Summary
折りたたみと結合差動スキャン熱量測定による不耐熱配位子との相互作用は生体分子の迅速な評価のためのプロトコルを提案します。
Abstract
示差走査熱量測定 (DSC) は生体分子の折りたたみと結合の相互作用を支配する熱力学的パラメーターを定量化するための強力な手法です。この情報は、新しい医薬化合物のデザインに重要です。ただし、多くの医薬関連配位子 DSC 分析で使用される高温で化学的に安定はありません。したがって、熱量計セル内配位子と熱変換製品の濃度は常に変化のために結合相互作用を測定が困難します。ここでは、急速に折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的情報に変換プロセスを得るため不耐熱配位子と DSC を使用してプロトコルを提案します。我々 は MN4 不耐熱リガンド コカインに結合する DNA アプタマーを私たちの手法を適用しました。不耐熱リガンド変換の新しいグローバル フィット分析を使用すると、折りたたみとバインディング パラメーターの完全なセットは、DSC 実験のペアから取得されます。さらに、1 つだけ補足 DSC データセットと不耐熱リガンド変換の速度定数がられる場合があるを示す.生体分子、折り畳み式の低速、低速のバインディング、および不耐熱リガンドの急速な枯渇の不可逆的な集計を含むを特定およびいくつかのより複雑なシナリオのデータを分析するためのガイドラインが掲載されています。
Introduction
示差走査熱量測定 (DSC)、生体分子結合のケイ光と折り畳み式の相互作用1,2,3の強力な方法です。DSC の強みには、バインドとフォールディング機構を明らかにし、対応する熱力学的パラメーター2,3を生成する能力が含まれます。また、DSC は近く生理条件下でのソリューションで実行することができます、生体分子や配位子、例えばフルオロ、スピン ラベルまたは核同位元素4とラベルを必要としません。楽器スキャン温度、配位子の有無で、生体分子を変性するに必要な熱の量を測定します。結果サーモグラムを使用してプロセスを折り配位子を支配する熱力学的パラメーターを抽出します。DSC や他の熱力学的手法によって提供される情報は、ターゲット生体分子1,5,6,7,8医薬品の設計を指導に不可欠です。ただし、高温に繰返しスキャン (〜 60-100 ° C) 問題が発生することができます。たとえば、多くの調剤上重要な化合物を受ける転位又は高温9,10,11,すなわちへの持続的な露出に分解、不耐熱。DSC による相互作用を通常結合の検討は、熱力学的解析12サーモグラムの再現性を確認するために複数の前方および逆のスキャンを必要とします。初期配位子の変更の結合特性を持つセカンダリ形式への変換熱が初期のリガンドの濃度低下しながら各スキャン形状と連続サーモグラムの位置で顕著な違いにつながる、熱変換製品を蓄積します。これらのデータセットは、伝統的な解析に適しておりません。
我々 は最近不耐熱リガンド DSC データセットの生体分子の折りたたみを支配する、バインドに参照される単一のリガンド結合実験からの相互作用の熱力学的パラメーターの完全なセットを生成するグローバル継ぎ手方式を開発した、無料生体分子4の必要なサーモグラムは。分析低減実験時間とサンプルに必要な 〜 10 倍標準的な DSC 手法に比べて。占めているサーモグラムはリガンドの濃度に依存しない各スキャンの高温部分の間に配位子のこれを仮定することにより熱の変換が行われます。したがって、配位子濃度は熱力学的パラメーターを抽出するために使用するサーモグラムの部分内にある定数です。私たちはさらに高温平衡期間が長く 1 つの補足実験を実行することによって配位子の熱変換の速度定数の取得方法を示した。配位子の温度差が少ない温度依存性システム (すなわち、すべての温度でかなり発生している)、分析は変数リガンド濃度を含めるように変更することができます。ここで我々 は急速に高温で benzoylecgonine に変換する不耐熱リガンド コカインの存在下で DNA アプタマー MN4 手順をデモンストレーション (> 60 の ° C)。これらの実験の温度で変換が行われない MN4 と連結されますので、キニーネはリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されます。不耐熱リガンド DSC データセットと降伏の折りたたみ、バインド、および配位子の熱力学的および速度論的パラメーター変換プロセス解析の買収について述べる。
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Protocol
1. サンプル準備
- 目的の生体分子13を浄化します。
注: このプロトコルを購入使用してコカイン バインディング DNA アプタマー MN4 に対して 3 回遠心フィルターを用いた 3 kDa の分子量カットオフ膜純水 3 つのラウンドに続いて 2 の M の NaCl を交換した後。 - 合成や浄化、目的不耐熱リガンド13を購入します。
注: MN4 不耐熱リガンド コカインにバインドします。MN4 はまた、これらの実験の温度でリガンド thermolability のネガティブ コントロールとして使用されるキニーネをバインドします。 - 精製された生体分子の透析と配位子 (20 mM リン酸ナトリウムと 140 mM NaCl のバッファー、MN4 とここで使用されるリガンドの pH 7.4) の溶解バッファーを準備します。
- 透析の管を使用してバッファーの少なくとも 2 L に対して生体分子を dialyze 0.5 - 1.0 kDa カットオフ。
- 徹底的にバッファーと平衡しては 0.2 μ m フィルターを通過、最後のバッファー (バッファーと呼ばれます) をフィルターします。
- リガンドの目的の固まりを量りし、フィルター バッファー中に溶解します。必要なリガンド濃度は正確に計量するのに小さすぎる大衆を必要とする場合は、集中配位子ストック ソリューション (たとえば 10 倍) です。
注: すべての DSC 実験サンプルの同じ作業バッファーを利用し、リガンド、すなわちは決して実験を実行バッファーの原因になります生体より作業バッファーの異なるバッチ内に配位子が解散が重要です。データの不一致アーティファクト。 - 徹底的に作業バッファーと平衡に達したされている 0.2 μ m のフィルターを通して生体分子の原液をフィルターします。
- 吸光度測定による生体分子の濃度を決定する (260 nm MN4 と 280 のような核酸蛋白質の nm)。
- 4 ° C の冷蔵庫 (MN4 とここで使用されるリガンドに適した)、または-20 で準備された生体分子と配位子を格納または-80 ° C 生体分子と配位子凍結や長期保存に耐える場合は必要です。ドガは、DSC に読み込む前にテーブルの上でバッファー、生体分子、およびリガンド ソリューション製 (材料の表を参照してください)。
注: は脱ガス気泡の高温 DSC を防ぐのに役立ちます。泡は、無名の DSC ピーク形状と基準信号アーチファクトを引き起こします。
2. DSC 準備
- DSC から圧力ハンドルを外し (材料の表を参照してください)。
- バッファーからシリコン チューブを実行し、参照毛細血管のフロントのフランジ (金属開口部) にアタッチします。
- リア参照フランジをフロント サンプル フランジに接続することで管を参照、サンプル間のブリッジを作成します。
- 真空線付き廃棄物フラスコに実行される後部サンプル フランジにシリコン チューブの部分を取り付けます。
- 200 ml のバッファーの DSC をフラッシュする真空ラインを入れます。
- バッファー付き DSC の参照毛細血管をロードします。参照キャピラリー フランジ約シリコン チューブの 3-5 cm のセクションに接続します。
- 後部フランジのシリコン チューブに 1 mL ピペット チップを挿入します。0.8 mL のピペットで作業バッファーを描画、バッファーでピペットの先端を前基準フランジのシリコン チューブに挿入します。
- 優しく、パス フロント シリコン チューブを介して作業バッファー参照毛細血管にまでピペット プランジャーを押すし、後部フランジには、ピペット チップを添付します。作業バッファー レベルに達するフロント シリコン チューブのすぐ上までピペット プランジャーを押しし、後部シリコン チューブのすぐ上の作業バッファー レベルに達するまでピペット プランジャーをリリースします。
- 泡の参照毛細血管内のボリュームを削除するのには、前後の作業バッファーを渡すことを繰り返します。
注: 通常、前後のソリューションの 10 のパス、任意の気泡をクリアするのに十分です。
- 泡の参照毛細血管内のボリュームを削除するのには、前後の作業バッファーを渡すことを繰り返します。
- 親指で背面のピペット チップをキャップし、リアのピペット チップと接続されているシリコン チューブで参照フランジからそれらを削除するフロントのピペットを軽く引いてください。
- 2.6 2.9 の手順のようにバッファーにサンプル毛細血管をロードします。後方参照の黒いプラスチックのキャップを置き、フランジ、明らかにフロントのフランジを残してのサンプルします。
- 圧力ハンドルをアタッチします。
- DSC ソフトウェアを開く (材料の表を参照してください) や電源読書が安定; したらインターフェイスの上部にある矢印を赤をクリックして楽器を加圧DSC 力が上部のボックスに示されている機器の温度および圧力を読むインターフェイスの右。
注: モニター DSC として読書力を加圧します。力の変化以上 〜 10 μ を示すデータのアーティファクトを引き起こす可能性が毛細血管のバブル形成。ソリューションを削除し、脱気する必要があります続行する前にさらに。 - 前方および逆スキャンを実行することでバッファーと DSC を平衡します。画面の左側にある「実験方法」タブでは、スキャン モードの温度で DSC を実行する「スキャニング」オプションが選択されているを確認います。
注: 実験的パラメーターは、温度範囲をスキャン、スキャン レート、低・高温平衡時間スキャン数です。- 「実験方法」タブで"温度パラメーター"はめ込み、で"暖房"のボタンをクリックしてします。下限と上限の実験的温度、1 ° C/分スキャン率および 60 の 1 ~ 100 ° C を入力平衡期間 s。
- 入力フィールドの下の平衡期間」シリーズの追加」ボタンをクリックします。(1 度の加熱と冷却スキャン) のポップアップ ・ ウィンドウで「手順を追加」フィールドに 2 を入力し「代替加熱/冷却」ボックスをオン。"OK"をクリックします。追加のスキャンは、インタ フェースの下部に表示されます。各スキャンのパラメーターは、チェック目的です。
- インターフェイスの上部に緑色の「再生」ボタンをクリックしてテストを開始します。目的のフォルダーに移動し、ポップアップ ウィンドウで実験を保存するファイル名を入力します。実験進捗状況を表示するには、「実験法」タブ右側に「データ」タブをクリックしますします。
3. 不耐熱リガンド DSC データセットの収集
います最小限の手順で構成されて 5 つの実験: バッファー参照実験とリガンドなし (基線の減算に使用する、議論参照)、サンプル無料の生体分子、リガンド分子の実験と長い高温平衡期間とリガンド分子。
- 参照実験サンプル データの基線の減算を実行します。両方の毛細血管でバッファーと DSC を再読み込み、1 ° C 分-1が上限 (高温) で適切な温度範囲にわたって複数の前方および逆スキャンを収集 120 の平衡化時間 s。
- インターフェイスの下の部分から個別にそれぞれを強調表示し、インタ フェースの右中央に赤色の X をクリックすると以前のバッファーの平衡化スキャンを削除します。新しいスキャンを追加するには、「シリーズを追加」ボタンをクリックして、「追加手順」のフィールドに 20 を入力、"代替加熱/冷却"ボックスをチェックします。OK をクリックし、上記の緑の再生ボタンをクリックしてテストを実行します。
- リガンドの手順 3.1 - 目的の参照を取得する両方の毛細血管でリガンド濃度バッファーで 3.1.1 実験 (120 を使用して 2 つの独立した実験を収集 s と 600 s 高温平衡の回それぞれ、不耐熱リガンド変換の速度定数を取得で使用される)。
注: ここで使用されるスキャン レートにより、その後の実験で生体分子が (説明参照) 前方および逆引きのスキャンで熱平衡状態にあります。スキャン レート < 0.1-0.2 ° C 分-1騒々しいサーモグラムにつながるし、DSC 実験には適用できません。温度を生体分子のリガンドで飽和の融点の上よく無料の生体分子の溶解温度以下の井戸から拡張する必要があります (~ MN4 20-80 ° C)。(例、10 進むと合計 20 の 10 逆スキャンで十分です) スキャンの再現性を確認します。 - 複数のリガンド (コカイン キニーネなど) を使用している場合は、毛細血管から配位子を外し、クロス汚染を防ぐために実行の間 (2.5 のステップから繰り返し) 作業バッファーの 200 mL の DSC をフラッシュします。
注: 以前の配位子が毛細血管の壁を強く吸着し、バッファーのフラッシュは適切に削除されないかどうかをチェックするために無料の生体分子のリガンドを実行した後複製の実験を実行すると便利です。無料の生体分子のサーモグラム リガンド結合実験後に大きい大きさと高い変性温度に移行する場合、以前の配位子がフラッシュした後カロリメータにまだ存在するそうです。20% で毛細血管の孵化によって吸着リガンドを削除オフ圧力ハンドル、プラスチック製のキャップと 60 ° C で 1 時間の Contrad 70。DSC ソフトウェアで平衡化時間のため入ったゼロ「等温」期間と等温温度 60 ° C の実験方法タブを選択 3,600 秒の下でに実験モードを変更します。「実験方法に追加」をクリックします。等温実験は、画面の下部に表示されます。終了後、2 L の脱イオン水で楽器をフラッシュし、2.5 のステップからを繰り返します。
- 同じ参照をスキャン プロシージャおよび実験的パラメーターを読み込み DSC を使用してサンプル実験を実行します。無料の生体データ セットの参照毛細血管にバッファーが含まれているサンプル キャピラリーには作業バッファーに必要な濃度で無料の生体分子が含まれていることを確認します。
- リガンド結合実験、リガンドはバッファー参照毛細血管で、生体分子と配位子は、サンプル、キャピラリー中でバッファーを確認します。追加ステップ 2.5 のように異なる配位子の間のシステムをフラッシュします。
- 600 の高温平衡期間の増加、不耐熱リガンド行きの生体追加実験の 1 つを実行 s とすべての他の実験的パラメーターは、3.2.1 の手順と同じです。
注: 第二配位子結合実験のため高温平衡期間中は単にリガンドの短い平衡時間実験よりより急速に劣化を確実に選択されます。最初からリガンド ピーク実験スキャン数の関数としてゆっくり崩壊場合 (例えば、連続ピーク マキシマの違いある ≤ 0.5 の ° C)、高温平衡期に 10 〜 20 倍向上の推定十分に配位子を消費し、第 2 の実験。配位子の変換のための速度定数の正確な計算は、2 番目の実験を最初に対する配位子のより速い枯渇する必要があります。同様、リガンドの枯渇が十分に 2 番目の実験ではアクセラ レートされていない場合使用できない 2 つの実験のグローバル分析から抽出されたリガンド濃度にあります。
4. データ処理
- 開いている DSC 実験 DSC データ解析ソフトウェアでファイル (材料の表を参照) と生の力データをスプレッドシートとしてエクスポートします。
- データフィッティングのためのソフトウェアに未加工力データを含むスプレッドシートをインポートします。
- ベースラインは、無料からのバッファー データと生体分子リガンド結合実験を減算してサンプル データを減算します。
注: 不耐熱リガンド実験のため初期リガンドの濃度は各スキャンで減少しています。したがって、サンプル スキャン 1 からバッファー スキャン 1 を減算に最適です。リガンド変換が行わし、不耐熱リガンド データのすべてを減算する単一不耐熱リガンド バッファー スキャンを使用ことができますそのためにコカインとバッファー スキャンがかなり変化しないことがわかった。 - サンプルのベースライン減算力データを比熱容量に変換します。
注: 変換には、推定14,,1516は、生体分子の部分比容が必要です。熱容量を電力に変換する数式がずっと17で説明しました。
5. データの解析
- 世界的に短い平衡時間不耐熱リガンド熱容量データセットに一連のベースライン、配位子濃度、折りたたみ、およびリガンド結合パラメーター4を前述のように合います。
- 不耐熱リガンド変換4を前述のように速度定数を計算するために長い平衡時間データセットのグローバル フィットを繰り返します。
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Representative Results
不耐熱リガンド DSC の代表的なデータは、図 1のとおりです。位置および不耐熱リガンド ピークの高さ連続シフト ダウン非連結の生体分子の方不耐熱リガンドが各スキャン (図 1 a) で使い果たされるとします。無料変性プロファイルは、不耐熱リガンド変換 (図 1 b) のエンドポイントの参照として使用されます。MN4 キニーネにバインドのためのデータは、変換不耐熱リガンド (図 1 b) のネガティブ コントロールとして表示されます。最終不耐熱リガンド スキャンがわずかに高い移行中点と不耐熱リガンド変換製品 (benzoylecgonine) に MN4 に弱い親和性を示す非連結 MN4 基準ピーク高さあります。図 1にデータセットのグローバル分析で得られた熱力学的パラメーターは、表 1に表示されます。コカインやキニーネ存在下で MN4 の折りたたみパラメーターは、どおり希釈の小さな分子が無料の生体分子の折りたたみの熱力学を摂動すると期待されないので、誤差範囲内で同じです。バインディング パラメーターは等温滴定熱量測定 (ITC)18からのそれらとよく一致、コカインにキニーネの MN4 の好みがより好ましい結合エンタルピーによって駆動されることを明らかにします。図 2高温平衡期間を長く、短い平衡期間データセットを基準にして各スキャン不耐熱リガンド濃度の顕著な削減が得られます。2 つのデータセットから最適化されたグローバル フィット濃度パラメーターを使用して、図 2インセットで直線の傾きから高い平衡温リガンド変換の速度定数が計算されます。
図 1。不耐熱リガンド DSC 。コカイン (初期濃度 778 μ M) に (、) サーモグラムの MN4 (83 μ M) のバインド。配位子の存在下で MN4 の最初と最後のスキャンは、対応するフィットは色付きの線として表示されます、暗い赤と青の円として表示されます。(b) 無料 MN4 のサーモグラム (83 μ M、黒い円) 連続スキャンは、キニーネ (880 μ M、色のついた丸) にバインドされているとします。無料やキニーネがバインドされたデータセットにフィットは、それぞれ黒と色の線として表示されます。参考資料4から王立化学会から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2。不耐熱リガンド変換の速度定数を測定します。短い (120 秒、暗赤色) とロング (600 s, 紺) 平衡コカイン行きの MN4 のサーモグラムの (、) のセットそれぞれ倍の 80 ° c。(b) スキャン数の関数として (、) のデータセットのグローバル解析から抽出されたコカインの濃度。実験のポイントと指数フィットは、それぞれ着色された円と線として表示されます。はめ込みは、ハークネスら42 つのデータセットの最適化されたグローバル フィット コカイン濃度を使用してから、前述の補正式 19 に線形フィットを示しています。配位子 80 ° C で熱変換のための速度定数は、直線の傾きとして計算されます。不耐熱リガンド変換の速度定数の誤差は、± 2 標準偏差として与えられます。参考資料4から王立化学会から許可を得て再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| フィットのパラメーター | コカインを追加 | キニーネを追加 |
| ∆HUF | 271.3±1.8 | 272.5±4.0 |
| ∆SUF | 824.4±5.1 | 827.9±10.9 |
| ∆GUF | 21.6±0.2 | 21.6±0.9 |
| ∆HB1F | -75.2±1.6 | -101.0±4.0 |
| ∆SB1F | -154.2±5.0 | -213.7±12.0 |
| ∆CpB1F | -1.5±0.1 | -1.2±0.1 |
| ∆GB1F | -28.5±0.2 | -36.2±0.7 |
| ∆HB2F | -33.7±1.8 | - |
| ∆SB2F | -49.9±5.2 | - |
| ∆CpB2F | -2.2±0.1 | - |
| ∆G地下 2 階 | -18.6±0.3 | - |
テーブル 1。コカインとキニーネ配位子を用いた MN4 DSC データセットのグローバル分析から抽出された熱力学的パラメーター。パラメーターは、30 ° C で計算されました。コカインまたはキニーネ束縛折り畳まれた状態を指します B1F と B2F benzoylecgonine バインド折り畳まれた状態を指します。Δ kJ/mol で発現するHと ΔG ΔS を表明した kJ/mol/k. J/mol ・ K と Δ のCpを表明した分散共同 variance 法19のエラーを算出します。
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Discussion
変更とトラブルシューティング
図 1 と図 2で使用されているグローバル フィット分析の詳細がされている4で説明しました。ここでは、実行して不耐熱配位子を DSC 結合実験の分析の実用的な側面をまとめました。不耐熱配位子だけでは配位子から差し引かれるために、DSC ベースラインが得られることに注意してください + 生体分子データセット、リリースまたは熱変換によって吸収される熱を効果的にキャンセル自体を処理します。標準不耐熱リガンド グローバル管継手解析 (図 1 および図 2) とし、システムは、熱力学的平衡温度スキャン全体不耐熱リガンド濃度は一定全体にわたって各サーモグラムは、高温平衡期間中のみ減少します。私たちは以前この仮定がコカイン バインド MN4 に適用し、これらのような反応速度で不耐熱リガンド/生体分子システムの保持するために期待を示しています。
しかし、熱力学的平衡にシステムを想定できないやリガンドの濃度は単一スキャンを通じて一定考慮することはできませんいくつかの状況があります。I) リガンド熱に変換するとき急速に温度スキャン レート基準 ii) iii) スキャン率に比べて折畳み・展開速度が遅いときに生体が高温での不可逆的な集計を受けるときが含まれますと iv)。リガンド会合/解離率がスキャン レートに比べて遅い。これらの場合、システムは運動ではなく、熱力学的管理下と参照 4 で与えられた分析が適用厳密にできません。データは、補助ファイル 1で説明するよう次の図 3、定量的シミュレート可能性があります。原則として、非平衡 DSC データ、この分析は、このペーパーの範囲を超えて、しかし潜在的速度論的・熱力学的データを降伏に合わせてこれらの反応速度論に基づく計算がされる可能性があります。代わりに、我々 は非平衡の状態を識別するのには、読者を支援するためにいくつかの代表的なシミュレートされた DSC のデータを提示します。
図 4 a, b.熱力学支配の理想的な使用例を示す無料の生体分子の DSC サーモグラムは重なること (図 4 a) と不耐熱リガンドとスキャンがヒステリシスを示さない、アップ スキャンが以前のダウン スキャン (折り畳み式の温度を一致する溶融温度で観察されるよう図 4 b)。不耐熱リガンドを急速に変換するときはスキャン率に比べてサーモグラムに大きな歪みが表示され、熱力学方程式では、図 4 c、dに示すように、ピーク形状を考慮しません。これは、スキャン レートを増やすことによって多少緩和されます。不耐熱リガンドが熱アップシフトの減少パターンを生成する温度依存的に生体分子集合体連続無料生体分子表示の DSC トレースが低下する (図 4e) の大きさに添加しながら(図 4 階) 減少の生体分子の濃度によってスケールが理想的なケースに似ています。折畳み・展開速度が遅いときに比べてスキャン レート ヒステリシスは無料の生体分子の DSC 跡の明白なアップ スキャンに明白な変性温度がダウン スキャン (明白な下の温度よりも高くなるよう図 4 g)。不耐熱配位子の添加は、アップ スキャン (図 4 h) の特に熱のアップシフトを減少のおなじみのパターンに します。最後に、急速な折り畳みと遅いバインディング システム (図 4i)、無料生体分子のヒステリシス無料 DSC サーモグラムを作り出す不耐熱リガンドとデータ表示履歴アップ スキャンの見かけの溶解温度が、しかし以前のダウン スキャン (図 4 j) の見かけの折り畳み式温度よりも高い。それにもかかわらず、熱のアップシフトを減少の典型的なパターンはアップ スキャンとダウン スキャンの両方で明らかにされます。非平衡行動遅い折るか、または速度をバインドすることができます非取るにたらない配位子熱変換スキャン中のリスクが実行されますが、スキャン レートを減少させることによってややを軽減。実習では、スキャン速度と上部の平衡温度を図 4 a, bに似ているデータを取得する手動で調整できます。
技術の限界
不耐熱配位子を用いた実験をバインド DSC に関する私たちの熱力学的解析は、折りたたみとバインディング プロセスが比較的急速である不耐熱リガンド変換は各スキャンの高温部分の前に時間がかかる必要があります。折り返しや連結状態の寿命が約 30 を超えるとき s (オフk, ku < 0.03 の-1)、ヒステリシスが 1 ° C 分-1で実行したスキャンの認識になります。配位子変換速度定数が約 kc以上の場合さらに、= 10-4の-1変性移行前に単一スキャンの過程で、配位子の重要な枯渇することができます。我々 の分析のアプリケーションは、不可逆的な集計が発生したときにも適切です。これらのケースより高度なモデル化は、データに適用でした。アフィニティ情報ない場合は配位子の変換が速いためにそれは最初の変性の遷移前に完成です。
既存のメソッドの意義
初めての手法では、親和性が高く、不耐熱配位子の結合の熱力学を測定するための DSC をことができます。すべてのスキャンのグローバル同時分析を実行する高精度20熱力学的パラメーターを抽出する.追加の利点は、熱変換製品が無料の生体分子の親和性を持たない場合としてはほとんど 1 つの実験の完全なデータセットを集めることができることです。対照的に、非不耐熱 ligand のための典型的な実験 DSC シリーズの生産を必要があります ~ 7-10 総実験。
将来のアプリケーション
この方法には薬物発見キャンペーンでタイトな不耐熱阻害剤の特性に直接塗布します。不耐熱、迅速な加水分解、または生理学的 pH および温度の近くを工事する抗生物質やベンゾジアゼピンなどいくつかの治療化合物が知られている 〜 60-70 ° C11。この DSC 法はよく識別し、特徴付ける多く配置されます。同様に、システムは運動ではなく、熱力学の制御を考慮してふさわしいプロトコルの変更上述のように、持って生物学的関連性のより多くのシステムへの扉を開く可能性を秘めています。
プロトコルの中で重要なステップ
考慮すべき最も重要な実験手順は、透析や同一作業バッファー ソリューション (プロトコル手順 1.3 1.6) 生体分子の配位子交換があります。バッファーに不一致配位子および生体分子のソリューションは、完全に不明確に折りたたみの関連データをベースラインとサンプルのスキャンで大きな成果物につながります。さらに、電源読書安定 DSC は加圧加圧 (プロトコル手順 2.3) 中に監視できるようにする前にことが不可欠です。電源読書して変更した場合以上 〜 加圧中 10 μ 泡毛細血管で形成された可能性が高いとデータで大アーティファクトが発生することができます。この場合、解決策より徹底的に脱気する必要があります。
図 3。生体分子の折り畳み、不耐熱リガンドと不可逆的な集計にバインドします。不耐熱配位子 (L) 速度定数 k のcを持つ製品 (X) に変換します。X には、生体への親和性はありません。無料と生体分子の交流の束縛状態 (B) 折り畳まれた率定数 kをk上の状態 (F) です。速度定数 kuと kfで展開状態 (U) と F の交流。U は、不可逆的速度定数 kaggに集約された状態 (A) に変換します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4。平衡と速度論的制御の DSC の計算機シミュレーション実験不在そして不耐熱配位子の存在。(、) 平衡の生体分子の折りたたみ。折り畳み式の平衡 (b)、不耐熱リガンドおよび遅い不耐熱リガンド変換。(c) 平衡分子の折りたたみ。(d) 平衡の折りたたみ、不耐熱リガンド結合と高速不耐熱リガンド変換。(e) 平衡分子の折りたたみと遅い不可逆的な集計。(f) 平衡折りたたみ、バインド、不耐熱リガンド変換、および低速の不可逆的な集計が遅くなります。遅い (g) 生体分子の折りたたみ。(h) 低速の折り畳み、平衡のバインド、および遅い不耐熱リガンド変換。(私) 平衡分子折り畳み。折り畳み式の平衡 (j)、遅い不耐熱リガンドと遅い不耐熱リガンド変換。すべてのパネルの最初と最後のシミュレートされたスキャンは、暗い暗い赤と青、それぞれ。だけ明るい部分と暗い青色サーモグラムを表示パネルは、シミュレートされたスキャンをすべてのオーバーレイ、ことを示し最後の 2 つだけがプロットに表示されます。DSC 実験を 1 ° C 分-1スキャン速度の 0-80 ° C の温度範囲で 20 スキャン (溶解 10 および 10 焼鈍) でシミュレートしました。特定のパネルは、シミュレーション動向のより良い視覚化できるように狭い温度範囲を表示します。シミュレーションでの生体分子と配位子濃度は 200 μ M と 10 mM であった。各実験は、スキャンする前に 0 ° C で 600 s の平衡化時間と各後続のスキャンの間 60 s 平衡時間シミュレートしました。平衡折りのアレニウスあった上= 5 x 10-1 M-1の-1オフ= 1 x 1019 s は-1E、上=-20 kJ mol-1E、オフ120 kJ mol-1、フォールドを = = 1 × 10-14の-1、展開= 5 x 1018, E、折る=-80 kJ mol-1、および E、展開= 120 kJ mol-1.バインドおよび折りたたみ速度論的制御のアレニウスあったに= 5 x 10-3 M-1の-1オフ= 1 × 1016 s は-1Eに-20 kJ mol-1E を =、オフ120 kJ mol-1、フォールドを = = 1 x 10-16の-1、展開= 5 x 1016Eを折る=-80 kJ mol-1、および E、展開= 120 kJ mol-1.ゆっくりと急速な不耐熱リガンド変換アレニウスが遅い= 1010の-1E、遅いx 7.509 = 94.65 kJ mol-1、および、高速= 1 s-1E、高速10 kJ mol-1を =。遅いの不可逆的な集計にアレニウスがagg。 = 5 x 107 s-1と E、agg。 80 kJ mol-1を =。ΔHUF (展開)、ΔHBF (バインド) ΔHAF (集約) と過剰比熱を求めた = 200、-140、および 50 kJ mol-1、それぞれ。不耐熱配位子を用いた実験 DSC の速度論的制御の理論的記述、これらのシミュレーション (および必要なパラメーター) を実行するためのスクリプトで利用できる補足ファイル 1.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Disclosures
著者は利益相反を宣言しません。
Acknowledgments
R. W. H. V は、マギル大学自然科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) Bionanomachines トレーニング プログラムによって支えられました。A. K. M. と p. e. j. は、レベル補助金 327028-09 (A. K. M) と 238562 (p. e. j.) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Chem Impex | #00829 | |
| Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 71502 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma Aldrich | S9763 | |
| Deioinized water for molecular biology | Millipore | H20MB1001 | |
| 0.2 micron sterile syringe filters | VWR | CA28145-477 | |
| 3 kDa centrifugal filters | Millipore | UFC900324 | |
| Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff | Spectrum Laboratories | 131048 | |
| Silicon tubing | VWR | 89068-474 | |
| Plastic DSC flange caps | TA Instruments | 6111 | |
| DNA aptamer MN4 | Integrated DNA Technologies | https://www.idtdna.com/site/order/menu | |
| Cocaine | Sigma Aldrich | C008 | |
| Quinine | Sigma Aldrich | 22620 | |
| NanoDSC-III microcalorimeter | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/nanodsc/ | |
| DSCRun software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| NanoAnalyze software | TA Instruments | http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ | |
| Contrad-70 | VWR | 89233-152 |
References
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