter med og uden ligand (anvendes til baseline subtraktion, se diskussion), prøve eksperimenter med den gratis biomolekyle, ligand-bundet biomolekyle, og den ligand-bundet biomolekyle med høj temperatur ækvilibrering længere.

  1. Køre reference eksperimenter til baseline subtraktion af eksempeldataene. Genindlæse DSC med arbejdende buffer i begge kapillærer og indsamle flere frem og bak scanninger over en passende temperaturinterval på 1 ° C min-1 med en øvre (høj temperatur) ekvilibreringstid 120 s.
    1. Slette de forrige buffer ækvilibrering scanninger fra den nederste del af grænsefladen ved at fremhæve hvert individuelt og klikke på det røde X til midten lige af grænsefladen. Tilføje nye scanninger ved at klikke på knappen "Tilføj serie", indtastning 20 i feltet for "Trin til at tilføje" og kontrol boksen "alternativ opvarmning/køling". Klik på OK og køre eksperimentet ved at klikke på den grønne play-knappen som ovenfor.
    2. Gentag trin 3.1 - 3.1.1 med arbejdende buffer der indeholder den ønskede koncentration af ligand i begge kapillærer at opnå referencen eksperimenter for liganden (indsamle to separate eksperimenter ved hjælp af 120 s og 600 s høj temperatur ækvilibrering gange henholdsvis, der skal bruges i erhverve konstanten for termolabile ligand konvertering).
      Bemærk: Søgehastigheden bruges her sikrer at biomolekyle i senere eksperimenter er ved termisk ligevægt i frem og bak scanninger (Se diskussion). Scan satser < 0,1-0,2 ° C min-1 føre til støjende thermograms og finder ikke anvendelse på DSC eksperimenter. Temperaturen bør udvide fra langt under smeltepunktet af den gratis biomolekyle til et godt stykke over smeltepunktet af ligand-mættet biomolekyle (~ 20-80 ° C for MN4). Kontrollere reproducerbarhed af scanninger (for eksempel, 10 frem og 10 omvendt scanninger for 20 samlede er tilstrækkeligt).
    3. Hvis du bruger flere ligander (som kokain og kinin), skyl DSC med 200 mL af arbejdende buffer (Gentag fra trin 2,5) mellem kørsler for at fjerne ligand fra kapillærerne og forhindre krydskontaminering.
      Bemærk: Det er nyttigt at udføre en Repliker eksperiment på den frie biomolekyle efter en ligand-bundet køre for at kontrollere, om den tidligere ligand binder stærkt til de kapillar vægge og fjernes ikke tilstrækkeligt med buffer skylning. Hvis thermograms for den gratis biomolekyle synes at være flyttet til et større omfang og højere denaturering temperatur efter ligand-bundet eksperimentere, er det sandsynligt, at den tidligere ligand er stadig til stede i NA48 efter skylning. Fjerne den adsorberede ligand ved at inkubere kapillærer med 20% Contrad-70 for 1 h ved 60 ° C med plastik hætte og tryk håndtaget ned. I DSC-software, ændre eksperimenterende mode til "Isotermisk" under den eksperimentelle metode tab. Vælg 3.600 s for varighed og 60 ° C for isotermisk temperaturen med nul henførsel af ekvilibreringstid. Klik på "Tilføj til Eksperimentel metode". Isotermisk eksperimentet vises i den nederste del af skærmen. Efter færdiggørelsen, skylle instrument med 2 L deioniseret vand og Gentag fra trin 2,5.
  2. Kør prøven eksperimenter ved hjælp af den samme DSC lastning procedure og eksperimenterende parametre som reference scanner. Datasæt gratis biomolekyle sikre, reference kapillær indeholder arbejder buffer, mens prøve kapillær indeholder den gratis biomolekyle på den ønskede koncentration i orden buffer.
    1. Ligand-bundet eksperimenter, og sørge for at liganden er i orden-buffer i reference kapillær, biomolekyle plus ligand er i orden buffer i stikprøven kapillær. Skylle systemet mellem tilføjelser af forskellige ligander som i trin 2,5.
  3. Udføre en yderligere eksperiment med biomolekyle bundet til den termolabile ligand hvor høj temperatur ækvilibrering periode øges til 600 s og alle andre eksperimentelle parametre er de samme som trin 3.2.1.
    Bemærk: Varigheden af høj temperatur ækvilibrering periode til den anden ligand-bundet eksperiment er simpelthen valgt at sikre, at liganden hurtigere forarmet end korte ækvilibrering tid eksperiment. Hvis ligand-bundet toppene fra først eksperiment henfald langsomt som en funktion af scan nummer (f.eks.forskelle i successive peak maxima er ≤ 0,5 ° C), anslår 10 til 20 gange stigninger i den høje temperatur ækvilibrering periode for at tilstrækkeligt nedbryder liganden under det andet eksperiment. Nøjagtig beregning af konstanten for ligand konvertering kræver, at det andet eksperiment har hurtigere nedbrydning af ligand i forhold til først. Ligand koncentrationer udvundet fra en global analyse af de to eksperimenter vil være tilsvarende og derfor ubrugelig, hvis ligand nedbrydningen ikke er tilstrækkeligt fremskyndet i det andet forsøg.

4. databehandling

  1. Åbn DSC eksperimentere filer i DSC data analyse software (Se Tabel af materialer) og eksportere rå magt data som regneark.
  2. Import regneark med rå magt dataene til software til data montering.
  3. Baseline trække eksempeldataene ved at fratrække den buffer magt data fra den frie og ligand-bundet biomolekyle eksperimenter.
    Bemærk: For eksperimentet termolabile ligand koncentration af indledende ligand er faldende med hver scanning. Derfor er det ideelt at subtrahere buffer scan 1 fra prøven scan 1, og så videre. Vi har fundet, at buffer scanninger med kokain ikke ændre mærkbart som ligand konvertering indtægt og derfor et enkelt termolabile ligand buffer scanning kan bruges til at trække alle termolabile ligand-bundet data.
  4. Konvertere baseline-trækkes magt eksempeldataene til varmekapacitet.
    Bemærk: Konvertering kræver den biomolekyle delvis bestemt volumen, som kan være anslået14,15,16. Ligningen for konvertering magt til varme kapacitet er blevet beskrevet tidligere17.

5. dataanalyse

  1. Globalt passe kort ækvilibrering tid termolabile ligand-bundne varme kapacitet datasæt med et enkelt sæt af baseline, ligand koncentration, folde og ligand bindende parametre som tidligere beskrevet4.
  2. Gentag den globale egnet til lang ækvilibrering tid datasæt for at beregne konstanten for termolabile ligand konvertering som tidligere beskrevet4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative data for termolabile ligand DSC er vist i figur 1. Position og højden af den termolabile ligand-bundet peak skifter successivt mod dette af den ubundne biomolekyle som den termolabile ligand er udtømt med hver scanning (figur 1a). Gratis denaturering profil bruges som en reference til slutpunktet for termolabile ligand konvertering (figur 1b). Data for MN4 bundet til kinin er vist som en negativ kontrol for termolabile ligand konvertering (figur 1b). De endelige termolabile ligand scanninger har lidt højere overgang midtpunkter og tophøjder i forhold til den ubundne MN4, med angivelse af produktets termolabile ligand konvertering (benzoylecgonine) har en svag affinitet for MN4. De termodynamiske parametre som følge af global analyse af datasæt i figur 1 er angivet i tabel 1. Folde parametrene for MN4 kokain eller kinin er identiske inden for fejl, som forventet, da fortyndet små molekyler ikke forventes at forurolige folde termodynamik i den gratis biomolekyle. Bindende parametre i god aftale med dem fra isotermisk titrering kalorimetri (ITC)18 og afsløre, at MN4's præference for kinin over kokain er drevet af en mere gunstig bindende enthalpi. I figur 2udbytter stigende høje temperatur ækvilibrering periode mere udtalt reduktioner af den termolabile ligand koncentration med hver scanning i forhold til den korte ækvilibrering periode datasæt. Hjælp af parametrene optimeret globale fit koncentration fra de to datasæt, konstanten for ligand konvertering ved høj ækvilibrering temperatur er beregnet ud fra hældningen af linjen i figur 2 indsatser.

Figure 1
Figur 1. Termolabile ligand DSC. (en) Thermograms af MN4 (83 µM) bundet til kokain (begyndelseskoncentration 778 µM). Første og sidste scanninger af MN4 i nærværelse af ligand vises som mørke røde og blå cirkler, mens de tilsvarende passer vises som farvede linjer. (b) Thermograms af gratis MN4 (83 µM, sorte cirkler) og efterfølgende scanninger bundet til kinin (880 µM, farvede cirkler). Passer til den gratis og kinin-bundet datasæt vises som sorte og farvede linjer, henholdsvis. Gengivet fra reference4 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Måling konstanten for termolabile Ligand konvertering. (en) sæt af thermograms for MN4 bundet til kokain med kort (120 s, mørk rød) og lange (600 s, mørkeblå) ækvilibrering gange ved 80 ° C, henholdsvis. (b) koncentrationer af kokain udvindes fra global analyse af datasæt i (et) som en funktion af scan nummer. Eksperimentelle point og eksponentiel passer er vist som farvede cirkler og linjer henholdsvis. Indsatsen viser en lineær pasform til de tidligere beskrevne supplerende Eq. 19 fra Harkness et al. ved hjælp af optimeret globale fit kokain koncentrationer for to datasæt4. Konstanten for ligand termisk konvertering ved 80 ° C beregnes som hældningen af linjen. Fejlen nemlig konstanten for termolabile ligand konvertering er givet som ± to standardafvigelser. Gengivet fra reference4 med tilladelse fra Royal Society of Chemistry. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Fit parametre Kokain tilføjet Kinin tilføjet
∆HUF 271.3±1.8 272.5±4.0
∆SUF 824.4±5.1 827.9±10.9
en∆GUF 21.6±0.2 21.6±0.9
en∆HansensB1F -75.2±1.6 -101.0±4.0
en∆SB1F -154.2±5.0 -213.7±12.0
∆CpB1F -1.5±0.1 -1.2±0.1
en∆GB1F -28.5±0.2 -36.2±0.7
en∆HansensB2F -33.7±1.8 -
en∆SB2F -49.9±5.2 -
∆CpB2F -2.2±0.1 -
en∆GB2F -18.6±0.3 -

Tabel 1. Termodynamiske parametre udvundet fra Global analyse af MN4 DSC datasæt ved hjælp af kokain og kinin ligander. Parametre blev beregnet ved 30 ° C. B1F henviser til kokain - eller kinin-bundet foldede stater og B2F henviser til benzoylecgonine-bundet foldet tilstand. ΔH og ΔG er udtrykt i kJ/mol, ΔS er udtrykt i J/mol/K og ΔCp er udtrykt i kJ/mol/K. fejl blev beregnet efter varians/co-variance metode19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ændringer og fejlfinding

Oplysninger om den globale montering analyse anvendes i figur 1 og figur 2 er blevet beskrevet tidligere4. Her redegør vi praktiske aspekter af udføre og analysere DSC bindende eksperimenter med termolabile ligander. Bemærk at en DSC baseline opnået for den termolabile ligand alene trækkes fra liganden + biomolekyle datasæt, effektivt aflyser ud den varme frigivet eller absorberet af den termiske konvertering processen selv. Standard termolabile ligand globale montering analyse (figur 1 og figur 2) antages det, at systemet er ved termodynamisk ligevægt i hele temperatur scanningen, og at den termolabile ligand koncentration konstant hele hver Termogram, faldende udelukkende under høj temperatur ækvilibrering periode. Vi har tidligere vist, at denne antagelse gælder for kokain-bundet MN4 og forventes at holde til ethvert termolabile ligand/biomolekyle system med kinetik svarende til disse.

Der er dog nogle situationer, som systemet ikke kan antages for at være ved termodynamisk ligevægt og/eller koncentration af ligand kan ikke anses for konstant gennem hele en enkelt scanning. Disse omfatter i) når liganden termisk konverterer hurtigt i forhold til søgehastighed temperatur ii) når biomolekyle gennemgår irreversibel sammenlægning ved høj temperatur, iii) når de folde udfoldning satser er langsom sammenlignet med scan rate, og iv). Når ligand association/dissociation satser er langsom i forhold til søgehastigheden. I disse tilfælde, at systemet er under kinetic snarere end termodynamiske kontrol og den analyse, der er givet i reference 4 kan ikke strengt. Data kan simuleres kvantitativt efter figur 3, som beskrevet i den supplerende fil 1. I princippet, kunne disse kinetik-baserede beregninger bruges til at passe ikke-ligevægt DSC data, potentielt giver både kinetisk og termodynamiske data, men denne analyse er uden for denne hvidbogs anvendelsesområde. I stedet præsenterer vi nogle repræsentative simulerede DSC data for at hjælpe læseren med at identificere ikke-ligevægt situationer.

Et ideelt eksempel på termodynamiske kontrol er vist i figur 4ab. DSC thermograms af den gratis biomolekyle er superimposable (figur 4a) og scanninger med den termolabile ligand viser ikke hysterese, sådan at den smeltende temperatur iagttages på up-scan kampe folde temperaturen i den tidligere ned-scan ( Figur 4b). Når den termolabile ligand konverterer hurtigt i forhold til søgehastighed, store forvridninger vises i Termogram og termodynamiske ligninger skal ikke redegøre for figuren peak, som vist i figur 4 c, d. Dette kan afhjælpes lidt ved at øge søgehastigheden. Når biomolekyle aggregater i en temperatur-afhængige måde, DSC spor for gratis biomolekyle Vis successive falder i størrelsesorden (figur 4e), mens tilføjelse af producerer den termolabile ligand et mønster af faldende termisk upshifts svarende til den ideelle sag, men skaleret af faldende biomolekyle koncentrationen (figur 4f). Når foldning/udfoldning kinetik er langsom sammenlignet med søgehastighed, hysterese fremgår i DSC spor af den gratis biomolekyle således, at den tilsyneladende denaturering temperatur på up-scanning er højere end den tilsyneladende genopretning temperatur på ned-scan ( Figur 4 g). Tilføjelse af en termolabile ligand fører til de velkendte mønster af faldende termisk upshifts, især for op-scanninger (figur 4 h). Endelig, systemer med hurtige foldning og langsom bindende producere hysterese-fri DSC thermograms for den gratis biomolekyle (figur 4i), men data med den termolabile ligand Vis hysterese hvor den tilsyneladende smeltepunktet af up-scanningen er højere end den tidligere ned-scanning (figur 4j) tilsyneladende folde temperatur. Ikke desto mindre det typiske mønster af faldende termisk upshifts er synlige i både op-scanninger og down-scanninger. Ikke-ligevægt adfærd for langsom folde eller bindende kinetik kan afhjælpes lidt ved at nedsætte søgehastigheden, selvom dette løber risikoen for ikke-ubetydelig ligand termisk konvertering forekommer i hele scanningen. I praksis, kan scan rate og øverste ækvilibrering temperaturen justeres manuelt for at opnå data der ligner figur 4a, b.

Begrænsninger af teknikken

Vores termodynamiske analyse for DSC bindende eksperimenter med termolabile ligander kræver, at folde og bindende processer er relativt hurtige og at termolabile ligand konvertering er langsom før den høje temperatur del af hver scanning. Når tilstanden foldede og/eller bundne levetid er større end ca 30 s (koff, ku < 0,03 s-1), hysterese bliver mærkbar i scanninger udføres på 1 ° C min-1. Derudover når ligand konvertering hastighed konstant er over ca kc = 10-4 s-1 før denaturering overgangen, kan der være betydelig udtynding af liganden i løbet af en enkelt scanning. Anvendelsen af vores analyse er også upassende, når irreversibel sammenlægning opstår. I disse tilfælde, kunne mere avanceret modellering anvendes på dataene. Der foreligger ingen affinitet oplysninger hvis ligand konvertering er så hurtig, at den når afsluttet før den første denaturering overgangen.

Betydning med hensyn til eksisterende metoder

Vores metode for første gang tillader DSC skal bruges til at måle den bindende termodynamik af høj affinitet, termolabile ligander. Ved at udføre en global simultan analyse af alle scanninger, ekstraheres termodynamiske parametre med høj nøjagtighed20. En ekstra fordel er, at det fulde datasæt kan afhentes i så lidt som et eksperiment, hvis produktets termisk konvertering har ingen affinitet til den gratis biomolekyle. I modsætning hertil fremstiller en typisk eksperimentel DSC-serien til en ikke-termolabile ligand kræver ~ 7-10 samlede eksperimenter.

Fremtidige ansøgninger

Denne tilgang har direkte ansøgninger til kendetegner stramme, termolabile hæmmere i drug discovery kampagner. Flere terapeutiske stoffer som antibiotika og benzodiazepiner er kendt for at være termolabile, undergår hurtig hydrolyse på eller i nærheden af fysiologisk pH og temperaturer på ~ 60-70 ° C11. Denne DSC metode er godt positioneret til at identificere og karakterisere mange flere. Samt har ændring af montering protokollen for at tage højde for systemer under kinetic snarere end termodynamiske kontrol, som beskrevet ovenfor, potentiale til at åbne døren for mange flere systemer af biologisk relevans.

Kritiske trin i protokollen

En af de vigtigste eksperimentelle procedurer at overveje er dialyse eller udveksling af biomolekyle og ligand i ens arbejde buffer løsninger (protokol trin 1.3-1.6). Buffer uoverensstemmelse mellem ligand og biomolekyle løsninger kan føre til store artefakter i baseline og prøve scanninger, der helt skjule den relevante folde data. Derudover er det vigtigt, at magt læsning stabiliserer før DSC er tryk således at den kan overvåges under opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet (protokol trin 2.3). Hvis magt læsning ændringer af mere end ~ 10 µW under opretholdelse tryk i hovedbrandledningssystemet, bobler har sandsynligvis dannet i kapillærer og kan forårsage store artefakter i dataene. I dette tilfælde skal løsningerne være afgasses mere grundigt.

Figure 3
Figur 3. Biomolekylær foldning, Binding til en termolabile Ligand og irreversibel Aggregation. Den termolabile ligand (L) konverterer til produktet (X) med en hastighed konstant kc. X har ingen affinitet for biomolekyle. Den bundne tilstand (B) af biomolekyle udvekslinger med de gratis foldet tilstand (F) med sats konstanter kud og kpå. F udveksling med udfoldet stand (U) med sats konstanter ku og kf. U konverterer uigenkaldeligt til den aggregerede tilstand (A) med hastighed konstant kagg. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Computersimulering af ligevægt og kinetisk kontrolleret DSC eksperimenter i fravær og tilstedeværelsen af en termolabile Ligand. (en) ligevægt Biomolekylær foldning. (b) ligevægt foldning, termolabile ligand bindende og langsom termolabile ligand konvertering. (c) ligevægt Biomolekylær foldning. (d) ligevægt foldning, termolabile ligand bindende, og hurtigt termolabile ligand konvertering. (e) ligevægt Biomolekylær foldning og langsom irreversibel sammenlægning. (f) ligevægt foldning, bindende, langsom termolabile ligand konvertering og langsom irreversibel sammenlægning. (g) Slow Biomolekylær foldning. (h) Slow folde, ligevægt bindende og langsom termolabile ligand konvertering. (jeg) ligevægt Biomolekylær foldning. (j) ligevægt folde, langsomme termolabile ligand bindende og langsom termolabile ligand konvertering. I alle paneler er de første og sidste simulerede scanninger mørke rød og mørk blå, henholdsvis. Paneler, der viser kun lys og mørk blå thermograms viser, at alle simulerede scanninger overlay, og kun de sidste to er synlige i plottet. DSC eksperimenter blev simuleret med 20 scanninger (10 smeltning og 10 udglødning) på 1 ° C min-1 scan rate, med et temperaturområde på 0-80 ° C. Visse paneler vises smallere temperaturområder for at tillade bedre visualisering af simulation tendenser. Biomolekyle og ligand koncentrationerne i simuleringerne var 200 µM og 10 mM, henholdsvis. Hvert forsøg blev simuleret med en 600 s ækvilibrering tid ved 0 ° C før scanning og en 60 s ekvilibreringstid mellem hver af de efterfølgende scanninger. Arrhenius parametre for ligevægt bindende og folde var enpå = 5 x 10-1 M-1 s-1, enoff = 1 x 1019 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1, Een off = 120 kJ mol-1, enfold = 1 x 10-14 s-1, enfold = 5 x 1018, Eenfold =-80 kJ mol-1, og Eenudfolde = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametre for kinetically kontrolleret bindende og folde var enpå = 5 x 10-3 M-1 s-1, enoff = 1 x 1016 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1, E en off = 120 kJ mol-1, enfold = 1 x 10-16 s-1, enfold = 5 x 1016, Eenfold =-80 kJ mol-1, og Eenudfolde = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametre for langsomme og hurtige termolabile ligand konvertering var enlangsom = 7.509 x 1010 s-1, Eenlangsom = 94.65 kJ mol-1, og enhurtig = 1 s-1, Een hurtig = 10 kJ mol-1. Arrhenius parametre for langsom irreversibel sammenlægning blev enagg. = 5 x 107 s-1 og Eenagg. = 80 kJ mol-1. Overskydende varme kapacitet blev beregnet med ΔHUF (udfoldning), ΔHBF (bindende) og ΔHAF (sammenlægning) = 200,-140 og 50 kJ mol-1, henholdsvis. En teoretisk beskrivelse af kinetically kontrolleret DSC eksperimenter med termolabile ligander og script til at udføre disse simuleringer (og de nødvendige parametre) er tilgængelige i supplerende fil 1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

R. W. H. V blev støttet af McGill naturvidenskab og teknisk forskning Rådet i Canada (NSERC) uddannelsesprogram i Bionanomachines. A. K. M. og P. E. J. blev støttet af NSERC tilskud 327028-09 (A. K. M) og 238562 (P. E. J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Chem Impex #00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71502
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9763
Deioinized water for molecular biology Millipore H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters VWR CA28145-477
3 kDa centrifugal filters Millipore UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff Spectrum Laboratories 131048
Silicon tubing VWR 89068-474
Plastic DSC flange caps TA Instruments 6111
DNA aptamer MN4 Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine Sigma Aldrich C008
Quinine Sigma Aldrich 22620
NanoDSC-III microcalorimeter TA Instruments http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70 VWR 89233-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
  2. Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
  3. Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
  4. Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
  5. Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
  6. Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
  7. Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  8. Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
  9. Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
  10. Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
  11. Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
  12. Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  13. Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  14. Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
  15. Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
  16. Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
  17. Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
  18. Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
  19. Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
  20. Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).

Tags

Biokemi sag 129 Differential scanning kalorimetri termodynamik kinetik foldning bindende termolabile ligander drug discovery
Måling af Biomolekylær DSC profiler med termolabile ligander til hurtigt karakterisere foldning og bindende interaktioner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harkness V, R. W., Johnson, P. E.,… More

Harkness V, R. W., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. J. Vis. Exp. (129), e55959, doi:10.3791/55959 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter