Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Måle Biomolecular DSC profiler med Thermolabile ligander å raskt karakterisere Folding og bindende interaksjoner

Published: November 21, 2017 doi: 10.3791/55959
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, McGill University, 2Department of Chemistry, York University

Summary

Vi presenterer en protokoll for rask karakterisering av biomolecular folding og bindende interaksjon med thermolabile ligander bruker differensial skanning calorimetry.

Abstract

Differensial skanning calorimetry (DSC) er en kraftfull teknikk for kvantifisere termodynamisk parametere biomolecular folding og bindende interaksjoner. Denne informasjonen er kritisk i utformingen av nye farmasøytiske forbindelser. Men er mange pharmaceutically relevante ligander kjemisk ustabil på de høye temperaturene i DSC analyser. Dermed er måle bindende interaksjoner utfordrende fordi konsentrasjonen av ligander og termisk konvertert produkter er i stadig endring i calorimeter cellen. Her presenterer vi en protokoll med thermolabile ligander og DSC for raskt å få termodynamisk og kinetisk informasjon på folding, binding og ligand konverteringsprosesser. Vi har brukt vår metode DNA aptamer MN4 som binder til thermolabile ligand kokain. Bruker en ny global passende analyse som står for thermolabile ligand konvertering, et komplett sett med folding og bindingsparameterne er Hentet fra et par DSC eksperimenter. I tillegg viser vi at rate konstant for thermolabile ligand konvertering kan oppnås med bare en supplerende DSC datasett. Retningslinjene for identifisere og analysere data fra flere mer kompliserte scenarier presenteres, inkludert irreversibel samling av biomolecule, langsom folding, langsom binding og rask uttømming av thermolabile ligand.

Introduction

Differensial skanning calorimetry (DSC) er en kraftig metode for quantitating biomolecular bindende og folding interaksjoner1,2,3. Styrken av DSC inkluderer dens evne til å belyse bindende og folding mekanismer, og den tilsvarende termodynamisk parametere2,3. Videre DSC kan utføres i løsningen under nær fysiologiske forhold og krever ikke merking av biomolecule eller ligand, f.eksmed fluorophores, spin-etiketter eller kjernefysiske isotoper4. Maskinen skanner i temperatur, måle mengden varme må denature biomolecule i tilstedeværelse og fravær av ligand. De resulterende thermograms brukes til å trekke ut termodynamisk parameterne for ligand binding og folding prosesser. Informasjon fra DSC eller andre termodynamisk teknikker er kritisk til veiledende utformingen av narkotika målretting biomolecules1,5,6,7,8. Men gjentatte skanning til høye temperaturer (~ 60-100 ° C) kan være problematisk. For eksempel mange pharmaceutically viktige forbindelser gjennomgå omorganisering eller nedbryting på vedvarende eksponering for høye temperaturer9,10,11, dvs., de er thermolabile. Undersøkelse av bindende interaksjoner av DSC vanligvis krever flere revers skanner for å verifisere reproduserbarhet av thermogram for termodynamisk analyser12. Termisk konvertering av en innledende ligand til en sekundær form med endrede bindende egenskaper fører til uttales forskjeller i form og stilling av påfølgende thermograms, siden konsentrasjonen av første ligand avtar med hver skanning mens den termisk konvertering produkter samles. Disse datasett er ikke mottakelig for tradisjonelle analyser.

Vi har nylig utviklet en global passende metode for thermolabile ligand DSC datasett som gir komplett sett av termodynamisk parametere for den biomolecular folding og bindende interaksjoner fra ett enkelt ligand binding eksperiment refererte til den nødvendige thermogram for gratis biomolecule4. Analysen reduserer eksperimentelle tid og eksempel kreves av ~ 10-fold sammenlignet med standard DSC tilnærminger. Vi har stått for ligand termisk konvertering av antar dette skjer under høy temperatur delen av hver skanning der thermogram ikke er avhengig av ligand konsentrasjon. Derfor er ligand konsentrasjonen en konstant i delen av thermogram som brukes til å hente termodynamisk parametere. Vi viste i tillegg hvordan rate konstant for ligand termisk konvertering kan oppnås ved å utføre et supplerende eksperiment med høy temperatur balanse lengre. For systemer der ligand termisk konvertering er mindre temperaturen-avhengige (i.e.forekommende merkbart i alle temperaturer), analysen kan endres for å inkludere variable ligand konsentrasjoner. Her viser vi denne prosedyren for DNA aptamer MN4 i nærvær av thermolabile ligand kokain, som hurtig konverterer til benzoylecgonine ved høye temperaturer (> 60 ° C). Kinin brukes som en negativ kontroll for ligand thermolability siden det gjennomgår konvertering på disse eksperimentelle temperaturer og også binder seg til MN4. Vi beskriver oppkjøpet av thermolabile ligand DSC datasett og analyse gir termodynamisk og kinetisk parametere av folding, binding og ligand konverteringsprosesser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. sample forberedelse

  1. Rense den ønskede biomolecule13.
    Merk: Denne protokollen bruker kjøpt kokain-bindende DNA aptamer MN4 etter utveksle mot 2 M NaCl tre ganger etterfulgt av tre runder med deionisert vann bruker en sentrifugal filter med en 3 kDa molekylvekt cut-off membran.
  2. Syntetisere og renser, eller kjøpe den ønskede thermolabile ligand13.
    Merk: MN4 binder thermolabile ligand kokain. MN4 også binder Kinin, som brukes som en negativ kontroll for ligand thermolability på disse eksperimentelle temperaturer.
  3. Forberede buffere dialyse av det renset biomolecule og oppløsning av ligander (20 mM natrium fosfat og 140 mM NaCl buffer, pH 7.4, for MN4 og ligander her).
  4. Dialyze biomolecule mot minst 2 L bufferen med dialyse rør med 0,5 - 1.0 kDa cut-off.
  5. Filtrere siste bufferen (referert til som arbeider buffer) gjennom en 0,2 µm filter som har blitt grundig equilibrated med buffer.
  6. Veie ut ønsket massene av ligander og oppløse dem i filtrert arbeider buffer. Hvis de ønskede ligand konsentrasjonene krever massene som er for små til å veie nøyaktig, lage en konsentrert ligand lager løsning (10 x for eksempel).
    Merk: Det er viktig at alle DSC eksperimenter benytte samme arbeider bufferen for prøven og ligand, dvs.aldri utføre et eksperiment der ligand er oppløst i en annen bakst arbeider bufferen enn biomolecule som dette vil føre til buffer feil gjenstander i dataene.
  7. Filtrere biomolecule lager løsningen gjennom et 0,2 µm filter som har blitt grundig equilibrated med arbeider buffer.
  8. Bestemme biomolecule konsentrasjonen av absorbansen målinger (260 nm for nukleinsyrer som MN4 og 280 nm for proteiner).
  9. Lagre forberedt biomolecule og ligand i 4 ° C kjøleskap (egnet for MN4 og ligander her), eller på -20 eller-80 ° C hvis de biomolecule og ligander tolererer frysing og langsiktig lagring er nødvendig. Degas buffer, biomolecule og ligand løsningene i et degasser (se Tabell for materiale) før lasting i DSC.
    Merk: Avgassing hjelper for å forhindre boble formasjon i DSC ved høyere temperaturer. Bobler føre signal gjenstander som obskure DSC peak figurer og opprinnelige planer.

2. DSC forberedelse

  1. Skru press håndtaket fra DSC (se Tabell for materiale).
  2. Kjøre silisium rør fra arbeider bufferen og legge den til foran flensen (metall åpning) av referanse capillary.
  3. Opprette en bro mellom referanse og prøve kapillærene av tilkobling flensen bak referanse til foran eksempel flensen.
  4. Knytte et stykke silisium rør til bakre eksempel flensen som går til en avfall kolbe tilknyttet en vakuum linje.
  5. Slå på vakuum linjen å spyle DSC med 200 mL arbeider buffer.
  6. Last av referanse kapillær av DSC med arbeider buffer. Fest omtrent 3-5 cm deler av silisium rør til referanse kapillær flensene.
  7. Sett inn et 1 mL pipette tips i bakre flensens silisium rør. Tegne 0,8 mL arbeider buffer med en pipette, og stikk pipette med buffer i front referanse flensens silisium rør.
  8. Trykk forsiktig pipette stempelet til pass arbeider bufferen gjennom foran silisium slangen i referanse-kapillære og opp i den bakre flensen festet pipette tips. Trykk ned stempelet Pipetter til buffer arbeidskraft kommer like over foran silisium slangen, så slipper pipette stempelet til buffer arbeidskraft kommer like over bakre silisium slangen.
    1. Gjenta passerer arbeider bufferen og tilbake for å rense volumet i referanse kapillær bobler.
      Merk: Vanligvis passerer 10 av løsningen og tilbake er tilstrekkelig å fjerne bobler.
  9. Cap bakre pipette spissen med tommelen og trekk forsiktig på bakre pipette tips og foran pipette å fjerne dem fra referanse flensene med silisium slangen festet.
  10. Last av prøven kapillær med arbeider buffer i trinn 2.6-2.9. Plasser en svart plast hetten på bakre referansen og smak flenser, forlater foran flensene avdekket.
  11. Legge press håndtaket.
  12. Åpne DSC programvaren (se Tabell for materiale) og pressurize apparatet ved å klikke røde opp-pilen øverst i grensesnittet når makt lesing har stabilisert seg; DSC makt er angitt i en boks øverst høyre i grensesnittet instrument temperatur og oljetrykk lesing.
    Merk: Skjermen makt lese som DSC pressurizes. Endringer i kraft mer enn ~ 10 µW angi boble formasjon i kapillærene, som kan forårsake gjenstander i dataene. Løsningene må fjernes og degassed ytterligere før du fortsetter.
  13. Equilibrate DSC med arbeider buffer ved å utføre en revers skanning. Kontroller at alternativet "Skanning" er valgt å kjøre DSC i temperatur skannemodus i kategorien "Eksperimentell metode" på venstre side av skjermen.
    Merk: Eksperimentell parametere er temperaturen skanning utvalg, avsøkingshastigheten, lav og høy temperatur balanse tid og antall skanninger.
    1. I "Temperatur parametere" senket under kategorien "Eksperimentell metode", klikk på knappen for "Oppvarming". Angi 1 og 100 ° C for nedre og øvre eksperimentelle temperaturer, 1 ° C/min for avsøkingshastigheten og 60 s for balanse perioden.
    2. Klikk "Legg til serien" under inndatafeltet for balanse perioden. Angi 2 i feltet "Trinn for å legge til" i popup-vinduet (for en oppvarming og en avkjølende skanning) og sjekk boksen "alternative oppvarming/kjøling". Klikk "OK"; ekstra skanner vises i nedre del av grensesnittet. Kontroller at parameterne for hver skanning er som ønsket.
    3. Start eksperimentet ved å klikke på den grønne "play"-knappen øverst i grensesnittet. Naviger til ønsket mappe og angi et filnavn for lagring eksperimentet i popup-vinduet. Vis eksperiment fremdriften ved å klikke kategorien "Data" til høyre for kategorien "Eksperimentere metoden".

3. samle Thermolabile Ligand DSC datasett

Merk: Minimal prosedyren består av fem eksperimenter: buffer referanse eksperimenter med og uten ligand (brukes for planlagte subtraksjon, se diskusjonen), prøve eksperimenter med den gratis biomolecule, ligand binding-biomolecule og ligand-bundet biomolecule med høy temperatur balanse lengre.

  1. Kjør referanse eksperimenter for planlagte subtraksjon av eksempeldataene. Oppdater DSC med arbeider buffer i begge kapillærene og samle flere revers skanninger over et egnet temperaturområde på 1 ° C min-1 med en øvre (høy temperatur) balanse tid 120 s.
    1. Slette tidligere buffer balanse skanner fra nedre del av grensesnittet ved å merke hvert individuelt og klikker den røde X til midten høyre i grensesnittet. Legge til nye skanner ved å klikke "Legg til serien" inn 20 i feltet "Trinn for å legge til" og merker av for "alternative oppvarming/kjøling". Klikk OK og utføre eksperimentet ved å klikke grønne spille som ovenfor.
    2. Gjenta trinn 3.1 - 3.1.1 med arbeider buffer som inneholder ønsket konsentrasjonen av ligand i begge kapillærer å få referansen eksperimenter for ligand (samle to separate forsøk bruke 120 s og 600 s høy temperatur balanse ganger henholdsvis i å anskaffe rate konstant for thermolabile ligand konvertering).
      Merk: Avsøkingshastigheten her sikrer at biomolecule i senere eksperimenter er på termisk likevekt i revers skanner (se diskusjon). Skanne priser < 0.1-0,2 ° C min-1 føre til støyende thermograms og gjelder ikke DSC eksperimenter. Temperaturen bør utvide fra godt under Smeltetemperaturen for den gratis biomolecule til godt over Smeltetemperaturen for ligand-mettet biomolecule (~ 20-80 ° C i MN4). Kontroller reproduserbarhet av skanner (for eksempel 10 fremover og 10 omvendt skanner for 20 totalt er tilstrekkelig).
    3. Hvis bruker flere ligander (som kokain og kinin), tømme DSC med 200 mL arbeider buffer (gjenta fra trinn 2.5) mellom går for å fjerne ligand fra kapillærene og forhindre kryss-kontaminering.
      Merk: Det er nyttig å utføre en Repliker eksperiment på den gratis biomolecule etter en ligand-bundet løpe for å kontrollere om tidligere ligand adsorbs sterkt kapillært vegger og fjernes ikke tilstrekkelig med buffer rødme. Hvis thermograms for den gratis biomolecule synes å bli flyttet til et større omfang og høyere rødsprit temperatur etter ligand-bundet eksperimentere, er det sannsynlig at tidligere ligand er fremdeles på calorimeter etter tømming. Fjerne adsorbert ligand ved rugende kapillærene med 20% Contrad-70 1t på 60 ° C med plasthetter og press håndtaket av. I DSC-programmet endre eksperimentell modus til "Isotermiske" under eksperimentell metode kategorien Velg 3600 s for varighet og 60 ° C i isotermiske temperatur, med null angitt for balanse gang. Klikk "Legg til eksperimentell metode". Isotermiske forsøket vises i den nedre delen av skjermen. Etter ferdigstillelse, rødme maskinen med 2 L vaskebuffer vann og gjenta fra trinn 2.5.
  2. Kjøre utvalg eksperimenter med samme DSC lasting prosedyre og eksperimentelle parametere for referansen avsøker. Kontroller at referanse kapillær inneholder arbeider bufferen mens av prøven kapillær inneholder den gratis biomolecule på ønsket konsentrasjonen arbeider buffer for datasettet gratis biomolecule.
    1. For de ligand binding eksperimentene, sikre at ligand er i arbeider bufferen i referanse kapillær, og biomolecule pluss ligand arbeider buffer i prøven kapillær. Tømme systemet mellom tillegg av ulike ligander som i trinn 2.5.
  3. Utføre en ekstra eksperimentere med biomolecule bundet til thermolabile ligand hvor høy temperatur balanse perioden er økt til 600 s og alle andre eksperimentelle parametere er de samme som trinn 3.2.1.
    Merk: Varigheten av høy temperatur balanse perioden for andre ligand binding eksperimentet er bare valgt å sikre at ligand raskere utarmet enn kort balanse tid eksperimentet. Hvis ligand binding toppene fra første eksperiment forfall sakte som en funksjon av skanning (f.eksforskjellene i påfølgende topp maxima er ≤ 0,5 ° C), beregne 10 - til 20 ganger økning i høy temperatur balanse perioden for å tilstrekkelig utarme ligand under andre eksperimentet. Nøyaktig beregning av rente konstant for ligand konvertering krever at andre eksperimentet har raskere uttømming av ligand i forhold til først. Ligand konsentrasjonen Hentet fra den globale analysen av to eksperimenter vil være lignende og ubrukelig hvis ligand uttømming ikke er tilstrekkelig akselerert i andre eksperimentet.

4. databehandling

  1. Åpne DSC eksperimentere filer i den DSC analyse programvaren (se Tabell for materiale) og eksporterer rå kraft dataene som regneark.
  2. Importere regneark som inneholder dataene som rå kraft i programvare for dataene passer.
  3. Opprinnelig trekke eksempeldataene ved å trekke buffer strømmen data fra den og ligand-bundet biomolecule eksperimenter.
    Merk: For thermolabile ligand eksperimentet, konsentrasjonen av første ligand avtar med hver skanning. Derfor er det ideelt å trekke buffer skanningen 1 fra prøve skanning 1 og så videre. Vi har funnet at bufferen skanner med kokain ikke endres merkbart når ligand konverteringen fortsetter og derfor et enkelt thermolabile ligand buffer søk kan brukes til å trekke alle thermolabile ligand binding dataene.
  4. Konvertere baseline-trukket strøm eksempeldataene til varmekapasitet.
    Merk: Konvertering krever at biomolecule delvis bestemt volum, som kan være beregnede14,15,16. Ligningen for konvertering makt til varmekapasitet har vært beskrevet tidligere17.

5. analyse

  1. Globalt passe kort balanse tid thermolabile ligand binding varmekapasitet dataset med et enkelt sett med planlagte, ligand konsentrasjon, bretting og ligand binding parametere som beskrevet tidligere4.
  2. Gjenta den globale passer for lang balanse tid datasettet for å beregne rente konstant for thermolabile ligand konvertering som beskrevet tidligere4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Representant data for thermolabile ligand DSC er vist i figur 1. Posisjon og høyde på thermolabile ligand binding toppen Skift suksessivt mot av ubundet biomolecule som thermolabile ligand er oppbrukt med hver skanning (figur 1a). Gratis rødsprit profilen brukes som referanse til endepunktet til thermolabile ligand konvertering (figur 1b). Dataene for MN4 bundet til kinin vises som en negativ kontroll for thermolabile ligand konvertering (figur 1b). Den endelige thermolabile ligand skanner har litt høyere overgang midtpunktene og topp høyder i forhold til den ubundne MN4, som indikerer thermolabile ligand konvertering produktet (benzoylecgonine) har en svak affinitet for MN4. Termodynamisk parameterne som følge av global analyse av datasett i figur 1 er oppført i tabell 1. Sammenleggbar parameterne for MN4 i nærvær av kokain eller kinin er identiske i feil, som forventet, siden fortynne små molekyler ikke forventes å forurolige folding termodynamikken for det ledig biomolecule. Bindingsparameterne er god avtale med de isotermiske titrering calorimetry (ITC)18 og avslører at MN4's preferanse for kinin over kokain er drevet av en gunstigere bindende entalpi. I figur 2gir økende temperatur balanse perioden mer markert reduksjon av thermolabile ligand konsentrasjonen med hver skanning i forhold til kort balanse perioden datasettet. Optimalisert globale passer konsentrasjon parameterne fra to datasett beregnes, rente konstant for ligand konvertering ved høy balanse temperatur fra stigningstallet for linjen i den figur 2 rammemargen.

Figure 1
Figur 1. Thermolabile ligand DSC. (en) Thermograms av MN4 (83 µM) grense kokain (innledende konsentrasjon 778 µM). Første og siste skanninger av MN4 i nærvær av ligand vises som mørke røde og blå sirkler mens tilsvarende passer vises som fargede linjer. (b) Thermograms av gratis MN4 (83 µM, svart sirkler) og påfølgende skanner bundet til kinin (880 µM, farget sirkler). Passer til gratis og kinin-bundet datasett vises som svarte og fargede linjene, henholdsvis. Gjengitt fra referanse4 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Måle hastigheten konstant for Thermolabile Ligand konvertering. (en) sett thermograms for MN4 bundet til kokain med kort (120 s, mørk rød) og lange (600 s, mørk blå) balanse ganger ved 80 ° C, henholdsvis. (b) konsentrasjoner av kokain utvunnet fra globale analyse av datasett i (en) som en funksjon av skanning. Eksperimentell poeng og eksponentiell passer vises som sirkler og linjer henholdsvis. Rammemargen viser en lineær plass til beskrevet tidligere supplerende Eq. 19 fra Harkness et al. bruker optimalisert globale passer kokain konsentrasjonen for to datasett4. Rate konstant for ligand termisk konvertering ved 80 ° C beregnes som stigningstallet for linjen. Feilen for rate konstant for thermolabile ligand konvertering gis som ± to standard avvik. Gjengitt fra referanse4 med tillatelse fra Royal Society of Chemistry. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Tilpass parametere Kokain lagt Kinin lagt
∆HUF 271.3±1.8 272.5±4.0
∆SUF 824.4±5.1 827.9±10.9
en∆GUF 21.6±0.2 21.6±0.9
en∆HB1F -75.2±1.6 -101.0±4.0
en∆SB1F -154.2±5.0 -213.7±12.0
∆CpB1F -1.5±0.1 -1.2±0.1
en∆GB1F -28.5±0.2 -36.2±0.7
en∆HB2F -33.7±1.8 -
en∆SB2F -49.9±5.2 -
∆CpB2F -2.2±0.1 -
en∆GB2F -18.6±0.3 -

Tabell 1. Termodynamisk parametere Hentet fra globale analyse av MN4 DSC datasett ved hjelp av kokain og kinin ligander. Parametere ble beregnet på 30 ° C. B1F refererer til kokain - eller kinin-bundet foldet stater og B2F refererer til benzoylecgonine-bundet foldet staten. ΔH og ΔG uttrykkes i kJ/mol, ΔS uttrykkes i J/mol/K og ΔCp uttrykt i kJ/mol/K. feil ble beregnet etter avvik/co-variance metoden19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Endringer og feilsøking

Detaljer om globale passende analysen brukes i figur 1 og figur 2 har vært beskrevet tidligere4. Her skissere vi praktiske sider ved utføring og analysere DSC bindende eksperimenter med thermolabile ligander. Merk at en DSC plan oppnådd for thermolabile ligand alene trekkes fra ligand + biomolecule datasett, effektivt avlyser ut heten eller opptatt av termisk konverteringen behandle seg selv. Standard thermolabile ligand globale passende analyse (figur 1 og figur 2) forutsetter at systemet er på termodynamisk likevekt gjennom temperatur skanningen og at thermolabile ligand konsentrasjonen er konstant gjennom hver thermogram, redusere utelukkende i høy temperatur balanse perioden. Vi har tidligere vist at forutsetningen gjelder kokain-bundet MN4 og er ventet å holde for alle thermolabile ligand/biomolecule system med kinetics lik disse.

Det er imidlertid noen situasjoner der systemet ikke kan antas for å være på termodynamisk likevekt og/eller konsentrasjonen av ligand ikke betraktes som konstant gjennom et enkelt søk. Disse inkluderer i) når ligand termisk konverteres raskt i forhold til temperatur avsøkingshastigheten, ii) når biomolecule gjennomgår irreversibel aggregering ved høy temperatur, iii) når folding/unfolding prisene går sakte sammenlignet avsøkingshastigheten, og iv). Når ligand association/dissosiasjon prisene er sakte sammenlignet med avsøkingshastigheten. I disse tilfellene systemet er kinetisk i stedet for termodynamisk kontroll og analyse i referanse 4 strengt brukes ikke. Data kan simuleres kvantitativt etter Figur 3, som beskrevet i supplerende fil 1. I prinsippet kan disse kinetics-basert beregningene brukes passer ikke-likevekt DSC data, potensielt gir både kinetic og termodynamisk data, men denne analysen er utenfor omfanget av dette dokumentet. I stedet presentere vi noen representant simulert DSC data for å hjelpe leseren til å identifisere ikke-likevekt situasjoner.

Et perfekt eksempel på termodynamisk kontroll er vist i figur 4ab. DSC thermograms av den gratis biomolecule er superimposable (figur 4a) og skanner med thermolabile ligand viser ikke hysteresis, slik at smeltende temperaturen observert på opp-søket samsvarer med folding temperaturen på den forrige ned-scan ( Figur 4b). Når thermolabile ligand konverterer raskt sammenlignet avsøkingshastigheten, store skjevheter vises i thermogram og termodynamisk ligningene ikke gjøre rede for topp figuren, som vist i Figur 4 c, d. Dette kan være lette noe ved å øke avsøkingshastigheten. Når biomolecule-aggregater på en måte som temperaturen-avhengige, DSC spor for all gratis biomolecule påfølgende nedgang i omfanget (figur 4e), mens tillegg av produserer thermolabile ligand et mønster av avtagende termisk upshifts lik det ideelle tilfellet, men skalert av synkende biomolecule konsentrasjonen (figur 4f). Når folding/unfolding kinetics er treg sammenlignet avsøkingshastigheten, hysteresis er tydelig i DSC spor av den gratis biomolecule slik at tilsynelatende rødsprit temperaturen på den-skanningen er høyere enn tilsynelatende renaturation temperaturen på ned-scan ( Figur 4 g). Tillegg av en thermolabile ligand fører til av synkende termisk upshifts, spesielt for opp-skanner (Figur 4 h). Til slutt, systemer med rask folding og langsom binding produsere hysteresis-fri DSC thermograms for den gratis biomolecule (figur 4i), men data med thermolabile ligand viser hysteresis hvor den tilsynelatende Smeltetemperaturen for den-skanningen er høyere enn tilsynelatende folding temperaturen på den forrige ned-scan (figur 4j). Likevel er den typiske mønsteret av avtagende termisk upshifts i både opp-skanner og ned-skanner. Non-likevekt situasjonen ved treg folding eller bindende kinetics kan være lette noe ved å redusere avsøkingshastigheten, selv om dette løper risikoen for ikke-ubetydelig ligand termisk konvertering forekommer i søket. I praksis kan skanning rate og øvre balanse temperaturen justeres manuelt for å få data ligner figur 4a, b.

Begrensninger av teknikken

Våre termodynamisk analyse for DSC bindende eksperimenter med thermolabile ligander krever at folding og forpliktende prosesser er relativt rask og at thermolabile ligand konvertering er treg før den høy temperatur delen av hver skanning. Når levetiden av brettet og/eller bundet er større enn ca 30 s (kav, ku < 0,03 s-1) hysteresis blir synlig i skanninger utført på 1 ° C min-1. I tillegg når ligand konvertering hastighet konstanten er over ca kc = 10-4 s-1 før rødsprit overgangen, kan det være betydelig uttømming av ligand i løpet av et enkelt søk. Anvendelsen av vår analyse er også upassende når irreversibel aggregering oppstår. I disse tilfellene kan mer avanserte modellering brukes på dataene. Ingen affinitet informasjon er tilgjengelig hvis ligand konvertering er så rask at den når ferdig før første rødsprit overgangen.

Betydning når det gjelder eksisterende metoder

Vår metode for første gang kan DSC brukes til å måle bindende termodynamikken for høy affinitet, thermolabile ligander. Ved å utføre en global samtidige analyse av alle skanner, pakkes termodynamisk parametere med høy nøyaktighet20. En ekstra fordel er at hele datasettet kan samles i så lite som ett eksperiment hvis termisk konvertering produktet har ingen affinitet for den gratis biomolecule. I motsetning produserer en typisk eksperimentelle DSC serie for en ikke-thermolabile ligand krever ~ 7-10 totalt eksperimenter.

Framtidige applikasjoner

Denne tilnærmingen har direkte programmer å karakterisere stramt, thermolabile hemmere i stoffet funnet kampanjer. Flere terapeutiske forbindelser som antibiotika og benzodiazepiner er kjent for å være thermolabile, gjennomgår rask hydrolyse på eller nær fysiologisk pH og temperaturer på ~ 60-70 ° C11. Denne DSC-metoden er godt posisjonert for å identifisere og karakterisere mange flere. Også, har modifisering av passende protokollen konto for systemer under kinetic i stedet for termodynamisk kontroll, som nevnt ovenfor, potensial til å åpne døren til mange flere systemer biologiske relevans.

Avgjørende skritt i protokollen

En av de viktigste eksperimentelle prosedyrene for å vurdere er dialyse eller bytte av biomolecule og ligand til identiske arbeider buffer løsninger (protokollen trinn 1.3-1.6). Buffer ikke samsvar mellom den ligand og biomolecule løsninger kan føre til store gjenstander i baseline og eksempel skanner som skjuler helt relevante folding data. I tillegg er det viktig at makt lesing stabiliserer før DSC er under trykk slik at det kan bli overvåket under pressurization (protokollen trinn 2.3). Hvis makt lesing endres av mer enn ~ 10 µW under pressurization, bobler har sannsynligvis dannet i kapillærene og kan forårsake store gjenstander i dataene. I dette tilfellet må løsningene være degassed mer grundig.

Figure 3
Figur 3. Biomolecular Folding, Binding til en Thermolabile Ligand og irreversibel aggregering. Thermolabile ligand (L) konverterer til produktet (X) med en rente konstant kc. X har ingen affinitet for biomolecule. Bundet staten (B) biomolecule-utveksling med gratis kastet stat (F) med rate konstanter kav og kpå. F utveksling med oppslåtte staten (U) med rate konstanter ku og kf. U konverterer irreversibelt til aggregert staten (A) med rate konstant kagg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Datasimulering av likevekt og Kinetically styres DSC eksperimenter i fravær og tilstedeværelsen av en Thermolabile Ligand. (en) likevekt biomolecular folding. (b) likevekt folding thermolabile ligand binding og langsom thermolabile ligand konvertering. (c) likevekt biomolecular folding. (d) likevekt folding thermolabile ligand binding og rask thermolabile ligand konvertering. (e) likevekt biomolecular folding og treg irreversibel aggregering. (f) likevekt folding, bindende, sakte thermolabile ligand konvertering og langsom irreversibel aggregering. (g) sakte biomolecular folding. (h) sakte folding likevekt bindende og langsom thermolabile ligand konvertering. (jeg) likevekt biomolecular folding. (j) likevekt folding, sakte thermolabile ligand binding og langsom thermolabile ligand konvertering. I alle paneler er den første og siste simulert skanner mørk rød og mørk blå, henholdsvis. Paneler som viser bare lyse og mørke blå thermograms angir at alle simulert skanner overlegg, og bare to siste vises i plottet. DSC eksperimenter ble oppnådd med 20 skanner (10 smelter og 10 annealing) på 1 ° C min-1 avsøkingshastigheten, med et temperaturområde på 0-80 ° C. Visse paneler vise smalere temperaturområdet å tillate bedre visualisering av simulering trender. De biomolecule og ligand konsentrasjonene i simuleringene var 200 µM og 10 mM, henholdsvis. Hvert eksperiment ble simulert med en 600 s balanse tid ved 0 ° C før skanning og en 60 s balanse tid mellom hver av de etterfølgende skanninger. Arrhenius parametere for likevekt bindende og folding var enpå = 5 x 10-1 M-1 s-1, enav = 1 x 1019 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1, Een av = 120 kJ mol-1, enkaste = 1 x 10-14 s-1, enbrette = 5 x 1018, Eenkaste =-80 kJ mol-1og Eenbrette = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametere for kinetically styres bindende og folding var enpå = 5 x 10-3 M-1 s-1, enav = 1 x 1016 s-1, Eenpå =-20 kJ mol-1, E en av = 120 kJ mol-1, enkaste = 1 x 10-16 s-1, enbrette = 5 x 1016, Eenkaste =-80 kJ mol-1og Eenbrette = 120 kJ mol-1 . Arrhenius parametere for langsom og rask thermolabile ligand konvertering var enlangsom = 7.509 x 1010 s-1, Eenlangsom = 94.65 kJ mol-1, og enrask = 1 s-1, Een rask = 10 kJ mol-1. Arrhenius parametere for langsom irreversibel samling var enagg. = 5 x 107 s-1 og Eenagg. = 80 kJ mol-1. Overflødig varme kapasitet ble beregnet med ΔHUF (unfolding), ΔHBF (bindende) og ΔHAF (aggregering) = 200-140 og 50 kJ mol-1, henholdsvis. Teoretisk beskrivelsen av kinetically styres DSC eksperimenter med thermolabile ligander og skript for å utføre disse simuleringene (og de nødvendige parameterne) er tilgjengelig i supplerende fil 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter.

Acknowledgments

R. W. H. V ble støttet av McGill naturvitenskap og Engineering Research Council for Canada (NSERC) treningsprogrammet i Bionanomachines. A. K. M. og P. E. J. ble støttet av NSERC tilskudd 327028-09 (A. K. M) og 238562 (P. E. J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sodium chloride Chem Impex #00829
Sodium phosphate monobasic dihydrate Sigma Aldrich 71502
Sodium phosphate dibasic Sigma Aldrich S9763
Deioinized water for molecular biology Millipore H20MB1001
0.2 micron sterile syringe filters VWR CA28145-477
3 kDa centrifugal filters Millipore UFC900324
Dialysis tubing 0.5-1.0 kDa cutoff Spectrum Laboratories 131048
Silicon tubing VWR 89068-474
Plastic DSC flange caps TA Instruments 6111
DNA aptamer MN4 Integrated DNA Technologies https://www.idtdna.com/site/order/menu
Cocaine Sigma Aldrich C008
Quinine Sigma Aldrich 22620
NanoDSC-III microcalorimeter TA Instruments http://www.tainstruments.com/nanodsc/
DSCRun software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
NanoAnalyze software TA Instruments http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/
Contrad-70 VWR 89233-152

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruylants, G., Wouters, J., Michaux, C. Differential scanning calorimetry in life science: thermodynamics, stability, molecular recognition and application in drug design. Curr Med Chem. 12 (17), 2011-2020 (2005).
  2. Privalov, P. L., Dragan, A. I. Microcalorimetry of biological macromolecules. Biophys Chem. 126 (1-3), 16-24 (2007).
  3. Brandts, J. F., Lin, L. N. Study of strong to ultratight protein interactions using differential scanning calorimetry. Biochemistry. 29 (29), 6927-6940 (1990).
  4. Harkness, R. W., Slavkovic, S., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Rapid characterization of folding and binding interactions with thermolabile ligands by DSC. Chem Commun. 52 (92), 13471-13474 (2016).
  5. Garbett, N. C., Chaires, J. B. Thermodynamic studies for drug design and screening. Expert Opin Drug Dis. 7 (4), 299-314 (2012).
  6. Holdgate, G. A., Ward, W. H. J. Measurements of binding thermodynamics in drug discovery. Drug Discov Today. 10 (22), 1543-1550 (2005).
  7. Plotnikov, V., et al. An autosampling differential scanning calorimeter instrument for studying molecular interactions. Assay Drug Dev Technol. 1 (1), 83-90 (2002).
  8. Schon, A., Lam, S. Y., Freire, E. Thermodynamics-based drug design: strategies for inhibiting protein-protein interactions. Future Med Chem. 3 (9), 1129-1137 (2011).
  9. Periánez Parraga, L., G-L, A., Gamón Runnenberg, I., Seco Melantuche, R., Delgado Sánchez, O., Puigventós Latorre, F. Thermolabile Drugs. Operating Procedure In the Event of Cold Chain Failure. Farmacia Hospitalaria. 35 (4), 1-28 (2011).
  10. Murray, J. B., Alshora, H. I. Stability of Cocaine in Aqueous-Solution. J Clin Pharmacy. 3 (1), 1-6 (1978).
  11. Waterman, K. C., et al. Hydrolysis in pharmaceutical formulations. Pharm. Dev. Technol. 7 (2), 113-146 (2002).
  12. Mergny, J. L., Lacroix, L. Analysis of thermal melting curves. Oligonucleotides. 13 (6), 515-537 (2003).
  13. Neves, M. A., Reinstein, O., Johnson, P. E. Defining a stem length-dependent binding mechanism for the cocaine-binding aptamer. A combined NMR and calorimetry study. Biochemistry. 49 (39), 8478-8487 (2010).
  14. Bonifacio, G. F., Brown, T., Conn, G. L., Lane, A. N. Comparison of the electrophoretic and hydrodynamic properties of DNA and RNA oligonucleotide duplexes. Biophys J. 73 (3), 1532-1538 (1997).
  15. Hinz, H. -J. Chapter 3. Thermodynamic Data for Biochemistry and Biotechnology. , Springer. Berlin Heidelberg. 45-128 (1986).
  16. Hellman, L. M., Rodgers, D. W., Fried, M. G. Phenomenological partial-specific volumes for G-quadruplex DNAs. Eur Biophys J Biophy. 39 (3), 389-396 (2010).
  17. Farber, P., Darmawan, H., Sprules, T., Mittermaier, A. Analyzing Protein Folding Cooperativity by Differential Scanning Calorimetry and NMR Spectroscopy. J Am Chem Soc. 132 (17), 6214-6222 (2010).
  18. Reinstein, O., et al. Quinine binding by the cocaine-binding aptamer. Thermodynamic and hydrodynamic analysis of high-affinity binding of an off-target ligand. Biochemistry. 52 (48), 8652-8662 (2013).
  19. Tellinghuisen, J. Statistical error propagation. J Phys Chem. A. 105 (15), 3917-3921 (2001).
  20. Drobnak, I., Vesnaver, G., Lah, J. Model-based thermodynamic analysis of reversible unfolding processes. J Phys Chem B. 114 (26), 8713-8722 (2010).

Tags

Biokjemi problemet 129 differensial skanning calorimetry termodynamikk kinetikk folding bindende thermolabile ligander medisiner
Måle Biomolecular DSC profiler med Thermolabile ligander å raskt karakterisere Folding og bindende interaksjoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harkness V, R. W., Johnson, P. E.,… More

Harkness V, R. W., Johnson, P. E., Mittermaier, A. K. Measuring Biomolecular DSC Profiles with Thermolabile Ligands to Rapidly Characterize Folding and Binding Interactions. J. Vis. Exp. (129), e55959, doi:10.3791/55959 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter